زرع الكلى

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

المقدمة

الكلىالزرعهو الخيار الأفضل لعلاج المرحلة النهائية من مرض الكلى المزمن. في الوقت الحالي ، برز الرفض بوساطة الجسم المضاد (AMR) ، والذي يتميز بوجود جسم مضاد محدد من المانحين (DSA) موجه إلى مستضد كريات الدم البيضاء البشرية (HLA) ، باعتباره السبب الرئيسي للضرر المزمن في الكسب غير المشروع الكلوي ، والذي يحد إلى حد كبير من بقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل. (1 ، 2). ومع ذلك ، فشلت المخططات الحالية في تحقيق نتائج واعدة في المجال السريريعلاج AMR (1 ، 3 ، 4). وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتحديد المؤشرات الحيوية وعوامل الخطر المحتملة لمقاومة مضادات الميكروبات بعد زرع الكلى ، وهو أمر بالغ الأهمية للعلاج ونتائج المرضى.

تشير الأدلة المتراكمة إلى أنه في ظل الظروف الطارئة ، يمكن للخلايا البائية أن تتمايز إلى بلازما إفراز الأجسام المضادة وخلايا ب منظمة (بريجز) ، وهي مجموعة فرعية خاصة من الخلايا البائية تفرز السيتوكينات المثبطة للمناعة ، وخاصة الإنترلوكين (IL) -10. (1 ، 5-7). وهكذا ، تنتج البلازما أجسامًا مضادة ، مما يؤدي إلى مقاومة مقاومة مضادات الميكروبات ، بينما تُظهر Bregs وظائف تنظيم المناعة وتساعد على إحداث التوازن المناعي. وبالتالي ، تم الإبلاغ عن ارتباط Bregs ارتباطًا وثيقًا بمقاومة مقاومة مقاومة مضادات الميكروبات بعد زراعة الكلى (1 ، 8 ، 9).

على الرغم من أن العلامات السطحية المتميزة لمجموعات فرعية Breg لم يتم تحديدها بعد في البشر (1) ، فقد أبلغت الدراسات السابقة عن أربعة مجموعات سكانية فرعية شائعة من Bregs: ذاكرة Bregs (mBregs) محددة بـ CD19 plus CD24 plus CD27 plus (10) ، Bregs انتقالية (10) tBregs) مُعرف بـ CD19 plus CD24 plus CD38 plus (10 ، 11) ، IL -10- إنتاج ذاكرة Bregs (IL -10 بالإضافة إلى mBregs) مع CD19 بالإضافة إلى CD24 بالإضافة إلى CD27 بالإضافة إلى IL -10 plus (12) و IL -10- المنتجةتم تعريف Bregs الانتقالية (IL -10 بالإضافة إلى tBregs) باستخدام CD19 بالإضافة إلى CD24 بالإضافة إلى CD38 بالإضافة إلى IL -10 بالإضافة إلى (13). لاجونا جويا وآخرون. ذكرت أن الانخفاض في tBregs و IL -10 بالإضافة إلى tBregs يرتبط بشكل إيجابي بالرفض الحاد بعد زراعة الكلى (14). ومع ذلك ، Zhou et al. ذكرت أن mBregs ، بدلاً من tBregs ، انخفض بشكل ملحوظ في خمسة مرضى يعانون من رفض حاد في زرع الكبد بعد (10). علاوة على ذلك ، شابير وآخرون. ذكرت أن tBregs لم تكن مرتبطة برفض الطعم الخيفي الكلوي في ثلاثة مرضى AMR (15). في ضوء هذه النتائج غير المتسقة ، هناك حاجة لمزيد من التوضيح أي السكان الفرعيين من Breg يلعب دورًا حيويًا في مرضى مقاومة مضادات الميكروبات بعد زراعة الكلى.

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة نسب أربع مجموعات سكانية فرعية من Bregs المتداولة بين المجموعات الصحية والمستقرة (ST) و AMR. بعد ذلك ، تم تحديد التوزيع الحيوي للخلايا البائية ، و IL -10 ، والكيموكينات في الطعوم الكلوية للمرضى الأصحاء ، ومرضى ST و AMR. علاوة على ذلك ، تم التحقيق في ديناميكيات المجموعات السكانية الفرعية الأربعة من الحوامل المنتشرة في مرضى ST لمدة 90 يومًا بعد الجراحة. تشير هذه النتائج الحالية ، جنبًا إلى جنب مع تلك التي أبلغت عنها الدراسات السابقة (1) ، إلى أن تعميم IL -10 بالإضافة إلى mBregs و IL -10 بالإضافة إلى tBregs هي المجموعات السكانية الفرعية الرائدة Breg التي تساهم في مقاومة مقاومة مقاومة مضادات الميكروبات.

مسحوق Cistanche tubulosaيمنعأمراض الكلى، انقر هنا للحصول على العينة

الكلمات الدالة:النمط الظاهري لـ Breg ، وزرع الكلى ، والرفض بوساطة الأجسام المضادة ، والتوازن ، والديناميكي

المواد والأساليب

المرضى والمجموعات

قدم جميع المرضى موافقة مستنيرة موقعة قبل الدراسة. تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة Zhengzhou (2018- KY -72). رقم تسجيل التجارب السريرية هو ChiCTR1900022501.

تم تقسيم هؤلاء المرضى إلى ثلاث مجموعات: (1) مجموعة مراقبة صحية (صحية ، n=9): متبرعون صحيون بالكلى في عمر 18-55 عامًا (خالية من المرض) ، تتكون من أشقاء وأزواج المتلقين ؛ (2) المتلقون الذين لديهم مجموعة وظيفية مستقرة (ST، n=25): المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و 55 عامًا ، وكانت وظائف الكلى لديهم مستقرة (خالية من العدوى أو الرفض قبل وبعد زراعة الكلى) أثناء المتابعة الفترة (أكبر من أو تساوي 6 أشهر) ؛ (3) متلقون مع مجموعة مقاومة مقاومة مضادات الميكروبات (AMR ، ن=18): المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين 18 و 55 عامًا ، والذين تم تشخيص إصابتهم بمقاومة مضادات الميكروبات. تم الحصول على ترقيع الكلى لمتلقي ST و AMR منمتبرع صحي بالكلىس. تم تأكيد التشخيص التفريقي بين مجموعات ST و AMR من قبل اثنين من أخصائيي أمراض الكلى ، وفقًا لإجماع بانف 2017 (3 ، 16).

الدم المحيطي وأنسجة الكلى وعينات الخلايا

تم جمع عينات الدم المحيطي من المجموعة السليمة في مرحلة ما قبل العملية ، وفي 1 و 7 و 14 يومًا بعد العملية. تم جمع العينات التي تم الحصول عليها من مجموعة ST في مرحلة ما قبل العملية ، وفي 1 و 7 و 14 و 30 و 90 يومًا بعد العملية. تم جمع العينات التي تم الحصول عليها من مجموعة مقاومة مضادات الميكروبات عند حدوث الرفض (قبل العلاج المضاد للرفض لمقاومة مقاومة مضادات الميكروبات). تم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من

5 مل من الدم عن طريق الطرد المركزي المتدرج Ficoll-Paque والمحفوظة بنسبة 10 في المائة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (Solarbio Inc. ، بكين ، الصين) في النيتروجين السائل.

تم جمع عينات الخزعة الكلوية بالإبرة الأساسية التي تم الحصول عليها من المجموعة السليمة قبل الجراحة لإجراء خزعات كلى متبرع بدون زمن. تم جمع عينات الخزعة الكلوية بالإبرة الأساسية التي تم الحصول عليها من مجموعة ST في 90 يومًا بعد العملية بعد استقرار وظائف الكلى بسبب خزعة البروتوكول. في ضوء ضعف البزل الثاني في وظائف الكلى ، رفض جميع مرضى مقاومة مضادات الميكروبات إجراء خزعة الكلى بالإبرة الأساسية بعد العلاج المضاد لرفض وظائف الكلى. وبالتالي ، تم جمع عينات خزعة الكلى بالإبرة الأساسية من مجموعة AMR فقط عند حدوث الرفض (قبل العلاج المضاد للرفض لـ AMR). قدم ما مجموعه ثلاثة متبرعين أصحاء ، وتسعة مرضى ST ، وتسعة مرضى AMR موافقة مستنيرة موقعة قبل خزعة الكلى بالإبرة الأساسية. المتبرعون الستة الباقون ، و 16 مريضًا من مرض ST ، وتسعة مرضى AMR رفضوا الخزعة الكلوية بالإبرة الأساسية بسبب الخوف من نزيف كبير مرتبط بالخزعة. تم عزل الخلايا المفردة من عينات الخزعة الكلوية بالإبرة الأساسية لثلاثة متبرعين أصحاء ، وثلاثة مرضى ST ، وثلاثة مرضى AMR ، عن طريق الجمع بين التفكك الميكانيكي مع التحلل الأنزيمي للمصفوفة خارج الخلية ، والتي تحافظ على السلامة الهيكلية للأنسجة (مجموعة تفكك الأنسجة المتعددة 1 ؛ Miltenyi Biotec ، بيرجيش جلادباخ ، ألمانيا). تم الحفاظ على خلايا الكلى بنسبة 10 في المائة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (شركة سولاربيو ، بكين ، الصين) في النيتروجين السائل ، وتم تضمين عينات الخزعة الكلوية بالإبرة الأساسية المتبقية في البارافون عند 4 درجات.

التدفق الخلوي

تم إذابة الخلايا المخزنة في النيتروجين السائل بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة لمدة 3 دقائق. تم احتضان إجمالي 2–3 × 106 PBMCs مع كوكتيل تحفيز خلايا التخفيف لمعهد Roswell Park Memorial Institute 1640 (500 ×) ، والذي يتكون من PMA (Phorbol 12- Myristate 13- Acetate) ، حامل أيون الكالسيوم (Ionomycin) ، ومثبطات نقل البروتين Brefeldin A و Monensin ، (eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) ، عند 37 درجة مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 5 ساعات. تم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ مع 7- aminoactinomycin D (Thermo Fisher Scienti ، Pittsburgh ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وكانت العلامات السطحية من Bregs مضادة لـ uorochrome (Violet 421 ™ Anti-Human Cd19 ، (PE) / Cy7 CD24 المضاد للإنسان ، Alexa FluorR647 CD27 المضاد للإنسان ، Alexa FluorR488

CD38 المضاد للإنسان ، و Brilliant Violet 510 ™ المضاد للإنسان CD45 ؛ ضوابط النوع المناسب: Brilliant Violet 421 ™ Mouse

IgG1 k Isotype Control ، PE / Cy7 Mouse IgG2a k Isotype Control ، Alexa FluorR647 Mouse IgG1 k Isotype Control ، Alexa FluorR488 Mouse IgG1 k Isotype Control ، و Brilliant Violet

510 ™ Mouse IgG1 k Isotype Control؛ Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ،

الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات ، مع الحماية من الضوء. بالنسبة للتلوين داخل الخلايا ، كانت الخلايا ملطخة بالأجسام المضادة التي تستهدف السيتوكينات داخل الخلايا لـ Bregs (PE المضاد للإنسان IL -10 ؛ عناصر التحكم في النمط المناسب: PE Rat IgG1 k Isotype Control ؛ Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. تم تحليل الخلايا المصنفة باستخدام أداة BD Biosciences Canto II (BD Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على ما مجموعه 100 حدث 000 في بوابة الخلايا الليمفاوية. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo (Tree Star ، سان كارلوس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

المناعية

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 نقطة إيجابية ، النتيجة=أربعة

تحليل احصائي

في دراسة الحالة والشواهد المتداخلة ، تم إجراء تحليل منحنى خاصية تشغيل المستقبِل (ROC) بواسطة MedCalc v18.11.3. تم إجراء التحليلات الإحصائية المتبقية باستخدام IBM SPSS 21. 0. تم التعبير عن بيانات القياس الموزعة عادةً مع تجانس التباين على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (x ± s) وتم تحليلها بواسطة اختبار t لعينة مستقلة (مقارنات بين المجموعات) أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (مقارنات بين المجموعات). تم التعبير عن بيانات القياس التي لم يكن لها توزيع طبيعي أو تجانس للتباين في المتوسط ​​مع المدى الربيعي (IQR) وتم تحليلها بواسطة اختبار Mann-Whitney U (المقارنات بين المجموعات) أو اختبار Kruskal-Wallis (بين المجموعة المقارنات). تم تحليل بيانات العد عن طريق اختبار c2 ، أو اختبار c2 المصحح ، أو اختبار فيشر الدقيق ، حسب الحاجة. طريقة واحدة متكررة لتحليل التباين

تم استخدامه في نقاط زمنية مختلفة. قيم ف<0.05 were="" considered="" statistically="">

النتائج

الخصائص الأساسية للمرضى

تم تضمين ما مجموعه تسعة متبرعين أصحاء ، و 25 مريضا من ST ، و 18 مريضا AMR في الدراسة الحالية. كما هو مبين في الجدول 1 ، لم يختلف جنس المستلمين ، والعمر ، ومؤشر كتلة الجسم (BMI) ، واعتلال الكلية الأولي ، وعدم تطابق HLA ، و CNI ، ووقت الإقفار الدافئ ، ووقت نقص التروية الباردة بين المجموعات ، أو بين المجموعات (P > 0. 0 5 للجميع). ومع ذلك ، كان معدل حدوث كل من مضاد الصنف الأول وإيجابية DSA للفئة الثانية في مجموعة مقاومة مضادات الميكروبات أعلى بشكل ملحوظ ، عند مقارنته بتلك الموجودة في مجموعة ST (P <0. 0="" 01="" للمضاد="" -صنف="" i="" dsa،="" p=""><0.001؛ p="0" .001="" لمقاومة="" الفئة="" ii="" dsa).="" علاوة="" على="" ذلك="" ،="" بالمقارنة="" مع="" مرضى="" st="" ،="" كان="" لدى="" مرضى="" amr="" درجات="" أعلى="" بشكل="" ملحوظ="" في="" التهاب="" الأنبوب="" (t)="" ،="" والتهاب="" الخلالي="" (1)="" ،="" والتهاب="" الشعيرات="" الدموية="" حول="" النبيبات="" (ptc)="" (p="0." 012="" لـ="" t="" ؛="" p=""><0.001 لـ="" i="" و="" ptc="" )="" ،="" وفقًا="" لتصنيف="" بانف="" (عادي="" ،="" الدرجة="0" ؛="" معتدل="" ،="" النتيجة="1" ؛="" متوسط="" ​​،="" النتيجة="2" ؛="" شديدة="" ،="" الدرجة="3)" (3="" ،="" 16)="" (="" الجداول="" التكميلية="" 1="" و="">

cistanche echinacosideإلى عن على داء السكري