الآليات الجزيئية للجدونين المضاد للميلانين المشتقة من شجرة النيم
Mar 28, 2022
جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com
Hwang-Ju Jeon 1 و Kyeongnam Kim 1 و Chaeeun Kim 2 و Myoung-Jin Kim 1 و Tae-Oh Kim 3 و 4 و 5 و † و Sung-Eun Lee 1،2 ، * ، †
الملخص:يمثل تكوين الميلانين سلسلة من العمليات التي تنتج الميلانين ، وهو صبغة جلدية واقية (ضد الأشعة فوق البنفسجية) ، وتحدد لون جلد الإنسان. لطالما كانت المواد الكيميائية التي تقلل إنتاج الميلانين مطلوبة في سوق مستحضرات التجميل بسبب اهتمامات العناية بالبشرة ، مثل التبييض. الآلية الرئيسية لتثبيط إنتاج الميلانين هي تثبيط التيروزيناز (TYR) ، وهو إنزيم رئيسي لتكوين الميلانين. هنا ، قمنا بتقييم حقيقي (Ged) ، ليمونويد تمثيلي ، لعمله المضاد لتكوين الميلانين. تم تحفيز إنتاج الميلانين في المختبر بواسطة الهرمون المنبه للخلايا الصباغية ألفا (-MSH) في خلايا الورم الميلانيني B16F10 في الفئران. يقلل جد من إنتاج الميلانين الذي يحفزه MSH ، مما يثبط نشاط TYR وكمية البروتين. أكدنا هذه النتيجة في نموذج الجسم الحي في الزرد لتكوين الميلانين. لم تكن هناك أي علامة على سمية أو تشوه في الزيبرافيشيمبريوس أثناء التطور في جميع التركيزات المعالجة. قلل جيد من عدد النقاط الصبغية لأجنة الزرد المنتجة ومحتويات الميلانين في الأجنة. كان التركيز عالي الفعالية لـ Ged (100 ميكرومتر) أقل بكثير من التركيز الإيجابي ، حمض كوجيك (8 ملي مولار). وبالتالي ، يمكن أن يكون جيد مرشحًا رائعًا للكواشف المضادة لتكوين الميلانين.
الكلمات الرئيسية: MITF؛ عامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم ؛ TYR ؛ التيروزيناز. DQ ؛ دوباكوينون ، TRP -1 ، البروتين المرتبط بالتيروزيناز 1 ؛ TRP -2 ؛ البروتين المرتبط بالتيروزيناز 2 ؛ MC1R ؛ مستقبلات الميلانوكورتين 1 ؛ -MSH ؛ - هرمون منشط للخلايا الصباغية. ACTH. الهرمون الموجه للغدة الكظرية؛ آسيا والمحيط الهادئ ؛ بروتين agoutisignaling معسكر؛ أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري ؛ الكريب. عنصر استجابة cAMP
1 المقدمة
يتم تصنيع الميلانين في العضيات الصباغية الشبيهة باللايسوزوم في الخلايا الصباغية. في الميلانوسوم ، يتم إنتاج الميلانين في صبغين ، إيوميلانين ، وفيوميلانين ، يمثلان بني - أسود وأحمر - أصفر ، على التوالي [1]. يبدأ تصنيع أصباغ الميلانين هذه من المادة الأولية ، L-tyrosine ، مع تفاعل أكسدة L-tyrosine إلى مركب يسمى dopaquinone (DQ) ، و L-DOPA [2]. في خطوة الأكسدة هذه ، يعمل التيروزيناز (TYR) كإنزيم يحد من معدل مسار تخليق الميلانين الكلي [2،3]. TRP -1 و TRP -2 ، المرتبطان ارتباطًا وثيقًا ببروتينات تكوين الميلانين ، يحفزان مسار التخليق الحيوي للإيوميلانين ويثبتان ويحفز نشاط TYR [1]. تحدث عملية إنتاج صبغات الميلانين (تسمى تكوين الميلانين) في الصباغ الميلاني للخلايا الصباغية ، وهو موقع تخليق وتخزين فورمات الميلانين [4]. في مسار تأشير تكوين الميلانين ، يكون مستقبل الميلانوكورتين 1 (MC1R) عضوًا في المستقبلات المقترنة ببروتين G. MCIR هي نقطة انطلاق لإشارات تكوين الميلانين ويتم تنشيطها بواسطة ناهضات MC1R مثل الهرمون المنشط للخلايا الصباغية (-MSH) وهرمون قشر الكظر (ACTH) وبروتين الإشارات agouti (ASP) [1،2]. يؤدي تنشيط مسار الإشارات -MSH-MC1R إلى زيادة تركيز الأدينوسينيمونوفوسفات الدوري (cAMP) والفوسفوريلات لعنصر استجابة cAMP (CREB). يحفز CREB المفسفرة مستوى البروتين لعامل النسخ المرتبط بالميكروفيلم (MITF) ، وعامل النسخ الذي ينظم الجينات المرتبطة بتخليق الميلانين ، و TYR ، والبروتين المرتبط بالتيروزيناز -1 (TRP -1) ، والبروتين المرتبط بالتيروزيناز -2 (TRP -2) من خلال ربط M-box لهذه الجينات [1،5،6]. من بين مستقبلات الميلانوكورتين الخمسة ، تمتلك MC1R أكثر الخلايا الصباغية وفرة. ينظم بشكل أساسي إنتاج الإيوميلانين (صبغة سوداء بنية) عن طريق تنشيط MC1R عندما يتم تحويل ناهضات المستقبل ، مثل a-MSH و ACTH ، إلى هذا المستقبل [2،4،7].
على الرغم من وجود اختلافات بين الثدييات والأسماك ، إلا أن أسماك الزرد لديها نسخة خارجية من MC5R و MC3R ، والتي لا تمتلكها السمكة المنتفخة [7] ، ولا يزال مسار الإشارات هذا موجودًا في أسماك الزرد ويعمل تمامًا كما هو الحال في الخلايا الصباغية للثدييات [7]. ازداد عدد الدراسات حول تثبيط تكوين صبغة الميلانين بسبب مزاياها البحثية ، مثل التطور السريع في الأجنة في المراحل المبكرة وسهولة الملاحظة [8-11]. في هذه الظواهر ، وجدت العديد من الدراسات السابقة أن تثبيط مسار الإشارات هذا يقلل من إنتاج الميلانين ويوجد العديد من المثبطات ، بما في ذلك بيسابولول أنجيلون ، 4- هيدروكسي -3- ميثوكسي سينامالديهيد ، وثنائي فينيل ميثيلين هيدرازين كاربو ثيامين [12 - 14].
جدونين (جيد) ، مثبط بروتين 90 لصدمة الحرارة المعروف ، هو ليمونويد ، موجود في أجناس نبات ميليسيا. هذا الليمونويد متوفر بكثرة في قشرة ثمار شجرة النيم الهندية الصغيرة (Azadirachta indica) وله أنشطة بيولوجية متنوعة ، بما في ذلك السرطان الأطلسي ، ومضاد الملاريا ، ومضاد الالتهاب ، ومضاد السكر ، ومضاد الأرجية ، ومبيد الحشرات ، ومبيد الأعشاب ، ومضاد الفطريات [15-18]. لا يوجد تقرير حول آلية التأثير المضاد لتولد الميلانين في جد.
كعقار طبي أو عامل تجميلي مرشح لعلاج الأمراض المرتبطة بالميلانين أو تغير لون الجلد ، قد يكون لـ Ged مزايا بسبب خصائصه النباتية الآمنة التي تحدث بشكل طبيعي [19]. تم تقييم التأثير المضاد للميلانين لـ Ged في المختبر وفي الجسم الحي باستخدام خلايا سرطان الجلد من الفئران B16F10 وأجنة الزرد ، على التوالي ، للعثور على عامل التبييض المناسب ، وهو أحد أكبر أجزاء سوق مستحضرات التجميل التجارية. تم إجراء الاختبار أيضًا لإظهار كيف يمكن أن يؤثر Ged على الحيوانات.
2. المواد والطرق
2.1. المواد الكيميائية والكواشف
تم شراء Ged من Microsource Discovery Systems ، Inc. (Gayloardville ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء محفز التكاثر النخاعي ، -MSH ، ومركب مضاد للميلانين ، وحمض كوجيك من Sigma-Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت جميع الكواشف الأخرى أعلى من درجة البيولوجيا الجزيئية.
2.2. زراعة الخلايا
تم الحصول على خط خلايا سرطان الجلد وسرطان الفأر ، B16F10 ، من American TypeCulture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تربيته باستخدام مصل بقري جنيني بنسبة 10 في المائة (v / v) ، وزود البنسلين وسائط Dulbecco المعدلة Eagle (GE الرعاية الصحية ، شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية) في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم زراعة الخلايا حتى وصلت نسبة الالتحام إلى 80٪ وتم تقسيمها ثلاث مرات في الأسبوع بنسبة قسمة 1: 8. تم رصد الخلايا كل 12 ساعة ، وتم فحص التغيرات المورفولوجية. ظل عدد مرور الزنازين المستخدمة صغيراً.
2.3 فحص جدوى الخلية
لتقييم التأثير التكاثري لـ Ged على خط خلايا سرطان الجلد في الفئران B16F1 0 ، تم إجراء اختبار MTS وفقًا للبروتوكول الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا [20] باستخدام مجموعة فحص تكاثر خلايا CellTiter96 Aqueous One Solution (Promega ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم بذر 1 × 103 خلية في كل بئر من لوحة البئر 96- واحتضانها لمدة 24 ساعة للاسترداد. بعد الحضانة ، عولج جد بتركيزات مختلفة: 0 ، 3.12 ، 6.25 ، 12. 5 25 ، 50 ، 75 ميكرومتر. بعد 48 ساعة ، تمت إضافة 20 ميكرولتر من محلول اختبار MTS إلى كل وسائط بئر تحتوي على 100- وسائط µL مع Ged وبدون Ged. بعد حضانة إضافية لمدة 4 ساعات ، تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Multiskan GO (ThermoScientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيع بيانات الامتصاص مع عنصر التحكم وتم تمثيلها كنسبة مئوية تثبيط.
2.4 تحديد محتويات الميلانين
تم تحديد محتويات الميلانين خارج الخلية وداخل الخلايا باتباع طريقة معدلة تم الإبلاغ عنها مسبقًا [21]. تم تحضين خلايا الورم الميلانيني المعالجة MSH (200 نانومتر) لمدة 72 ساعة مع وبدون حمض كوجيك (200 ميكرومتر) وجيد (25 و 50 ميكرومتر). بعد الحضانة ، تم جمع وسائط الثقافة الخالية من الفينول الأحمر ، وتم حصاد الخلايا المستنبتة باستخدام محلول تحلل RIPA. تم الطرد المركزي للخلايا المحصودة عند 4 درجات مئوية ، 13 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة وتم إذابة الكريات في 1 مولار هيدروكسيد الصوديوم ، محلول DMSO بنسبة 10 في المائة عند 95 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم قياس امتصاص الوسائط المجمعة والميلانين المذاب عند 470 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تم تطبيع جميع العينات مع تحديد تركيز البروتين باتباع طريقة BCA.
2.5 فحص نشاط التيروزيناز داخل الخلايا
تم تحديد نشاط التيروزيناز الخلوي عن طريق قياس معدل أكسدة L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) كما ورد سابقًا ، مع تعديلات طفيفة [22]. تمت معالجة خلايا الورم الميلانيني B16F10 بالماوس باستخدام 200 نانومتر من -MSH لمدة ساعة واحدة متبوعة بالمعالجة بـ 200 ميكرومتر. حمض كوجيك ، مع وبدونه جد (25 و 50 ميكرومتر) ، وحضنت لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة ، تم حصاد الخلايا باستخدام محلول تحلل يحتوي على مثبط بروتيناز ، وتم طرد العينة عند 13 ، 000 × جم ، 4 ْم لمدة 15 دقيقة. تم نقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. تم خلط كل عينة (20 ميكرولتر) و 80 ميكرولتر من 40 ملي L-DOPA في صفيحة بئر 96- وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم تحديد الامتصاصية عند 475 نانومتر بواسطة المؤكسد L-DOPA باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة. تمت تسوية قيمة الامتصاصية بتركيز البروتين لكل عينة.
فائدة مستخلص Cistanche: يثبط تعبير التيروزيناز.
2.6. عزل الحمض النووي الريبي و qRT-PCR
تم إجراء عزل إجمالي RNA و qRT-PCR وفقًا لطريقة تم وصفها مسبقًا بواسطة [18]. تم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي (RNA) لفترة وجيزة من كل عينة باستخدام كاشف Trizol (Ambion ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد إجمالي تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر ، وتم فحص جودة الحمض النووي الريبي الكلي بنسبة امتصاص تبلغ 260: 280 و 260: 230 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكان GO (Thermo Scientific). تم تصنيع TotalRNA (5 ميكروغرام) في cDNA باستخدام مجموعة توليف Maxima الأول من cDNA (Thermo Scientific) و cDNA المركب. تم تحديد مستويات تعبير mRNA لـ Mitf و Tyr و Trp -1 و Trp -2 باستخدام Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs، Ipswich، MA، USA) وأداة QuantStudio 3 Real-Time PCR ( Applied Biosystems ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول المدرب. تم تعديل مستوى التعبير عن الجينات باستخدام جليسيرالديهيد 3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH).
2.7. تحليل اللطخة المناعية
تم إجراء تحليل اللطخة المناعية وفقًا للطرق الموصوفة سابقًا [23]. تم جمع بروتينات خلايا B16f10 باستخدام محلول Ceti lysis buffer (Translab ، Daejeon ، كوريا) ، وتم تحديد التركيز باستخدام مجموعة اختبار بروتين Pierce BCA (Thermo Scientific). تم تحميل كمية متساوية من البروتينات (30 ميكروغرام) من كل عينة على هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد وفصلها بالكهرباء. بعد الانفصال ، تم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز ، وتم حظر الغشاء في محلول حليب غير دهني بنسبة 10 بالمائة لمدة ساعتين. تم تحضين الأغشية المحظورة بجسم مضاد أولي طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، متبوعًا بحضانة أخرى بجسم مضاد ثانوي عند 26 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية بنسبة 1: 1000 و 1: 3000 على التوالي. أخيرًا ، تم توثيق الأغشية المنقطة باستخدام ChemiDoc (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع كاشف ECL (SuperSignal ، Thermo Scientific). تم شراء الأجسام المضادة الأولية والثانوية من سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية).
2.8. اختبار أجنة الزرد
Wild-type zebrafish were thankfully obtained from Professor Tae-Lin Huh, the School of Life Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea. The strain was kept for more than eight generations in a laboratory condition of 26 ◦C ± 1 ◦C, and a day-to-night ratio of 8:16. General fish care and breeding conditions, as previously described, were followed [24]. Ten groups of zebrafish were mated to obtain embryos with a mating ratio (male: female, 1:2), and among obtained embryos, healthy embryos had >معدل التخصيب 80٪ وتم اختيارهم واستخدامهم للتجربة. تم وضع اثني عشر جنينًا صحيًا في كل مجموعة مُعالجة في كل بئر من 96- صفيحة بئر بدون جد (25 ، 50 ، 75 ، و 100 ميكرومتر) وحمض كوجيك (8 ملي مولار) في وسط E3 في مرحلة الدرع. 24 ساعة بعد الإخصاب (h / pf) ، تم فك الأجنة ، وتم فحص الشذوذ كل 24 ساعة حتى 72 ساعة / pf. تم تصوير النمط الظاهري للأجنة في عرض جانبي وظهري لمقارنة الاختلافات بين المجموعات باستخدام مجهر BX53 قائم مع DP80CCD (أوليمبوس لايف ساينس سوليوشنز ، والتهام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد التصوير ، تم تجانس الأجنة باستخدام محلول Ceti lysis buffer (TransLab) ، وتم تحديد تركيز الميلانين ، وهو ما يعادل تحديد محتوى الميلانين في الخلية B16F10.
2.9 تحليل احصائي
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية المقدمة في هذه الدراسة باستخدام GraphPad Prismv.8. 0 (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey لإجراء مقارنات متعددة. يتم تمثيل جميع البيانات على أنها المتوسط ± الانحرافات المعيارية. اعتبرت فروق ذات دلالة إحصائية عند p <0.>
3. النتائج
3.1. التأثير السام للخلايا للبيبرلونجومين في خلايا B16F10
قبل التحقيق في التأثير المضاد لتولد الميلانين لـ Ged ، أجرينا اختبار صلاحية في خط خلية B16F1 0 لتعيين نطاق الجرعة في هذه الدراسة. في نطاق التركيز من 3.12 إلى 50 ميكرومتر ، لم تظهر الخلايا أي تأثير مثبط على النمو ، وكان تكاثرها النسبي من 91.0 في المائة إلى 118.7 في المائة (الشكل 1). في المقابل ، على الرغم من وجود أهمية حنين ، إلا أن المجموعات المعالجة بـ 75 ميكرومتر قد تم تثبيط نموها بشكل طفيف (89.3 في المائة ؛ الشكل 1). لذلك ، تم ضبط أعلى تركيز على 50 ميكرومتر في تجارب خط الخلية المتبقية.
الشكل 1. السمية الخلوية للجدونين (جد) في خلايا B16F10
3.2 Gedunin يثبط إنتاج الميلانين ونشاط التيروزيناز داخل الخلايا في خلايا B16F10 الماوس
قمنا بتقييم التأثير المضاد للميلانين لـ Ged في خلايا سرطان الجلد B16F10. ناهض TheMC1R ، -MSH ، تسبب بشكل فعال في إنتاج الميلانين داخل الخلايا وخارج الخلية (الشكل 2 أ-ج). كان لون الوسائط التي تم جمعها غامقًا مع -MSH (الشكل 2 أ). تلاشى اللون مع إضافة جيد ، وكان التأثير يعتمد على الجرعة (الشكل 2 أ). في النتائج الإجمالية لمحتويات الميلانين ، زاد -MSH إنتاج الميلانين في الخلايا الصباغية بحوالي سبعة أضعاف أعلى من المجموعة الضابطة ونقص الميلانين المحفز بإضافة حمض الكوجيك ، وهو عنصر تحكم إيجابي معروف في تكوين الميلانين (الشكل 2 د). قلل جد أيضًا إنتاج الميلانين المحفز للمنبهات في الخلايا الصباغية في جميع التركيزات المختبرة في هذه الدراسة (الشكل 2 د). علاوة على ذلك ، في اختبار نشاط التيروزيناز ، أظهر جد تأثيرًا مانعًا قويًا على إنزيم الحد من المعدل ، التيروزيناز ، في تكوين الميلانين (الشكل 2 هـ). انخفض النشاط الحراري للتيروزيناز في مجموعة معالجة 50 ميكرومتر من Ged بنسبة 20 في المائة و 12.24 في المائة مقارنة بمجموعة التحكم والمجموعة المحفزة بـ MSH ، على التوالي.
الشكل 2. تأثير مضاد للميلانين حقيقي (جد) على إنتاج الميلانين المحفز للخلية الصباغية ألفا (-MSH) في خلايا B16F10.
3.3 يقلل Gedunin من التعبير الجيني المرتبط بتكوين الميلانين المستحث بـ MSH
-MSH (2 0 0 نانومتر) المستحثة بمستوى mRNA من Mitf ؛ عامل نسخ تكون الميلانين ؛ والجينات المستهدفة Tyr و Trp -1 و Trp -2 (الشكل 3). خفضت معالجة جد مستوى الرنا المرسال لجميع الجينات بطريقة تعتمد على الجرعة بتركيز 25 و 50 ميكرومتر (الشكل 3) مقارنة مع التحكم الإيجابي ، حمض كوجيك (200 ميكرومتر) ، كان جد أكثر فعالية في تقليل مرنا مستوى الجينات المرتبطة بتكوين الميلانين في خلايا B16F10. علاوة على ذلك ، انخفض مستوى Mitfand Tyr بمقدار 0. 10- و 0. 26- أضعاف أقل من الخلايا المستحثة MSH ، على التوالي ، بتركيز 50 ميكرومتر (الشكل 3 أ ، ب). خفضت مستويات mRNA الخاضعة للتنظيم من هذه الجينات من مستوى Tyr وخفضت كمية إنتاج TYR من الميلانين أقل من المجموعة الضابطة.
الشكل 3. تأثير التقليل على الجينات المرتبطة بتكوين الميلانين.
3.4. Gedunin خفض TYR و TYR -1 المبلغ
يلعب TYR دورًا مهمًا في تكوين الميلانين ، ويؤثر مستوى البروتين في هذا الإنزيم على تكوين الميلان بشكل مباشر. حاولنا تأكيد التغيير في كمية البروتين ، TYR ، الناجم عن انخفاض مستوى الرنا المرسال من خلال تحليل اللطخة المناعية. انخفض TYR بشكل ملحوظ مقارنة بالسيطرة ، وعولج -MSH بالاعتماد على الجرعة (الشكل 4 أ). علاوة على ذلك ، تم تقليل TRP -1 ، وهو عامل نسخ أساسي لـ TYR ، بشكل طفيف (الشكل 4 أ). كانت النتائج أكثر وضوحًا عندما تم تطبيع كل فرقة بروتين بواسطة بروتين حفظ المنزل ، GAPDH (الشكل 4 ب ، ج).
الشكل 4. النشاف الغربي لهرمون تحفيز الخلايا الصباغية ألفا (-MSH) يسببه خلايا B16F10 بعلاج حقيقي.
3.5 سمية جدونين ضد أسماك الزرد في مراحل التنمية المبكرة
تم إجراء التقييم السمي لـ Ged على تطور المرحلة المبكرة من أسماك الزرد قبل تقييم اختبار مضاد للميلانين لـ Ged في الجسم الحي. لم يلاحظ الشذوذ المورفولوجي لأجنة الزرد في أي تركيز معالج من جد (الشكل 5 أ). التركيزات المكثفة من Ged و 25 و 50 و 75 و 100 ميكرومتر ، لم يكن معدل بقاء المجموعات المعالجة لـ Ged فروقًا ذات دلالة إحصائية في 72 ساعة من فترة المعالجة الكيميائية (الشكل 5 ب).
الشكل 5. سمية حقيقية (جد) على أسماك الزرد في مرحلة مبكرة من التنمية.
3.6 جدونين يقلل من محتويات الميلانين في أجنة الزرد
نظرًا لعدم وجود سمية نمو في Ged في أجنة الزرد ، قمنا بفحص تأثير مضاد الميلانين في سلسلة من تركيزات Ged و 25 و 50 و 75 و 100 ميكرومتر. في الملاحظة البصرية ، قمنا بفحص نقاط الصباغ الزرد. يظهر منظر الجانب العلوي لأجنة الزرد في الشكل 5 أ. حمض كوجيك له تأثير تثبيط على إنتاج الصبغ لأجنة الزرد. كان لدى أجنة سمك الزرد المعالجة جد عدد أقل من النقاط الصبغية على الرأس (الشكل 6 أ). بالإضافة إلى ذلك ، انخفض إجمالي محتويات الميلانين المستخرجة من الجسم الكامل لأجنة الزرد بعد التعرض لـ Ged لمدة 72 ساعة في كل من حمض الكوجيك ، والتحكم الإيجابي ، والمجموعات المعالجة بـ Ged (الشكل 6 ب ، ج)
الشكل 6. تأثير حقيقي على إنتاج الميلانين في الجسم الحي.
4. مناقشة
في هذه الدراسة ، تم تقييم خصائص تثبيط Ged ضد إنتاج الميلانين ، وبناءً على النتائج التي توصلنا إليها ، كانت قدرة Ged على التثبيط 11 تقريبًا. 98- أضعاف تلك الموجودة في حمض الكوجيك (الشكل 2) ، وتركيز Ged ( كان 50 ميكرومتر أقل من حمض الكوجيك (200 ميكرومتر) ، السيطرة الإيجابية. كان يقابله نشاط ضعيف داخل الخلايا التيروزينية ، وهو إنزيم يحول L-Dopa إلى DQ ، السلائف الأولية للأومييلانين والفيوميلانين. يستلزم انخفاض نشاط Tyr تباطؤ عمليات إنتاج الميلانين بالكامل ونقص كل من المنتجات النهائية ، eumelanin و pheomelanin [1-3]. تم تنظيم مستويات النص و TYR من خلال سلسلة من عوامل النسخ: Mitf و Trp -1 و Trp -2 [1،2]. كمية مخفضة من البروتين ومستوى mRNA يعني تنشيط MC1R عبر محور إشارات -MSH-MC1R-PKA-CREB بواسطة -MSH مع معالجة Ged بتركيز 25 و 50 ميكرومتر ، اعتمادًا على الجرعة في كل من PCR الكمي والنشاف الغربي. كما هو موضح سابقًا ، يؤدي تقليل كمية MITF إلى نقص Tyr و Trp -1 و Trp -2 عن طريق تقليل الارتباط بمنطقة المحفز لهذه الجينات [25-27]. يؤدي تقليل عوامل النسخ هذه إلى انخفاض TYR إلى مستوى أقل ويمنع إنتاج صبغة الميلانين في خلايا B16F10. بالإضافة إلى ذلك ، توضح النتائج الحالية التأثير المثبط لـ TYR لـ Ged ، وهي نقطة حرجة أخرى لإنتاج الميلانين في الخلايا الصباغية. أظهر جد أيضًا تأثير تثبيط على إنتاج الصباغ أثناء تطور المرحلة المبكرة من أسماك الزرد في النماذج المختبرية والحيوية. أظهرت نتائجنا أن العلاج بـ Ged لمدة 72 ساعة قلل بشكل ملحوظ من تصبغ الزرد. تم تقليل محتوى الميلانين الكلي ومستويات الرنا المرسال للجينات ذات الصلة مع وجود Ged ، وميل هذه النتائج يدعم بقوة خاصية تكوين الميلانين في المختبر في Ged.
علاوة على ذلك ، كانت قدرة Ged على التثبيط أقوى بكثير من حمض الكوجيك ، وهو أحد أكثر المركبات المعروفة ككاشف تبييض في صناعة مستحضرات التجميل [6،28]. كان التركيز الذي يعمل فيه Ged أقل نسبيًا من حمض الكوجيك. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تقرير سابق أن كاشف التبييض الشائع الآخر ، أربوتين ، له تأثير مضاد لتولد الميلانين مثل حمض الكوجيك [2]. لذلك ، يجب اعتبار Ged بمثابة كاشف مبيض بدلاً من أربوتين أو حمض الكوجيك المستخدم حاليًا ، وكمضاد للميلانومادروغ فيما يتعلق بخصائصه الواعدة.
تم اقتراح الخصائص المضادة لتكوين الميلانين لـ Ged قبل [29،30] ، لكن هذه الدراسات لم تركز على الآليات المحددة للتأثير ، ولاحظوا ببساطة تغيير التأثيرات السامة للخلايا وكمية إنتاج الميلانين في المختبر ، في حين أن النشاط المضاد للتكاثر والتأثيرات المثبطة على تم تمييز تعبير HSP 90 [31–33]. تم الإبلاغ عن إمكانية استخدام جد كعامل مضاد للتولد الميلانيني ؛ ومع ذلك ، لم تركز هذه الدراسات على الآليات المحددة للتأثير ، وقد لاحظوا ببساطة تغيير التأثيرات السامة للخلايا وكمية إنتاج الميلانين في المختبر. لقد حاولنا تحديد آلية المستوى الخلوي من خلال تأكيد مستوى الرنا المرسال وكمية البروتين في الجينات المرتبطة بإنتاج الميلانين. جنبا إلى جنب مع التقارير السابقة ، أظهرت هذه الدراسة منظورًا جديدًا لـ Gedas ، وهو مكون من مكونات مستحضرات التجميل لفائدتين ، وهما مضاد للسرطان ومضاد لتكوين الميلانين ، والذي يمكن تطبيقه على كل من الورم الميلانيني المستحث بالأشعة فوق البنفسجية وتراكم الصباغ ، خاصة ، في نفس الوقت.
مسحوق استخراج cistanche: الجذور الحرة واضحة
5. الاستنتاجات
في الختام ، أظهرت كل هذه النتائج أن مركبًا جديدًا ، Ged ، يمكن استخدامه ككاشف تصبغ لتخليق الميلانين الحيوي ، والذي يقصر البروتينات النهائية TYR و TRP -1 و TRP -2 بكمية مخفضة مقارنة بالبروتين الرئيسي تنظيم البروتين ، MITF ، في كل من الأنظمة المختبرية والحيوية لنموذج الزرد.
أقراص cistanche
