MicroRNA المشتق من الحليب الخارجي -2478 يمنع تكون الميلانين من خلال مسار Akt-GSK3

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

In-Seon Bae و Sang Hoon Kim

الملخص:تشارك Exosomes في الاتصال بين الخلايا عن طريق نقل الجزيئات من الخلايا المتلقية donorto. توجد Exosomes في سوائل الجسم المختلفة ، بما في ذلك الدم والبول والسائل الدماغي النخاعي والحليب. تحتوي exosomes الحليب على العديد من جزيئات microRNA الذاتية. MicroRNAs هي رنا صغيرة غير مشفرة ولها أدوار مهمة في العمليات البيولوجية. الوظائف البيولوجية المحددة لإكسوزومات الحليب ليست مفهومة جيدًا. في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في آثاراللبنعلى إنتاج الميلانين في خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغية. لقد وجدنا أنانخفضت exosomes الحليبمحتويات الميلانين ، نشاط التيروزيناز ، والتعبير عن الجينات المرتبطة بتكوين الميلانين في خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغية. إن miR الخاص بالأبقار -2478 في exosomes يثبط إنتاج الميلانين. وجدنا أن Rap1a هو جين مستهدف مباشر لـ miR -2478 في خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغية. قلل تعبير MiR -2478 من تعبير Rap1a ، مما أدى إلى تقليل إنتاج الميلانين وتعبير الجينات المرتبطة بتكوين الميلانين. انخفض تثبيط تعبير Rap1aتكون الميلانينمن خلال مسار إشارة Akt-GSK3. تدعم هذه النتائج دور miR -2478 المشتق من Milkexosomes كمنظم لـتكون الميلانينمن خلال الاستهداف المباشر لـ Rap1a. تظهر هذه النتائج أن إكسوسومات الحليب يمكن أن تكون مكونات مستحضرات تجميل مفيدة لتحسينهاتبييض.

الكلمات الدالة: تكون الميلانين;exosome الحليب؛ miR -2478 ؛ Rap1a

الأعشاب cistanchesهو مكون مثبط للميلانين

1 المقدمة

Cosmeceutical هي كلمة مركبة تجمع بين مستحضرات التجميل والأدوية وتشير إلى مستحضرات التجميل بمكونات وظيفية لها تأثيرات طبية [1]. في الماضي ، كان الجلد يتحسن من خلال الإجراءات الجلدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، ازداد الاهتمام بالمستحضرات التجميلية بسبب رغبة المستهلكين في الحصول على هذه التأثيرات من خلال مستحضرات التجميل ، كما أظهرت صناعة مستحضرات التجميل اهتمامًا متزايدًا في السنوات الأخيرة باستخدام مكونات مستحضرات التجميل الحديثة [ 2]. تشمل مستحضرات التجميل الوظيفية المنتجات التي تساعد على تبييض البشرة عن طريق منع ترسب الميلانين على الجلد.

الميلانين ، عنصر مهم يحدد لون الجلد والشعر ، يحمي الجلد من الأشعة فوق البنفسجية [3]. ومع ذلك ، فإن التكوين المفرط للميلانين يسبب لهجة غير لامعة ، على سبيل المثال ، البقع والنمش [4]. عامل نسخ صغر العين (MITF) هو منظم رئيسي لتطور الخلايا الصباغية. Tyrosinase (TYR) هو أهم إنزيم لتخليق الميلانين. يتم تحفيز عملية تصنيع الميلانين عن طريق تنشيط TYR عبر MITF ، وهو إنزيم مهم يشارك في المرحلة الأولية من عملية تخليق الميلانين ويستخدم الشكل L من التيروزين أو DOPA كركيزة لتشكيل الميلانين [5].

MicroRNAs (miRs) عبارة عن رنا قصيرة غير مشفرة تشارك في العديد من العمليات البيولوجية من خلال التحكم في التعبير الجيني بعد النسخ [6]. كشفت الدراسات أيضًا عن التحكم في تخليق الميلانين الحيوي بواسطة الرنا الميكروي. على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن أن miR -143-5 p يستهدف جين Tak1 ويقلل من تعبير MITF ، وبالتالي يمنع تكوين الميلانين [7]. MiR -125 b ، منظم سلبي لـتكون الميلانين، تم إثبات أنه ينظم جين التصبغ SH3BP4 [8] ، و miR -675 في exosomes الذي يفرز من مثبطات الخلايا الكيراتينيةتكون الميلانينمن خلال استهداف MITF [9].

Exosomes هي عبارة عن حويصلات ذات غشاء يتراوح حجمها بين 30-200 نانومتر وتحتوي على DNA و RNA و peptides [10]. يمكن للمكونات الداخلية للإكسوسومات أن تنقل المعلومات بأمان إلى الخلايا المجاورة أو البعيدة دون أن تتحلل بفعل الإنزيمات الموجودة في السوائل البيولوجية ، وبالتالي تؤثر على البيئة الدقيقة حول الخلايا المختلفة [11].exosomes الحليبهي حويصلات خارج خلوية مشتقة من الحليب تكون مستقرة في عمليات الجهاز الهضمي للإنسان [12]. لا تحتوي الإكسوسومات المستخرجة من حليب الأبقار على العديد من البروتينات فقط مثل الكازين واللاكتوجلوبولين ، بل تحتوي أيضًا على جزيئات الحمض النووي الريبي الدقيقة ، التي تعمل كبضائع [13-15]. يحتوي حليب الأبقار على جزيئات الحمض النووي الريبي الدقيقة المرتبطة بالمناعة مثل miR -15 b و miR -27 b و miR -34 a و miR -10. هذه الـ microRNAs متوفرة بكثرة في اللبأ [16].

أظهرت بعض الدراسات أن مكونات الحليب تمنعتكون الميلانينفي الخلايا الصباغية ؛ على سبيل المثال ، البروتينات مثل -lactoglobulin وبيتا-كازين في الحليب تنظم تكوين الميلانين [17 ، 18]. تم العثور على طاف من Lactobacillus helveticus NS 8- للحليب المخمر لمنع تلف الأشعة فوق البنفسجية وفرط تصبغ الجلد [19]. ومع ذلك ، لا يوجد تقرير حتى الآن حول ما إذا كانت الجزيئات الدقيقة الموجودة في حليب الأبقار متورطة في الجلدتبييض، على الرغم من وجود 79 ميكرو آر إن إيه فيexosomes الحليب[13]. لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بفحص ما إذا كانت exosomes الحليب التي تحتوي على microRNAs تمنع تخليق الميلانين في خلايا الورم الميلانيني البشري والفئران والخلايا الصباغية.

2. المواد والأساليب

2.1. زراعة الخلايا

تمت زراعة خلايا سرطان الجلد B16F10 في وسط Dulbecco المعدل النسر (DMEM ، Hyclone ، Logan ، UT ، الولايات المتحدة الأمريكية). نمت خلايا الورم الميلانيني البشري MNT -1 في الحد الأدنى من المتوسط ​​الأساسي (MEM ، Hyclone). تم استكمال جميع الوسائط بنسبة 10 بالمائة من مصل الأبقار (FBS ، Hyclone ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 بالمائة من محلول البنسلين الستربتومايسين. تم الحفاظ على الخلايا الصباغية البشرية الطبيعية (NHEM ، PromoCell ، Heidelberg ، ألمانيا) عند رقم 5 أو 6 في وسط نمو الخلايا الصباغية (PromoCell). تم تحضين هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون.

2.2. تنقية Exosomes

تم طرد الحليب التجاري (1 مل) عند 2 000 × جم لمدة دقيقة واحدة 0 ، ثم تم طرد الطاف عند 1 0 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق. تم تمرير المادة الطافية للحليب من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر ثم مرشح 0.2 ميكرومتر. تم خلط المحلول الناتج (300 ميكرولتر) مع محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) و 300 ميكرولتر من محلول Exoquick Exosome لمحلول الترسيب (Systems Biosciences ، Palo Alto ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وحضنت لمدة 30 دقيقة. تم الطرد المركزي للخليط عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة للحصول على حبيبات exosome ، والتي تم إعادة تعليقها بعد ذلك في PBS. تم تحديد توزيع حجم exosomes على Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments ، Almelo ، فرنسا). تم تخزين الإكسوسومات عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.

2.3 المجهر الإلكتروني بالتبريد

تم امتصاص قسامة 3 ميكرولتر من تعليق exosomes الطازج إلى شبكة مثقبة ومغلفة بالكربون متوهجة (2 / 2-3 C C-flat ؛ Protochips ، موريسفيل ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والتي تم مسحها بعد ذلك لمدة 3 ثوانٍ في 4 درجات مئوية ومجمدة باستخدام Vitrobot Mark IV (Thermo FisherScientific ، Lafayette ، CO ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تخزين الشبكات في نيتروجين سائل ، ثم نقلت إلى حامل عينة Gatan 626 cryo (Gatan ، Pleasanton ، CA ، USA). تم تصوير العينات بتكبير اسمي قدره 29 ، 000 × في مجهر إلكتروني تجميد (FEI Tecnai F20 TEM ، FEI ، Hillsboro ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مزود بمسدس انبعاث ميداني قياسي (s-FEG) و كاميرا K2Summit (جاتان) بجهد متسارع 200 كيلو فولت.

2.4 فحص قابلية الخلية (WST Assay)

تم زرع خلايا الميلانوما (B16F10 ، MNT -1) والخلايا الصباغية البشرية (NHEM) عند 4 × 103 خلايا / بئر في 96- أطباق جيدة وتم معالجتها باستخدامexosomes الحليب(20 و 50 ميكروغرام / مل) أو تقليد microRNA (قليل النوكليوتيدات RNA مزدوج حبلا) لكل تجربة. في النقاط الزمنية المحددة ، تم قياس صلاحية الخلية باستخدام مجموعة اختبار صلاحية الخلية المحسنة EZ-CyTox (Daeil Lab Service ، سيول ، كوريا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي Vmax (الأجهزة الجزيئية ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.5 قياس محتوى الميلانين

تم علاج خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغيةexosomes الحليب(20 و 50 ميكروجرام / مل) لمدة 48 ساعة. بعد الغسيل مرتين باستخدام PBS المثلج ، تم طرد الخلايا عند 2500 × جم لمدة 10 دقائق. تم إعادة تعليق حبيبات الخلايا عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 1 N هيدروكسيد الصوديوم تحتوي على 10 في المائة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. تم قياس محتوى الميلانين الكلي على مقياس الطيف الضوئي Vmax (الأجهزة الجزيئية) عند 405 نانومتر.

2.6. فحص نشاط التيروزيناز

تم تحضين خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغيةexosomes الحليبلمدة 48 ساعة. تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ومحلول ببرنامج تلفزيوني يحتوي على 1 في المائة من تريتون X -100 و 0. 1 ملي فينيل ميثان سلفونيل فلوريد. بعد الطرد المركزي ، تم جمع المادة الطافية ونقلها إلى لوحة بئر 96-. بعد إضافة 0. 1 مل -3 ، 4- ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين ، تم تحضين العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم قياس نشاط التيروزيناز على أساس الامتصاصية عند 475 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة (الأجهزة الجزيئية).

الأعشاب cistanches

2.7. أنسجة جلد الإنسان

تم الحصول على معادلات البشرة التي تحتوي على الخلايا الصباغية (MelanoDerm، MEL -300 B) من MatTek (Ashland، MA، USA) وتم الاحتفاظ بها في وسط EPI -100- NMM -113-.exosomes الحليبتم تطبيقه على أنسجة MelanoDerm في الأيام 1 و 3 و 7 و 9 و 12. تم استخدام PBS كعنصر تحكم سلبي. تم تصوير المناديل في الأيام 3 و 7 و 9 و 12 و 14. تم قياس التصبغ من خلال مقارنة التغييرات في قيمة L (Adobe PhotoshopCC 2015). تم قياس محتويات الميلانين في أنسجة جلد الإنسان في اليوم 14 بواسطة مقايسة Solvablemelanin. باختصار ، تم إذابة أنسجة MelanoDerm باستخدام Solvable (PerkinElmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وحضنت طوال الليل عند 60 درجة مئوية. تم تدوير العينات ثم طردها عند 16500 × جم لمدة 5 دقائق. تم نقل المادة الطافية إلى آبار لوحة البئر 96- وقراءتها عند 490 نانومتر بواسطة مقياس طيف ضوئي.

3. النتائج

3.1. توصيف Exosomes المعزولة من الحليب

لاستكشاف خصائص exosomes المستخرجة من حليب الأبقار ، قمنا أولاً بقياس حجم exosomes عن طريق تشتت الضوء الديناميكي. ونتيجة لذلك ، وجد أن قطر الإكسوسومات المستخرجة من الحليب يتراوح بين 80 و 190 نانومتر (الشكل 1 أ). إلى عن علىاللبنالتنقية ، تم طرد خليط Exoquick-milk supernatant للحصول على حبيبات الحليب الخارجية. تم اكتشاف تعبير CD9 و TSG101 و HSP70 كعلامات خارجية في الكريات ، لكن هذه البروتينات لم تكن موجودة في المادة الطافية (الشكل 1 أ). 1 ب). تم العثور على Exosomes لها شكل دائري يصل قطره إلى 200 نانومتر. بعد ذلك ، درسنا ما إذا كانت الخلايا الخارجية المستخرجة من الحليب قد تمتصها الخلايا. تم تحضين خلايا الماوس B16F10 باستخدامexosomes الحليبالمسمى بصبغة الفلورسنت thelipophilic PKH26. نتيجة لذلك ، لاحظنا أن exosomes المسمى كان موجودًا داخل الخلايا (الشكل S1).

3.2 تم قمع نشاط التيروزيناز وإنتاج الميلانين بواسطة Exosomes الحليب في خلايا B16F10

بعد ذلك ، درسنا تأثير الإكسوسومات المستخرجة على حيوية الخلية. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كشفنا أنه لا يوجد فرق كبير في قابلية الخلية للحياة ، بغض النظر عن تركيز الإكسوسوم.

لفحص خلية الجلد المحتملة-تبييضتأثيرexosomes الحليب، تمت معالجة الخلايا بإكسوسومات الحليب. وجدنا أن نشاط التيروزيناز في الخلايا المعرضة لخلايا اللبن بتركيزات 20 أو 50 ميكروغرام / مل تقلص بنسبة 43 في المائة و 59 في المائة على التوالي (الشكل 2 ب). نظرًا لأن تقليل نشاط إنزيم التيروزيناز يمكن أن يثبط تخليق الميلانين الحيوي ، فقد تم قياس محتويات الميلانين بعد العلاج بإكسوسومات الحليب. لاحظنا تثبيط تخليق الميلانين في الخلايا المعرضة لexosomes الحليب(20 أو 50 ميكروغرام / مل) بنسبة 45 في المائة و 55 في المائة على التوالي (الشكل 2 ج). علاوة على ذلك ، انخفض التعبير عن MITF mRNA مع زيادة تركيز exosomes الحليب. انخفض مستوى MITF مرنا بنسبة 59 في المائة في الخلايا المعالجة بـ 20 ميكروغرام / مل من exosomes وبنسبة 84 في المائة في الخلايا المعالجة بـ 50 ميكروغرام / مل exosomes ، على التوالي (الشكل 2 د). تقلص أيضًا تعبير مرنا Tyrosinase (TYR) بنسبة 49 في المائة و 76 في المائة في الخلايا المعرضة لتركيزات الإكسوسومات هذه (الشكل 2 د). كما انخفضت مستويات بروتين MITF و tyrosinase مع تركيز الحليبexosomesزاد (الشكل 2E). تشير هذه النتائج إلى أن exosomes الحليب تمنع تكون الميلانين في خلايا الماوس B16F10.

3.3 تعمل miR الخاصة بالأبقار -2478 من Exosomes الحليب على منع تكون الميلانين

لتحديد ما إذا كانت miR -2478 مشتقة منexosomes الحليبيؤثر بشكل مباشر على تكون الميلانين ، فقد تم نقل مثبط miR -2478 إلى الخلايا المعرضة لخلايا اللبن (50 ميكروغرام / مل). في وجود exosomes الحليب ، أظهرت خلايا B16F10 المنقولة باستخدام مثبط ثيم {4}} نشاطًا أعلى بكثير للتيروزيناز مقارنةً بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 4 أ). كانت محتويات الميلانين أيضًا أعلى في الخلايا المعالجة بمثبطات miR -2478 عنها في خلايا التحكم (الشكل 4 ب). كان تعبير MITF mRNA –2. 5- أضعاف في الخلايا المعالجة بمثبط miR 2478 مقارنة بالخلايا الضابطة ، وكان تعبير TYR mRNA - 2- أضعاف عندما تم تثبيط miR -2478 (الشكل 4C ). كما تعافت مستويات بروتينات MITF و TYR في الخلايا المعرضة لهاexosomes الحليببعد أن تم نقل هذه الخلايا باستخدام مثبط miR -2478 (الشكل 4 د). تشير هذه النتائج إلى أن miR -2478 المشتق من exosomes من الحليب يثبط بشكل مباشر تكون الميلانيني في خلايا الورم الميلانيني في الفئران.

3.4. تمنع Exosomes الحليب تكون الميلانين من خلال مسار Akt-GSK3

بعد ذلك ، قمنا بفحص كيفية القيام بذلكexosomes الحليبتنظيمتكون الميلانينلتحديد المسار المتأثر ذي الصلة في خلايا الورم الميلانيني. على الرغم من أنه من غير المعروف ما إذا كان Rap1a يتحكم بشكل مباشر في تكون الميلانين ، فقد تم الإبلاغ عن أن Rap1a يثبط خلايا Akt الفسفرة الحارقة [20]. على أساس هذه المعلومات ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان نمط Rap1a هو مسار Akt للترويج.

في Akt ذات الصلةتكون الميلانينPathway ، Akt المنشط يحث على فسفرة Gsk3 في Ser9 وبالتالي يعطله ؛ يثبط هذا التغيير نشاط النسخ لـ MITF ويقلل من تنظيم التيروزيناز [21،22]. في الدراسة الحالية ، قمنا بتقييم تعبير Akt و GSK3 في الخلايا المعالجة بـ Rap1a siRNA. في هذه الخلايا ، زاد تنشيط الفسفرة Akt وزاد أيضًا مقدار pGSK3 (الشكل 7 أ). تم تعطيل GSK3 عن طريق تنشيط Akt بطريقة تعتمد على التركيز في الخلايا المعالجة بـ 20 أو 50 ميكروغرام / مل منexosomes الحليب(الشكل 7 ب). كانت مستويات البروتينات Akt و GSK3 في الخلايا المعالجة بمحاكاة miR -2478 متوافقة مع النتائج المذكورة أعلاه (الشكل 7C). بعد ذلك ، اختبرنا ما إذا كانت miR -2478 من exosomes الحليب تؤثر على مسار Akt-GSK3. في وجود exosomes الحليب ، كانت فسفرة البروتينات Akt و GSK3 أقل في الخلايا المعالجة بمثبط -2478 ثيم (الشكل 7 د). بالإضافة إلى ذلك ، أدى العلاج باستخدام مثبط AKT GSK690693 إلى زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة بـتكون الميلانينفي الخلايا المعالجة بالحليب الخارجي. (الشكل 7E). تعني هذه النتائج أن miR -2478 فيexosomes الحليبيقلل من تنظيم Rap1a ويمنع تكون الميلانين من خلال مسار Akt-GSK3.

cistanche هيرباتأثير التبييض على الجلد لمضادات الأكسدة

3.8 تمنع Exosomes الحليب تكون الميلانين في خلايا الورم الميلانيني البشري ، والخلايا الصباغية ، وأنسجة ميلانانوديرم

بشرطexosomes الحليبتثبطتكون الميلانينفي خلايا الفئران ، حددنا بعد ذلك ما إذا كانت exosomes الحليب لها نفس الفعالية في الخلايا البشرية. أولاً ، تم فحص جدوى MNT -1 خلايا الورم الميلانيني البشري والخلايا الصبغية البشرية NHEM بعد الحضانة باستخدام 20 أو 50 ميكروغرام / مل من exosomes الحليب. كما هو معروض في الشكل 8 أ ، لم يكن هناك اختلاف في الجدوى. تم تثبيط نشاط التيروزيناز بنسبة 43 في المائة و 85 في المائة ، على التوالي ، في خلايا MNT -1 التي تعرضت لـ 20 ميكروغرام / مل أو 50 ميكروغرام / مل من إكسوسومات الحليب (الشكل 8 ب). تم تخفيض NHEM أيضًا بنسبة 34 في المائة و 66 في المائة ، على التوالي ، من خلال العلاج بـ 20 ميكروغرام / مل أو 50 ميكروغرام / مل من إكسوسومات الحليب (الشكل 8 ب). علاوة على ذلك ، تم قياس محتويات الميلانين في خلايا MNT -1 وتعرض NHEM لإكسوسومات الحليب. نتيجة لذلك ، تعرض تخليق الميلانين في خلايا MNT -1 إلى 20 ميكروغرام / مل أو 50 ميكروغرام / مل منexosomes الحليبتم تثبيطه بنسبة 37 في المائة و 58 في المائة على التوالي ، وفي خلايا NHEM ، أعاق علاج الحليب الخارجي تخليق الميلانين بنسبة 36 في المائة و 62 في المائة على التوالي (الشكل 8 ج). بالإضافة إلى ذلك ، فإن تأثير تفتيح البشرةexosomes الحليبتم تأكيده أيضًا باستخدام أنسجة جلد الإنسان. بعد العلاج بإكسوزومات الحليب في الأنسجة البشرية ، نسبيتبييض لوحظت التأثيرات في الأيام 3 و 9 و 12 و 14. ونتيجة لذلك ، وجدنا أن لون الجلد في الأنسجة المعرضة لخلايا الحليب الخارجية يبدو أكثر إشراقًا من أنسجة التحكم (الشكل 8 د). تم حساب درجة التصبغ كقيمة L ، وهي قيمة تمثل السطوع. تقدم التصبغ بشكل أبطأ في أنسجة الجلد المعالجة بالحليب الخارجي مقارنة بأنسجة الجلد المتحكمة (الشكل 8 د). تعاملت المجموعة التجريبية معexosomes الحليبأظهر حجم جسيم الميلانين أصغر وكمية منخفضة من صبغة الميلانين مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 8E). نتيجة قياس محتويات الميلانين بعد 14 يومًا من exosomes الحليب ، ثبطت تخليق الميلانين في الأنسجة البشرية (الشكل 8F). لذلك ، خلصنا إلى أن اللبنكسوسومات تمنعتكون الميلانينفي الخلايا والأنسجة البشرية.

4. مناقشة

دراسات على تنظيم exosomesتكون الميلانينذكرت أن exosomes المشتقة من الخلايا الكيراتينية لها تأثير تبييض. ترتبط الخلايا الصباغية والخلايا الكيراتينية المحيطة وظيفيًا لتشكيل وحدات الميلانين في البشرة [23 ، 24]. العوامل القابلة للذوبان المشتقة من الخلايا الكيراتينية تنظم تكوين الميلانين للخلايا الصباغية المجاورة. Exosomess المفرز من الخلايا الكيراتينية الطبيعية يعزز تكوين الميلانين عن طريق تنظيم التعبير عنتكون الميلانينالبروتينات ذات الصلة [23-25]. بالإضافة إلى ذلك ، في أتبييضدراسة باستخدام exosomes مستخرجة من الخلايا ، تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن exosomes المستخرجة من الخلايا الجذعية / اللحمية المشتقة من الأنسجة البشرية أظهرت فعالية في تفتيح البشرة في خلايا الورم الميلانيني [26]. كان هناك أيضًا تقرير يفيد بأن الإكسوسومات المستخرجة من النباتات لها تأثير تبييض. أظهرت الحويصلات خارج الخلوية المستخرجة من أوراق نبات د. في دراستنا ، تم التحقيق في تأثير التبييض للأكسوسومات المشتقة من الحليب.

بالمقارنة مع exosomes المستخرجة من بلازما الدم أو سائل المزرعة ، تتمتع exosomes المشتقة من الحليب بمزايا ليس فقط وجود كميات كبيرة من exosomes التي يمكن استخلاصها لكل وحدة حجم ولكن أيضًا بسعر منخفض [26،27]. لانexosomes الحليبلها تركيبة كيميائية مماثلة لتلك الموجودة في أغشية الخلايا ، فهي تظهر أقل مناعة وسمية خلوية ولديها توافق حيوي مرتفع [28 ، 29]. في الآونة الأخيرة ، عندما تم تغذية exosomes الحليب إلى الفئران نموذج التهاب القولون الناجم عن DSS (ملح كبريتات ديكستران) ، انخفض التعبير عن السيتوكينات الالتهابية IL -6 و TNF مقارنةً بالمجموعة الضابطة ، مما يقلل الالتهاب ويحسن التهاب الأمعاء الناخر [30 ، 31]. بالإضافة إلى ذلك ، أدى إطلاق exosomes الحليب في نموذج الفأر لمرض هشاشة العظام إلى تحسين التهاب المفاصل عن طريق زيادة كثافة العظام وتقليل السيتوكينات المؤيدة للالتهابات [32،33]. حتى الآن ، تركزت تأثيرات exosomes الحليب على الظواهر المناعية التي تقلل السيتوكينات الالتهابية ، وعلى نمو العظام ، مثل التخفيف من التهاب الأمعاء وتحسين هشاشة العظام. في هذه الدراسة ، إلى جانب طريقة أخذهاexosomes الحليب، فقد تم التأكيد على أنه عند وضعه على الجلد ، كان فعالاً في البشرةتبييض. يشير هذا إلى أنه يمكن تطبيقه لعلاج الأمراض المختلفة عن طريق تعزيز النشاط الفسيولوجي باستخدام exosomes الحليب في المستقبل.

على الرغم من أن هذه الدراسة اقترحت ذلكexosomes الحليبتعيقتكون الميلانين، من المعروف بالفعل أن بروتينات مصل اللبن مثل الكازين ، -لاكتوغلوبولين ، و -لاكتالبومين لها تأثير مبيض. - يقلل اللاكتوجلوبولين من نشاط التيروزيناز في الخلايا الصباغية البشرية [18] ، ويثبط k-casin تكوين الميلانين في خلايا الورم الميلانيني B16 بالفأر [17]. ومن المثير للاهتمام أن العديد من هذه المكونات موجودة أيضًا في exosomes الحليب. وفقًا للنتائج البروتينية ل exosomes الحليب ، يتم توزيع الكازين ، و -lactoglobulin ، و -lactalbumin في التكسوزومات [15،34،35]. تحتوي exosomes الحليب على microRNAs وكذلك البروتينات. كنتيجة لمصفوفة ميكروية من miRNA باستخدام exosomes الحليب بواسطة Izumi وزملائه ، miR -2478 ، miR -1777 b ، miR -1777 a ، let -7 b ، و miR {{16 }} كانت منتشرة بشكل كبير في exosomes الحليب [13]. في هذه الدراسة ، باستثناء miR -2478 ، من بين هذه microRNAs ، miR -1777 b ، miR {-1777 a ، let -7 b ، و miR -1224 أظهر لا فرق في نشاط التيروزيناز من المجموعة الضابطة (الشكل S2). كانت miR -2478 متوفرة بكثرة فيexosomes الحليبوانخفاض النشاط التيروزيني. ومع ذلك ، فإن التعبير عن جينات MITF و TYR المرتبطة بالتبييض انخفض أكثر في الخلايا المعالجةexosomes الحليبمن الخلايا المعالجة بمحاكاة miR -2478 وحدها. تشير هذه النتائج إلى أن العديد من المكونات ، بما في ذلك microRNAs في Milkexosomes ، متورطة فيتبييضعمل.

تمارس معظم الرنا الميكروي في إكسوسومات الحليب وظائف بيولوجية عن طريق تثبيط التعبير عن الجينات المستهدفة في الخلايا المتلقية. في هذه الدراسة ، أعاق miR -2478 أيضًا تخليق الميلانين عن طريق استهداف Rap1a كجين مستهدف. على الرغم من أنها لم تكن ميكرو آر إن إيه مشتقة من الحليب ، فقد تم بالفعل الإبلاغ عن ميكرو آر إن إيه التي تتحكم في التعبير عن الجينات المرتبطة بالتبييض. عندما تم تطبيق محاكاة miR -27 a -3 p على خلايا mousemelanocytes ، فقد أدى إلى تثبيط تعبير Wnt3a وبالتالي منع تخليق الميلانين [36] ، كما أدى miR خارج الرحم -218 إلى تثبيط نشاط TYR عن طريق تقليل تعبير MITF في الخلايا الميلانينية من الفئران [37]. يتم الترويج لـ miR -203تكون الميلانينمن خلال CREB1 / MITF / Rab27apathway باستهداف Kif5b في سرطان الجلد [38]. هناك 79 ميكرو آر إن إيه في إكسوسومات الحليب

microRNAs فيexosomes الحليبمشتق من الأبقار [13]. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث حول النشاط الفسيولوجي لإكسوسومات الحليب.

5. الاستنتاجات

النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى ذلكexosomes الحليبهم مرشحون لعوامل مضادة للميلانين تقلل التصبغ عن طريق تثبيط التعبير عن الجينات المرتبطة بالميلانين (الشكل 10). في خلايا الورم الميلانيني والخلايا الصباغية ، أظهرت exosomes الحليب تثبيط TYR وخفض محتوى الميلانين مقارنة بالتحكم السلبي. بالإضافة إلى ذلك ، تم التوسط في هذه التأثيرات بواسطة miR -2478 منexosomes الحليب. لذلك ، قد تكون exosomes الحليب مفيدة لتطوير وظيفيتبييضمستحضرات التجميل ذات السمية الخلوية المنخفضة.

cistancheتأثير التبييض على الجلد لمضادات الأكسدة