دراسة على الإنزيمات الميكروبية المنتجة خلال التخمير البكتيري المشترك وأنشطتها البيولوجية ⅲ

الفصل 3 دراسة عن نشاط مضادات الأكسدة للإنزيمات

 

لقد ثبت أن العديد من الأمراض البشرية مرتبطة بـالأكسجين النشط والجذور الحرة، مثلاشتعال, تصلب الشرايين,شيخوخة, السكري, سرطان، إلخ.الجذور الحرة المفرطةفي الجسم يمكن أن يسبب تمسخ البروتين ، تلف الخلايا والموت ، وحتى التغيرات المرضية في الجسم. لذلك ، تبحث العديد من الدراسات في الداخل والخارج عن الأطعمة الغنية بالمكونات الطبيعية المضادة للأكسدة لمنع وتنظيم الأمراض الناجمة عن الجذور الحرة من خلال النظام الغذائي. اليوم ، مع زيادة مستويات المعيشة ، تحول الأشخاص تدريجياً تركيزهم إلى أجسادهم ، لذلك تظهر المزيد والمزيد من المنتجات الصحية في تيار لا نهاية له. ومع ذلك ، ليس من السهل أن تكون مفيدًا حقًا. الإنزيمات هي نوع من الطعام الذي يمكن أن يصنعه بنفسك في حياة الناس. التكلفة ليست مرتفعة للغاية وهناك العديد من الفوائد.
تحتوي الإنزيمات الميكروبية على مجموعة متنوعة من الوظائف الصحية مثل مضادات البكتيريا ومضادة للالتهابات ، وتعزز التمثيل الغذائي ، وتحسين المناعة ، والتبييض ، ومضاد للشيخوخة ، وإزالة السموم ومضاد للسرطان. في الوقت الحاضر ، هناك عدد قليل نسبيًا من الدراسات حول خصائص مضادات الأكسدة للإنزيمات الميكروبية في الداخل والخارج ، لذلك نخطط لإجراء أبحاث متعمقة عليها. تأخذ هذه الورقة إنزيم Apple ككائن بحث ، وتستخدم محتوى الفينول الكلي ، مما يقلل من الطاقة ، DPPH · الجذور الحرة ، · OH الجذرية الحرة ، الجذرية الحرة الفائقة ، ABTS ABTS Free Radical Climpling Conshends كتحقيقات في إجراء تحقيق شامل ومنهجي لإنزيم التفاح بعد التخمير لمدة 3 أشهر. تمت دراسة تكوين ومحتوى المكونات النشطة المضادة للأكسدة ، وتم فهم نشاطه المضاد للأكسدة.

الأعشاب الجديدة cistanche مع قوة مضادة للأكسدة أكثر بكثير من تخمير البكتيريا

خدمة داعمة لـ Wecistanche-أكبر مصدر Cistanche في الصين:
البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 المواد والأساليب

3.1.1 المواد

(1) المواد التجريبية
اغسل التفاح الطازج بماء معقم في ظل ظروف معقمة ، وتجفيفها بشكل طبيعي في طاولة تشغيل معقمة ، وقشرها ، وشريحةها للاستخدام لاحقًا. يُضاف السكر الأبيض والتفاح في جرة زجاجية معقمة بنسبة الكتلة من 1: 1. قم بتنشيط البكتيريا المطلوبة للتجربة وتلقيحها في الإنزيم وفقًا للمخطط الأمثل (تم حذف خطوة العملية هذه في مجموعة التحكم) ، وقم بإغلاقها ووضعها في مكان بارد وجاف. بعد 3 أشهر من تخمير درجة حرارة الغرفة ، خذ عينة للحصول على سائل الإنزيم بأكمله يحتوي على اللب ، وتصفيةه. خذ طافًا كعينة تجريبية ، وطرد الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في الطرد المركزي عالي السرعة قبل تحديد البيانات ذات الصلة. تجدر الإشارة إلى أنه في عملية صنع الإنزيمات ، من أجل تجنب التلوث غير الضروري ، يتم تنفيذ جميع عملياتنا في ظل ظروف معقمة.

(2) الأدوات الرئيسية
مقياس الطيف: V -1100 ، مصنع أداة شنغهاي العلمي ؛
حمام ماء درجة حرارة ثابتة: HH -2 ، شركة Wuhan Litian Technology Co. ، Ltd. الأدوات الأخرى هي نفسها 2.1.3.

3.1.2 الطرق

(1) تحديد محتوى الفينول الكلي [53]
① تحضير المنحنى القياسي:
وزن بدقة {0}}. خذ 8 Clean 1 {{1 0}} ml قوارير حجمية ، أضف 0 ، 0.2 ، 0.4 ، 0.6 ، 0.8 ، 1.0 ، 1.2 ، و 1.4 مل من محلول حمض الغالك ، على التوالي ، قم بتخفيفه مع الماء المائل ، إضافة 1 ml من المقاومة الورقية و 2 م. دقيقة ، بارد وترفض إلى 20 مل ، وضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الامتصاص A عند الطول الموجي الذي يبلغ 650 نانومتر ، ورسم منحنى قياسي مع الامتصاص A كمحور أفقي وتركيز العينة كمحور رأسي. ② الكشف
يُضاف الماء المقطر إلى 100 ميكرولتر ، 200μL ، 300 ميكرولتر ، 400 ميكرولتر ، و 500 ميكرولتر إلى 46 مل ، ثم أضف 1 مل من كاشف فولن-فينول ، يخلط بالتساوي ، ويتفاعل مع 3 دقائق ، ثم أضف 3 مل من NACO3 ، واهزح في حوض مياه ثابت 25 درجة 2H ، استخدم المياه المقطوعة ، وقياسها بامتصاصها في AN A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Aا مقياس الطيف. يتم التعبير عن إجمالي محتوى الفينول على أنه معادل حمض الغال ، ويتم حساب إجمالي محتوى الفينول وفقًا لمعادلة المنحنى القياسية.

(2) اختبار التخفيض [54]
أضف 1 0} 0 μl ، 2 0 0μl ، 300μl ، 400μl ، و 500μl من العينة إلى 2.5 مل من البوتاسوم ( درجة لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 2.5 مل من حمض الترايكلورو أسيتيك (ث/ت) مع تركيز الكتلة 10 ٪ ، والطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في الطرد المركزي عالي السرعة. مباشرة بعد إخراجها ، خذ 2.5 مل من طاف إلى قارورة حجمية ، أضف 2.5 مل من الماء المقطر و 0.5 مل من كلوريد الحديديك (ث/ت) مع تركيز الكتلة 0.1 ٪. استخدم الماء المقطر كعنصر تحكم فارغ ، وقياس الامتصاصية A على طول موجة 700 نانومتر باستخدام مقياس الطيف. يمكن الحكم على قوة تقليل القوة من خلال قيمة الامتصاصية. كلما زادت قيمة الامتصاصية ، زادت قوة الحد من القوة.

 

(3) تحديد تأثير الكسح الجذري الخالي من الأوكسيد الفائق [55]

خذ 4.5 مل من 0. أضف 1 مل من محلول عينة الإنزيم مع تركيزات 10 ٪ و 20 ٪ و 30 ٪ و 40 ٪ و 50 ٪ و 0.4 مل من محلول البيروغالول 25 مليمول/لتر على التوالي. تخلط جيدا وتفاعل في حمام مائي 25 درجة لمدة 5 دقائق. أضف 1.0 مل من 8 مول/لتر HCL لإنهاء التفاعل. استخدم Tris-HCL Buffer كمرجع واستخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس الامتصاصية A عند طول موجي يبلغ 299 نانومتر لحساب معدل الكسح. بالنسبة لمجموعة التحكم الفارغة ، تم استخدام 1 مل من المذيب بدلاً من العينة. تم حساب معدل scavenging O {26}} وفقًا للصيغة 3.1: O 2- معدل scavenging (٪)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) حيث: a1 هو امتصاص أنبوب الفراغ ؛ A2 هو امتصاص العينة.

(4) تحديد تأثير الكسح على جذور الهيدروكسيل [56]

1 0 0μl ، 200μl ، 300μl ، 400μl ، تمت إضافة محلول عينة 500 ميكرولتر مع الماء إلى 2 مل ، ثم تمت إضافته إلى 1.4 مل من بيروكسيد الهيدروجين مع تركيز الكتلة المولي من 6 ملمول/لتر ، ثم يضاف مع 0.6 مل من ساليسيليت الصوديوم مع تركيز الكتلة 20mmol 20ml و 2ml من ferros من ferros. 1.5mmol/L ، وتسخين في حمام ماء درجة حرارة ثابتة في 37 درجة لمدة 1 ساعة. اضبط الصفر بالماء المقطر ، وقياس الامتصاصية A عند طول موجة قدره 562 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. أداء 3 مكررات لكل علاج. احسب معدل الكسح الجذري للهيدروكسيل وفقًا للصيغة 3.2: معدل الكحول الجذري للهيدروكسيل (٪)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.2) حيث: A1 هو متوسط ​​امتصاص الفراغ ؛ A2 هو متوسط ​​امتصاص محلول العينة. (5) تحديد تأثير الكسح الجذري الحرة DPPH [57]

الأعشاب الجديدة cistanche مع قوة مضادة للأكسدة أكثر بكثير من تخمير البكتيريا

 

ماصة بدقة 2 مل من محلول عينة الإنزيم مع تركيزات من 1 0} ، 20 ٪ ، 30 ٪ ، 40 ٪ ، و 50 ٪ في قارورة حجمية 10 مل ، ثم أضف 2 مل من 80 ٪ من محلول الإيثانول الإيثانول إلى قارورة التبريد. تركيز الكتلة المولي هو 2 × 10-4 mol/l. بعد الخلط ، دعها تقف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. باستخدام محلول الإيثانول بنسبة 80 ٪ كمرجع ، قم بقياس امتصاص العينة بطول موجة قدره 517 نانومتر ، والذي يتم تسجيله كـ A1. مزيج 2 مل من محلول DPPH و 2 مل من محلول الإيثانول مع تركيز الكتلة 80 ٪ وقياس امتصاصها في نفس الطول الموجي ، والتي يتم تسجيلها على أنها A0. مزيج 2 مل من محلول الإنزيم ومحلول الإيثانول 2 مل مع تركيز الكتلة 80 ٪ وقياس امتصاصهم في نفس الطول الموجي ، والذي يتم تسجيله كـ A2. احسب معدل الكسح الجذري الحرة DPPH وفقًا للصيغة 3.3:
DPPH Free Radical Scavenging Rate (٪) {{0}}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) حيث: A1 هو امتصاص 2 ml dPPH 80 ٪ ethanol aque. A2 هو امتصاص محلول مختلط من محلول إنزيم 2 مل و 2 مل 80 ٪ من الإيثانول بتركيز الكتلة ؛ A0 هو امتصاص محلول مختلط من محلول DPPH 2 مل و 2 مل 80 ٪ من الإيثانول عن طريق تركيز الكتلة.

(6) ABTS Free Radical Scavenging القدرة [58]
أضف كمية معينة من كبريتات البوتاسيوم إلى محلول ABTS 7 مليمول/لتر حتى يكون التركيز النهائي للمحلول المختلط 2.45 مليمول/لتر. ضع المحلول المختلط في مكان بارد وجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 إلى 16 ساعة. تم استكمال 1μL ، 3μL ، 5μL ، 7μL ، و 9μL من محلول العينة إلى 10 ميكرولتر مع 5 ملمول/لتر PH7.4 المخزن المؤقت الفوسفات ، ثم تم خلطه بالتساوي مع 10 مل من كبريتات البوتاسيوم أعلاه ومحلول مختلط ABTs ، وسمح للتفاعل عند درجة حرارة التفاعل 30 درجة ومراعم 5 دقائق. الصفر مع الماء المقطر ، وقياس الامتصاصية A على طول موجة 734nm باستخدام مقياس الطيف. احسب معدل الكسح الجذري ABTS وفقًا للصيغة 3.4:
ABTS Free Radical Scavenging Rate (٪)=[(A 1- A2)/A1] × 100 (3.4) حيث: A1 هو امتصاص مجموعة التحكم الفارغة ؛ A2 هو امتصاص المجموعة التجريبية

 

3.2 النتائج والتحليل

3.2.1 إجمالي محتوى الفينول

(1) منحنى قياسي
تم رسم المنحنى القياسي لمحتوى الفينول الكلي مع تركيز حمض الغالك كمحور أفقي وقيمة الامتصاصية A كمحور رأسي ، كما هو مبين في الشكل 3.1.

 

الشكل 3.1 المنحنى القياسي لمحتوى الفينول الكلي

من Fig.3.1 ، يمكننا أن نرى أن معادلة المنحنى القياسية هي y =11. 375x +0. 2593 (x هو تركيز العينة ، y هو الامتصاص) ، r 2=0.

(2) تحديد العينات

يظهر الشكل 3.2 نتائج تحديد محتوى الفينول الكلي لإنزيمات التفاح في المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية بتركيزات مختلفة.

 

 

 

Fig.3.2 منحنى محتوى الفينول الكلي

كما هو مبين في الشكل 3.2 ، فإن إنزيمات Apple في كل من مجموعة التحكم والمجموعة التجريبية لها محتوى فينول إجمالي مرتفع ، وكلاهما يزداد مع زيادة كمية محلول العينة المضافة. في نفس التدرج التركيز ، زاد المحتوى الفينولي الكلي لإنزيم Apple في المجموعة الضابطة من 0. المحتوى الفينولي الكلي للمجموعة التجريبية أعلى بكثير من مجموعة التحكم ، والاتجاه الصعودي أكثر وضوحًا. وفقًا لمحتوى الفينول الكلي ، يكون النشاط الإجمالي المضاد للأكسدة للمجموعة التجريبية أكبر من النشاط الضابطة.

 

3.2.2 تقليل الطاقة

يوضح الشكل 3.3 نتائج تقليل تحديد الطاقة من إنزيمات التفاح في المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية بتركيزات مختلفة.

 

كما هو مبين في الشكل 3.3 ، فإن الاتجاه المتغير لتقليل قوة إنزيمات التفاح يشبه الاتجاه المتغير لمحتوى الفينول الكلي. تكون القدرة المخفضة للمجموعة التجريبية أعلى من قوة المجموعة الضابطة ، وما إذا كانت المجموعة التجريبية أو المجموعة الضابطة ، ضمن نطاق التركيز المقدم في التجربة ، تُظهر قوة الحد من الاتجاه المتزايد مع زيادة كمية محلول العينة. أكدت البيانات التجريبية أيضًا أنه من حيث الحد من الطاقة ، فإن نشاط مضادات الأكسدة للمجموعة التجريبية أكبر من مجموعة التحكم.

 

 

3.2.3 Superoxide أنيون الحرة الجذرية الكسح القدرة

يوضح الشكل 3.4 نتائج قدرة الأنيون الخالية من الأوكسيد الحرة على أنزيمات التفاح في المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية بتركيزات مختلفة في الشكل 3.4.

كما هو مبين في الشكل 3.4 ، هناك اختلاف كبير في قدرة الكسح الجذرية الخالية من الأوكسيد الفائقة بين المجموعة التجريبية ومجموعة التحكم. ضمن نطاق التركيز المقدم في التجربة ، تتغير قدرة الغطاء الجذري الخالي من الأوكسيد الخالي من الأوكسيد بشكل كبير عندما يكون تركيز العينة 10 ٪ إلى 20 ٪ ، والتغيير غير واضح بعد أن يكون التركيز أكبر من 20 ٪ ؛ عندما يكون التركيز 50 ٪ ، تكون قدرة الكسح الجذرية الخالية من الأوكسيد الفائقة تصل إلى 85.4 ٪. يمكن رؤية قدرة الكسح الجذرية الخالية من أكسيد الأوكسيد التي تظهرها مجموعة التحكم بوضوح من مخطط الاتجاه. مع زيادة تركيز الإنزيم ، تزداد قدرة الكسح الجذرية الحرة أيضًا ، وتتغير ببطء ، وتميل تدريجياً إلى حالة مستقرة. تصل قدرة الكسح إلى 42.6 ٪ كحد أقصى. المجموعة التجريبية ما يقرب من ضعف عدد المجموعة الضابطة.

 

 

3.2.4 هيدروكسيل القدرة على الكسح الجذرية الحرة

يوضح الشكل 3.5 التغيرات في التغيرات في قدرة هيدروكسيل الجذرية الجذرية لإنزيمات التفاح في المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية بتركيزات مختلفة.

 

 

Fig.3.5 منحنى الكسح هيدروكسيل الحرة الجذرية

 

يمكن أن نرى من الشكل 3.5 أنه ضمن نطاق التركيز المقدم في التجربة ، زادت قدرة الهدروكسيل الجذرية الحرة للإنزيمات في المجموعة التجريبية وزادت المجموعة الضابطة مع زيادة الكمية المضافة. كانت قدرة الكسح الجذرية الخالية من الهيدروكسيل للمجموعة التجريبية أقل من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة ، وأداءها بشكل سيء للغاية بتركيزات منخفضة. بتركيزات عالية ، زادت قدرة الكسح الجذرية الخالية من الهيدروكسيل بشكل كبير. قد يكون السبب هو أنه خلال عملية التخمير ، كانت أنواع ومحتويات الكائنات الحية الدقيقة في إنزيمات التفاح في المجموعة التجريبية ومجموعة التحكم مختلفة ، وكانت محتويات المستقلبات الثانوية ومكونات كل منتج ينتج عن التخمير مختلفًا ، لذلك كانت قدرة مضادات الأكسدة مختلفة.

 

3.2.5 DPPH · قدرة الكسح الجذرية الحرة

بالمقارنة مع طرق الكشف الأخرى ، تستخدم DPPH · قدرة الكسح الجذرية الحرة على نطاق واسع لتقييم نشاط مضادات الأكسدة في فترة زمنية قصيرة [59]. تم رسم قدرة DPPH · القدرة على الكسح الجذرية الحرة بتركيزات مختلفة وفقًا لنتائج مجموعة التحكم والإنزيمات التفاح الجماعية التجريبية ، كما هو مبين في الشكل 3.6.

كما هو مبين في الشكل 3.6 ، عندما كان تركيز إنزيم تفاحة المجموعة الضابطة أقل من 30 ٪ ، كانت قدرة DPPH · الحرية المتطرفات الجذرية أقل من 50 ٪ ، لكن إنزيم تفاح المجموعة التجريبية أظهر أيضًا قدرة أعلى من الجذور الجذرية الحرة بتركيزات منخفضة. تُظهر النتائج التجريبية أن إضافة Aspergillus oryzae ، والخميرة ، والمكورات العقدية الحرارية ، واللاكتوبيد البلغارية ، مفيدة لقدرة الكسح الجذرية الحرة للإنزيم. عندما يكون تركيز الإنزيم 50 ٪ ، فإن هذه القدرة تصل إلى 91.4 ٪ ، وهو أعلى بكثير من 69.8 ٪ من المجموعة الضابطة في نفس التركيز.

 

3.2.6 ABTS قدرة الكسح الجذرية

يوضح الشكل 3.7 نتائج قدرة الغزل الجذري ABTS لإنزيمات التفاح في المجموعة الضابطة والمجموعة التجريبية بتركيزات مختلفة.

Fig.3.7 منحنى ABTS الراديكالي سعة الكسح
يمكن أن نرى من الشكل 3.7 أن معدل الكسح لإنزيمات التفاح في المجموعة التجريبية أعلى عندما يكون كمية إضافة الإنزيم أكبر من 5μL. الدراسة التي أجراها إريل وآخرون. أظهرت أن قدرة الكسح لجذور ABTS تعتمد إلى حد كبير على التركيز العالي للمواد الفينولية [60]. أظهرت نتائج تحديد محتوى الفينول الكلي أن إجمالي محتوى الفينول للمجموعة التجريبية كان أعلى من مجموعة المجموعة الضابطة. النتائج التجريبية في الشكل 3.7 فقط تحقق من أن قدرة الكسح لجذور ABTS أكبر من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة.

 

3.3 ملخص هذا الفصل

يدرس هذا الفصل العلاقة بين النشاط المضاد للأكسدة لإنزيمات التفاح التي تنتجها التخمير مع أربع سلالات مختارة من التفاح ، وتركيز عينات الإنزيم ، ومقارنة المكونات النشطة المضادة للأكسدة وقدرة الكسح الجذرية الحرة بين المجموعة التجريبية ومجموعة التحكم. تُظهر النتائج التجريبية أن إجمالي محتوى الفينول في إنزيم التفاح في المجموعة الضابطة أقل من ذلك في المجموعة التجريبية ، وقوتها المتقلبة ، والجذرية الخالية من الأوكسيد ، والجذرية الحرة DPPH ، و ABTS Free Radical Scavenging أفضل من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة ؛ يتمتع الإنزيم في المجموعة الضابطة بقدرة على الكسح بشكل خاص للجذور الحرة هيدروكسيل.
بشكل عام ، أظهرت المجموعة التجريبية نشاطًا أعلى من مضادات الأكسدة ، مما أكد كذلك جدوى إضافة سلالات مصطنعة لصنع الإنزيمات الميكروبية. وبهذه الطريقة ، تتمتع أطعمة الإنزيم الميكروبية بمزيد من المواد المفيدة لصحة الإنسان على أساس التخمير الطبيعي الأصلي ، ويمكن أن تتطور بشكل أفضل في الاتجاه المتوقع من قبل الناس.