يكشف التنميط المناعي الطولي عن الحواتم المهيمنة التي تتوسط المناعة الخلطية طويلة المدى في مرض كوفيد-19 - الأفراد المتعافين

خلفية: فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) هو فيروس تاجي شديد الإمراض ومعدٍ تسبب في حدوث جائحة عالمي أدى إلى وفاة 5.2 مليون شخص حتى الآن. الأسئلة المتعلقة بالسمات المصلية للمناعة طويلة المدى، وخاصة الحواتم السائدة التي تتوسط استجابات الأجسام المضادة الدائمة بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2، لا تزال بحاجة إلى توضيح.

موضوعي: نحن نهدف إلى تشريح حركية الاستجابات المناعية وطول عمرها لدى مرضى فيروس كورونا 2019 (COVID-19)، بالإضافة إلى الحواتم المسؤولة عن المناعة الخلطية المستدامة طويلة الأمد ضد فيروس SARS-CoV-2.

طُرق: قمنا بتقييم ديناميكيات المناعة لـ SARS-CoV-2 لمدة تصل إلى 180 إلى 220 يومًا بعد ظهور المرض لدى 31 فردًا عانوا في الغالب من أعراض معتدلة لـCOVID-19، ثم أجرينا تحديدًا على مستوى البروتين للحواتم السائدة المسؤولة عن الاستجابات المناعية الخلطية المستمرة.

نتائج: كشف التحليل الطولي عن وجود أجسام مضادة مستمرة خاصة ببروتين SARS-CoV-2 وأجسام مضادة معادلة لدى مرضى COVID-19، إلى جانب تنشيط إنتاج السيتوكينات في المراحل المبكرة بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2. وقد تبين أن الحواتم شديدة التفاعل التي كانت قادرة على التوسط في استجابات الأجسام المضادة طويلة المدى موجودة في بروتينات السنبلة وORF1ab. تم تعيين الحلقات الرئيسية لبروتين SARS-CoV-2 الشوكية إلى المجال الطرفي N للوحدة الفرعية S1 والوحدة الفرعية S2، بدرجات متفاوتة من التماثل التسلسلي بين فيروسات كورونا البشرية المستوطنة وهوية تسلسل عالية بين فيروسات السارس- CoV -2 (ووهان-هو - 1) والمتغيرات المتداولة الحالية.

فوائد ملحق cistanche-كيفية تقوية جهاز المناعة

خاتمة: تحفز عدوى SARS-CoV-2 مناعة خلطية مستمرة لدى الأفراد المتعافين من فيروس كورونا-19 من خلال استهداف الحواتم المهيمنة الموجودة عند بروتينات السنبلة وORF1ab التي تتوسط الاستجابات المناعية طويلة المدى. توفر النتائج التي توصلنا إليها طريقًا للمساعدة في تصميم اللقاح العقلاني وتطوير التشخيص. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

الكلمات الدالة:

السارس-CoV-2، فيروس كورونا-19، الاستجابة المناعية طويلة المدى، المناعة الخلطية، مصفوفة الببتيد الدقيقة على مستوى البروتين، الحاتمة السائدة

ينتمي فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV- 2)، العامل الممرض المسبب لجائحة مرض فيروس كورونا الحالي 2019 (COVID-19)، إلى جنس فيروسات كورونا بيتا، الذي يتضمن فيروسين بشريين آخرين معروفين بدرجة عالية من الإمراض فيروسات كورونا: فيروسات كورونا المرتبطة بالمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (سارس) ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (ميرس). الحالات المؤكدة و5.2 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم اعتبارًا من نوفمبر 2021، مما أثر على 220 دولة ومنطقة عبر 5 قارات.2 بعد الإصابة، تتنوع المظاهر السريرية على نطاق واسع، بما في ذلك العدوى بدون أعراض، أو أعراض خفيفة أو معتدلة، أو حتى الالتهاب الرئوي الحاد الذي يهدد الحياة.3 على الرغم من ومع توافر أنواع متعددة من أساليب اللقاحات، لا تزال العديد من البلدان تكافح من أجل احتواء موجات جديدة من العدوى، مع ظهور متغيرات فيروسية تبدو وكأنها تظهر زيادة في قابلية الانتقال ومقاومة الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات. يجب أن تمتلك الاستجابة المناعية الخلطية الفعالة التي تتوسطها الأجسام المضادة المعادلة مناعة تكيفية قوية لا غنى عنها لمنع العدوى والقضاء على مسببات الأمراض الفيروسية. بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2، لوحظ معدل مرتفع (أكثر من 90%) من الانقلاب المصلي القوي بين الأفراد المصابين بعد 7 إلى 14 يومًا من ظهور المرض. 4-6 إنتاج مستضد محدد IgA، IgG، وIgM الذي يتعرف على بروتين السنبلة (S) وبروتين القفيصة النووية (N) لـ SARS-CoV-2 كان قابلاً للاكتشاف خلال المرحلة الحادة من المرض والمرحلة المبكرة من النقاهة.4،5،7 يبدو أن حجم الأجسام المضادة المعادلة كان واضحًا ترتبط بالعمر، وأعراض العدوى، وشدة المرض. يميل المرضى المسنون والأفراد الذين تظهر عليهم أعراض شديدة لفيروس كورونا-19 إلى تطوير مستويات أعلى من الأجسام المضادة المعادلة.4،8-10 كشفت العديد من الدراسات المتعلقة بطول عمر استجابات الأجسام المضادة أنه على الرغم من فقدان تفاعل المصل/البلازما مع الفيروس المستضدات وانخفاض عيارات الأجسام المضادة المعادلة بمرور الوقت في بعض حالات فيروس كورونا-19 التي تظهر عليها أعراض، لوحظ مستوى ثابت من المناعة الخلطية الشاملة طويلة المدى لمدة تصل إلى 8 إلى 12 شهرًا بعد الإصابة بكوفيد-19-الأفراد في فترة النقاهة .10-13 علاوة على ذلك، ظل عدد خلايا الذاكرة B الخاصة بمستضد SARS-CoV-2 ثابتًا لمدة 6 إلى 12 شهرًا على الأقل،12،13 جنبًا إلى جنب مع الانتقاء المستمر وتراكم مستنسخات الخلايا B التي تعبر عن تحييد الأجسام المضادة،12،14 مما يشير إلى الحفاظ على المناعة الخلطية المستمرة بعد الإصابة بفيروس SARSCoV-2.

فوائد مكملات cistanche - زيادة المناعة

تلعب الأجسام المضادة المحايدة دورًا أساسيًا في دفاعات المضيف ضد العدوى الفيروسية. تم التعرف على مجموعة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القوية للغاية لـ SARS-CoV-2،15-17 تستهدف في المقام الأول الحواتم الموجودة في مجال ربط المستقبلات لبروتين S الذي يتجمع في أدوات القطع على سطح الفيريون ويسهل دخول الفيروس والاندماج في إشراك مستقبل الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2.18 تحتوي مناطق أخرى من بروتين S، بما في ذلك المجال الطرفي N (NTD) للوحدة الفرعية S1 والوحدة الفرعية S2، أيضًا على حواتم مناعية قادرة على تحفيز الأجسام المضادة المعادلة.16 ,19,20 إلى جانب التحييد، قد تمنح الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 الحماية في الجسم الحي عبر وظائف المستجيب بوساطة Fc، مثل البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة والتي تسببها الخلايا القاتلة الطبيعية والسمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة بواسطة الخلايا الوحيدة أو البلاعم. 21،22 بالإضافة إلى مكافحة الالتهابات الفيروسية، فإن الأجسام المضادة الناتجة عن العدوى الطبيعية أو التطعيم قد تسهل التسبب في الفيروس، إما عن طريق زيادة تنشيط الالتهاب أو تعزيز عدوى الفيروس من خلال تكوين المركب المناعي للمستضد/الجسم المضاد أو عن طريق الوظائف المعتمدة على Fc، 23-25 على الرغم من عدم ملاحظة العدوى الفيروسية المعززة في سياق السارس-CoV-2 في الجسم الحي. تتطلب هذه الأدوار المتباينة لاستجابات الأجسام المضادة توصيفًا منهجيًا لحواتم SARSCoV-2، بالإضافة إلى خصائص الأجسام المضادة طويلة الأمد التي تستهدف الحواتم المعادلة أو غير المحايدة. على الرغم من التقدم الأخير في حركية استجابات الأجسام المضادة ومدة استجاباتها بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2، لا يزال التحليل الطولي فيما يتعلق بالحواتم البارزة التي تدعم الاستجابات المناعية الخلطية طويلة المدى محدودًا. حددت الدراسات السابقة حلقات استجابة الأجسام المضادة لدى الأفراد المصابين بـCOVID-19 بشكل رئيسي باستخدام المقايسات القائمة على ELISA،26،27 الأساليب القائمة على عرض العاثيات أو البكتيريا،28-31 والتقنيات القائمة على المصفوفة الدقيقة.30،{{ 38}} تم تحديد العديد من الحواتم المناعية لبروتين SARS-CoV-2 S؛ تم تعيين المناطق الأكثر اكتشافًا بشكل متكرر بالقرب من أو امتداد الببتيد الاندماجي (FP) للوحدة الفرعية S2، ويتكرر السباعي الثاني داخل الوحدة الفرعية S2 وعلى مجال الطرف C للوحدة الفرعية S1.26،28-30، 32،33 بالإضافة إلى ذلك، كشف الفحص المصلي أيضًا عن الحواتم الموجودة في بروتينات أخرى عبر بروتين SARS-CoV-2، بما في ذلك بروتين N وبروتين الغشاء (M) وORF1ab وORF3a وORF7a.28-30، 34،35 على الرغم من أن الدراسات السابقة قد قدمت نظرة ثاقبة مهمة حول الحواتم المستضدية، فقد ركزت هذه الدراسات إلى حد كبير على تحديد ملامح الحاتمة لمرضى كوفيد-19 في مرحلة النقاهة المبكرة. الحواتم الدقيقة التي تتوسط استجابات الأجسام المضادة الدائمة لـ SARS-CoV-2، بالإضافة إلى ديناميكيات التعرف على الحاتمة لا تزال بحاجة إلى توضيح. هنا، للحصول على فهم أعمق لحركية الاستجابات المناعية الخلطية وطول عمرها لدى مرضى فيروس كورونا-19، وخاصة الحواتم المسؤولة عن المناعة المستدامة طويلة الأمد ضد السارس-CoV-2، أجرينا تحليلًا طوليًا شاملاً من التنميط المناعي لدى 31 مريضًا بفيروس كورونا-19 لمدة تصل إلى 180 إلى 220 يومًا بعد ظهور الأعراض. استنادًا إلى تقييم الأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد والمعادلة بالإضافة إلى مستويات السيتوكينات في المصل، حددنا أيضًا مجموعة من الحواتم الموجودة في بروتينات ORF1ab وS وN لـ SARSCoV-2 والتي تتوسط الاستجابات المناعية الخلطية المستمرة باستخدام الببتيد. ميكروأري يشمل البروتين الكامل لـ SARS-CoV-2. تسلط نتائجنا الضوء على سمات المناعة طويلة المدى للتغلب على العدوى الفيروسية وستساعد في تصميم اللقاح العقلاني وتطوير أدوات التشخيص المصلية المحسنة.

طُرق

دراسة المشاركين وجمع العينات

لتقييم حركية الاستجابات المناعية الموجهة لـ SARS-CoV-2 طوليًا، تم جمع 101 عينة مصل من 31 فردًا مصابًا بفيروس SARS-CoV-2 - الذين تم إدخالهم إلى مستشفى نانتونغ الثالث التابع لجامعة نانتونغ (نانتونغ) ، الصين) بين يناير ومارس 2020. تم تشخيص إصابة جميع المرضى بعدوى مؤكدة بفيروس SARS-CoV-2 من خلال اختبار النسخ العكسي الكمي PCR؛ تم تعريف شدة المرض على أنها خفيفة إلى متوسطة (غير خطيرة) أو شديدة من فيروس كورونا-19 وفقًا للإصدار 7 من بروتوكول تشخيص وعلاج الالتهاب الرئوي الناجم عن فيروس كورونا الجديد الصادر عن لجنة الصحة الوطنية لجمهورية الصين الشعبية.36 وتمت متابعة المرضى يصل طولياً لمدة 4 إلى 8 أشهر بعد الشفاء من العدوى الحادة. تم جمع عينات الدم بطريقة طولية من 4 إلى 219 يومًا بعد ظهور الأعراض لـ 20 مريضًا من بين 31 مشاركًا في الدراسة (متوسط ​​4.5 عينة لكل فرد، تتراوح من 2 إلى 8)، في حين تم إجراء أخذ عينات في نقطة زمنية واحدة لكل من المشاركين في الدراسة. 11 فردًا آخرين كانوا في مرحلة النقاهة المتأخرة من المرض (الأيام 122 إلى 214 بعد ظهور المرض). وفقًا لذلك، تم أيضًا تضمين الأمصال (n 5 20) من المتبرعين الأصحاء المتطابقين مع العمر والجنس كمجموعة مراقبة. لم يكن لدى أي مشارك في الدراسة عدوى سابقة موثقة بالسارس أو متلازمة الشرق الأوسط التنفسية.

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى نانتونغ الثالث التابع لجامعة نانتونغ (موافقة EL2020006). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل من المشاركين في الدراسة. تم فصل المصل عن الدم المحيطي في أنابيب هلام المصل عن طريق الطرد المركزي، وتشكيله إلى قسامات، وتخزينه عند درجة حرارة 2808 مئوية قبل الاستخدام.

خطوط الخلية

تم استزراع خلايا HEK293T وHuh7 في وسط النسر المعدل بواسطة Dulbecco (Gibco؛ Thermo Fisher Scientific، Waltham، Mass) مع 10٪ من مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (Gibco)، و100 U / مل من البنسلين (Gibco)، و100 مجم / لتر. مل ستربتومايسين (جيبكو) عند 378 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

الكشف عن الأجسام المضادة IgG بواسطة ELISA

تم تحديد مستويات الأجسام المضادة IgG المرتبطة بالمستضد في عينات المصل البشري بواسطة ELISA. تم طلاء ستة وتسعين لوحة ELISA جيدًا (كورنينج، كورنينج، نيويورك) مسبقًا ببروتين SARS-CoV -2 nucleocapsid (Sino Biological، Beijing، China، رقم الكتالوج. 40588-V08B ، 50 نانوغرام لكل بئر) أو بروتين سبايك (Sino Biological، 40589-V08B1، 100 نانوغرام لكل بئر)، بروتين سبايك SARS-CoV (Sino Biological، 40634-V08B، 100 نانوغرام لكل بئر) جيدًا)، أو البروتين الشوكي لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (Sino Biological، 40069-V08B، 50 نانوغرام لكل بئر) طوال الليل عند درجة حرارة 48 درجة مئوية. بعد الحجب باستخدام 5% حليب خالي الدسم في محلول ملحي بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.05% توين 20 (PBS-T) لمدة ساعتين عند 378 درجة مئوية، 3- قم بطي عينات المصل المخففة تسلسليًا والمعطلة بالحرارة عند تخفيف بداية قدره 1 تمت إضافة 200 : إلى أطباق مطلية مسبقًا لمدة ساعتين عند 378 درجة مئوية. تم غسل الآبار 3 مرات بين كل خطوة باستخدام PBS-T. تم تصور التفاعلات من خلال الحضانة باستخدام الجسم المضاد IgG المضاد للإنسان المصاحب لبيروكسيداز الفجل (Abcam، Cambridge، المملكة المتحدة، 1:100، 000 تخفيف) لمدة ساعة واحدة عند 378 درجة مئوية، تليها إضافة ركيزة رباعي ميثيل بنزيدين (Life Technologies، Carlsbad) ، كاليفورنيا). تم إيقاف التفاعلات النامية باستخدام 2 مول من H2SO4، وتم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر مع ضبط الطول الموجي التصحيحي عند 630 نانومتر (OD450 2 OD630). لحساب عيار نقطة النهاية للأجسام المضادة الملزمة، تم تحديد البيانات خطيًا عن طريق رسم سجل تخفيفات المصل مقابل قيم الكثافة البصرية المصححة (OD) (OD450 2 OD630) داخل الجزء الخطي من المنحنى (y 5 kx 1 b ، r2 > 0.99)، وتخفيف المصل الذي تم عنده حساب قيمة OD المعدلة (OD 450 2 OD630) 5 0 لإعطاء عيار نقطة النهاية. تم تقييم الأجسام المضادة IgG الخاصة بمستضد معين في الفئران المحصنة بالببتيد بواسطة ELISA القائم على الببتيد. باختصار، تم طلاء ألواح ELISA جيدًا (Thermo Fisher Scientific) بـ 1 مجم لكل بئر مكونة من 4 ببتيدات مختلطة (الببتيدات 318 و356 و510 و530) في محلول كربونات (درجة الحموضة 9.6) طوال الليل عند 48 درجة مئوية. بعد الحظر باستخدام PBS-T الذي يحتوي على 5% من الحليب الخالي من الدسم، تم تحضين الآبار بعينات مصل مخففة عند 1:40 لمدة ساعة واحدة عند 378 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم غسل الأطباق واحتضانها باستخدام الجسم المضاد IgG المضاد للفأر (Abcam) من بيروكسيداز الفجل الحار. تم تصور التفاعلات باستخدام ركيزة رباعي ميثيل بنزيدين (تقنيات الحياة)، وتم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر بعد إيقاف التفاعلات مع 2 مول من H2SO4.

إنتاج الفيروس الزائف والمعايرة

الجين المُحسّن للكودون الذي يشفر SARS-CoV-2 (NC_045512) أو SARS-CoV (AY291315.1) البروتين الشوكي مع حذف C-terminal 19 aa، أو MERS-CoV (JX{{10) }}) تم استنساخ بروتين السنبلة المقطوع باستخدام C-terminal 16 aa في ناقل pcDNA3.1(1)، على التوالي. تم نقل خلايا HEK 293T المستزرعة في طبق زراعة الأنسجة بحجم 100 ملم باستخدام 1 ملغ من بروتين سبايك الذي يشفر البلازميد و15 ملغ من العمود الفقري الذي يعاني من نقص البيئة ويعبر عن اللوسيفيراز (pNL 4-3.luc.RE) باستخدام البولي إيثيلين أمين (العلوم المتعددة). ، وارينجتون، بنسلفانيا). تم جمع المواد الطافية لزراعة الخلايا المحتوية على فيروسات زائفة بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن، وتم ترشيحها وتخزينها عند درجة حرارة 2808 مئوية في قسامات. لتحديد عيار الفيروس (جرعة معدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50%)، تمت إضافة التخفيفات التسلسلية للفيروسات الزائفة إلى 1 3 104 خلايا Huh7 المزروعة مسبقًا في 96- صفائح جيدة. وبعد 12 ساعة من الإصابة، تم استبدال الوسط المحتوي على الفيروس بوسيط نمو جديد، وتمت زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية. تم قياس نشاط Luciferase لتحلل الخلايا باستخدام نظام الفحص Steady-Glo Luciferase (Promega، Madison، Wisc) باستخدام قارئ صفيحة ميكروية (BioTek Instruments، Winooski، Vt)، وتم اعتبار الآبار التي تنتج وحدات تلألؤ نسبية أعلى من 10 أضعاف متوسط ​​قيمة الخلفية إيجابي.

زائفةفحص تحييد روس

تم تخفيف عينات المصل المعطلة بالحرارة من مرضى فيروس كورونا-19 أو المتبرعين الأصحاء 2-أضعافًا تسلسلية واحتضانها باستخدام 200 فيروسات كاذبة عند جرعة معدية من زراعة الأنسجة بنسبة 50% لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 378 درجة مئوية. تم بعد ذلك تطبيق الخلائط على إصابة خلايا Huh7 المزروعة مسبقًا في 96-ألواح بئر مكررة. تم تجديد الآبار بوسط نمو جديد بعد 12 ساعة من الإصابة، وتم تحديد نشاط الخلايا لوسيفيراز بعد 48 ساعة. تم حساب عيار التعادل بنسبة 50% (NT50) ضد فيروسات SARS-CoV-2 والفيروسات الزائفة SARS-CoV عن طريق الانحدار غير الخطي باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software، La Jolla، Calif)؛ وتم تعريف NT50 للفيروس الزائف لـ MERS-CoV على أنه أعلى تخفيف للمصل أدى إلى انخفاض بنسبة 50٪ في وحدات التلألؤ النسبية مقارنة بمكافحة الفيروس دون تطبيق عينات المصل.

الكشف عن السيتوكينات المستندة إلى ميكروأري البروتين

القياس الكمي للسيتوكينات المتعددة (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10) و IL -13 و MCP -1 و IFN-g و TNF-a) في عينات المصل باستخدام صفيف ELISA متعدد الإرسال (RayBiotech، Peachtree Corners، Ga) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تم حظر الشرائح الزجاجية المطلية مسبقًا بأجسام مضادة خاصة بالسيتوكينات باستخدام عينة مخففة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، تليها إضافة 60 مل 2- أضعاف عينات المصل المخففة أو التخفيفات القياسية للسيتوكين. بعد الحضانة طوال الليل عند درجة حرارة 48 مئوية، تم غسل الشرائح 5 مرات وصبغها بكوكتيل الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيلات 80 مل ثم الستربتافيدين المكافئ للصبغة Cy3 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم اكتشاف شدة التألق بواسطة الماسح الضوئي InnoScan 300 ميكروأري (Innopsys، Chicago، Ill) عند 532 نانومتر، وتم تحليل البيانات بواسطة برنامج Q-Analyzer (RayBiotech).

تخليق الببتيد والاقتران مع ألبومين المصل البقري

تم تصنيع إجمالي 515 ببتيدًا (15 أأ في الطول، متداخلة بمقدار 11 أأ) تغطي بروتين SARS-CoV-2 بواسطة GL Biochem (شنغهاي، الصين) على أساس تسلسل الأحماض الأمينية لـ SARS-CoV -2 سلالة ووهان هو-1. تم ربط الببتيدات مع ألبومين المصل البقري (BSA) باستخدام crosslinker Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تمت إضافة Sulfo-SMCC عند 30-أضعاف المولي الزائدة إلى BSA، متبوعًا بغسيل الكلى إلى PBS. بعد ذلك، تمت إضافة الببتيد المحتوي على السيستين بنسبة 1:1 (وزن / وزن) وتم تحضينه لمدة ساعتين، وتم غسيله أيضًا باستخدام PBS للتخلص من الببتيدات الحرة.

تصنيع ميكروأري الببتيد

لتحضير المصفوفة الببتيدية الدقيقة، وببتيدات SARS-CoV-2، بالإضافة إلى التحكم السلبي (BSA) والضوابط الإيجابية (الأجسام المضادة IgG المضادة للإنسان والأجسام المضادة IgM المضادة للإنسان؛ Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) ، تم تجميدها على شرائح الركيزة PATH (Grace Bio-Labs، Bend، Ore) في ثلاث نسخ باستخدام طابعة Super Marathon (Arrayjet، Edinburgh، Scotland، United Kingdom). ثم تم الحفاظ على المصفوفات الببتيدية الدقيقة عند درجة حرارة 2808 مئوية لمزيد من الاستخدام.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

رسم خرائط الحاتمة المستندة إلى ميكروأري

تم إجراء تحليل المصل القائم على ميكروأري مثل لي وآخرون، 37 مع تعديلات طفيفة. من أجل إنشاء غرف فردية للمصفوفات الفرعية المتطابقة، تم تركيب حشية مطاطية للغرفة 14- على كل شريحة ميكروأري من الببتيد. تم تسخين صفائف الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام، ثم تم حظرها بـ 3٪ BSA في PBS-T لمدة 3 ساعات. تم تخفيف عينات المصل من مرضى COVID-19 أو الأمصال المجمعة من 20 من المتبرعين الأصحاء (مجموعة المراقبة) عند 1:200 في PBS-T لمعظم العينات ثم تم احتضانها مع كل صفيف فرعي لمدة ساعتين عند 48ج. تم غسل المصفوفات باستخدام PBS-T، واحتضانها بـ Cy3- IgG المترافق مع الماعز والمضاد للإنسان وAlexa Fluor 647– IgM المترافق مع الحمير والمضاد للإنسان (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) عند تخفيف 1:1000. كل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة، تم غسل المصفوفات باستخدام PBS-T ثم تجفيفها بالكامل بواسطة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تم فحص المصفوفات باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري LuxScan 10K-A (CapitalBio ، بكين ، الصين) ، وتم الحصول على بيانات كثافة مضان FL وتحليلها بواسطة برنامج GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices، Sunnyvale، Calif).

الشكل 1. الديناميكيات الطولية لاستجابات الأجسام المضادة لدى مرضى فيروس كورونا-19. رسم تخطيطي لتصميم الدراسة. تم تسجيل ما مجموعه 31 فردًا مصابًا بفيروس SARS-CoV-2 و20 متبرعًا صحيًا في الدراسة. تم إجراء جمع عينات المصل طوليًا في نقاط زمنية متعددة لـ 20 مريضًا من بين 31 فردًا مصابًا بـ SARS-CoV-2، بينما تم إجراء أخذ العينات في نقطة زمنية واحدة لـ 11 مريضًا آخرين. يتم سرد عدد المشاركين وعينات المصل المستخدمة في فحوصات مختلفة. B وC، تم اختبار إجمالي 101 عينة مصل من 31 مريضًا بفيروس كورونا بواسطة ELISA بحثًا عن الأجسام المضادة IgG المرتبطة بـ SARS-CoV-2 بروتين N (B) وبروتين S (C) في نقاط زمنية مختلفة. بعد ظهور الأعراض (أيام 1-30، ن 5 37؛ أيام 31-61، ن 5 18؛ أيام 100-150، ن 5 21؛ أيام {{21) }}، ن 5 25). تم تضمين عينات المصل من 20 متبرعا أصحاء كمجموعة مراقبة. تم حساب D، NT50 ضد فيروسات SARS-CoV-2 الزائفة بمرور الوقت من خلال الانحدار غير الخطي. E، يتم عرض توزيع نشاط تحييد المصل لدى مرضى كوفيد-19 في نقاط زمنية محددة بعد ظهور المرض. تم تعريف العينات ذات عيار NT50 أقل من 20 على أنها غير معادلة

تحليل بيانات ميكروأري الببتيد

تم تحليل بيانات IgG وIgM على التوالي. تم تعريف شدة الإشارة لكل بقعة على أنها المقدمة مطروحًا منها الخلفية وبلغ متوسط ​​النقاط الثلاثية لكل ببتيد. تم تعيين قيمة القطع لاستجابة الببتيد الإيجابية لعينات فيروس كورونا -19 على ضعف شدة الإشارة للتحكم في المتبرع السليم. تم تعريف الببتيدات ذات المعدلات الإيجابية التي تزيد عن 80٪ بين العينات التي تم اختبارها في جميع النقاط الزمنية الثلاث لأخذ العينات (الأيام 10-60 و100-150 و180-220 بعد ظهور المرض) على أنها الببتيدات والببتيدات السائدة والمستمرة مع تردد استجابة إيجابي أعلى من 60% في جميع النقاط الزمنية 3-تم اعتباره ثانويًا ومستمرًا. تم حساب متوسط ​​كثافة الإشارة لكل الببتيد في 3 مجموعات زمنية لأخذ العينات؛ تم أيضًا اختيار الببتيدات التي تظهر كثافة إشارة عالية (أعلى من متوسط ​​1 SD لشدة الإشارة لجميع العينات التي تم اختبارها). تم إجراء معالجة البيانات وتحليلها بواسطة برنامج R v3.6.3 (https://www.r-project.org/)، وتم تقييم التغيرات الكبيرة في شدة الإشارة بين مجموعات النقاط الزمنية المختلفة لأخذ العينات بناءً على Limma. واعتبرت الاختلافات مع P <.05 ذات دلالة إحصائية.

تحصين الفأر

تم شراء الفئران الأنثوية BALB / c التي تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 8 أسابيع من شركة Beijing Vitalstar Biotechnology (بكين، الصين). تم إيواء جميع الفئران في مرافق محددة خالية من مسببات الأمراض، وتمت الموافقة على الدراسة على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة لجامعة تيانجين الطبية (تيانجين، الصين). للتحصين، تم حقن مجموعات من الفئران (ن 5 5) عضليا بـ 25 ملغ لكل جرعة من كل ببتيد (الببتيدات 318، 356، 510، و 530 على التوالي) ممزوجة بـ 50 ملغ من الشب (InvivoGen، سان دييغو، كاليفورنيا) و10 ملغ من المواد المساعدة CpG، ويتم تعزيزها مرتين بـ 50 ملغ لكل جرعة من الببتيدات في وجود المواد المساعدة على فترات 2-أسبوعية. كان التطعيم بالمواد المساعدة وحده بمثابة السيطرة السلبية. تم جمع الأمصال من الفئران المحصنة في اليوم 10 أو اليوم 14 بعد التحصين الثاني والثالث.

التحليلات الإحصائية والهيكلية

تم رسم جميع الرسوم البيانية بواسطة GraphPad Prism. تم إجراء المقارنات الإحصائية بين المجموعات في الأشكال 1 و2 و4 بطريقة 1- ANOVA مع مقارنة توكي المتعددة. تم تحديد الارتباطات الموضحة في الشكل 1 والشكل E9 والشكل E10 في المستودع عبر الإنترنت المتاح على www.jacionline.org من خلال تحليل ارتباط بيرسون. واعتبرت الاختلافات مع P <.05 ذات دلالة إحصائية. هياكل البروتين الشوكي لـ SARS-CoV-2 (بنك بيانات البروتين [PDB; http://www.wwpdb.org/] المعرف: 6VXX ومعرف PDB: 6ZGI) ومجال تقليص SARS-CoV{{ 13}} تم استخدام بروتين القفيصة النووية (معرف PDB: 6YUN) لتشريح التفاصيل الهيكلية للحواتم المحددة الموجودة على بروتين السنبلة ومجال تقليص بروتين القفيصة النووية. تم إجراء محاذاة التسلسل وتحليل التماثل بين فيروسات كورونا البشرية المختلفة بواسطة خوارزمية Clustal W في برنامج MEGA v10.1.6.

نتائج

تؤدي عدوى SARS-CoV-2 إلى تحفيز الارتباط المستمر لمستضد محدد وتحييد الأجسام المضادة

لتقييم استجابات الأجسام المضادة طوليًا بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2، تم جمع 101 عينة مصل من 31 فردًا مصاب بعدوى SARS-CoV-2 المؤكدة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1، أ). شمل المشاركون في الدراسة 26 مريضًا يعانون من أعراض متوسطة لمرض كوفيد-19، وواحد يعاني من عرض بدون أعراض، واثنان يعانيان من مرض خفيف، واثنان يعانيان من أعراض حادة (انظر الجدول E1 في المستودع عبر الإنترنت المتوفر على www.jacionline.org). تراوحت أعمار المرضى المسجلين في هذه الدراسة من 17 إلى 66 عامًا (متوسط ​​العمر 45 عامًا)، مع توزيع متساوٍ تقريبًا بين الذكور (51.6%) والإناث (48.4%). وشملت الأعراض الأكثر شيوعًا بين المشاركين في الدراسة الحمى (83.9%)، والسعال (67.7%)، وألم العضلات (22.6%)، والقشعريرة (22.6%)، مع متوسط ​​مدة المرض 15 يومًا. تم جمع إجمالي 90 عينة مصل من 20 مريضًا بفيروس كورونا-19 أثناء العلاج في المستشفى والخروج بعد الشفاء في نقاط زمنية متعددة تصل إلى 219 يومًا بعد ظهور الأعراض (الشكل 1، أ، وانظر الجدول E2 في المستودع عبر الإنترنت). تم إجراء أخذ عينات من المشاركين الـ 11 الآخرين في نقطة زمنية واحدة خلال فترة النقاهة المتأخرة (الأيام 122 إلى 214 بعد ظهور الأعراض). بالإضافة إلى ذلك، تم تضمين عينات من 20 متبرعًا أصحاء مع توزيع مطابق للعمر والجنس كمجموعة مراقبة (الجدول E1). تم قياس كمية الأجسام المضادة IgG الخاصة بمستضد معين في عينات المصل بواسطة ELISA المطلية مسبقًا ببروتين SARS-CoV-2 N أو بروتين S. بالمقارنة مع المتبرعين الأصحاء، تم تطوير كل من الأجسام المضادة لـ N وS IgG في مرضى كوفيد-19 في غضون 30 يومًا بعد ظهور الأعراض، مع متوسط ​​هندسي لعيار نقطة النهاية يبلغ 4.10 (log10 anti-N IgG) و 4.20 (log10 anti-S IgG) (الشكل 1 وB وC؛ وانظر الجدول E3 في المستودع عبر الإنترنت على www.jacionline.org؛ الشكل E1 وA وB؛ والشكل E2)، وذلك بالاتفاق مع الملاحظات السابقة التي تشير إلى أن التحويل المصلي يحدث بعد أسبوع إلى أسبوعين من الإصابة بـ SARS-CoV-2. بعد ذلك، انخفض عيار الأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد بدرجات متفاوتة بمرور الوقت. لوحظ انخفاض سريع وكبير في مستويات الأجسام المضادة لـ N IgG لدى مرضى فيروس كورونا-19، في حين تم الحفاظ على مستويات أعلى من عيارات الأجسام المضادة لـ S IgG لمدة تصل إلى 180 إلى 220 يومًا بعد ظهور المرض مقارنة بالمتبرعين الأصحاء (الشكل 1، ب). ، و ج). كشف تحليل الارتباط عن وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين عيارات log10 المضادة لـ N IgG وعيارات IgG المضادة لـ S (r 5 0.50 وP <.001؛ الشكل 1، F). بالإضافة إلى تحديد كمية الأجسام المضادة الملزمة، تم تحديد ديناميكيات الأجسام المضادة المعادلة الوظيفية لدى الأفراد المصابين بـCOVID-19 بشكل أكبر باستخدام النمط الكاذب لـ SARS-CoV-2. أكثر من 95% من عينات مصل المريض (35/37) التي تم جمعها بين 4 و30 يومًا بعد ظهور الأعراض كان لها أنشطة تحييد قوية ضد السارس-CoV-2، وأظهرت نسبة كبيرة من العينات معتدلة (NT50 80-320) ) إلى نشاط تحييد قوي (NT50> 320) (الشكل 1 وD وE). تجدر الإشارة إلى أنه تم جمع عينتين بدون عيار معادل أو منخفض (NT50 عند الحد الأدنى من تخفيف المصل بنسبة 1:20) في فترة مبكرة بعد العدوى الفيروسية (في اليوم 4 واليوم 11 بعد ظهور الأعراض) قبل استنباط أجسام مضادة قوية تحييد (الشكل 1). 1، د، والشكل E1، ج). على الرغم من انخفاض مستويات الأجسام المضادة المعادلة لـ SARS-CoV-2 لدى مرضى فيروس كورونا-19 بمرور الوقت، فإن معظم عينات مصل المريض (24/25) التي تم الحصول عليها خلال 180 إلى 220 يومًا بعد ظهور الأعراض ظلت إيجابية للتحييد ضد السارس- CoV-2، مع انخفاض قدره 2.8- أضعاف في المتوسط ​​الهندسي لعيار NT50 (الشكل 1 وD وE؛ الجدول E3؛ الشكل E3). كما هو متوقع، بالمقارنة مع الأجسام المضادة IgG المضادة لـ N، تم تحديد علاقة أقوى بين عيارات IgG المرتبطة بـ SARS-CoV-2 S وعيارات الأجسام المضادة المعادلة (r 5 0.61 وP <.001؛ الشكل 1 و G و H)، بما يتوافق مع النتائج التي تفيد بأن بروتين SARS-CoV-2 S هو الهدف الرئيسي لتحييد الأجسام المضادة. يشترك بروتين S الخاص بـ SARS-CoV-2 في تشابه تسلسلي عالي مع SARS-CoV شديد الضراوة (هوية تسلسلية بنسبة 76%) ويظهر تماثلًا منخفض التسلسل لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (هوية تسلسلية بنسبة 34%). تم الإبلاغ عن التفاعل المصلي المتبادل بين فيروسات كورونا؛8,10,28,29 ومع ذلك، تظل البيانات المتعلقة بتقييم المتابعة الطولية للتفاعل المتبادل للأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 تجاه فيروسات كورونا الأخرى محدودة. لقد حددنا الأجسام المضادة المتقاطعة والمتعادلة في الأمصال الطولية من الأفراد المصابين بفيروس SARS-CoV-2}. أظهرت النتائج أن أكثر من 80% من عينات مصل المريض مرتبطة ببروتينات S لفيروس السارس و/أو فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية خلال شهر واحد بعد ظهور الأعراض، مع ظهور تفاعل متقاطع مزدوج في 27% من العينات (الشكل 1، I). امتلك التفاعل مع بروتين SARS-CoV S نسبة أكبر (73%) من MERS-CoV (35%) بين العينات التي تم اختبارها في فترة مبكرة (1-30 يومًا بعد ظهور المرض) (الشكل 1، I). أظهرت الأجسام المضادة للارتباط المزدوج والارتباط المتقاطع لـ SARS-CoV انخفاضًا تدريجيًا مع مرور الوقت، مع 8٪ فقط من الارتباط المتبادل المزدوج و20٪ من عينات الارتباط المتقاطع الفردي لـ SARS-CoV بعد 180 إلى 220 يومًا من ظهور المرض (الشكل 1). ، I؛ في المستودع عبر الإنترنت المتوفر على www.jacionline.org، انظر الشكل E4، A؛ الشكل E5، A؛ والشكل E6 في المستودع عبر الإنترنت لهذه المقالة على www.jacionline.org). ومن المثير للاهتمام أن إيجابية الأجسام المضادة المتفاعلة مع بروتين MERS-CoV S ظلت ثابتة نسبيًا مع مرور الوقت (الشكل 1، I). وبخلاف قدرة الارتباط المتبادل العالية، تم تحييد الفيروسات الزائفة لـ SARS-CoV و/أو MERS-CoV فقط بعدد صغير من عينات مصل المريض (الشكل 1، I؛ الشكل E4، B؛ الشكل E5، B؛ وانظر الشكل E7 في المستودع عبر الإنترنت). ما يقرب من 27% من العينات التي تم جمعها في غضون 1 إلى 30 يومًا بعد ظهور الأعراض أظهرت نشاطًا تحييدًا تبادليًا، وانخفض هذا العدد إلى 20% في 180 إلى 220 يومًا، مع تغييرات أكثر دراماتيكية في نشاط تحييد السارس-CoV (الشكل 1، I). ). نسبة أعلى من عينات فيروس كورونا المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة الشديدة (SARSCoV) مقارنة بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) في غضون 30 يومًا بعد ظهور المرض. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من تشابه نسب العينات التي تظهر تحييدًا تبادليًا لـ SARS-CoV وMERS-CoV، كانت قيم NT50 لـ MERS-CoV أقل بكثير من قيم SARSCoV بين عينات المصل التي كانت إيجابية للتحييد التبادلي (الشكل E4، ب؛ الشكل E5، B؛ الشكل E7).

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

تؤدي عدوى SARS-CoV-2 إلى تنشيط إنتاج السيتوكينات

لتوصيف التغيرات المناعية بشكل شامل بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2، قمنا أيضًا بتقييم التغيرات في ديناميكيات مستويات السيتوكينات في أمصال مرضى فيروس كورونا-19. تم استخدام خمسة وخمسين عينة مصل طولية تم جمعها خلال أول شهرين من ظهور الأعراض للكشف عن إنتاج السيتوكين بواسطة المصفوفة الدقيقة المعتمدة على البروتين. تمت ملاحظة زيادة مستويات مصل السيتوكينات المتعددة خلال الشهر الأول من المرض، بما في ذلك IL-1a (مسبب للالتهابات)، IL-6 (موالي للالتهابات)، و IL-10 (مضاد للالتهابات )، والتي تم ربطها بمتلازمة إطلاق السيتوكين في حالات فيروس كورونا الشديدة-19،39،40 بالإضافة إلى IFN-g (نوع TH1) وIL-4 (نوع TH2) (الشكل 2، أ، والشكل E8 في المستودع عبر الإنترنت المتاح على www.jacionline.org). على وجه التحديد، زادت مستويات IL-6 وIL-10 وIFN-g في المصل خلال 15 يومًا بعد ظهور الأعراض لدى المرضى وانخفضت في المراحل اللاحقة، في حين أن إطلاق IL-1 تبين أن a و IL-4 قد زادا بشكل ملحوظ خلال 16 إلى 30 يومًا من بداية المرض، ثم انخفضا بسرعة إلى الوضع الطبيعي بعد ذلك (الشكل 2، A). أشار تحليل الارتباط إلى وجود ارتباط خطي ضعيف أو معدوم بين استجابات الأجسام المضادة الخاصة بمستضد محدد وإنتاج السيتوكينات بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2، على الرغم من ملاحظة وجود دلالة إحصائية بين مستويات IL-10 وSARS-CoV{{ 34}} الجسم المضاد المرتبط بالبروتين N (r 5 0.321 وP <.05)، بين إنتاج IL-1b والجسم المضاد المرتبط بالبروتين S (r 5 20.335 وP<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

يحدد رسم الحواتم على مستوى البروتين الحواتم السائدة التي تتوسط الاستجابات المناعية الخلطية المستمرة لدى مرضى فيروس كورونا-19

لتوصيف السمات المميزة للمناعة الخلطية لـ SARS-CoV-2 بشكل أفضل بمرور الوقت، قمنا بتطبيق رسم خرائط الحاتمة على مستوى البروتين باستخدام المصفوفات الدقيقة القائمة على الببتيد. تم إنشاء مكتبة الببتيد التي تغطي بروتين SARS-CoV-2 وتثبيتها على شرائح، حيث كان طول كل ببتيد 15 أأ مع تداخل 11 أأ. ما مجموعه 51 عينة مصل طولية من 19 مريضًا يعانون من أعراض إما بدون أعراض (ن 5 1) أو خفيفة (ن 5 2) إلى معتدلة (ن 5 15) أو شديدة (ن 5 1 ) تم اختبار عدوى SARS-CoV-2 (الجدول الأول). لتحقيق أرقام عينات وفواصل ونقاط زمنية متوازنة نسبيًا، تم جمع العينات بشكل تسلسلي عند نقطتين أو ثلاث نقاط زمنية من كل مشارك في فيروس كورونا-19 تتراوح من 16 إلى 219 يومًا بعد ظهور الأعراض. قام غالبية المرضى (18/19) بتوليد أجسام مضادة معادلة بعد الإصابة الفيروسية، باستثناء الفرد الوحيد المصاب بعدوى بدون أعراض (الجدول الأول). وفقًا للنقاط الزمنية المختلفة لأخذ العينات، تم تقسيم العينات إلى 3 مجموعات: الأيام 10-60 (ن 5 18)، والأيام 100-150 (ن 5 18)، والأيام {{28} }} (ن 5 15). تم إجراء تقييم طولي للملفات الأولية لحلقات الفيروس لدى مرضى كوفيد-19 لكل من الأجسام المضادة IgG وIgM في المصل، مع استخدام الأمصال المجمعة من 20 متبرعًا صحيًا كعنصر تحكم سلبي. باستخدام المصفوفة البروتينية الدقيقة لـ SARS-CoV-2، تم تحديد وتحليل حركية استجابات الأجسام المضادة المرتبطة بالببتيد من أجل (1) شدة إشارة الربط، و(2) النسبة المئوية للعينات الإيجابية التفاعلية (المعدل الإيجابي) لكل ببتيد. . استنادًا إلى قيمة القطع للاستجابة الإيجابية لربط الببتيد، والتي تم ضبطها على ضعف شدة الإشارة للتحكم السلبي، حددنا إجمالي 460 ببتيدًا إيجابيًا لـ IgG و479 ببتيدًا إيجابيًا لـ IgM والتي كانت متفاعلة مع مريض واحد على الأقل. عينة المصل. كانت أرقام الببتيد الإيجابية وتوزيع الاستجابات عبر إطارات القراءة المفتوحة المختلفة (ORFs) لـ SARS-CoV-2) مستقرة نسبيًا بين مجموعات أخذ العينات المختلفة، مع وجود اتجاه لانخفاض طفيف في أعداد الببتيد الإيجابية بمرور الوقت (الشكل 3، أ). تم التعرف على أكبر قدر من التفاعل في بروتين النسخ المتماثل ORF1ab، وهو أكبر ORF، ويشمل أكثر من ثلثي الجينوم بأكمله (الشكل 3، أ). ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا درجات معتدلة إلى قوية من الارتباط بين الاستجابات الإيجابية لربط الببتيد ومستويات السيتوكينات في الدم مبكرًا بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 (أيام 10-60 بعد ظهور المرض؛ انظر الشكل E10 في المستودع عبر الإنترنت على www.jacionline.org). تبين أن عدد الببتيدات الملزمة الإيجابية لـ IgM يرتبط بمستويات مصل IL-6 و IL-10؛ وبالمثل، فإن متوسط ​​شدة الإشارة لإجمالي الببتيدات التفاعلية وببتيدات ربط ORF1ab لـ IgM قدمت ارتباطات إيجابية مع إنتاج IL-6 وIFN-g في عينات المصل. تشير هذه البيانات إلى أن التغيرات في مستويات السيتوكينات بعد الإصابة بـ SARS-CoV-2 قد تؤثر على حجم واتساع الحواتم التي تتعرف عليها الاستجابات الخلطية الخاصة بمستضد معين. استنادًا إلى تحديد الحواتم الإيجابية، اخترنا أيضًا الحواتم الأكثر شيوعًا والتي ظلت متفاعلة باستمرار في أكثر من 80% من عينات فيروس كورونا-19 بين كل مجموعة من مجموعات العينات الثلاث (تسمى الحواتم السائدة والمستمرة). كشفت النتائج أن هذه الحواتم المهيمنة للغاية والقادرة على التوسط في الاستجابات المناعية الخلطية طويلة المدى كانت موجودة في بروتين SARS-CoV-2 ORF1ab متعدد البروتينات وبروتين S، مع وجود عدد أكبر من الحواتم التي تتعرف عليها الأجسام المضادة IgM (n 5 33) أكثر من الأجسام المضادة IgG (n 5 10) (الشكل 3 وB والجدول II؛ انظر الشكل E11 والشكل E12 في المستودع عبر الإنترنت على www.jacionline.org). يمتلك بروتين ORF1ab الحد الأقصى لعدد الحواتم المهيمنة التي تتوسط الاستجابات طويلة المدى، وتم توزيع الحواتم على نطاق واسع على مناطق البروتينات غير الهيكلية (nbsp) 2-5، nbsp 8-10، nbsp 12-14، ونبسب 16 (الجدول الثاني). على وجه الخصوص، حددنا حلقة واحدة مهيمنة مناعية، 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815)، والتي يمكن التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة IgG وIgM من 100% من مرضى فيروس كورونا-19، بغض النظر عن النقاط الزمنية لأخذ عينات المصل (الشكل 3، ب، والجدول 2؛ انظر الشكل E13 والشكل E14 في المستودع عبر الإنترنت). يقع هذا الببتيد عالي التفاعل داخل منطقة الهليكاز (nsp 13) من بروتين ORF1ab، وهو أمر ضروري لتفكيك قوالب الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل أثناء تكاثر SARS-CoV-2. 41 من بين الببتيدات المختارة لـ ORF1ab، 2 ببتيد مسيطر مناعي. مع أعلى متوسط ​​لشدة الإشارة التي تتعرف عليها الأجسام المضادة IgG، الرقم 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) والرقم 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815)، كلاهما موجودان على nsp 13. بالنسبة لاستجابات IgM، الببتيد 685 (ORF1ab, aa 249-263) على nsp 2 والببتيد 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) على nsp 13 قدم أقوى شدة الارتباط (الشكل 3، ب). بالنظر إلى التباين في إشارات خط الأساس (الأمصال المجمعة من المتبرعين الأصحاء) للببتيدات المختلفة (الشكل 3، ب)، قمنا أيضًا بحساب التغيرات الطية في شدة الإشارة فيما يتعلق بكل ببتيد رئيسي، بالنسبة إلى مجموعة التحكم الصحية. أظهرت النتائج أن الببتيد 2073 (ارتباط IgG) والببتيد 1985 (ارتباط IgM) الموجود في منطقة nsp 13 حافظا على أعلى شدة ربط الببتيد (تغير الطية) بين أمصال المريض التي تم جمعها حتى 180 إلى 220 يومًا (الشكل E13 والشكل E14).

الشكل 2. حركية إنتاج السيتوكينات لدى مرضى فيروس كورونا-19. أ، تم الكشف عن مستويات إنتاج السيتوكين في 55 عينة مصل تم جمعها من 16 مريضًا بـCOVID-19 خلال المرحلة الحادة والمرحلة المبكرة من النقاهة بواسطة ELISA القائم على البروتين المصفوفة الدقيقة (الأيام 1-15، n 5 11؛ أيام 16-30، ن 5 26؛ أيام 31-61، ن 5 18؛ متبرعين أصحاء، ن 5 20). تمثل كل نقطة عينة مصل فردية؛ الخطوط المنقطة تشير إلى حد الكشف. تم تحديد الأهمية الإحصائية بواسطة 1-طريقة ANOVA مع مقارنات Tukey المتعددة. *P <.05، **P <.01، و ****P <.0001. ب، التغير الطي في كل مستوى من مستويات إنتاج السيتوكين لدى مرضى كوفيد-19 الموضح في (أ) مقارنة بالقيم المتوسطة لـ 20 عينة من متبرعين أصحاء. يشير كل عمود إلى عينة مصل مميزة تم جمعها من نقاط زمنية محددة بعد ظهور الأعراض؛ يمثل كل صف سيتوكينًا واحدًا تم اختباره.

الجدول الأول. خصائص مرضى فيروس كورونا-19 ومجموعات العينات في رسم خرائط الحاتمة

الشكل 3. التعرف على IgM وIgG للحواتم السائدة التي تساهم في استجابات الأجسام المضادة طويلة المدى لدى الأفراد المصابين بـ SARS-CoV-2. التحليل الطولي للتعرف على الحواتم المصلية لدى 19 فردًا مصابًا بـCOVID-19 باستخدام مصفوفة ببتيدية دقيقة تغطي بروتين SARS-CoV-2. تم تعيين قيمة القطع للاستجابة الإيجابية لربط الببتيد في عينات المرضى (ن 5 51) ​​على ضعف شدة إشارة الأمصال المجمعة من 20 متبرعًا صحيًا. أ، تعداد الببتيد وتوزيع الببتيدات الملزمة الإيجابية التي يمكن اكتشافها في عينة واحدة أو أكثر تم جمعها في 10-60 يوم (ن 5 18)، 100-150 يوم (ن 5 18)، و180- 220 يومًا (ن 5 15) بعد ظهور المرض. تشير الأرقام إلى إجمالي حلقات IgG وIgM المحددة من كل ORF. B، شدة الإشارة لحواتم IgG وIgM السائدة والمستمرة (المحور السيني) والتي كانت متفاعلة بشكل مستدام في أكثر من 80% من العينات خلال جميع النقاط الزمنية الثلاث لأخذ العينات. تشير كل نقطة إلى الأمصال المجمعة من متبرعين أصحاء (أعلى) أو عينة مصل مريض متميزة تم جمعها من نقاط زمنية محددة بعد ظهور الأعراض. E، البروتين المغلف.

TABLE II. Epitopes with >معدل إيجابي 80% في جميع النقاط الزمنية الثلاث لأخذ العينات

توجد الحواتم المهيمنة والمستمرة لبروتين SARS-CoV-2 S في وحدتي NTD وS2

تم تحديد إجمالي 4 حواتم سائدة ومستمرة من بروتين SARSCoV-2 S: الببتيد 318 (S, aa 45-59) والببتيد 356 (S, aa 197-211)، والتي تقع داخل منطقة NTD؛ الببتيد 510 (S, aa 813-827)، الذي يغطي موقع الانقسام S2 وأجزاء من الوحدة الفرعية FP لـ S2، والببتيد 530 (S, aa 893-907)، الموجود في منطقة الاتصال بين FP ومنطقة تكرار heptad الأولى للوحدة الفرعية S2 (الشكل 3 وB والجدول II). من بين هذه الببتيدات الرئيسية لبروتين S التي اخترناها، يمتلك الببتيد 318، الموجود في NTD لبروتين S، أقوى كثافة ربط (تغير الطية بالنسبة للتحكم؛ الشكل E13 والشكل E14). وكشفت التحليلات الهيكلية أن هذه الحواتم مكشوفة بالكامل على سطح بروتين S المونومري؛ ومع ذلك، فإن بعض بقايا الحواتم للببتيدات 318 و356 و530 مخفية تحت سطح بروتين S الثلاثي (الشكل 4، A وB)، مما يشير إلى أنه يتم التعرف على كل من مونومر S وهياكل القطع بكفاءة بواسطة الجهاز المناعي المضيف في ظل ظروف معينة. ظروف. على وجه التحديد، تم الكشف عن قطعتين من الببتيد 318 (aa 45-46 و aa 56-59) على بروتين S الثلاثي، مع دفن الشريط b المركزي بالداخل؛ ويمكن الوصول إلى معظم بقايا الببتيد 356 على السطح، بما في ذلك حبلا b الأساسي (aa 203-209) وقطعة الحلقة (aa 210-211). يحتوي الببتيد 510 على موقع انقسام S2 وحلزون مركزي لـ FP، وكلاهما موجود بالكامل على سطح بروتين S؛ تكون بقايا الببتيد 530 غامضة في الغالب، مع وجود جزء صغير فقط من الحلقة (aa 893-895) مكشوفًا على بروتين S الثلاثي (الشكل 4، C). كشف تحليل التماثل التسلسلي بين 7 فيروسات تاجية بشرية شائعة أن حلقتين موجودتين في الوحدة الفرعية S2 (الببتيدات 510 و530) تشتركان في هوية تسلسلية عالية مع فيروسات تاجية أخرى، مما يشير إلى تفاعل مصلي متقاطع يستهدف هذه الحواتم بين فيروسات كورونا البشرية (الشكل 4، د). أظهر تسلسل الببتيد 318 تشابهًا كبيرًا مع SARSCoV، في حين ظهر مستوى منخفض من التماثل التسلسلي للببتيد 356 بين الفيروسات التاجية، مما يشير إلى استجابات الأجسام المضادة المحددة لـ SARS-CoV-2 والتي تستهدف هذه المنطقة (الشكل 4، د). بالنظر إلى متغيرات SARS-CoV-2 الجديدة الناشئة والمنتشرة عالميًا، أجرينا أيضًا محاذاة التسلسل فيما يتعلق بالحواتم الرئيسية لبروتين S بين سلالة SARS-CoV-2 المبكرة (Wuhan-Hu{{52} }) و5 متغيرات مثيرة للقلق (Alpha وBeta وGamma وDelta وOmicron)، بالإضافة إلى متغيرين مثيرين للاهتمام (Lambda وMu)، وفقًا لتصنيف منظمة الصحة العالمية للفيروسات المتنوعة (تم التحديث في 30 نوفمبر 2021). ). أظهرت النتائج أن تسلسل هذه الحواتم السائدة والمستمرة متطابق تقريبًا بين المتغيرات التي تم تحليلها، باستثناء طفرة N211I واحدة تم تحديدها في متغير Omicron الجديد (الشكل 4، E). تشير هذه البيانات إلى أن الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها بواسطة سلالات SARS-CoV-2 المبكرة قد تتعرف باستمرار على المتغيرات الحالية المنتشرة وأن هذه الحواتم المهيمنة قد تكون قادرة على التوسط في استجابات طويلة الأمد للأجسام المضادة عند الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 المتغيرات. لمزيد من تحديد الخصائص المناعية للحواتم المحددة على بروتين S، ولمواصلة التحقيق في القيمة المحتملة لهذه الحواتم من بروتين S كمرشحين للقاح الببتيد، أجرينا دراسة تحصين الفئران باستخدام الببتيدات المختارة. تم تلقيح الفئران BALB/c 3 مرات بكل ببتيد في وجود الشبة والمواد المساعدة CpG (الشكل 4، F). من بين الببتيدات الأربعة المختارة، أدى التطعيم بالببتيد 356 إلى ظهور أجسام مضادة خاصة بمستضد بعد الجرعتين الثانية والثالثة (الشكل 4، G). كشفت نتائج اختبار تحييد المصل أن التحصين بالببتيدات الخطية لم يولد مستويات كبيرة من الأجسام المضادة المعادلة ضد السارس-CoV-2 (الشكل 4، ح)، مما يشير إلى أن أداء هذه الببتيدات الخطية ضعيف في تحفيز استجابات الأجسام المضادة المعادلة القوية.

يفتقر بروتين N الخاص بـ SARS-CoV-2 إلى معظم الحواتم التفاعلية التي تتوسط استجابات الأجسام المضادة الدائمة بعد العدوى الفيروسية

أوضح عدد من الدراسات القدرة الفعالة لبروتين SARS-CoV-2 N.4,11,12 ومع ذلك، فشلنا في تحديد الحواتم السائدة والمستمرة الموجودة في البروتين N على أساس معايير الاختيار الحالية (أعلى من 80% معدل إيجابي في جميع النقاط الزمنية الثلاث لأخذ العينات). من أجل التقييم الطولي لملامح الحاتمة لبروتين N لدى الأفراد المصابين بـCOVID-19، أجرينا جولة ثانية من فحص الحاتمة التي تعتمد على البيانات التي تم الحصول عليها من المصفوفة الدقيقة للببتيد لاختيار الحواتم الفرعية التي ظلت تفاعلًا إيجابيًا باستمرار في أكثر من 60% من عينات فيروس كورونا-19 لكل نقطة من النقاط الزمنية الثلاث لأخذ العينات (تسمى الحواتم الفرعية السائدة والمستمرة). تم تحديد ما مجموعه 4 حلقات فرعية ومستمرة من بروتين SARS-CoV-2 N، من بينها الببتيد 2455 (N, aa 213-227) الذي أظهر تفاعلًا مع كل من الأجسام المضادة IgG وIgM في فيروس كورونا{{16 }} المرضى، مع مستويات أعلى نسبيًا من شدة الإشارة (الشكل 5، A وB، وانظر الجدول E4 في المستودع عبر الإنترنت على www.jacionline.org). يوجد الببتيدان المتداخلان، الببتيد 2455 (N، aa 213-227) والببتيد 2456 (N، aa 217-231)، في منطقة الوصلة الغنية بـ Ser/Arg بين مجال ربط RNA للمحطة N ومجال تقليص الطرف C للبروتين N. يقع الببتيد 2482 (N، aa 321-335) والببتيد 2491 (N، aa 357-371) بشكل كامل أو جزئي داخل مجال تقليص البروتين N (الجدول E4). نظرًا لعدم وجود 3- هياكل D فيما يتعلق بالتشكل السليم لبروتين N، فقد أجرينا فقط تحليلات هيكلية لحلقتين محددتين على البنية الخافتة لمجال تقليص حجم الطرف C. تشكل بقايا الببتيد 2482 خيوط 2 b التي يتم ترتيبها بطريقة غير متوازية في واجهات dimerization، في حين تشكل aa 357-364 من الببتيد 2491 هياكل قائمة على الحلزون والتي تقع على طرفي نقيض من dimer (الشكل 5، C) . كشفت محاذاة التسلسل بين SARS-CoV-2 المبكر (سلالة Wuhan-Hu-1) و7 متغيرات ناشئة أيضًا أن تسلسل هذه الحواتم الفرعية السائدة والمستمرة في بروتين N متطابق تقريبًا بين المتغيرات المتداولة الحالية، مع وجود يحدث استبدال G215C واحد للببتيد 2455 في متغير دلتا وطفرة G214C واحدة من الببتيد 2455 تم تحديدها في متغير Lambda، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة التي تستهدف هذه الببتيدات من المحتمل أن تتعرف على مستضد متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة (الشكل 5، د) ).

الشكل 4. الحواتم المهيمنة لـ SARS-CoV-2 البروتين الشوكي من حيث التوسط في الاستجابات المناعية الخلطية الدائمة. A و B، مواقع الحواتم السائدة والمستمرة على 3- الهياكل D للبروتين الأحادي (A) والتريميري (B) S (معرف PDB: 6VXX). يتم تمييز الحواتم باللون الأخضر (الببتيد 356، أأ 197-211)، والأحمر (الببتيد 318، أأ 45-59)، والأزرق (الببتيد 510، أأ 813-827)، والأرجواني (الببتيد 530، أأ 893-907)، على التوالي. تم تصوير مونومرات S الثلاثة ذات الشكل المغلق باللون الرمادي والوردي والسماوي على التوالي. C، تحليل هيكلي تفصيلي للحواتم السائدة في بروتين SARS-CoV-2 S في الحالة المغلقة للقاطع S (معرف PDB: 6VXX). د، محاذاة تسلسل الحواتم المحددة بين فيروسات كورونا البشرية الشائعة. بقايا الحاتمة المحفوظة بين SARS-CoV-2 والفيروسات التاجية البشرية الأخرى مظللة باللون الرمادي. E، تحليل حفظ الحاتمة لفيروس SARS-CoV المبكر -2 (سلالة Wuhan-Hu-1) و7 متغيرات ناشئة. تمثل النقاط السوداء بقايا متطابقة بين سلالة Wuhan-Hu-1 والمشار إليها.

الشكل 5. الحواتم الفرعية الموجودة في بروتين القفيصة النووية SARS-CoV-2 قادرة على التوسط في استجابات الأجسام المضادة المستمرة. ترددات التعرف على A وIgG وIgM للببتيدات السائدة (متفاعلة بشكل دائم في أكثر من 60٪ من العينات) بين عينات مصل المريض التي تم جمعها في نقاط زمنية متعددة بعد ظهور المرض. ب، حركية شدة الإشارة للحواتم الفرعية المحددة مع مرور الوقت. تمثل كل نقطة عينة مميزة من مصل المريض تم الحصول عليها من مرضى فيروس كورونا -19 في نقاط زمنية محددة بعد ظهور الأعراض. تشير الخطوط الأفقية المنقطة إلى قيم القطع للاستجابة الإيجابية لكل الببتيد. C، تحليل هيكلي مفصل للحلقات في مجال تقليص حجم الطرف C لبروتين N (معرف PDB: 6YUN). يتم تمييز الحواتم باللون الأزرق (الببتيد 2482، أأ 321-335) ​​والبني (الببتيد 2491، أأ 357-364). تم تصوير الهيكلين الأحاديين باللون الرمادي والسماوي على التوالي. D، تحليل محاذاة التسلسل لحلقات البروتين N المحددة بين فيروس السارس المبكر -2 (سلالة Wuhan-Hu-1) و7 متغيرات ناشئة. تشير النقاط السوداء إلى تسلسلات متطابقة بين سلالة Wuhan-Hu-1 والمتغير المشار إليه. يتم تمييز التغييرات في تسلسل الأحماض الأمينية باللون الأحمر.

الشكل 6. الحواتم الخطية ذات كثافة الارتباط العالية وانخفاض الترددات التفاعلية مع مرور الوقت، والتي يتعرف عليها الأفراد المصابون بـ SARS-CoV-2. A و B، التحليل الطولي وتوزيع الببتيدات المحددة التي تظهر كثافة إشارة ربط عالية (أعلى من متوسط ​​1 SD لشدة الإشارة لجميع العينات التي تم اختبارها) ولكن انخفاض المعدل الإيجابي مع مرور الوقت. تم رسم تردد التعرف (A) وشدة الإشارة (B) للحلقات مع 3 نقاط زمنية لأخذ العينات بعد ظهور الأعراض. كل نقطة في (ب) تمثل عينة مصل المريض الفردية التي تم جمعها في نقاط زمنية محددة بعد ظهور الأعراض؛ تشير الخطوط الأفقية المنقطة إلى قيم القطع الإيجابية لكل الببتيد. تم إجراء تحليل الدلالة الإحصائية بناءً على برنامج Limma of R v3.6.3. *ف <.05 و **ف <.01. C، مقارنات الموقع والتسلسل بين حلقتين متجاورتين، الببتيد 510 (السائد والمستمر) والببتيد 511 (كثافة الإشارة العالية والإيجابية المتناقصة بمرور الوقت)، على بنية بروتين SARS-CoV-2 S (معرف PDB: 6ZGI) . يتم تمييز المناطق المتداخلة بين الحواتم 2 باللون الأخضر؛ يتم تمييز التسلسلات الفريدة باللون الأحمر والأزرق.

يحدد التحليل المصلي الطولي الحواتم ذات كثافة الإشارة العالية ولكن التفاعل يتناقص مع مرور الوقت

بالإضافة إلى الحواتم المختارة شديدة التفاعل والمسؤولة عن الاستجابات المناعية الخلطية المستمرة المذكورة أعلاه، قمنا أيضًا بتحديد ووصف لوحة مكونة من 9 ببتيدات إيجابية أظهرت شدة ربط قوية (أعلى من متوسط ​​1 SD لشدة الإشارة لجميع العينات التي تم اختبارها) مع اتجاه انخفاض التفاعل (تغيرات المعدل الإيجابي فوق 20%) بين عينات المصل من مرضى كوفيد-19 بمرور الوقت، وفقًا للاتجاه العام للتراجع في الاستجابات المناعية الخلطية. يتم وضع هذه الحواتم داخل المستضدات الثلاثة السائدة: بروتينات ORF1ab وS وN (الشكل 6، A؛ وانظر الجدول E5 في المستودع عبر الإنترنت على www.jacionline.org). بالإضافة إلى ذلك، لوحظت انخفاضات كبيرة في شدة الإشارة لأربعة ببتيدات من ORF1ab (الببتيدات 784-IgG و1617-IgM و1986-IgM) وبروتينات N (الببتيد 2457-IgG). بين العينات من فترة مبكرة من النقاط الزمنية لأخذ العينات (الأيام 10-60 بعد ظهور المرض) والمرحلة اللاحقة من النقاط الزمنية لأخذ العينات (الأيام 100-150 أو الأيام 180-220 بعد ظهور الأعراض) (الشكل 6) ، ب). بشكل ملحوظ، على الرغم من التداخل إلى حد كبير مع بعضها البعض، 2 الببتيدات من الببتيد البروتين S 510 (المهيمنة والمستمرة؛ الشكل 3، ب) والببتيد 511 (كثافة الإشارة العالية وانخفاض المعدل الإيجابي مع مرور الوقت؛ الشكل 6، أ) أظهرت أنماط مختلفة من التفاعل بين عينات مصل المريض مع مرور الوقت. أشار تحليل التسلسل والموقع إلى أن الببتيد 510 يحتوي على موقع انقسام S2' وأحماض أمينية إضافية من 813-SKRS-816، في حين أن الببتيد 511 موجود بالكامل داخل FP مع 828-LADA{{29) ممتد }} البقايا المكشوفة بالكامل على سطح بروتين S الثلاثي (الشكل 6، C). كشفت هذه النتائج عن ميزات جديدة للحواتم التي قد تساهم في نهاية المطاف في مناعة خلطية أقوى وأطول أمدًا ضد السارس-CoV-2.

مناقشة

يعد التوصيف المنهجي للاستجابات المناعية طويلة المدى لعدوى SARS-CoV-2 أمرًا بالغ الأهمية لتطوير التشخيص المحسن والتدخلات العلاجية الفعالة واللقاحات. في الدراسة الحالية، أجرينا تحليلًا طوليًا شاملاً لمرضى كوفيد-19 على مدى 180 إلى 220 يومًا من المتابعة، وأظهرنا استجابات مناعية خلطية مستمرة وإنتاج السيتوكينات المنشط بعد العدوى الفيروسية.

بشكل ملحوظ، من خلال الاستفادة من المصفوفة الدقيقة القائمة على الببتيد والتي تمتد لبروتين SARS-CoV-2، كشفنا أيضًا عن حركية التعرف على الحاتمة وحددنا لوحة من الحواتم المهيمنة القادرة على التوسط في المناعة الخلطية طويلة المدى. تؤكد النتائج التي أبلغنا عنها هنا فيما يتعلق بطول عمر الاستجابات المناعية الخلطية بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 بعض البيانات المنشورة مسبقًا 5،10،12،13،42 ولكنها تعمل على توسيعها عن طريق إجراء التنميط المصلي العميق وفحص الحاتمة باستخدام عينات المصل الطولية من الأفراد المصابين بفيروس كورونا-19 من خلال منهج المصفوفة الدقيقة على مستوى البروتين. في هذه الدراسة، حددنا 4 حواتم سائدة (الببتيدات 318 و356 و510 و530) داخل بروتين SARS-CoV-2 S الذي كان قادرًا على التفاعل باستمرار مع أكثر من 80% من مرضى فيروس كورونا-19 تم اختبار العينات، لمدة تصل إلى 180 إلى 220 يومًا بعد ظهور الأعراض. الببتيد 510 (S, aa 813-827)، الذي يشتمل على موقع الانقسام S2 وFP للوحدة الفرعية S2، تم تحديده بشكل شائع في الدراسات السابقة لمجموعات أخرى. 26،28، 32-34 أشارت التحليلات الوظيفية إلى الأجسام المضادة قد يُظهر استهداف هذه المنطقة قوة تحييد محدودة ضد السارس-CoV-226،33 على الرغم من تعرضه بدرجة عالية على سطح بروتين S (الشكل 4، AC). في حالة الببتيد 530 (S, aa 893-907)، الذي يتم وضعه بين FP ومنطقة تكرار السباعية الأولى للوحدة الفرعية S2، يتم دفن البقايا عمومًا داخل البنية الثلاثية لبروتين S، مما يجعله يصعب الوصول إليه عبر أجسام مضادة قوية تحييد ضد السارس-CoV-2 (الشكل 4، AC). بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا اختيار 2 من الببتيدات الموجهة S1- NTD والتي يمكن أن تتوسط استجابات الأجسام المضادة طويلة المدى لـ SARS-CoV-2. أشارت التحليلات المتعلقة بتسلسل الببتيد وموقعه إلى أن بقايا هذين الببتيدين - الببتيد 318 (S, aa 45-59) والببتيد 356 (S, aa 197-211) - على مقربة من الحواتم المبلغ عنها والتي تم التعرف عليها بواسطة الأجسام المضادة المعززة للعدوى ولكن بصرف النظر عن المواقع الرئيسية للأجسام المضادة المعادلة القوية للغاية التي تستهدف NTD للوحدة الفرعية S1، 16،19،43 مما يشير إلى إمكانية التعرف على الحاتمة بواسطة الأجسام المضادة غير المحايدة تجاه هذين الببتيدات المحددة. بالإضافة إلى التفاصيل المذكورة أعلاه، أشار تحصين الفأر باستخدام الببتيدات المختارة أيضًا إلى الفعالية المنخفضة لهذه الببتيدات الخطية ذات المجال غير المرتبط بالمستقبلات في إحداث استجابات قوية للأجسام المضادة المعادلة (الشكل 4، G). بشكل جماعي، تشير هذه البيانات إلى أن الحواتم الخطية السائدة التي تتوسط الاستجابات المناعية الخلطية طويلة المدى على عدوى السارس-CoV-2 ربما تحفز الأجسام المضادة مع عدم وجود فعالية تحييد أو محدودة. إن الفهم الكامل للمشهد الحاتمي للأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2، وخاصة الحواتم الموجهة من بروتين S، يوفر رؤية جديدة للتشريح الوظيفي للأجسام المضادة، مما يسهل أيضًا تصميم اللقاح المبتكر والعقلاني. تمنح الأجسام المضادة المحايدة الحماية للقضاء على العدوى الفيروسية، في حين أن الأجسام المضادة غير المحايدة قد تلعب دورًا مفيدًا أو محايدًا أو حتى ضارًا أثناء إزالة الفيروس. توفر الأجسام المضادة غير المعادلة حماية إضافية في الجسم الحي عبر مجموعة من وظائف المستجيب بوساطة Fc في سياق البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة والسمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة. في المقابل، اقترحت بعض الدراسات إمكانية وجود دور إمراضي للأجسام المضادة غير المعادلة في الإصابة بفيروس كورونا. لاحظت الدراسات السابقة التي استخدمت أنواعًا متعددة من اللقاحات المرشحة لـ SARS-CoV وMERS-CoV أمراضًا مناعية معززة في الحيوانات الصغيرة المحصنة والرئيسيات غير البشرية بعد تحدي الفيروس.24، 44-50 في الآونة الأخيرة، أفادت دراسات لمجموعتين أن اللقاحات غير المعادلة كانت الأجسام المضادة التي تستهدف NTD لبروتين SARS-CoV-2 S قادرة على تعزيز العدوى الفيروسية في المختبر من خلال آليات مستقلة عن مستقبلات Fcg،23،25 على الرغم من أن الأجسام المضادة المعززة للعدوى التي يتم تناولها بشكل سلبي في النماذج الحيوانية أثبتت أنها وقائية ضد السارس -عدوى CoV-2 في الجسم الحي. وبالنظر إلى الأدوار المثيرة للجدل للأجسام المضادة أثناء الإصابة بفيروس كورونا، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات للتحقق من صحة الدور المحتمل للأجسام المضادة في التعرف على هذه الحواتم السائدة والمستمرة في مكافحة العدوى الفيروسية في الجسم الحي. يمكن تصور المرحلة التالية من تصميم اللقاح العقلاني لـ SARS-CoV-2 من خلال استنباط أجسام مضادة معادلة قوية للغاية وأجسام مضادة وقائية غير معادلة، إلى جانب تقليل ظهور الحواتم المعززة للعدوى أو الحواتم المسيطرة مناعيًا التي لا تحتوي على آثار مفيدة. على الرغم من أن عددًا من الدراسات السابقة ركزت فقط على بروتين S لـ SARS-CoV-2 بهدف تحديد وظائف الجسم المضاد فيما يتعلق بالتحييد، فقد أجرينا رسم خرائط شامل للحواتم على مستوى البروتين وحددنا لوحة من الحواتم داخل بروتين ORF1ab الذي تم التعرف عليه باستمرار من خلال نسبة عالية من عينات مصل المريض مع مرور الوقت. على الرغم من أن هذه الببتيدات الموجهة بواسطة ORF1ab الموزعة على البروتينات غير الهيكلية المتعددة قد لا تثير أجسامًا مضادة وظيفية تستهدف فيروس SARS-CoV-2، إلا أنها يمكن تطبيقها كأداة تشخيصية للمساعدة في التمييز بين العدوى الطبيعية والتطعيم. مع تزايد عدد متلقي اللقاح في جميع أنحاء العالم، تواجه الاختبارات المصلية الحالية المستندة إلى بروتين S وبروتين N تحديات باعتبارها طريقة فعالة لمساعدة الاختبارات الجزيئية للكشف عن عدوى السارس-CoV-2، وكذلك للكشف عن عدوى فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV){99}} تحديد الحالة المناعية بعد الإصابة الفيروسية. من خلال الاستفادة من الببتيدات الأكثر شيوعًا والمستمرة التفاعل داخل ORF1ab بين الأفراد المصابين بكوفيد{101}}، سيتم إجراء التشخيص المصلي للعدوى الطبيعية دون مراعاة حالة التطعيم التي تتضمن بروتين S المستند إلى مجال ربط المستقبل. نهج اللقاحات القائمة على الفيروسات والمعطلة. هناك حاجة لدراسات مستقبلية لتقييم تفاعل وحساسية وخصوصية ببتيدات ORF1ab المحددة في مجموعات أكبر تضم الأفراد المصابين بفيروس SARSCoV-2 ومتلقي اللقاح. بالإضافة إلى ذلك، ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التقييم لكفاءة الكشف من خلال استراتيجيات تركيبة الببتيد المتعددة للتغلب على الحساسية المنخفضة للببتيدات مقارنة بالبروتين كامل الطول والتفاعل المتبادل المحتمل بين فيروسات كورونا البشرية الشائعة. تتمثل القيود الرئيسية لدراستنا في العينات القليلة نسبيًا التي تم الحصول عليها من مجموعة صغيرة من المرضى، وكان غالبية المشاركين يعانون من أمراض{106} غير خطيرة بسبب فيروس كورونا. قد يحد هذا من بعض استنتاجاتنا فيما يتعلق بتكرار الاستجابة الإيجابية وحجم الاستجابات المناعية، والتي قد تختلف وفقًا لشدة المرض. ومع ذلك، فإن البيانات المقدمة في هذه الدراسة توفر رؤى قيمة حول حركية الاستجابات المناعية مع مرور الوقت بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 وميزات الحواتم السائدة القادرة على التوسط في المناعة الخلطية المستدامة لدى الأفراد المصابين بفيروس كورونا-19. تقدم هذه النتائج معًا فهمًا أعمق لطول عمر المناعة الطبيعية الناجمة عن العدوى الفيروسية، ولها آثار واسعة النطاق على استراتيجيات التطعيم المبتكرة وأساليب التشخيص المحسنة.

مراجع

1. لو آر، تشاو إكس، لي جي، نيو بي، يانغ بي، وو إتش، وآخرون. التوصيف الجيني وعلم الأوبئة لفيروس كورونا الجديد لعام 2019: الآثار المترتبة على أصول الفيروس وربط المستقبلات. لانسيت 2020;395:565-74.

2. منظمة الصحة العالمية. لوحة معلومات فيروس كورونا (COVID-19) لمنظمة الصحة العالمية، 2021. متاحة على: https://COVID19.who.int/. تم الوصول إليه في 30 نوفمبر 2021.

3. وو زي، ماكجوجان جي إم. خصائص تفشي مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) في الصين والدروس المهمة المستفادة منها: ملخص تقرير عن 72314 حالة من المركز الصيني لمكافحة الأمراض والوقاية منها. جاما 2020;323:1239-42.

4. ريديزنسكي مودرباخر سي، راميريز سي، دان جي إم، غريفوني إيه، هاستي كم، فايسكوبف دي، وآخرون. المناعة التكيفية الخاصة بالمستضد ضد السارس-CoV-2 في حالات الإصابة بفيروس كورونا الحاد-19 والارتباطات بالعمر وشدة المرض. خلية 2020;183:996-1012.e19.

5. وو جي، ليانغ بي، تشن سي، وانغ إتش، فانغ واي، شين إس، وآخرون. تؤدي عدوى SARS-CoV-2 إلى استجابات مناعية خلطية مستمرة لدى المرضى المتعافين بعد ظهور أعراض فيروس كورونا-19. نات كومون 2021؛12:1813.

6. لونغ كيو إكس، ليو بي زد، دينغ إتش جيه، وو جي سي، دينغ كيه، تشن واي كيه، وآخرون. استجابات الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 في المرضى المصابين بـCOVID-19. نات ميد 2020;26:845-8.

7. ستيرلين د، ماتيان أ، ميارا إم، موهر أ، آنا إف، كلير إل، وآخرون. يهيمن IgA على استجابة الجسم المضاد المعادلة المبكرة لـ SARS-CoV-2. ساي ترانس ميد 202؛13: eabd2223.

8. تشانغ جيه، وو كيو، وليو زي، ووانغ كيو، وو جي، وهو هو واي، وآخرون. الخلايا التائية المساعدة الجرابية المنتشرة والمحددة واستجابات الأجسام المضادة المعادلة لدى الأشخاص المتعافين من فيروس كورونا-19. نات ميكروبيول 2021;6:51-8.

9. وانغ بي، ليو إل، ناير إم إس، يين إم تي، لوه واي، وانغ كيو، وآخرون. تعد استجابات الأجسام المضادة المعادلة لـ SARS-CoV-2 أكثر قوة في المرضى الذين يعانون من مرض شديد. الميكروبات الناشئة تصيب 2020;9:2091-3.

10. فانشيلا كيه، دي كريستانزيانو في، كليباس إف، ديوالد إف، شومرز بي، جيسيلمان إل، وآخرون. حركية وارتباطات استجابة الجسم المضاد المعادل لعدوى SARSCoV-2 في البشر. ميكروب مضيف الخلية 2021;29:917-29.e4.

11. شيانغ تي، ليانغ بي، فانغ واي، لو إس، لي إس، وانغ إتش، وآخرون. انخفاض مستويات الأجسام المضادة المعادلة ضد SARS-CoV-2 في مرضى فيروس كورونا المتعافين-19 بعد عام واحد من ظهور الأعراض. فرونت إيمونول 2021;12:708523.

12. وانغ زي، ميكش إف، شيفر-باباجيو دي، فينكين إس، فيانت سي، غابلر سي، وآخرون. تم تعزيز نطاق التعادل بشكل طبيعي ضد السارس-CoV-2 بعد عام واحد من الإصابة. طبيعة 2021;595:426-31.

13. دان جي إم، ماتيوس جي، كاتو واي، هاستي كم، يو إد، فاليتي سي، وآخرون. تم تقييم الذاكرة المناعية لـ SARS-CoV-2 لمدة تصل إلى 8 أشهر بعد الإصابة. العلوم 2021;371:eabf4063.

14. سوكال أ، تشابيرت بي، باربا سبيث جي، رويسر أ، الفراتي إس، عزاوي الأول، وآخرون. نضوج واستمرار استجابة خلايا الذاكرة B المضادة لـ SARS-CoV-2. الخلية 2021؛ 184:1201-13.e14. 15. جو بي، تشانغ كيو، جي جي، وانغ آر، صن جي، جي إكس، وآخرون. الأجسام المضادة البشرية المعادلة التي أثارتها عدوى السارس-CoV-2. طبيعة 2020;584:115-9.

16. ليو إل، وانغ بي، ناير إم إس، يو جي، راب إم، وانغ كيو، وآخرون. أجسام مضادة قوية تحييد ضد الحواتم المتعددة على ارتفاع SARS-CoV-2. طبيعة 2020;584:450-6.

17. زوست إس جيه، جيلشوك بي، كيس جي بي، بينشتين إي، تشن ري، نكولولا جي بي، وآخرون. قدرة فعالة على تحييد الأجسام المضادة البشرية وحمايتها ضد السارس-CoV-2. الطبيعة 2020؛ 584:443-9.

18. شو سي، وانغ واي، ليو سي، تشانغ سي، هان دبليو، هونغ إكس، وآخرون. الديناميكيات المطابقة لبروتين سكري SARS-CoV-2 في مجمع مع مستقبل ACE2 الذي كشفت عنه تقنية cryo-EM. الخيال العلمي 2021;7:eabe5575.

19. ماكالوم إم، دي ماركو إيه، ليمب فا، تورتوريسي إم إيه، بينتو دي، وولز إيه سي، وآخرون. يكشف التعيين المستضدي لنطاق N-terminal عن موقع ثغرة أمنية لـ SARSCoV-2. خلية 2021;184:2332-47.e16.

20. سوير مم، تورتوريسي MA، بارك YJ، الجدران AC، Homad L، أكتون الجريدة الرسمية، وآخرون. الأساس الهيكلي لتحييد الفيروس التاجي على نطاق واسع. نات ستراكت مول بيول 2021;28:478-86.

21. تورتوريسي إم إيه، بيلتراميلو إم، ليمب فا، بينتو دي، دانغ إتش في، روزين إل إي، وآخرون. تحمي الأجسام المضادة البشرية فائقة القوة من تحدي SARS-CoV-2 عبر آليات متعددة. علوم 2020;370:950-7.

22. بينتو د، بارك واي جيه، بيلتراميلو إم، وولز إيه سي، تورتوريسي إم إيه، بيانكي إس، وآخرون. تحييد متقاطع لـ SARS-CoV-2 بواسطة جسم مضاد بشري أحادي النسيلة لـ SARS-CoV. طبيعة 2020;583:290-5.

23. ليو واي، سوه وت، كيشيكاوا جي، هيروس إم، ناكاياما إي إي، لي إس، وآخرون. موقع يعزز العدوى على بروتين SARS-CoV-2 الشوكي الذي تستهدفه الأجسام المضادة. الخلية 2021؛ 184:3452-66.e18.

24. ليو إل، وي كيو، لين كيو، فانغ جي، وانغ إتش، كووك إتش، وآخرون. يتسبب IgG المضاد للارتفاع في إصابة الرئة الحادة الشديدة عن طريق تحريف استجابات البلاعم أثناء العدوى الحادة لـ SARS-CoV. جي سي آي انسايت 2019;4:e123158.

25. لي دي، إدواردز آر جيه، ماني كيه، مارتينيز دي آر، شيوفر إيه، علم إس إم، وآخرون. وظائف عدوى SARS-CoV-2 في المختبر وفي الجسم الحي - تعزيز الأجسام المضادة وتحييدها. خلية 2021;184:4203-19.e32. 26. بوه سي إم، كاريسيمو جي، وانغ بي، أمرون إس إن، لي سي واي، تشي آر إس، وآخرون. تعمل حلقتان خطيتان على البروتين الشوكي لـ SARS-CoV-2 على تحفيز الأجسام المضادة المعادلة لدى مرضى فيروس كورونا-19. نات كومون 2020؛11:2806.

27. تشانغ بي زد، هو واي إف، تشن إل إل، ياو تي، تونغ واي جي، هو جي سي، وآخرون. تعدين الحواتم على البروتين الشوكي لـ SARS-CoV-2 من مرضى كوفيد-19. دقة الخلية 2020;30:702-4.

28. ستودارد سي آي، جالواي جي، تشو إتش واي، شيبلي إم إم، سونغ كيه، إيتيل إتش إل، وآخرون. يكشف تحديد ملامح الحاتمة عن التوقيعات الملزمة للاستجابة المناعية لـ SARS-CoV-2 في العدوى الطبيعية والتفاعل المتبادل مع فيروسات كورونا البشرية المتوطنة. مندوب الخلية 2021;35: 109164.

29. شروك إي، فوجيمورا إي، كولا تي، تيمز آر تي، لي آي إتش، لينغ واي، وآخرون. يكشف تحديد الحاتمة الفيروسية لمرضى فيروس كورونا-19 عن التفاعل المتبادل وارتباطات الخطورة. العلوم 2020;370:eabd4250.

30. زاميكنيك سي آر، راجان جي في، ياموتشي كا، مان إس إيه، لوديرميلك آر بي، سوا جي إم، وآخرون. ReScan، وهو خط أنابيب تشخيصي متعدد الإرسال، يقوم بتوزيع الأمصال البشرية لمستضدات SARS-CoV-2- 2. سيل ريب ميد 202؛1:100123.

31. هاينز دبليو إيه، كاماث ك، بوزكوفسكي جيه، باوم جونز إي، كامبل إم، كازانوفاس ماسانا إيه، وآخرون. رسم خرائط الحاتمة عالية الدقة وتوصيف الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 في مجموعات كبيرة من الأشخاص المصابين بـCOVID-19. كومون بيول 2021;4:1317.

32. لي واي، لاي دي واي، لي كيو، شو زو، وانغ إف، هو إتش، وآخرون. تقييم منهجي لاستجابات IgG لـ SARS-CoV-2 الببتيدات المشتقة من بروتين سبايك لمراقبة مرضى كوفيد-19. خلية مول إيمونول 2021؛18:621-31.

33. لي واي، ما إم إل، لي كيو، وانغ إف، هونغ دبليو، لاي دي واي، وآخرون. منظر الحاتمة الخطية لبروتين SARS-CoV-2 الشوكي الذي تم إنشاؤه من 1,051 مريضًا بفيروس كورونا-19. مندوب الخلية 2021;34:108915.

34. وانغ إتش، وو إكس، وتشانغ إكس، وهوي إكس، وليانغ تي، ووانغ دي، وآخرون. SARS-CoV-2 المصفوفة البروتينية الدقيقة لرسم خرائط تفاعلات الأجسام المضادة لـCOVID-19 عند تحليل الأحماض الأمينية. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. يي زي، لينغ واي، تشانغ إكس، تشن جيه، هو كيه، وانغ واي، وآخرون. رسم خرائط وظيفية للحواتم الخطية للخلايا B لـ SARS-CoV-2 في مجتمع النقاهة من فيروس كورونا-19. الميكروبات الناشئة تصيب 2020;9:1988-96.

36. لجنة الصحة الوطنية والإدارة الوطنية للطب الصيني التقليدي. بروتوكول تشخيص وعلاج الالتهاب الرئوي الناجم عن فيروس كورونا الجديد (الإصدار التجريبي 7). تشين ميد جي (إنجلترا) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/CM9.0000000000000819.

37. لي واي، لي سي كيو، قوه إس جيه، قوه دبليو، جيانغ إتش دبليو، لي إتش سي، وآخرون. يحدد التنميط الطولي لمرجع الأجسام المضادة الذاتية في المصل المؤشرات الحيوية المرتبطة بالجراحة في سرطان الغدة الرئوية. إيبيوميديسيني 2020؛53:102674.

38. تشاو جي، يوان كيو، وانغ إتش، ليو دبليو، لياو إكس، سو واي، وآخرون. استجابات الأجسام المضادة لـ SARSCoV-2 في المرضى المصابين بمرض فيروس كورونا الجديد 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. لوكاس سي، وونغ بي، كلاين جيه، كاسترو تي بي آر، سيلفا جيه، سوندارام إم، وآخرون. تكشف التحليلات الطولية عن خلل مناعي في حالات الإصابة الشديدة بكوفيد-19. طبيعة 2020;584: 463-9.

40. مور جي بي، يونيو سي إتش. متلازمة إطلاق السيتوكين في حالات كوفيد الشديدة-19. علوم 2020;368:473-4.

41. تشين جيه، مالون بي، لويلين إي، جراسو إم، شيلتون بي إم إم، أوليناريس بي دي بي، وآخرون. الأساس الهيكلي لاقتران هيليكاز-بوليميراز في مجمع النسخ والنسخ لـ SARS-CoV-2. الخلية 2020;182:1560-73.e13.

42. واجنبيرج أ، أمانات إف، فيربو أ، ألتمان دي آر، بيلي إم جي، منصور إم، وآخرون. تستمر الأجسام المضادة القوية المحايدة لعدوى SARS-CoV-2 لعدة أشهر. العلوم 2020; 370:1227-30.

43. تشي إكس، يان آر، تشانغ جي، تشانغ جي، تشانغ واي، هاو إم، وآخرون. يرتبط الجسم المضاد البشري المعادل بالمجال الطرفي N للبروتين الشوكي لـ SARS-CoV-2. علوم 2020;369:650-5.

44. تسينج سي تي، سبرانا إي، إيواتا-يوشيكاوا إن، نيومان بي سي، جارون تي، أتمار آر إل، وآخرون. يؤدي التحصين بلقاحات فيروس السارس التاجي إلى الإصابة بأمراض مناعية رئوية في مواجهة فيروس السارس. بلوس وان 201؛7:e35421.

45. بولز إم، ديمينج دي، لونج كيه، أجنيهوثرام إس، ويتمور إيه، فيريس إم، وآخرون. يوفر لقاح فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة المزدوج المعطل حماية غير كاملة في الفئران ويحث على زيادة الاستجابة الرئوية الالتهابية اليوزينية عند التحدي. جي فيرول 201؛85:12201-15.

46. ​​وينجارتل إتش، تشوب إم، تشوب إس، نيوفيلد جيه، مارسزال بي، جرين جيه، وآخرون. يرتبط التحصين باستخدام فيروس اللقاح المعدل (لقاح مؤتلف مقره في أنقرة ضد المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة) بالتهاب الكبد الوبائي المعزز في القوارض. جي فيرول 200؛78:12672-6.

47. ياسوي إف، كاي سي، كيتاباتاكي إم، إينوي إس، يونيدا إم، يوكوتشي إس، وآخرون. يسبب التحصين المسبق مع بروتين القفيصة النووية المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS) المرتبط بفيروس كورونا (SARS-CoV) التهابًا رئويًا حادًا في الفئران المصابة بفيروس SARS-CoV. J إيمونول 200؛ 181: 6337-48.

48. ديمينغ د، شيهان تي، هيز إم، يونت بي، ديفيس إن، سيمز أ، وآخرون. فعالية اللقاح في الفئران المسنة تواجه تحديات مع فيروس السارس المؤتلف الحامل للوباء والمتغيرات الحيوانية المنشأ. بلوس ميد 200؛3:e525.

49. وانغ كيو، تشانغ إل، كوهارا ك، لي إل، ليو زي، لي تي، وآخرون. أثارت الحواتم المناعية لفيروس كورونا التاجي السارس في البشر تأثيرات معززة ومعادلة للعدوى في الرئيسيات غير البشرية. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. أغراوال إيه إس، تاو إكس، الجيسي إيه، جارون تي، نارايانان كيه، بينج بي إتش، وآخرون. يؤدي التحصين بلقاح فيروس كورونا المعطل لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية إلى الإصابة بأمراض مناعية في الرئة في مواجهة الفيروس الحي. Hum Vaccin Immunother 201;12:2351-6.