تثبيت غشاء الميتوكوندريا بواسطة عديد السكاريد Angelica Sinensis في فقر الدم اللاتنسجي المورين

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

الملخص

من أجل التحقيق في آلية تثبيت غشاء الميتوكوندريا بواسطة عديد السكاريد Angelica Sinensis (ASP) في فقر الدم اللاتنسجي الفئران (AA) تم تقسيم الفئران ICR بشكل عشوائي إلى مجموعة تحكم. المجموعات المعالجة AA و ASP عولجت فئران مجموعة AA بـ 60 درجة مئوية وحقن داخل الصفاق من سيكلوفوسفاميد وكلورامفينيكول. عولجت الحيوانات الضابطة بالإشعاع الواقي من الرصاص والحقن بمحلول ملحي. تم تغذية الفئران المعالجة بـ ASP لمدة أسبوعين. لوحظت البنية التحتية الدقيقة للميتوكوندريا لنخاع العظام عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، وتم فحص إمكانات الغشاء للخلايا ذات النواة بالنخاع العظمي (BMNC) عن طريق القياس الطيفي الفلوري. تمت دراسة محتويات Cox و MDH للوسيط أيضًا في المجموعات الثلاث ، انخفض عدد الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء لـ BMNC في نخاع العظم في مجموعة AA مقارنة بمجموعة التحكم ولكن تحسن في المجموعة المعالجة بـ ASP مقارنةً بالمجموعة المعالجة بـ ASP. مجموعة AA. تأخر بشكل كبير انقسام الميتوكوندريا الكامل في المجموعة المعالجة بـ ASP (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

الكلمات الرئيسية: فقر الدم اللاتنسجي ، عديد السكاريد أنجليكا سينينسيس ، الميتوكوندريا ، إمكانات الغشاء ، فئران ICR

مستخلص cistanche: يعزز تكوين العظام ويزيد من كثافة العظام

خلفية

فقر الدم اللاتنسجي (AA) هو اضطراب في الدم يتلف فيه نخاع العظم وخلايا الدم الجذعية المرتبطة به مما يؤدي إلى نقص خلايا الدم الحمراء وخلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية. تُعرف هذه العيوب بشكل فردي باسم فقر الدم ونقص الكريات البيض ونقص الصفيحات على التوالي ، وتُعرف مجتمعة باسم قلة الكريات الشاملة. التعرض للمواد الكيميائية والأدوية والإشعاع والمواد المشعة والأجهزة المنتجة للإشعاع والعدوى. يمكن أن يؤدي مرض المناعة والوراثة (في 50 بالمائة من الحالات) والمسببات غير المعروفة أيضًا إلى تطور AA.

تعتبر الميتوكوندريا "مراكز القوة في الخلية" لأنها تنتج الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق استخلاص الطاقة بشكل منهجي من جزيئات المغذيات (الركائز) [1]. علاوة على ذلك ، يتم نسخ mtDNA بمعدل طفرة مرتفع لأنه يفتقر إلى هيستونات واقية ونظام فعال لإصلاح الحمض النووي. ترتبط الطفرات في mtDNA بأمراض الدم مثل فقر الدم الحديدي الأرومي المكتسب ، ومتلازمات خلل التنسج النقوي ، و AA المكتسب [2-4]. أظهرت دراستنا السابقة 5] أن الضعف الوظيفي في السلسلة التنفسية للميتوكوندريا الناجم عن الطفرات قد يكون متورطًا في فشل تكوين الدم في مرضى AA. بصرف النظر عن السمات المورفولوجية لموت الخلية في نهاية المرحلة (موت الخلايا المبرمج ، أو النخر ، أو البلعوم الذاتي ، أو الانقسام الفتيلي) ، غالبًا ما يكون نفاذية غشاء الميتوكوندريا (MMP) هو الحدث الحاسم بين البقاء على قيد الحياة والموت [6]

وفقًا للطب الصيني التقليدي ، تساعد Angelica Sinensis في توحيد الدم وتعزيز الدورة الدموية [7]. أظهرت الدراسات الحديثة أن مقتطفات من Angelica Sinensis لها تأثيرات مضادة للأكسدة وقائية للأعصاب [8،9]. ومع ذلك ، لا تزال الوظيفة المضادة للأكسدة لـ ASP غير واضحة. فحصت هذه الدراسة الضرر المبكر للخلايا باستخدام منحنى زمن تحلل الميتوكوندريا وتأثير تثبيت غشاء الميتوكوندريا لـ ASP في AA.

مكمل cistanche يزيد من كثافة العظام ويعزز تكوين العظام

المواد والأساليب

تجميع الحيوانات

تم توفير فئران ذكور سليمة من ICR ، تزن 18-22 جم ، وعمرها 6-8 أسبوعًا ، بواسطة مركز الحيوانات التجريبية بجامعة شاندونغ (الصين). تم إيواء الحيوانات في بيئة دافئة وهادئة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء. وتأقلمها لمدة أسبوع قبل بدء التجارب.

تم تقسيم الفئران عشوائياً إلى ثلاث مجموعات: مجموعة عادية ، مجموعة AA ، ومجموعة معالجة على التوالي. تم إنشاء نموذج فقر الدم اللاتنسجي كما هو موضح سابقًا [10].

باختصار ، تم تشعيع الفئران بـ 2. 0 Gy 60Coy ثم عولجت بحقن يومية داخل الصفاق بمقدار 40 مجم / كجم / يوم سيكلوفوسفاميد و 50 مجم / كجم / يوم كلورامفينيكول للأيام الثلاثة التالية. تم تغذية المجموعة المعالجة داخل المعدة بـ ASP (200 مجم / كجم / يوم ، وفقًا للقاموس الطبي الصيني). تم تغذية مجموعة التحكم وفئران مجموعة AA داخل المعدة بمحلول ملحي فسيولوجي (10 مل / كجم / يوم) نظام غذائي مكمل. علاوة على ذلك ، تلقت جميع الفئران نظامًا غذائيًا قياسيًا أثناء الدراسة. بعد العلاج بـ ASP أو محلول ملحي فسيولوجي لمدة أسبوعين ، تم التضحية بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم.

فحص الدم

تم جمع عينات دم الذيل من المجموعات الثلاث في اليوم الأول والرابع عشر على التوالي. تم حساب WBC والصفائح الدموية في عينات الدم المحيطية ، وتم تحديد مستويات خضاب الدم. عند الانتهاء من التجارب ، تم التضحية بالفئران وتم تحضير مسحات عظم الفخذ للعد التفاضلي للخلايا ذات النواة بنخاع العظم (BMNCs) (الشكل 1).

المجهر الإلكتروني للإرسال

تم تلطيخ النخاع الفخذي وتقطيعه إلى شرائح رفيعة للغاية. تم تحليل الميتوكوندريا للخلايا المكونة للدم في نخاع الفخذ وحسابها بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (JEM -2000 EX ، اليابان) تحت 50 مجالًا للرؤية.

منحنى وقت تحلل الميتوكوندريا

تم استخراج الميتوكوندريا من BMNCs الفئران وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة عزل الميتوكوندريا (Pierce Biotechnology Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية). يشير تركيز مونوامين أوكسيديز (MAO) إلى تركيز الميتوكوندريا وتم تحديده باستخدام 200 وحدة / مل من معلقات الميتوكوندريا من 20 مزرعة مصل ، خلال 12 ساعة في نقاط زمنية مختلفة (30 دقيقة على فترات زمنية). كما تم تحديد محتويات السيتوكروم أوكسيديز (كوكس) ومالات ديهيدروجينيز (MDH) في الوسط. أظهر تحليل وقت الذروة لغشاء الميتوكوندريا ومنحنيات وقت تركيز الإنزيم الخاص بالمصفوفة مدى تحلل غشاء الميتوكوندريا.

إمكانات غشاء الميتوكوندريا

بعد الحضانة المسبقة باستخدام MAO أو ASP ، تم تعليق الميتوكوندريا المعزولة من المجموعات الثلاث في 0. 5 مل من محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (Wuhan Boster Biotechnology، Ltd.، China） و 10 ul rhodamine 123 محلول ( تمت إضافة Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية) واحتضانها عند 37 درجة مئوية في 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة.تم تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 490 نانومتر وطول موجة انبعاث 520 نانومتر.

تحليل احصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج SPSS 19. 0. يتم التعبير عن البيانات كوسائل وانحرافات معيارية. تم استخدام اختبار t للطالب لمقارنة المجموعات المختلفة. تم اعتبار P <0. 05="" ذات="" دلالة="">

عشب cistanche: لتحسين جودة العظام

نتائج

تعداد الدم المحيطي و BMC

باستخدام محلل خلايا الدم الأوتوماتيكي بالكامل ، وجد أن عدد خلايا الدم المحيطية و BMCs في فئران AA قد انخفض بشكل ملحوظ (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

البنية التحتية للميتوكوندريا في فئران فقر الدم اللاتنسجي

أظهر الفحص المجهري الإلكتروني لنخاع عظم الفئران AA أن البنية التحتية للميتوكوندريا تحسنت بشكل كبير مع ASP في المجموعة المعالجة (الجدول 2 والشكل 1) ، مما يشير إلى أن ASP يعمل على استقرار الميتوكوندريا في الفئران AA. كان حجم وشكل الميتوكوندريا للمجموعة الضابطة طبيعيين. في المقابل. كانت الميتوكوندريا في مجموعة AA قد وسعت الهياكل الكروية ، إلى جانب اختلال أو اختفاء الكرستاي (الشكل 1 أ-ج).

إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) في فئران فقر الدم اللاتنسجي

نظرًا لأن المجهر الإلكتروني للإرسال كشف عن تلف الميتوكوندريا ، فقد حددنا تأثير ASP على MMP في الفئران AA عن طريق قياس الاختلافات النسبية في مضان Rh 123 بين المجموعات الثلاث باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري.

أظهرت النتائج أن الفلورة Rh 123 لخلايا نخاع العظام في مجموعة AA (19.6 ± 3.03) كانت أقل من تلك الموجودة في المجموعة الضابطة (31.7 ± 2.59 ، P.<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

منحنى وقت تحلل الميتوكوندريا في تلف الخلايا المبكر

في المجموعة الضابطة ، استغرقت محتويات الميتوكوندريا في المزرعة المختبرية Cox و MDH 3.5 ساعة للوصول إلى الذروة. لم يتغير محتوى MAO في المزرعة بشكل كبير بمرور الوقت ، لكن محتويات COX و MDH زادت تدريجياً بمرور الوقت ، ووصلت إلى الذروة ، ثم تنخفض تدريجياً. وهكذا ، استغرقت محتويات الميتوكوندريا الكاملة التي أطلقتها الخلايا حوالي 3.5 ساعة للوصول إلى ذروة الانقسام.

ظهرت قمم COX و MDH في مجموعة AA عند 1.5 ساعة ، 1.375U / ، 36.732U / لتر ، على التوالي. ظهرت قمم COX و MDH في المجموعة المعالجة عند 5.5 ساعة و 6.5 ساعة و 1.341 وحدة / لتر و 33.994 وحدة / على التوالي. تم استخدام مجموعتين من البيانات في كل نقطة زمنية للتحليل الإحصائي. في 1.5 ساعة ، كانت مستويات COX و MDH في مجموعة AA أعلى بكثير مما كانت عليه في المجموعة المعالجة (P <0. 0="" 5).="" لذلك="" ،="" تأخر="" انقسام="" الميتوكوندريا="" الكامل="" في="" المصل="" بشكل="" كبير="" بعد="" إضافة="" asp="" (p=""><0.05) ،="" مع="" انخفاض="" طفيف="" في="" الذروة="" (الشكل="">

مناقشة

فقر الدم اللاتنسجي (AA) هو متلازمة فشل نخاع العظم تتميز بقلة الكريات الشاملة المحيطية ونقص تنسج النخاع. تم إثبات طفرات وعدم استقرار mtDNA في العديد من الأمراض. قد يؤدي الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا وانخفاض عدد الميتوكوندريا إلى تقليل mtDNA ، وقد وُجد أن الحذف المكتسب لـ mtDNA في الحيز المكون للدم يحدث في قلة الكريات الشاملة الشديدة ونقص الكريات البيض الشبكي [11]. بناءً على بحثنا السابق [5] ، قمنا بفحص ما إذا كان ASP يمكنه تثبيت غشاء الميتوكوندريا لفئران AA.

ليس لمركب أنجليكا سينينسيس متعدد السكاريد والحديد (APIC) تأثير علاجي فائق على IDA فحسب ، بل أيضًا على تكميل الدم وتعزيز الدورة الدموية [12]. قد يكون ASP مفيدًا في علاج الأمراض التي يسببها فرط إفراز الهيبسيدين عن طريق منع جانوس كيناز (JAK) ، ابن الأمهات ضد مسارات الكيناز خارج الخلية (SMAD) و 1 الكيناز الخاضع للتنظيم (ERK) لتنظيم تعبير الهيبسيدين في فئران IDA [13 ]. وجد Qin J أن ASP يمكنه تحسين تخليق البروتيوغليكان (PG) للخلايا الغضروفية في نموذج الزراعة العضوية للفئران في الجسم الحي والخلايا الغضروفية المحفزة بـ IL -1 في المختبر من خلال تعزيز التعبير عن aggrecan و GTs المشاركة في تخليق PG [14].

في دراستنا ، تم تحفيز نموذج الماوس AA عن طريق مزيج من أسيتيل فينيل هيدرازين والأشعة السينية وسيكلوفوسفاميد. أظهرت الفئران AA انخفاضًا مهمًا من الناحية الإحصائية في كريات الدم البيضاء في الدم المحيطي ، و Hb ، والصفائح الدموية (الجدول 1) ، وانخفاض شديد في خلايا النخاع العضدي والخلايا السلفية الملتزمة بالنخاع ، وهي خصائص سريرية لـ AA. أظهرت الفئران AA المعالجة بـ ASP زيادة تدريجية في خلايا BM مقارنة بمجموعة AA. بالإضافة إلى ذلك ، تأثر أيضًا عدد الميتوكوندريا في الخلايا المكونة للدم. نتج عن ASP عددًا أكبر بكثير من الميتوكوندريا في المجموعة المعالجة مقارنة بمجموعة AA (الشكل 1). أظهرت هذه النتائج أن ASP يمكن أن يعزز تكاثر الخلايا ذات النواة النخاعية ، وزيادة عدد الميتوكوندريا ، وتثبيت غشاء الميتوكوندريا في الفئران AA.

تنعكس إصابة الميتوكوندريا من خلال تلف mtDNA وانخفاض مستويات نصوص mtRNA ، وتخليق البروتين ، ووظيفة الميتوكوندريا ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الطاقة الخلوية ، وتعطيل إشارات الخلية ، والتداخل مع التمايز الخلوي والاستماتة. علاوة على ذلك ، قد يؤدي نقص إنتاج الـ ATP في الميتوكوندريا إلى تعزيز عدم استقرار الكروموسومات [15]. نظرًا لأن mtDNA يشفر مكونات أربعة من أصل خمسة معقدات تنفسية للميتوكوندريا ، فإن التغييرات في mtDNA تؤدي إلى مرض الميتوكوندريا [16-18]. بصرف النظر عن مرض الميتوكوندريا ، ترتبط الطفرات في mtDNA بالسرطان والسكري. أمراض القلب والأوعية الدموية. الاضطرابات التنكسية العصبية وأمراض الدم مثل اللوكيميا وكذلك عملية الشيخوخة الطبيعية [19]. الأهم من ذلك ، أن طفرات mtDNA ، وكذلك انخفاض عدد نسخ mtDNA ، يمكن أن تكون مسببة للأمراض [20 ، 21]. إن فهم الآليات الخلوية للحفاظ على سلامة mtDNA ورقم النسخ له أهمية قصوى لأنه يمكن أن يوفر أهدافًا للتدخلات السريرية التي تهدف إلى الوقاية والعلاج من أمراض الدم مثل AA. قد تؤدي هذه العوامل أيضًا إلى انخفاض التمثيل الغذائي للطاقة ، مما سيؤثر على التجديد الذاتي والتمايز للخلايا الجذعية المكونة للدم.

تظهر نتائج الدراسة الحالية أن ASP يمكن أن يحسن البنية التحتية للميتوكوندريا ، وقمع التنظيم المنخفض لإمكانات الغشاء وموت الخلايا المبرمج للعناصر النخاعية لعلاج فشل نخاع العظم.

مستخلص الكستانش والكيستانش: عظام بيفيت

مراجع

1 Chinnery PF، Schon EA. الميتوكوندريا. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003 ، 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mitochondrial DNA الطفرات في نظام المكونة للدم. اللوكيميا 2004 ، 18: 18-22.

3. Gattermann N ، Retzlaff S ، Wang YL ، et al. الطفرات النقطية غير المتجانسة للحمض النووي للميتوكوندريا التي تؤثر على الوحدة الفرعية الأولى من السيتوكروم سي أوكسيديز في مريضين مصابين بفقر الدم المجهول السبب.

Kim HR و Shin MG و Kim MJ وآخرون. ميتوكوندريا

4. انحرافات الحمض النووي لخلايا نخاع العظام من مرضى فقر الدم اللاتنسجي. كوري ميد ساي 2008 ، 23: 1062-1067. X Cui و JO Wang و ZG Cai وآخرون. تسلسل كامل

5. تحليل الحمض النووي للميتوكوندريا وطول التيلومير في فقر الدم اللاتنسجي. Int J Mol Med 2014.34: 1309-1314.

6. Chiu TL ، Su CC. يحفز Tanshinone IA موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان الرئة البشرية A549 من خلال تحريض أنواع الأكسجين التفاعلية وتقليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا. Int J Mol Med 2010 ، 25: 231-236.

7. Liu PJ. هسيه WT. هوانغ ش وآخرون. تأثير المكونة للدم للسكريات القابلة للذوبان في الماء من Angelica Sinensis على الفئران المصابة بفقدان الدم الحاد. إكسب هيماتول 2010 ، 38: 437-445.

8. Kuang X و Yao Y و Du JR وآخرون. الدور الوقائي العصبي 8F لـ Z-ligustilide ضد إصابة نقص تروية الدماغ الأمامي في الفئران ICR. Brain Res 20061102: 145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y et al.Radi Angelica Sinensis الذي يحتوي على مكون Z-ligustilide يعزز تكوين الخلايا العصبية لدى البالغين للتوسط في التعافي من الضعف الإدراكي Curr Neurovasc Res 203، 10: 304-315.

10. Chen YF و Wu ZM و Xie C وآخرون: مستوى التعبير عن IL -6 الذي تفرزه خلايا انسجة نخاع العظم في الفئران المصابة بفقر الدم اللاتنسجي ISRN Hematol 2013: 986219.

11. Hatfill SJ ، LaCock CJ ، Laubscher R ، et al. Arole للحمض النووي للميتوكوندريا في التسبب في خلل التنسج النقوي الناجم عن الإشعاع وسرطان الدم الثانوي. Leuk Res 1993،17: 907-913.

12. Wang PP ، Zhang Y ، Dai LQ ، et al. تأثير مركب أنجليكا سينينسيس عديد السكاريد والحديد على فقر الدم الناجم عن نقص الحديد في الفئران. Chin J Integr Med 2007 ، 13: 297-300.

13. Zhang Y، Cheng Y، Wang N، et al. تأثير مسارات إشارات JAK و SMAD و ERK على تثبيط الهيبسيدين بواسطة السكريات من Angelica Sinensis في الفئران المصابة بفقر الدم بسبب نقص الحديد. Food Funct2014.5: 1381-1388.

14. Qin J ، Liu YS ، Liu J ، et al. تأثير عديد السكاريد Angelica Sinensis على هشاشة العظام في الجسم الحي وفي المختبر: آلية ممكنة لتعزيز تخليق البروتيوغليكان. مكمل قائم على الأدلة Alternat Med 2013،79476.

15. Gattermann N. Mitochondrial DNA الطفرات في نظام المكونة للدم. اللوكيميا 2004 ، 18: 18-22.

16. هولت إي جيه ، هاردينج إيه إي ، مورغان هيوز ج. حذف الحمض النووي للعضلات في المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلي الميتوكوندريا. Nature 1988، 331: 717-719.

17. Lestienne P ، متلازمة Ponsot G Kearns-Sayre مع حذف الحمض النووي للعضلات من الميتوكوندريا. لانسيت 1988 ، 1: 885.

18. والاس دي سي ، سينغ جي ، لوت إم تي ، وآخرون. طفرة الحمض النووي للميتوكوندريا المرتبطة بالاعتلال العصبي البصري الوراثي ليبر. العلوم 1988،242: 1427-1430.

19. والاس دي سي. نموذج ميتوكوندريا للأمراض الأيضية والتنكسية ، والشيخوخة ، والسرطان: فجر للطب التطوري. Annu Rev Genet 2005 ، 39: 359-407.

20. Clay Montier LL ، Deng JJ ، Bai Y. عدد الأمور: التحكم في رقم نسخة الحمض النووي للميتوكوندريا في الثدييات. J Genet Genomics 2009،36: 125-131.

21. Rötig A ، Poulton J. الأسباب الجينية لنضوب الحمض النووي للميتوكوندريا في البشر. Biochim Biophys Acta 2009،1792: 1103-1108.

مستخلص cistanche: يعزز تكوين العظام ويزيد من كثافة العظام