التطعيم الأمومي الذاتي الناتج عن الفيروس المعطل يعزز المناعة ضد PRRSV في الخنازير الجزء 1

خلاصة:

تعتبر المناعة المشتقة من الأم مكونًا مهمًا لبقاء ونجاح النسل في الخنازير للحماية من مسببات الأمراض المنتشرة مثل فيروس المتلازمة التنفسية والتكاثرية من النوع 2 (PRRSV -2).

الغرض من هذه الدراسة هو التحقيق في نقل المناعة المضادة لـ PRRSV إلى الخنازير من المواد المذهبة التي تلقت الفيروس الحي المعدل (MLV) بمفرده (العلاج (TRT) 0) ، أو بالاشتراك مع واحد من اثنين ذاتي المنشأ المعطل لقاحات (AIVs ، TRT 1 plus 2). تم تحدي الخنازير من هذه الخنازير مع سلالة PRRSV ذاتية التولد -2 في عمر أسبوعين وتم تقييم استجابتها المناعية التكيفية (IR) حتى 4 أسابيع بعد التلقيح (dpi).

تم تحليل الأشعة تحت الحمراء الخلطية والخلوية النظامية في سلالات ما قبل التخضير ، وفي الخنازير الصغيرة ، والتلقيح المسبق ، وعند 2 و 4 نقطة في البوصة. كلاهما يحمي الخنازير جزئيًا مع انخفاض أمراض الرئة وزيادة الوزن ؛ خفضت TRT 1 أيضًا فيريمية الخنازير ، وأفضل ما يفسرها الإنتاج المستحث بـ AIV للأجسام المضادة المعادلة في السلالات الذهبية ونقلها إلى الخنازير. في الخنازير الصغيرة ، قبل التلقيح ، كان منتجو الإنترفيرون الجهازي الرئيسي هم CD21 بالإضافة إلى الخلايا البائية. من 0 إلى 4 نقاط في البوصة ، انخفض دور هذه الخلايا البائية وأصبحت خلايا CD4 T هي المنتج الأساسي لنظام IFN.

تشير الفيروسات الحية الجيدة إلى الفيروسات التي لا تسبب المرض ، ولها علاقة معينة بمناعة جسم الإنسان. يمكن للفيروسات الحية تحفيز جهاز المناعة البشري لإنتاج استجابة مناعية ، وبالتالي تعزيز مناعة الإنسان. أظهرت الدراسات أنه بعد إصابة جسم الإنسان بفيروس حي ، فإنه سيطلق بعض الوسطاء والسيتوكينات ، التي يمكن أن تنشط الخلايا المناعية ، وتعزز وظيفة الجهاز المناعي ، وتعزز قدرة الجسم على مقاومة الفيروسات.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للفيروسات الحميدة والقابلة للحياة أن تحتل الخلايا بشكل تنافسي ، مما يجعل من الصعب على مسببات الأمراض غزوها والتكاثر ، وبالتالي حماية جسم الإنسان من العدوى الأخرى. لذلك ، يمكن أن تؤدي العدوى الفيروسية الحميدة والحيّة إلى تحسين مناعة الإنسان ، لكن العدوى المفرطة قد تؤدي إلى المرض. لذلك ، في الحياة اليومية ، يجب على الناس الانتباه إلى السيطرة على عدوى الفيروسات الحية وتحسين المناعة من خلال نمط حياة صحي. من وجهة النظر هذه ، نحن بحاجة إلى تحسين المناعة. يمكن أن يحسن القفص المناعة بشكل كبير. يحتوي رماد اللحوم على مجموعة متنوعة من المكونات النشطة بيولوجيًا ، مثل السكريات ، واثنين من الفطر ، وهوانجلي ، وما إلى ذلك ، ويمكن لهذه المكونات أن تحفز الوظائف المختلفة لجهاز المناعة. الخلايا الشبيهة بالخلايا ، مما يزيد من نشاطها المناعي.

انقر فوق الفوائد الصحية من cistanche

في الرئتين ، كانت خلايا CD8 T هي الخلايا الأولية و CD4 T كانت منتجة IFN الثانوية ، بما في ذلك مجموعة فرعية جديدة من الخلايا التائية CD8 −CCR7− CD4 الخنازير ، والتي من المحتمل أن تكون خلايا CD4 TEMRA متمايزة نهائيًا. باختصار ، توضح هذه الدراسة أن تلقيح الأم ضد فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يحسن حماية الخنازير قبل الفطام ضد PRRSV -2 ؛ يوضح أهمية نقل الأجسام المضادة المعادلة إلى الخنازير الصغيرة ، ويقدم مجموعتين فرعيتين جديدتين من الخلايا المناعية في الخنازير - IFN- ينتج CD21 بالإضافة إلى خلايا B وخلايا CD8 −CCR7− CD4 T.

الكلمات الدالة:

تطعيم الأم لقاح غير نشط ذاتي المنشأ نقل الحصانة استجابة مناعية خلطية استجابة مناعية خلوية ؛ الخلايا التائية PRRSV ؛ انثي خنزير؛ IFN- إنتاج الخلايا البائية ؛ خلايا CD4 TEMRA.

1 المقدمة

المناعة المشتقة من الأم (MDI) في الثدييات هي سمفونية مذهلة ("التعقيد المتناغم" - [1]). في هذا النظام ، أو السمفونية ، تنقل الأم الحماية المناعية (المؤقتة و / أو الدائمة) إلى نسلها إما أثناء الحمل من خلال المشيمة ، أو بعد الولادة من خلال إفرازات الثدي ، أو كليهما [2]: يتلقى البشر الغلوبولين المناعي أثناء الحمل وفي النهاية من خلال الثدي إفرازات [3] ؛ تتلقى الكلاب والقوارض الغلوبولين المناعي أثناء الحمل ومن خلال إفرازات الثدي ، وتتلقى الخنازير والماشية الأخرى الغلوبولين المناعي فقط من خلال إفرازات الثدي.

على غرار الأنواع الأخرى ، تتلقى الخنازير الصغيرة MDI في شكل غلوبولين مناعي وخلايا مناعية وجزيئات أخرى مرتبطة بالمناعة [4،5]. في حين يمكن الحصول على الغلوبولين المناعي من خنازير مختلفة (= التبويض المتبادل) ، يمكن للأمهات البيولوجيات فقط نقل الخلايا المناعية بنجاح إلى نسلهن [5] ، كما أن كمية اللبأ في الخنازير تقلل بشكل كبير من معدل الوفيات وتحسن الأداء [6] ]. تشتمل هذه الخلايا المناعية على الخلايا البائية [7] ، بالإضافة إلى مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية - CD4 و CD8 ومستقبلات الخلايا التائية بشكل أساسي (TCR) - الخلايا التائية [8].

يمكن بعد ذلك تمييز مجموعات الخلايا التائية الفرعية هذه بناءً على مرحلة التمايز ونمط التوجيه. في الخنازير ، تُستخدم سلسلة CD8 لتمييز CD8 - ساذج عن CD8 بالإضافة إلى خلايا CD4 T ذات تجربة المستضد أو الذاكرة [9-11]. إن التعبير عن مستقبلات الكيموكين (CCR) 7 يميز أيضًا CCR7 بالإضافة إلى توجيه العقدة الليمفاوية من الخلايا التائية الموجهة للأنسجة الطرفية CCR7− [12]. من خلال تحليل CD8 / CCR7 المدمج ، يمكننا بعد ذلك التمييز بين مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية: CD8 −CCR7 بالإضافة إلى خلايا CD4 T ساذجة ، و CD8 بالإضافة إلى CCR7 بالإضافة إلى الذاكرة المركزية (TCM) ، وخلايا CD4 T ، و CD8 بالإضافة إلى ذاكرة المستجيب CCR7− (TEM) ) خلايا CD4 T ؛ توجيه الأنسجة المحيطية CCR7− والعقدة الليمفاوية موجه CCR7 بالإضافة إلى خلايا CD8 T و CD8 −CCR7− و CD8 plus CCR7− و CD8 plus CCR7 بالإضافة إلى خلايا TCR- T.
بينما أبلغنا سابقًا أن خلايا TCR- T الخنازير تمتلك نمط توجيه عكسي مقارنة بنظيراتها من TCR ، إلا أن الدور المحدد لهذه المجموعات الفرعية المختلفة لم يتم وصفه بعد [13]. يتم نقل كل من المجموعات الفرعية من الخلايا المناعية والأجسام المضادة إلى النسل لحمايتهم من مسببات الأمراض المختلفة [4،5].

لعقود من الزمان ، كان أكثر مسببات الأمراض كارثية للخنازير هو فيروسات المتلازمة التنفسية والتكاثرية للخنازير (PRRSV، [14،15]). يوجد نوعان رئيسيان من PRRSV - النوع 1 و 2 (PRRSV -1 و 2) ؛ إن تنوعها العالي وقدراتها المثبطة للمناعة تجعل PRRSV مرضًا إشكاليًا ، مما يؤدي إلى خسائر اقتصادية هائلة لصناعة الخنازير [16] وحتى الآن ، بينما توفر اللقاحات حماية جزئية ضد PRRSV ، فإنها لم تكن قادرة على السيطرة الكاملة على هذا المرض.

يتوفر نوعان رئيسيان من اللقاحات للوقاية من PRRSV - لقاحات الفيروس الحي المعدل (MLV) واللقاحات المعطلة ، وخاصة اللقاحات المعطلة ذاتية المنشأ (AIVs) ؛ ومع ذلك ، كلا النوعين يواجهان تحدياتهما.

إن الوقت الطويل لتطوير لقاحات MLV شديدة المناعة يعني أنها عادة ما تكون أكثر تنوعًا مع سلالات PRRSV السائدة في المزرعة ، وبينما يتم توجيه AIVs ضد هذه السلالات المنتشرة في المزرعة ، فإن طبيعتها المعطلة تجعلها عمومًا أقل مناعة.

تؤدي هذه التحديات إلى نقص الحماية خاصة في الخنازير الصغيرة التي يمكن أن تُعزى إلى ثلاثة عوامل: أولاً ، معدل الطفرات المرتفع لـ PRRSV يحد من الحماية غير المتجانسة ، لذا فهو يقلل من فعالية لقاح MLV ؛ ثانيًا ، قدرته على كبت المناعة تحد من اللقاحات الأضعف (مثل AIVs) وتأخره في تحريض الاستجابة المناعية الوقائية يجعل الخنازير الصغيرة معرضة بشكل خاص [17] ؛ وثالثًا ، فإن فهمنا للاستجابة المناعية لـ PRRSV ، خاصة في الخنازير الصغيرة ، محدود. أنتج Loving and Lunney مراجعة لطيفة فيما يتعلق بالفهم العام للاستجابة المناعية لـ PRRSV [18،19].

يعتمد منتجو الخنازير بشكل أساسي على الوقت الممتد لتأسيس المناعة التي يسببها اللقاح ضد PRRSV ، وغالبًا ما يقوم منتجو الخنازير بتلقيح الخنازير والبذار لتمكين نقل المناعة إلى الخنازير. لم يعرقل البحث عن تطعيم الأم باستخدام MLV تجاري ضد نوع PRRSV -1 تحصين الخنازير الصغيرة التي يبلغ عمرها 2 أو 3- أسبوعًا كما قام بحماية الخنازير جزئيًا من التحدي غير المتجانسة [20]. أدت إستراتيجية التطعيم هذه أيضًا إلى تحفيز PRRSV -1- معين IgG و IgA و interferon (IFN) - إفراز خلايا في اللبأ وحليب البذار المحصنة. هذه الخلايا المنتجة لـ IFN مهمة للغاية في الاستجابات المضادة للفيروسات ، بما في ذلك PRRSV [19 ، 21].
تسبب هذا التطعيم أيضًا في مصل مضاد IgG المضاد لـ PRRSV ، والذي تم اكتشافه بعد ستة أسابيع من العمر للخنازير غير المحصنة وظل مستقرًا في الخنازير المحصنة قبل التحدي ؛ ومع ذلك ، لا يمكن تمييز خلايا إفراز IFN عن مستويات الخلفية في الخنازير قبل الفطام [22]. في حين أن استخدام MLVs هو معيار صناعي ، فإن نظام التطعيم المشترك لقاح MLV الأساسي و AIV يبدو واعدًا للتغلب على كل سلبيات استخدام MLVs و AIVs بشكل مستقل.

لذلك ، كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تحديد ليس فقط ما إذا كان تلقيح الأم باستخدام نوعين مختلفين من مضادات الفيروسات القهقرية (العلاج (TRT) 1 زائد 2) يمكن أن يعزز تطعيم MLV المتوافق مع معايير الصناعة وحده (TRT 0) ) ، لحماية النسل بشكل أفضل من تحدي PRRSV2 المبكر. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بدراسة الاستجابة الخلطية المستحثة باللقاح والمناعة الخلوية (CMI) في هذه المواد المذهبة وقمنا بتحدي الفطام المبكر من gilts داخل كل مجموعة من هذه المجموعات في عمر أسبوعين. تمت متابعة الاستجابة المناعية الجهازية والمحلية لهذه الخنازير لمدة 2-4 أسابيع.

لقد أظهرنا أن التطعيم المعزز لـ AIV يمكن أن يحسن حماية الخنازير ضد تحدي PRRSV في عمر أسبوعين ونحدد أيضًا آليات المناعة الأساسية ونميز الاستجابة الخلطية المضادة لـ PRRSV واستجابة CMI في هذه الخنازير الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا نوعين جديدين من الخلايا في الخنازير: (1) CD8 −CCR7− CD4 T الخلايا التي تساهم بقوة في إنتاج IFN في غسل القصبات الهوائية (BAL) - خلايا CD4 TEMRA المحتملة ، و (2) مصدر رئيسي لـ الاستجابة المضادة لـ PRRSV خاصة في الخنازير - IFN- إنتاج الخلايا البائية.

2. المواد والأساليب

2.1. تصميم الدراسة والحيوانات ومعالجة العينات

كان الغرض من هذه الدراسة هو تقييم تأثير سلسلة التطعيم الأمومية المختلفة PRRSV2 على المناعة الوقائية في الخنازير المفطومة ضد PRRSV -2. قبل الدراسة ، تم عزل سلالة PRRSV -2 المتداولة (تعدد أشكال طول الجزء المقيد (RFLP) ، 1-7-4) من شركة لحم الخنزير في ولاية كارولينا الشمالية ونشرها شركتان مستقلتان في مجال العلوم البيولوجية ؛ لقد أنتجوا لقاحين ذاتي التولد متميزين. يحتوي كلا اللقاحين على مكونات مختلفة مسجلة الملكية ولكنهما يحتويان على نفس سلالة 1-7-4 PRRSV -2 المعطلة. تم توضيح تصميم هذه الدراسة في الشكل 1.

تم إعطاء التطعيمين عن طريق الحقن العضلي في سلسلة من أربع جرعات قبل التخدير: وفقًا لجدول التطعيم الخاص بشركة لحم الخنزير في ولاية كارولينا الشمالية ، تم تطعيم 46 من التطعيمات السالبة PRRSV -2 في مزرعة زراعة تجارية بلقاح Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH ، ألمانيا) تسعة أسابيع قبل التزاوج. للحفاظ على المصطلحات المتسقة خلال هذه الدراسة ، سيتم الإشارة إلى الخنازير الإناث الناضجة جنسيًا المسجَّلة (المُعرَّفة هنا بالذهبية) على أنها خنازير حتى بعد أن تم تربيتها وإنجابها (يشار إليها عادةً باسم الخنازير). قبل أربعة أسابيع من التكاثر ، تم جمع عينات الدم من جميع المواد السكرية من أجل المصل ثم تم تخصيصها لثلاث علاجات: TRT 0 (لقاح MLV فقط) ؛ TRT 1 (التطعيم ضد MLV بالإضافة إلى 4 جرعات من اللقاح المعطل ذاتي المنشأ (1-7-4) 1) ؛ أو TRT 2 (لقاح MLV بالإضافة إلى 4 جرعات من اللقاح المعطل ذاتي المنشأ (1-7-4) 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) وأعلى عيار لتحييد تركيز الفلورسنت المصل (FFN) (معايير المناعة الأولية) وأعلى استجابة IFN لخلايا T CD4 (معايير المناعة الثانوية) ضد سلالة تحدي AIV داخل مجموعتهم. بالنسبة إلى TRT 1 plus 2 ، تراوحت هذه التتر FFN من 1: 4 إلى 1: 128. نظرًا لأن TRT {{1 0}} لم يكن بها أي عيار ضد سلالة AIV ، فقد اخترنا gilts مع أعلى عيار مضاد لـ MLV ؛ تراوحت هذه التتر من 1:16 إلى 1:32. تراوحت استجابة IFN- داخل جميع gilts المحددة من 0. 09–0.21 بالمائة من إجمالي خلايا CD4 T.

قدم كل من هذه الخنازير أربعة خنازير لدراسة التحدي. في عمر أسبوعين (= 0 أسابيع بعد الإصابة ، مؤشر الدم في البوصة) ، تم اختيار الخنازير الأربعة التي تحتوي على أكبر متوسط ​​أوزان للقمامة لدراسة التحدي وتم نقلها إلى مرافق الإسكان من المستوى الثاني للأمن الحيوي بجامعة ولاية كارولينا الشمالية ( NCSU) مختبر الموارد الحيوانية (LAR) (رالي ، نورث كارولينا). هنا ، تم توزيعهم عشوائيًا على واحد من ستة أقلام في نفس الغرفة ؛ تم إيواء اثنين من الخنازير لكل معاملة في كل حظيرة (واحد لكل مذهب). باختصار ، كان هناك ما مجموعه 36 خنزير صغير في الدراسة مع 12 خنزير صغير لكل مجموعة معالجة.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106 درجة فهرنهايت) وقلة الاستجابة للتنبيه الجسدي. تم تضمين هذا الخنزير في جميع التحليلات خلال الأسبوع 3 وتم تقييم رئتيه لعلم الأمراض. لم يحدث تحليل التدفق الخلوي (FCM) لهذا الحيوان في التشريح.

بعد يوم واحد من الفطام والوصول إلى NCSU ، تم تلقيح جميع الخنازير عن طريق الأنف بجزيئات فيروسية 1 × 105.5 PRRSV -2 (سلالة ذاتية 1-7-4) في 1 مل 1X محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS ، Corning ، Corning ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) (500 ميكرولتر / فتحة الأنف) ، في وضع ضعيف لمدة 30 ثانية ثم عادوا إلى أقلامهم. تم التضحية بنصف الحيوانات بمعدل 2 نقطة في البوصة وتم التضحية بالحيوانات المتبقية عند 4 نقطة في البوصة. في التشريح ، تم جمع BAL والرئتين والغدد الليمفاوية الرغامية (TrBr LNs) ومعالجتها كما هو موضح سابقًا [13].

تم أخذ العينات قبل التلقيح (0 wpi) ثم أسبوعيًا ، كما هو موضح في الشكل 1. تم جمع المصل في أنابيب فاصل المصل (SST) (Becton Dickinson (BD) Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، و تم جمع الدم لعزل PBMC في أنابيب الهيبارين (BD Biosciences). تم وضع سكن الحيوانات من قبل دليل المعاهد الوطنية للصحة لحيوانات البحث. كان لدى الخنازير وصول غير محدود إلى الماء ، وتم إطعامها نظامًا غذائيًا انتقاليًا للفطام ، ثم نظامًا غذائيًا منتظمًا مرتين يوميًا ، والمحافظة عليها عند 83 درجة فهرنهايت مع 12- ساعة من الضوء / دورة الظلام. تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه بجامعة ولاية نورث كارولاينا (IACUC) ID # 17-166 أ (29 نوفمبر 2017).

2.2. انتشار الفيروس والمعايرة والتقييم

تم نشر PRRSV -2 المعزول الفيروسي (سلالة ، 1-7-4) على الضامة السنخية الخنازير سلبية PRRSV في RPMI -1640 ، 1 × مع L-glutamine (Corning ، Corning ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS) (VWR ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومضاد حيوي 1X (Corning) (يُشار إليه باسم RPMI-Complete) لمدة 30 ساعة تقريبًا في قوارير T -75 (Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا) حتى لوحظ تأثير الاعتلال الخلوي. تم إذابة القوارير مرة واحدة وتم لف المادة الطافية عند 2200 جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. لتركيز الفيروس ، تم بعد ذلك نقل المادة الطافية إلى 36 مل من أنابيب الطرد المركزي Nalgene (Thermo Fisher Scientific ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم نسجها في جهاز طرد مركزي فائق Sorvall 100S (Sorvall ، Thermo Fisher Scientific) ، نيوتاون ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 73 ، 000 جرام عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.

تم التخلص من المادة الطافية ، وتم إعادة تعليق الحبيبات في الوسائط (RPMI كاملة) وتخزينها في 100 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية. تم تحديد الجرعة المعدية لزراعة الأنسجة 50 (TCID50) من محاليل المخزون الفيروسي باستخدام PAMs كما هو موصوف سابقًا (طريقة Spearman-Karber TCID50 وفقًا لدليل الاختبارات التشخيصية لمنظمة OIE [المنظمة العالمية لصحة الحيوان ، سابقًا المكتب الدولي للأوبئة (OIE ) ، "الفصل 2.8.7 الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي" ، تير مان ، رقم مايو 2015 ، 2015].

2.3 فيرميا

تم تحليل المصل المعزول من قبل المختبر التشخيصي لشركة لحم الخنزير في ولاية كارولينا الشمالية باستخدام تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل للنسخ العكسي (RT qPCR) مع مجموعة RNA / DNA الممرضة 5X MagMAX (Thermo Fisher Scientific) ومجموعة VetMAX PRRSV qPCR (Thermo Fisher Scientific). كان مصل المصل الملقح سالبًا لـ PRRSV (qPCR) عند التخدير على النحو الذي حدده مختبر التشخيص البيطري بجامعة ولاية أيوا (ISU VDL ، Ames ، IA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب قيم ∆Ct بطرح قيمة Ct لعينة من قيمة Ct التي تعتبر PRRSV سالبة (Ctneg=37) لـ PRRSV: ∆Ct=37 - Ctx.

2.4 تحييد التحقق من صحة الأجسام المضادة وتحديد العينات الإيجابية

تم شحن عينات مصل من الخنازير والخنازير إلى مختبر أبحاث وتشخيص الحيوانات بجامعة ولاية ساوث داكوتا (Brookings ، SD) الذي أكمل PRRSV -2 تحديد الأجسام المضادة (NA) باستخدام FFN و 1-7-4 سلالة التلقيح. النتيجة الإيجابية هي أعلى تخفيف في مصل الدم مع انخفاض بنسبة 90 بالمائة أو أعلى في عدد وحدات تشكيل التركيز البؤري الفلوري [23].

2.5 إجراءات التشريح ، والتسجيل ، وعزل خلايا الأنسجة

في التشريح (2 أو 4 wpi) ، تم التضحية بالحيوانات باستخدام الحقن الوريدي المميت لـ Euthasol (Covetrus ، MW ، 390 مجم / مل بنتوباربيتال ، 50 مجم فينيتوين / مل). بعد ذلك ، تم حصاد الرئتين ، والغدة الصعترية ، و TrBr LNs.

بالنسبة للرئتين ، تم التقاط الصور الظهرية والبطنية ؛ تم مسح الرئتين بـ 1 × PBS لجمع غسل القصبات الهوائية (BAL) وأخذت خمس عينات إجمالية للأنسجة: واحدة من كل من الفص الذيلية الأيمن والأيسر ، والفص الأوسط الأيمن والأيسر ثم واحد من الفص الإضافي. تم تثبيت عينات الأنسجة في مثبت الفورمالديهايد / الزنك (علوم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، PA) لمدة 24 ساعة ، ونقلها إلى 70 في المائة من الإيثانول ، وملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). تم شحن الشرائح الملطخة (علم الأنسجة) وصور الرئة (علم الأمراض الإجمالي) إلى ISU VDL وتم تسجيلها من قبل أخصائي علم الأمراض البيطري التشخيصي الذي أعمى عن العلاجات وتواريخ التشريح ؛ تم إجراء آفة الرئة وتسجيل الالتهاب الرئوي الخلالي كما هو موضح سابقًا [24].

تم تقييم المناظر الظهرية والبطنية لصور الرئة بالنسبة المئوية للرئة المصابة بالالتهاب الرئوي. على وجه التحديد ، تم تقدير النسبة المئوية للالتهاب الرئوي بصريًا لكل فص رئوي ، وتم حساب النسبة المئوية الإجمالية للرئة بأكملها بناءً على النسبة الموزونة لكل فص بالنسبة لحجم الرئة الكلي. يمثل كل من الفصوص القحفية المركزية الأربعة 10 في المائة ، والفص الإضافي 5 في المائة ، ويمثل كل من الفصوص الذيلية 27.5 في المائة من إجمالي الرئة.

تم فحص أقسام الأنسجة الرئوية بشكل أعمى بحثًا عن آفات مجهرية وتم إعطاء كل فص درجة تقديرية بناءً على شدة الالتهاب الرئوي الخلالي على النحو التالي: 0=لا توجد آفات مجهرية ؛ 1=الحد الأدنى من الالتهاب الرئوي الخلالي ؛ 2=التهاب رئوي خلالي خفيف ؛ 3=التهاب رئوي خلالي متوسط؛ 4=الالتهاب الرئوي الخلالي الغزير ؛ 5=التهاب رئوي خلالي شديد متعدد البؤر ؛ 6=التهاب رئوي خلالي شديد ومنتشر. بالنسبة لجميع الأنسجة التي تم جمعها (الرئتين ، الغدة الصعترية ، و TrBr LNs) ، تم تقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة وضغطها من خلال مصافي استنزاف دائرية من الفولاذ المقاوم للصدأ (Grainger ، Lake Forest ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) في أنابيب سعة 50 مل مع PBS المثلج للتخلص منها تعليق خلية واحدة. تم ترشيح الكتل الليفية باستخدام مرشحات 40 ميكرومتر (BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.6. عزل الدم المحيطي ، التحفيز الفيروسي ، وتلطيخ / تحليل IFN- FCM

تم إجراء عزل PBMC باستخدام الطرد المركزي بكثافة Ficoll-Paque (GE Healthcare ، Uppsala ، السويد) وأنابيب SepMate {{1} مل (STEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كولومبيا البريطانية ، كندا) بواسطة بروتوكول الشركة المصنعة. تم الانتهاء من تعداد خلايا PBMC والخلايا المفردة المعلقة على نظام عد خلايا CASY (نظام Schärfe ، الآن: Roche Innovatis AG ، بيليفيلد ، ألمانيا). بالنسبة لفحص IFN- الإنتاج ، تم طلاء 5 × 105 PBMCs والخلايا الليمفاوية من الرئتين ، و TrBr LNs في ثماني مكررات في 96- صفيحة مستديرة القاع (Corning) في 100 ميكرولتر كاملة RPMI واستراح طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي تمت إضافة 100 ميكرولتر من RPMI كاملة تحتوي على سلالة PRRSV 1-7-4 (تعدد العدوى ، وزارة الداخلية=0. 1) إلى كل بئر ؛ تم إرجاع الصفائح إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة من التحفيز الفيروسي.

في آخر 4 ساعات من الثقافة ، تمت إضافة monensin (5 ميكروغرام / مل ، Alfa Aesar ، Haverhill ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمنع إطلاق IFN من الخلايا. عند الانتهاء من الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم تجميع التكرارات وتلطيخها كما هو مذكور في الجدول 1 ؛ في المتوسط ​​، تم تسجيل 276756 خلية ليمفاوية حية واحدة (SLLs) على Cytoflex باستخدام برنامج CytExpert (بيكمان كولتر ، بريا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تحليل البيانات باستخدام الإصدار 10.6.1 من FlowJo (FLOWJO LLC). يظهر التسلسل الهرمي للبوابة لتحليل استجابة IFN في الشكلين 4 و 5 لـ PBMC وفي الشكل التكميلي S1 والشكل 7 لـ BAL وأنسجة الرئة و TrBr LNs.

2.7. تحليل احصائي

تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام Graphpad Prism 8 (برنامج Graphpad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل البيانات التي تحتوي على مجموعة بيانات كاملة إما باتجاهين (طوال الدراسة) أو أحادي الاتجاه (عند التشريح) ANOVAs. تم تحليل البيانات ذات نقاط البيانات المفقودة (ويرجع ذلك أساسًا إلى تشريح 50 في المائة من الخنازير بدقة 2 نقطة في البوصة) بواسطة نموذج التأثيرات المختلطة (الاحتمال الأقصى المقيد ، REML). تم إجراء جميع المقارنات المتعددة باستخدام اختبار المقارنة المتعددة لـ Dunnett. تم إجراء رسم توضيحي للبيانات باستخدام مخططات الكمان التي توضح التوزيع والنقاط الفردية والوسيط (حسب الاقتضاء ، الخط الأسود المتقطع) والفواصل الزمنية 25/75 (كخط ملون قابل للتطبيق). تم إجراء تحليلات الارتباط بين مستويات nAb المذهبة والخنزير الصغير باستخدام معاملات ارتباط بيرسون وفاصل ثقة 95 بالمائة ثنائي الذيل.

3. النتائج

3.1. تصميم الدراسة وفعالية اللقاح - العلامات السريرية ، وفيروسات الدم ، وزيادة الوزن ، وعلم أمراض الرئة

أجريت الدراسة كما هو موضح في الشكل 1. عند تلقيح PRRSV ، أظهرت الخنازير أعراض PRRSV خفيفة تبدأ في غضون 3-4 أيام من الإصابة - حمى [بشكل رئيسي عند 1 wpi ، dns] ، خمول ، انخفاض استهلاك الطعام ، سعال خفيف / عطس. لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية لهذه الأعراض واستمرت بدرجات متفاوتة حتى التشريح. يوضح الشكل 2 viremia ومكاسب وزن الجسم الأسبوعية بالإضافة إلى النتائج الإجمالية والتشريح المرضي.

كما هو مبين في الشكل 2 أ ، كانت جميع الخنازير سلبية PRRSV -2 عند الفطام والتلقيح داخل الأنف باستخدام PRRSV -2 تسبب في حدوث فيروسية بلغت ذروتها عند 2 نقطة في البوصة. على الرغم من عدم وجود اختلاف في الفيروس بين TRT 0 و TRT 2 ، كان لدى TRT 1 انخفاضًا ملحوظًا في فيروسية في الأسبوعين الأولين من مجموعة التحكم TRT 0. كانت زيادة وزن الخنازير في جميع المجموعات متشابهة جدًا في الأسابيع الثلاثة الأولى ؛ ومع ذلك ، في نهاية الدراسة - وبالمقارنة مع TRT 0 - حققت TRT 2 و TRT 1 مكاسب أسبوعية أعلى في الوزن بشكل ملحوظ - الشكل 2 ب. الأهم من ذلك ، في حين أن أمراض الرئة يتم حلها بشكل عام في عدوى PRRSV وبالتالي كانت متشابهة بين المجموعات بدقة 4 نقطة في البوصة (dns) ، فإن كلا من التطعيمات AIV للأم ، لذا TRT 1 plus 2 ، قللت بشكل كبير من أمراض الرئة عند 2 نقطة في البوصة: كلاهما خفض مستويات النسبة المئوية من الآفات العيانية و / أو الالتهاب الرئوي الخلالي (الشكل 2 ج ، د). كان انتشار آفات الرئة العيانية في الرئتين من TRT 0 بين 2 0 - 7 0 في المائة ؛ بالمقابل ، كان انتشار آفة الرئة في معظم الخنازير في TRT 1 + 2 أقل من 20٪ - الشكل 2C. وبالمثل ، في حين أن متوسط ​​درجة التشريح المرضي للالتهاب الرئوي الخلالي في الرئتين من الخنازير TRT 0 كان ثلاثة ، كان 1.8 لـ TRT 1 و 1.2 لـ TRT 2 ، على التوالي. بالمقارنة مع TRT 0 ، يوضح هذا ميلًا نحو الأهمية (ص=0. 07) وانخفاض ملحوظ في التشريح المرضي للرئة في الخنازير من gilts الملقحة بـ AIV - الشكل 2D. توضح هذه البيانات أن لقاح AIV يمكن أن يقلل بشكل كبير من فيروسية وأمراض الرئة ، بالإضافة إلى أنها تظهر أيضًا أن تطعيم الأمهات ضد فيروس نقص المناعة البشرية (PRRSV) -2 يمكن أن يعزز مناعة 2- الخنازير الصغيرة التي يبلغ عمرها أسبوعًا.

3.2 تحريض الأجسام المضادة الأمومية المحايدة ونقلها إلى الخنازير

تم تحليل تحريض الاستجابة المناعية الخلطية في gilts وذريتهم بتحديد NA FFN التتر (الشكل 3).

تحصين جميع المجموعات باستخدام عيار NA المستحث بـ MLV في جيل من أربعة إلى 64 مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الثلاث (dns). في المقابل ، في حين أن التطعيم ضد MLV وحده (TRT 0) لم يتضمن NAs ضد السلالة غير المتجانسة 1-7-4 ، فإن كلا من اللقاحات المضادة للفيروسات القهقرية تزيد من نسبة التتر NA حتى 1:16 (لـ TRT 2) وحتى 1 : 128 (لـ TRT 1) - الشكل 3 أ.

تم نقل NAs المصل هذه من الأم إلى الخنازير (الشكل 3 ب): بينما لم تظهر خنازير TRT 0 أي عيار NA عند 0 wpi ، تمتلك خنازير TRT 1 و TRT 2 مصل NAs للتوتر 1-7-4 من قبل العدوى التي ترتبط ارتباطًا مباشرًا بمستويات NA للأم (الشكل 3C ، r=0. 886 ، p <0. 0 001). انخفضت عيارات NA هذه خلال الأسبوعين الأولين ، قبل أن تستقر بمقدار 4 wpi. ومع ذلك ، مقارنةً بـ TRT 0 ، كان لدى الخنازير الصغيرة من السيلان الملقح بـ AIV (TRT 1 plus 2) عيارات NA أعلى بكثير من المصل قبل التحدي واستمرت هذه التتر المتزايدة حتى 2-3 نقطة في البوصة ، لذلك حتى عمر 4-5 أسابيع - الشكل 3 ب.

For more information:1950477648nn@gmail.com