LRRK2 مثبط كيناز يجدد الشيخوخة الخلوية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية الجزء 1

يرجى الاتصالoscar.xiao@wecistanche.comلمزيد من المعلومات

خلفية.يلعب كيناز التكرار الغني بالليوسين 2 (LRRK2) دورا حاسما في التسبب في مرض باركنسون (PD). الشيخوخة هي عامل الخطر الأكثر أهمية لتطور مرض باركنسون. تم تأسيس العلاقة بين الشيخوخة والشيخوخة الخلوية. ترتبط الشيخوخة الخلوية بخلل تنظيم المسار البروتيني وخلل الميتوكوندريا ، والتي ترتبط أيضا بتجميع α-سينوكلين (α-syn). أساليب. تم التعامل مع الخلايا العصبية الشبيهة بالدوبامين البشري (خلايا SH-SY5Y المتباينة) بالروتينون في وجود أو عدم وجود مثبط كيناز LRRK2 GSK2578215A (GSK-KI) لمدة 48 ساعة. علامات الشيخوخة الخلوية ، بما في ذلك p53 ، p21Wafi / Cip1 (p21) ، β-galactosidase (β-gal) ، الفسفرة Rb ، المرتبطة بالشيخوخة (SA) β-gal النشاط ، والليزوسوماتالنشاط ، تم فحصها. عولجت خلايا داش والخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران بألياف α-syn قبل 30 دقيقة من العلاج بالروتينون في وجود أو عدم وجود GSK-KI لمدة 48 ساعة. تم حقن الفئران داخل الصفاق مع الروتينون و MLi-2 (مثبط كيناز LRRK2) مرة واحدة كل يومين لمدة أسبوعين. النتائج. قام Rotenone برفع مستوى الفسفرة LRRK2 ومستويات β-gal من خلال تنشيط محور الإشارات p53-p21 وفسفرة Rb منخفضة التنظيم. بالإضافة إلى ذلك ، قام الروتينون بتنظيم نشاط SA β-gal ، ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية ، و LRRK2فسفرةوتثبيط نشاط الليزوزوم. أدى تنظيم LRRK2 الناجم عن الروتينون إلى إضعاف إزالة ألياف a-syn. خفف العلاج بمثبط LRRK2 من الشيخوخة الخلوية الناجمة عن الروتينون وتراكم α سين. الاستنتاجات. عزز تنظيم نشاط كيناز LRRK2 الناجم عن الروتينون الشيخوخة الخلوية ، مما عزز تراكم α syn. ومع ذلك ، فإن إدارة مثبط كيناز LRRK2 جدد الشيخوخة الخلوية الناجمة عن الروتينون.

يرجى الضغط هنا لمعرفة المزيد

1. مقدمة

يتميز مرض باركنسون (PD) ، وهو أكثر الأمراض العصبية التنكسية شيوعا ، بضعف التحكم الحركي[1]. تساهم العديد من العوامل الوراثية والبيئية في التسبب في مرض PD [2-5]. LRRK2 ، وهو عامل خطر وراثي رئيسي لمرض باركنسون ، يعرض كل من أنشطة GTPase و kinase [6]. يعزز المتحور LRRK2 G2019S ، الذي يظهر نشاطا كينازا معززا ، تقدم PD [7]. يزداد خطر الإصابة بمرض باركنسون لدى المرضى الذين يؤوون متحور G2019S مع تقدم العمر [8] حيث ترتبط الشيخوخة بتطور الأمراض العصبية التنكسية [9]. في السابق ، أبلغنا أن نشاط كيناز LRRK2 يعزز الشيخوخة الخلوية ويمنع تدهور مجاميع ألفا سينوكلين (α-syn) [10].α-Syn هو مكون رئيسي لأجسام ليوي (LB) أو عصبات ليوي ، والتي هي علامات ما بعد الوفاة ل PD. يؤدي التحلل الضعيف α-syn في تجميعه [11].

الشيخوخة الخلوية تضعف آلية تحلل البروتين [12-14]. التعرض لجرعة منخفضة من الروتينون ، والذي يقال إنه يحفز PD ، يعزز الشيخوخة الخلوية في خط خلية الشبكة التربيقية البشرية [15]. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم الروتينون نشاط كيناز LRRK2 في الخلايا العصبية [16]. لذلك ، افترضنا أن الروتينون يعزز الشيخوخة الخلوية من خلال تنشيط كيناز LRRK2 وبالتالي يعزز تجميع α-syn.

Cistanche يمكن أن يحسن المناعة

2. الأساليب والمواد

2.1. زراعة الخلايا وعلاجها.

تم استزراع خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري (SH-SY5Y cells) في وسط نمو (وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM; 10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro),1٪ بنسلين/ستربتومايسين (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific), and 1٪ كاشف إزالة الميكوبلازما (KOMA)) عند 37 درجة مئوية أ 5٪ CO، حاضنة (Thermo Fisher Scientific). تم الحصول على خلايا SH-SY5Y المتمايزة (خلايا dSH) بعد العلاج بحمض الريتينويك 10μM المحول بالكامل (R2625-100MG ، Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) المحضر في وسط نمو مرة واحدة كل يومين لمدة سبعة أيام. في اليوم 7 بعد علاج حمض الريتينويد ، تمت معالجة الخلايا بالروتينون (1 UM) و GSK2572815A (GSK-KI; مثبط كيناز LRRK2 ؛ 1μM) معد في وسط نمو لمدة 48 ساعة. تم استخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كوسيلة للروتينون و GSK-KI. تم تنقية ألياف α-syn كما هو موضح سابقا [10]. تمت معالجة الخلايا المعالجة بالروتينون و GSK-KI بألياف a-syn (70nM). عولجت الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران بالروتينون (1μM) و GSK-KI (l μM) و A-syn fibril (70nM) لمدة 48 ساعة. كانت ظروف العلاج للخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران متطابقة مع تلك المستخدمة في dSH. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بفوسفات بارد (PBS) وتم تحليلها في مخزن مؤقت لعينة 1x (50mM Tris-HCl (pH6.8) ، و 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، و 10٪ جلسرين ، و 1٪ β-mercaptoethanol ، و 0.02٪ بروموفينول أزرق).

2.2.عزل وزراعة الخلايا العصبية القشرية الأولية من أجنة الفئران E16.

تم قتل الفئران الحوامل بغاز ثاني أكسيد الكربون. تم تشريح الرحم ، وتم وضع الأجنة من الأكياس الجنينية في HBSS-/-(14175-079 ، Gibco ، Thermo Fisher Scientific). تم تقشير الجمجمة باستخدام ملقط ، وتم تشريح القشرة من الدماغ بأكمله. بعد إزالة السحايا ، تم احتضان القشرة بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA (25200-056 ، Gibco ، Thermo Fisher Scientific) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حمام مائي. بعد ذلك ، تم احتضان القشرة باستخدام 40 ميكروغرام / مل DNase I (DN25 ، Sigma-Aldrich) ، دوامة بلطف ، وتحضينها لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. تمت إزالة معظم السوبرناتانت عن طريق الشفط ، وتم احتضان العينات باستخدام MEM يحتوي على مثبطات المصل (11090-08 ، Gibco ، Thermo Fisher Scientific) ، 1.5٪ DMEM ، 5٪ FBS ، 2.5mg / mL ألبومين مصل البقر (BSA; A7906 ، سيغما ألدريش) ، ومثبط التربسين 2.5 ملغ / مل (T9253 ، سيغما ألدريش). تمت إزالة مثبط المصل ، وتم إعادة تعليق حبيبة الخلية في 10 أضعاف حجمها مع وسط النمو. كان تكوين وسط النمو على النحو التالي: الوسط العصبي القاعدي (21103-049 ، كورنينج سيلغرو ، ثيرمو فيشر ساينتيفيك) ، 2٪ B-27 (17504044 ، كورنينج سيلغرو ، ثيرمو فيشر ساينتيفيك) ، و 1x GlutaMAX-1 (35050-061 ، كورنينج سيلغرو ، ثيرمو فيشر ساينتيفيك). تم زرع الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران المعزولة (3×10 درجة / بئر) في صفيحة من 12 بئرا (SPL30012 ، SPL Life Sciences ، Pochoen ، كوريا الجنوبية) وزرعت في وسط النمو عند 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ CO ، incuba-tor لمدة 24 ساعة. تم استبدال وسط الاستزراع بوسط نمو مكمل ب 0.2 ملغ / مل من 5-fluoro-2'-deoxyuridine (F0503 ، Sigma-Aldrich) و 96ug / mL من uridine (U3750 ، Sigma-Aldrich) لمنع الانقسام الخيطي. في اليوم 6 ، عولجت الخلايا ب 1uM rotenone و 1uM GSK-KI وألياف 70nM α-syn لمدة 48 ساعة وتم حصادها باستخدام مخزن مؤقت لعينة LX.

2.3. اللطخة الغربية.

تم إجراء النشاف الغربي كما هو موضح سابقا [17]. تم استخدام الأجسام المضادة التالية للنشاف الغربي: أرنب مضاد ل LRRK2 phospho-S935 أحادي النسيلة (ab133450 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ، rab-bit anti-LRRK2 phospho-S1292 أحادي النسيلة (ab203181 ، Abcam) ، الفأر المضاد ل LRRK2 أحادي النسيلة (N241A / 34 ، Neu-roMab ، UC Davis ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، الفأر المضاد ل p53 أحادي النسيلة (للإنسان p53: sc-126 ؛ للفأر p53: sc-393031 ؛ سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية)، الماوس المضادة p21wafi/-Ccip1 (p21) وحيدة النسيلة (CM5131، ECM العلوم البيولوجية، فيرساي، كنتاكي، الولايات المتحدة الأمريكية)، الماوس المضادة Rb وحيدة النسيلة (#9309S، تكنولوجيا إشارات الخلية (CST)، دانفرز، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية)، المضادة للفوسفورrb (Ser807/811) (#9308S، CST)، الماوس المضادة β-galactosidase وحيدة النسيلة (sc-377257، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية nology)، الماوس المضادة p62 وحيدة النسيلة (ab56416، أبكام)، الفأر المضادة β الأكتين وحيدة النسيلة (sc-47778; سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية)، أرنب المضادة LC3B متعدد النسيلة (#2775S؛ CST) ، الماوس المضادة α سين (استنساخ 42) وحيدة النسيلة (610786 ؛ بكالوريوس العلوم الحيوية، سان خوسيه، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)،مضاد للفوسفو ثريونين-أرجي-تسعة (#2351S، CST)، المضادة p53 (SC-99، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية)، ومكافحة LaminB (SC-6216، سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية-nology)، الماعز بيروكسيديز المترافقة AffiniPure المضادة للفأر IgG (H + L) (# 115-035-003؛ جاكسون للأبحاث المناعية Labo-ratories Inc. ، ويست غروف ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والماعزبيروكسيديز مترافقAffiniPure المضادة للأرانب IgG (H + L) (#1l1-035-144 ؛ جاكسون مختبرات البحوث المناعية شركة الاجسام المضاده. تم تطوير إشارات مناعية في غشاء النيتروسليلوز باستخدام Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500 ، Merck & Co. Inc. ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم التقاط الصور بكاميرا MicroChemi4.2 (Shimadzu ، كيوتو ، اليابان).

2.4.فحص ربط القرب (PLA) والتألق المناعي (IF).

تم تنفيذ PLA باستخدام Duolink(9) في كواشف الكشف عن الموقع الأخضر (DUO92014-100RXN ، Sigma-Aldrich) ، DuolinkeIn in Situ PLA四Probe Anti-Mouse MINUS anti-Mouse MINUS antibody (DUO92002-100RXN ، Sigma-Aldrich) ، والأجسام المضادة المضادة المضادة للأرانب Plus (DUO92004-100RXN ، Sigma-Aldrich) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تم تمييز خلايا SH-SY5Y المزروعة في 96 لوحة سوداء (655077 ، Greiner Bio-One ، Krems-münster ، النمسا) ، وعولجت الخلايا المتمايزة بالروتينون و GSK-KI في اليوم 7. تم شطف الخلايا مرتين باستخدام PBS (DPBS) من Dulbecco البارد ، وتم تثبيته بنسبة 4٪ من بارافورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، وشطفها ثلاث مرات باستخدام DPBS البارد المثلج. بعد ذلك ، تم اختراق الخلايا باستخدام 0.1٪ Triton X-100 المحضر في DPBS. بعد غسل ثلاث مرات مع DPBS الباردة ، تم احتضان الخلايا بقطرة من محلول الحجب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تمت إزالة محلول الحجب ، وتم احتضان الخلايا بأجسام مضادة (50μL) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. يتكون خليط الأجسام المضادة من جسم مضاد مخفف من المجموعة (الأجسام المضادة المستخدمة في جيش التحرير الشعبى الصينى: الأجسام المضادة المضادة للفأر LRRK2 أحادية النسيلة (1:20) والأجسام المضادة للأرانب المضادة LRRK2 phospho-S1292 أحادية النسيلة (1:20) الأجسام المضادة ؛ الأجسام المضادة المستخدمة في فحص IF: الأجسام المضادة متعددة النسيلة β متعددة النسيلة (1:400 ، ab9361 ، Abcam)). في فحص IF ، تمت إضافة الجسم المضاد طوال العملية بأكملها حتى خطوة تطبيق PLA. ثم تم غسل العينات مرتين باستخدام 1x غسل المخزن المؤقت A لمدة 5 دقائق. لإعداد حل المسبار ، فإن Duolink(8)In Situ PLA· تم خلط المسبار المضاد للفأر ناقص ومضاد الأرنب زائد مع الجسم المضاد المخفف (1: 5). بالنسبة لفحص IF ، تمت إضافة الجسم المضاد β-gal (1:400) إلى الخليط. تم احتضان الخلايا مع 50μL من محلول المسبار في 37C لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن lx wash buffer A لمدة 5 دقائق. بالنسبة لفحص IF ، تم خلط ligase (40: 1) والأجسام المضادة المضادة β-gal (400: 1) في المخزن المؤقت للربط. تم احتضان الخلايا بمحلول الربط (50μL) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وغسلها مرتين باستخدام مخزن غسيل lx المخزن المؤقت A لمدة 5 دقائق. لفحص IF ،البوليميراز(1:40) تم احتضانه مع الماعز المضاد للدجاج IgY H + L (Alexa Fluor(2) 594 ؛ ab150172) الأجسام المضادة الثانوية (1:500) لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل 1x B لمدة 10 دقائق ، يليه الغسيل باستخدام المخزن المؤقت للغسيل 0.01x B لمدة 1 دقيقة. لتلطيخ النواة ، تم احتضان الخلايا باستخدام Hoechst 33342 (1: 1000 ؛ 62249 ، Thermo Fisher Scientific) التي تم إعدادها في DPBS في RT لمدة 10 دقائق. تم التقاط صور الخلايا في الصفائح السوداء المكونة من 96 بئرا باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة (LSM 700 ، Carl Zeiss Jena ، ألمانيا).

2.5.هطول الأمطار المناعية.

تم إعداد محللات الخلايا الكاملة من dSHcells المعالجة بالروتينون (1 ميكرومتر) و GSK-KI (1 uM) باستخدام محلول التحلل (PBS ، 1٪ Triton X-100,1x كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني ، وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز lx). تم طرد الليزات مركزيا عند 4000 جرام و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتم احتضان المادة الفائقة مع الجسم المضاد المضاد p53 (554293 ، BD Biosciences) و PierceProtein G Aga-rose (20398 ، Thermo Fisher Scientific) أعيد تعليقه في محلول التحلل لمدة 12 ساعة. تم غسل الخرز مرتين باستخدام محلول التحلل ، وتم تشويه مركب بروتين الخرز باستخدام مخزن مؤقت لعينة lx.

2.6. التجزئة النووية.

تم عزل الجزء النووي باستخدام كواشف الاستخراج النووي والسيتوبلازمي NE-PERr (78833 ، Thermo Fisher Scientific) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2.7. إعداد الحمض النووي الريبوزي المرسال وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).

تم عزل mRNA من خلايا dSH المعالجة بالروتينون / GSK-KI باستخدام مجموعة RNeasy Plus Mini (74134 ، QIAGEN ، هيلدن ، ألمانيا). بعد ذلك ، تم نسخ mRNA عكسيا إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة توليف TOPscript cDNA (EZ005S ، Enzynomics ، Daejeon ، جمهورية كوريا).cDNA خضع ل qRT-PCR باستخدام TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green مع ROX منخفض ، UDG plus) (RT500M ، Enzynomics). تم استخدام الاشعال التالية ل qRT-PCR: الإنسان p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(إلى الأمام)) و 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3' (عكس)؛ الإنسان P16INK4 (P16) ، 5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3 '(إلى الأمام) و 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT-3' (عكس).QRT-PCR تم تنفيذه على دورة Mic QPCR (MIC-4 ، الأنظمة الجزيئية الحيوية ، كوميرا العليا ، أستراليا).

2.8. قياس نشاط Galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA) (β-Gal) ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، ونشاط الليزوزوم.

في 30min بعد المعالجة ، كانت خلايا dSH الحية ملطخة ب 2μM GlycoGREEN-βGal (GC611 ، Goryo Chemical Inc. ، هوكايدو ، اليابان) ، 5uM 2 '، 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA ؛ 287810 ، Calbio-chem ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533 ، Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و 1 μM Hoechst 33342 لفحص نشاط SA β-gal ، ROS ، الليزوسومات النشطة ، والنواة ، على التوالي. تم تركيب الخلايا الملطخة باستخدام حامل ProLongDiamond Antifade (P36965 ، Invitrogen) وتم تصويرها باستخدام مجهر مسح بالليزر البؤري. تم الحصول على صور تباين التداخل التفاضلي باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري. فحص نشاط 2.9.SA β-Gal. تم فحص نشاط SAβ-gal باستخدام مجموعة فحص الشيخوخة الخلوية 96 بئرا (CBA-213 ، Cell Biolabs Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

2.10.مناولة الفئران وإدارة المخدرات.

تم التعامل مع الفئران كما هو موضح سابقا [18] وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في دانكوك (Dankook IACUC ، 18-026). C57BL/6] تم حقن الفئران الذكور التي تبلغ أعمارها 16 أسبوعا داخل الصفاق بالروتينون (0.75 مغ/كغ من وزن الجسم) و MLi-2 (مثبط كيناز LRRK2؛ 1 مغ/كغ من وزن الجسم) مرة كل يومين لمدة أسبوعين.

2.11.اختبار الروتارود وإعداد أنسجة المخ.

في اليوم 14 بعد العلاج ، تم وضع الفئران على قضيب على شكل أسطوانة قابلة للتدوير. تم تسجيل الوقت اللازم للسقوط على الأرض. يتم وصف تفاصيل اختبار الروتارود في مكان آخر [18]. بعد ذلك ، تم قتل الفئران الرحيم ودمجها عبر القلب مع HBSS البارد المثلج الذي يحتوي على Ca2 و Mg. تم تشريح الدماغ الأوسط باستخدام مقص صغير وملاقط. تم تحليل الأنسجة في PBS التي تحتوي على 1٪ Triton X-100,1xXpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (P3100 ، GenDEPOT ، Katy ، TX ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و lx Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (P3200 ، GenDEPOT). تم تجانس العينات باستخدام محرك Pellet Pestle اللاسلكي (Sigma-Aldrich). خضع السوبرناتانت للنشاف الغربي ، وفحص نشاط SA β-gal ، وفحص الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

2.12.ELISA ل Oligomeric α-Syn.

في السابق ، أنشأنا شطيرة ELISA لتحليل أوليغومرات الليفي α-syn باستخدام جسم مضاد يتعرف على التشكيل الخيطي لمجاميع α-syn [17]. تم إخضاع محللات الدماغ المتوسط الخام ل ELISA ، وتم تحديد كمام α-syn باستخدام معايير ألياف α-syn.

2.13. تحليل الصور والبيانات.

تم قياس شدة PLA وتلطيخ الخلايا الحية باستخدام Zen 2012 (Carl Zeiss). تم إجراء قياس كثافة البروتينات المستهدفة باستخدام

FiGURE 1: تنشيط كيناز LRRK2 الناجم عن الروتينون يعزز الشيخوخة الخلوية في خط الورم الأرومي العصبي البشري المتمايز. تحليل النشاف الغربي لخلايا DSH المعالجة ب 1 uM rotenone أو 1 uM GSK2578215A (GSK-K) ، مثبط كيناز LRRK2 ، لمدة 48 ساعة باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات المستهدفة (a). تم تطبيع كثافات البروتينات إلى تلك الموجودة في β-actin (b-g).n = 3. (ح) خضعت خلايا dSH المعالجة ب 1 uM rotenone أو 1uM GSK-KI لمدة 48 ساعة لفحص ربط القرب (PLA) من phospho-S1292 LRRK2 وإجمالي IRRK2 (PIA-pS1292) وتحليل التألق المناعي (TF) β-galactosidase ، تم تلطيخ النوى ب Hoechst 33342.كشفت عناصر التحكم المستخدمة في تلطيخ PLA و IF عن صحة النتائج (اللوحتان الأيمن). تم تطبيع كثافة PLA-pS1292 (i) و β-galactosidase (j) إلى تلك الموجودة في 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4; عدد الخلايا = 12-17.

مقياس متعدد (فوجيلم، طوكيو، اليابان). تم تحليل جميع مجموعات البيانات ورسمها بيانيا باستخدام Prism 8 (GraphPad Software ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل البيانات من التجارب التي أجريت باستخدام خلايا dSH والخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران باستخدام تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) ، يليه اختبار بونفيروني اللاحق المخصص (n = 3). وفي الوقت نفسه،تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من تجارب الماوس ، وتلطيخ الخلايا الحية ، و PLA في خلايا dSH باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه ، يليه اختبار Tukey اللاحق المخصص (n>3). يتم تمثيل جميع البيانات كمتوسط ± خطأ قياسي في المتوسط. *ع<><><><0.0001,and n.s.="not">

الشكل 2: يمنع مثبط كيناز LRRK تنشيط p53 في خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري المتمايز. (أ) تم جمع محللات الخلايا الكاملة (20٪) ، والتي كانت تستخدم كمدخلات لهطول الأمطار المناعي (IP) ، والكسر النووي. وكشف التحليل أن مدخلات 20٪ أظهرت نتائج مماثلة لتلك التي لوحظت في الشكل 1. (ب، ج) تم تشويه عينات IP وإخضاعها للنشاف الغربي. تم تطبيع مستويات الفسفرة في موقع TXR في p53 إلى مستويات p53 الإجمالية. ن = 3. (د-ه) تم فحص إجمالي مستويات p53 في nuceus باستخدام النشاف الغربي. تم استخدام LaminB لتطبيع مستويات p53 النووية. ن = 3. (و) تم تطبيع مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال P21 و pl6 في مجموعة المعالجة إلى تلك الموجودة في المجموعة المعالجة بالمركبة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد -) ، n = 3.

تم استخراج هذه المقالة من مجلد الطب التأكسدي الهنداوي وطول العمر الخلوي 2021 ، معرف المقالة 9969842 ، 16 صفحة https://doi.org/10.1155/2021/9969842