MTHFD2 عبارة عن نقطة تفتيش استقلابية تتحكم في المستجيب ومصير الخلايا التائية التنظيمية ووظيفتها

مجردة رسومية

المؤلفون :

أياكا سوجيورا ، غابرييلا أندريجيفا ، كيلسي فوس ، ... ، أشوتوش ك.منغالام ، جوشوا دي رابينوفيتش ، جيفري سي راثميل

مراسلة:

jeff.rathmell@vumc.org

باختصار :

تخليق النوكليوتيدات مطلوب لدعم الانتشار السريع للخلايا التائية. سوجيورا وآخرون أظهر أن استقلاب de novo purine يشير إلى تمايز الخلايا التائية المباشرة ووظيفتها ويحدد MTHFD2 كنقطة تفتيش استقلابية وهدف علاجي للأمراض الالتهابية.

يسلط الضوء

• MTHFD2 أمر بالغ الأهمية لخلايا CD4 T المنشط للحفاظ على تخليق دي نوفو البيورين

• يعزز MTHFD2 غير الكافي الأنماط الظاهرية الشبيهة بالخلايا Treg والتمثيل الغذائي في خلايا Th17 d يمنع تثبيط MTHFD2 إشارات mTORC1 ويغير مثيلة الهيستون

• يمكن استهداف MTHFD2 للحماية من الالتهاب والمناعة الذاتية في الجسم الحي

MTHFD2 هو نقطة تفتيش استقلابية تتحكم في المستجيب ومصير الخلية التائية التنظيمية ووظيفتها

أياكا سوجيورا ،¹غابرييلا أندريجيفا ،¹كيلسي فوس¹دارين ر.¹شينتشنغ شو ،⁵ماثيو زي مادن ،¹شيانغ يي ،¹كاثرين ل.¹Nowrin U. Chowdhury ،²ميليسا م وولف ،²أريسا سي يونغ ،¹دالتون ل. غرينوود ،¹أليسون إي سيويل ،¹Shailesh K. Shahi،³سامانثا ن. فريدمان ،³ألانا إم كاميرون ،⁴باتريك فورش ،⁴تيم بورن ،⁴خوان سي جارسيا كانافيراس ،⁵جون كاريجوليتش¹داون سي نيوكومب ،²أشوتوش ك.³جوشوا د.⁵وجيفري سي راثميل^1,6,*

¹مركز فاندربيلت لبيولوجيا المناعة ، قسم علم الأمراض والأحياء الدقيقة والمناعة ، المركز الطبي لجامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي 37232 ، الولايات المتحدة الأمريكية

²قسم الطب ، قسم أمراض الدم والأورام ، المركز الطبي لجامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي 37232 ، الولايات المتحدة الأمريكية

³قسم علم الأمراض ، جامعة آيوا ، آيوا سيتي ، أيوا 52242 ، الولايات المتحدة الأمريكية

⁴Sitryx Therapeutics Limited ، Magdalen Center ، Oxford Science Park ، أكسفورد ، المملكة المتحدة

⁵قسم الكيمياء ، معهد لودفيج لأبحاث السرطان ، فرع برينستون ، معهد لويس سيجلر لعلم الجينوم التكاملي ، جامعة برينستون ، برينستون ، نيوجيرسي 08544 ، الولايات المتحدة الأمريكية 6 الاتصال الرئيسي

* المراسلات: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

ملخص

يعزز التحفيز الأنتيجيني إعادة البرمجة الأيضية للخلايا التائية لتلبية متطلبات التخليق الحيوي المتزايدة والطاقة الحيوية والإشارات. نوضح أن إنزيم التمثيل الغذائي أحادي الكربون (1C) methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2 (MTHFD2) ينظم تخليق دي نوفو البيورين والإشارات في الخلايا التائية المنشطة لتعزيز الانتشار وإنتاج السيتوكين الالتهابي. في الخلايا التائية المساعدة المسببة للأمراض -17 (Th17) ، منع MTHFD2 الانتفاخ الشاذ لعامل النسخ FoxP3 جنبًا إلى جنب مع الكسب غير المناسب للقدرة القمعية. عزز نقص MTHFD2 أيضًا تمايز الخلايا T (Treg) التنظيمي. ميكانيكيًا ، أدى تثبيط MTHFD2 إلى استنفاد أحواض البيورين ، وتراكم الوسائط الحيوية البيورينية ، وتقليل إشارات مستشعر المغذيات mTORC1. كان MTHFD2 مهمًا أيضًا لتنظيم مثيلة الحمض النووي والهيستون في خلايا Th17. الأهم من ذلك ، أن نقص MTHFD2 قلل من شدة المرض في العديد من نماذج الأمراض الالتهابية في الجسم الحي. وبالتالي فإن MTHFD2 هو نقطة تفتيش استقلابية لدمج استقلاب البيورين مع إشارات خلية المستجيب المسببة للأمراض وهو هدف علاجي محتمل ضمن مسارات التمثيل الغذائي 1C.

المقدمة

تتطلب التعبئة الفعالة للاستجابة المناعية التكيفية تنشيطًا قويًا لخلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية للخضوع لنمو الخلايا وتكاثرها بسرعة. يتضمن ذلك إعادة البرمجة الأيضية ، التي يقودها مستشعر المغذيات mTORC1 ، من حالة الراحة التقويضية إلى حالة النمو الابتنائية مع زيادة متطلبات التخليق الحيوي والطاقة الحيوية والإشارات. اعتمادًا على بيئة السيتوكين ، تتمايز خلايا CD4 + T إلى مستجيب بالإضافة إلى مجموعات فرعية تنظيمية لها برامج استقلابية متميزة تقود وظائف المستجيب (Bantug et al. ، 2018 ؛ Buck et al. ، 2015). يعد توازن هذه المجموعات الفرعية أمرًا بالغ الأهمية للمناعة الطبيعية مع الوقاية من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية. على سبيل المثال ، يتميز التصلب المتعدد (MS) بزيادة الإنترلوكين -17 (IL - 17) - إنتاج الخلايا التائية المساعدة -17 (Th17) وخلايا T (Treg) التنظيمية القمعية المتناقصة أو غير الفعالة (دندرو وآخرون ، 2015). يوفر استهداف برامج التمثيل الغذائي المحددة لمجموعات الخلايا التائية الفرعية هذه طريقة بديلة للعلاج المناعي.

بدأ العلاج القائم على التمثيل الغذائي للخلايا في عام 1948 عندما ثبت أن عوامل العلاج الكيميائي المضادة للفولات فعالة في الأطفال المصابين بابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (فاربر وآخرون ، 1948). يساهم حمض الفوليك في التمثيل الغذائي للكربون الواحد (1C) من أجل التخليق الحيوي للبيورين ، وتوليد متبرعات الميثيل ، والحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال الخلوي (Ducker and Rabinowitz، 2017؛ Yang and Vousden، 2016). تم تطوير العديد من الأدوية ، بما في ذلك الميثوتريكسات (MTX) ، والفلورويوراسيل (5- FU) ، والميركابتوبورين (6- MP) ، لاستهداف هذا المسار. تشترك الخلايا التي تتكاثر بسرعة ، بما في ذلك الخلايا السرطانية والخلايا التائية المنشطة ، في الاعتماد على هذه المسارات لتوليف الحمض النووي والحمض النووي الريبي. تظل MTX شائعة الاستخدام لعلاج أمراض المناعة الذاتية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي (براون وآخرون ، 2016). ومع ذلك ، بسبب التعبير الواسع عن الإنزيمات المستهدفة ، ترتبط هذه العوامل العلاجية بآثار ضائرة شائعة وقد تكون شديدة. يمكن أن يؤدي تحديد أهداف إنزيم التمثيل الغذائي ذات الأهمية الانتقائية في مجموعات الخلايا ذات الأهمية إلى تطوير علاجات مناعية أكثر أمانًا وفعالية.

يتضمن التمثيل الغذائي 1C دورات حمض الفوليك والميثيونين مع نقل وحدات الكربون المفردة. يعمل Serine كمانح بدرجة 1C لتنشيط رباعي هيدروفولات (THF) إلى 5 ، 10- ميثيلين THF ، مع إنتاج الجلايسين المصاحب. 5 ، 10- يمكن بعد ذلك أكسدة ميثيلين THF باستخدام NAD (P) لتوليد مادة البيورين 10- formylTHF. بدلاً من ذلك ، يمكن تصنيع 10- فورميل THF من فورمات و THF بطريقة تعتمد على ATP. في المسار الخلوي ، 10- يتم إنتاج fomylTHF بوساطة methyleneTHF dehydrogenase 1 (MTHFD1). يؤدي فقدان MTHFD1 إلى تجويع الخلايا من أجل 10- فورميل THF ، والقضاء على قدرة التخليق الحيوي للبيورين ، والطفرات في MTHFD1 تسبب نقصًا مناعيًا مشتركًا شديدًا (SCID) (فيلد وآخرون ، 2015). يعتمد مسار الميتوكوندريا على الميتوكوندريا MTHFD2 و MTHFD 1- مثل (MTHFD1L).

الشكل 1. يتم تنظيم التمثيل الغذائي 1C و MTHFD2 في CD4 المنشط^زائدالخلايا التائية وفي سياق EAE

(أ) التغيير في أنواع التمثيل الغذائي للنيوكليوتيدات في CD4 المتباينة في المختبر^زائدمجموعات فرعية من الخلايا التائية مقارنة بالخلايا الساذجة المقاسة بمقياس الطيف الكتلي (ن=3 مكررات بيولوجية).

(ب) سير العمل لفحص كريسبر المستهدف في نموذج التهاب الرئة في الجسم الحي.

(C) التغيير في وفرة gRNA من 1C الأيض المستهدف في فحص CRISPR في الجسم الحي في CD4 الأساسي^زائدالخلايا التائية (التحليل الإحصائي الذي تم إجراؤه بواسطة MAGeCK ،=3 مكررات بيولوجية).

(D) تعبير mRNA للجينات المحددة في (C) أثناء تطوير الخلايا التائية وتفعيلها (بيانات من مستعرض بيانات ImmGen RNA-seq).

(هـ) التعبير البروتيني عن الجينات المحددة في (C) في CD4 الساذج والمنشط^زائدالخلايا التائية (بيانات من مصدر البروتين المناعي [إمبريس]).

(F) تعبير mRNA عن الجينات المحددة في (C) في الدم الكامل للأفراد المصابين باضطرابات الالتهاب المشار إليها بالنسبة لأفراد التحكم الأصحاء (Aune et al. ، 2017). RA-MTX، RA تحت علاج MTX؛ الذئبة الحمراء ، الذئبة الحمامية الجهازية. MS-Tx ساذج ، علاج ساذج مرض التصلب العصبي المتعدد في وقت التشخيص ؛ مرض التصلب العصبي المتعدد ، مرض التصلب العصبي المتعدد قيد العلاج وفي مغفرة المرض ؛ ن=3 - 8 متبرعين.

(G) IHC تظهر تلطيخ CD3 و MTHFD2 في مقطع ذنب الفرس من الحبل الشوكي للفئران مع أعراض EAE في 2003 (أعلى ؛ شريط مقياس ، 100 مم) و 4003 (أسفل ؛ شريط مقياس ، 50 مم) تكبير (البيانات تمثيلية من تجربتين مستقلتين).

(H و I) النسبي (H) يعني شدة التألق (MFI) و (I) تعبير مرنا عن MTHFD2 في CD4^زائدالخلايا التائية من الطحال والحبل الشوكي للفئران المصابة بأعراض EAE والطحال لفئران التحكم (متوسط ​​± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه ، تمثل البيانات تجربتين مستقلتين مع 6 مكررات بيولوجية كاملة).

(J) تعبير MTHFD2 مرنا في CD4 غير متمايز^زائدالخلايا التائية 0 ، و 5 ، و 24 ساعة بعد التنشيط بأجسام مضادة لـ CD3 ومضادة لـ CD28 (يعني ± SD ، و ANOVA أحادي الاتجاه ،=3 مكررات بيولوجية).

(K) MTHFD2 MFI النسبي على مدار 5 أيام بعد التنشيط في مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية ، والتي تم تطبيعها للخلايا المسترخية (يعني ± SD ، n=3 التكرارات البيولوجية). انظر أيضًا الشكل S1. يتم تصنيف النتائج المهمة إحصائيًا (* p <0. 0="" 5="" ،="" **="" p=""><0. 0="" 1="" ،="" ***="" p=""><0.001 ،="" ****="" ع="" في="" المئة="">

MTHFD2 هو واحد من أكثر الجينات استحثاثًا وإفراطًا في التعبير في جميع الأورام (Nilsson et al. ، 2014). على الرغم من أنه يتم تنظيمه على نطاق واسع أثناء التطور الجنيني ، إلا أن MTHFD2 له تعبير قليل أو معدوم في معظم أنسجة البالغين (Nilsson et al. ، 2014). في العلاج المضاد للسرطان (Zhu and Leung ، 2020) ، قد يؤدي تثبيط MTHFD2 إلى زيادة الإجهاد التأكسدي (Ju et al. ، 2019 ؛ Wan et al. ، 2020) ، والاعتماد على الجلايسين (Koufaris et al. ، 2016) ، وعدم كفاية تخليق البيورين (Ben-Sahra et al.، 2016؛ Pikman et al.، 2016). يمكن لنقص MTHFD2 أيضًا كبح نشاط mTORC1 من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك من خلال استنفاد الجوانين والتثبيط اللاحق لـ mTORC 1- الذي ينشط GTPase Rheb (Emmanuel et al. ، 2017). يتسبب نقص MTHFD2 أيضًا في تراكم وسيطة مسار تخليق البيورين ، بما في ذلك تناظرية الأدينوزين أحادي الفوسفات (AMP) 5- aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) (Ducker et al. ، 2016) ، والتي يمكن أن تنشط بروتين كيناز AMP المنشط (AMPK) لتثبيط mTORC1 (Su et al. ، 2019).

نظرًا لأن التمثيل الغذائي 1C يدمج مدخلات مغذية متعددة ويمكن تتبعه علاجيًا ، فقد درسنا دور التمثيل الغذائي 1 في CD4^زائدالمستجيب T (Teff) ومجموعات الخلايا الفرعية Treg. من خلال الفحص المستهدف غير المتحيز في الجسم الحي CRISPR-Cas 9- في خلايا الفئران التائية الأولية ، حددنا MTHFD2 على أنه نتيجة تم تنظيمها أيضًا بشكل ثابت في الأفراد الذين يعانون من اضطرابات التهابية. والجدير بالذكر أن نقص MTHFD2 أضعف تكاثر خلايا Teff ووظائفها. عزز نقص MTHFD2 أيضًا تعبير FoxP3 الشاذ والنشاط القمعي في خلايا TH17 مع تعزيز تمايز الخلايا Treg. ارتبطت هذه التأثيرات بتراكم AICAR ، وانخفاض تركيزات البيورين ، وتقليل تنظيم إشارات mTORC1 ، وزيادة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، وتغيير الحمض النووي ومثيل هيستون. في الجسم الحي ، استهداف MTHFD2 محمي ضد العديد من نماذج الأمراض الالتهابية. تظهر هذه البيانات أن MTHFD2 بمثابة نقطة تفتيش استقلابية في خلايا Th17 و Treg وتسلط الضوء على إمكانات هذا الإنزيم كهدف للعلاج المناعي المضاد للالتهابات.

النتائج

التمثيل الغذائي 1C وتخليق البيورين نشط تفاضليًا في CD4^زائدمجموعات الخلايا التائية الفرعية

افترضنا أن تخليق النوكليوتيدات قد يختلف عبر CD4^زائدمجموعات الخلايا التائية الفرعية. CD4^زائدتم تفريق الخلايا التائية في المختبر إلى خلايا Th1 و Th17 و Treg وتم جمعها بعد 72 ساعة لقياس الطيف الكتلي. كانت كميات أنواع النيوكليوتيدات مرتفعة بشكل عام في جميع المجموعات الفرعية مقارنة بالخلايا الساذجة (الشكل 1 أ). والجدير بالذكر أن وسيطة تخليق البيورين كانت وفيرة بشكل تفاضلي ، مع أعلى تراكم للجليسيناميد ريبونوكليوتيد (GAR) ، 1- (فسفوريبوسيل) إيميدازول كاربوكساميد (سايكار) ، وأيكار في خلايا Th17 (الشكل S1A).

لاختبار اعتماد CD4^زائدالخلايا التائية على الإنزيمات في عملية التمثيل الغذائي 1C ، أجرينا شاشة في الجسم الحي تعتمد على CRISPR-Cas 9- في CD4 الأساسي^زائدالخلايا التائية (الشكل 1 ب). تم إنشاء مكتبة دليل RNA (gRNA) مخصصة لاستهداف الإنزيمات في عملية التمثيل الغذائي 1C ، جنبًا إلى جنب مع مجمع التصلب الدرني 2 (TSC2) كعنصر تحكم إيجابي وعناصر تحكم سلبية غير مستهدفة (NTCs). CD4^زائدتم نقل الخلايا التائية المعزولة عن مستقبلات الخلايا التائية المحددة (TCR) المعدلة وراثيًا OT-II Cas9 مع هذه المكتبة ونقلها عن طريق الوريد إلى Rag1^{__ /__}المضيفين. ثم تم تحصين الفئران باستخدام OVA داخل الأنف للحث على التهاب الرئة. تم تسلسل الخلايا التائية المستردة من رئتي هذه الفئران ، وتم إنشاء تخصيب أو استنفاد جرناز بالنسبة لترددات الإدخال. تم إثراء TSC2 gRNA ، مما يدعم الدور المثبط لهذا البروتين في الخلايا التائية. في المقابل ، تم استنفاد جرناس PPAT و AHCY و MAT2A و MTHFD1 بشكل كبير ، وتم تقليل GART و DHFR و DNMT1 و MTRR و MTR و SHMT2 و MTHFD2 إلى حد أقل ، مما يشير إلى أن هذه الجينات تساهم في تكاثر الخلايا التائية والوظيفة الالتهابية في الجسم الحي (الشكلان 1C و S1B).

قمنا بعد ذلك بفحص ملف تعريف التعبير للجينات المحددة من الشاشة. على الرغم من أنه تم تنظيمها جميعًا بشكل متناسق في تطوير الخلايا التوتية ، تم تحفيز MTHFD2 mRNA والبروتين بشدة في الخلايا التائية الطرفية المحفزة (الشكلان 1D و 1E). علاوة على ذلك ، في مجموعة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المنشورة بشكل منفصل (RNA-seq) من الدم الكامل للأفراد المصابين بمجموعة متنوعة من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية (Aune et al. ، 2017) ، تم الإفراط في التعبير عن MTHFD2 باستمرار عبر حالات متعددة ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحي ومرض كرون. ، مرض الاضطرابات الهضمية ، التهاب المفاصل الروماتويدي ، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، الصدفية ، التهاب المفاصل الصدفي ، متلازمة شوجرين ، ومرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 1 و). والجدير بالذكر أن الأفراد المصابين بمرض التصلب العصبي المتعدد الذين تم تشخيصهم مؤخرًا قد رفعوا بشكل ملحوظ تعبير MTHFD2 بالنسبة للمتبرعين الأصحاء أو الأفراد الذين يعانون من مرض التصلب العصبي المتعدد الذين يخضعون للعلاج مع مغفرة المرض (الشكل S1C). وهكذا ، CD4^زائديعتمد تكاثر الخلايا التائية وبقائها على جينات معينة من جينات التمثيل الغذائي 1C ، ويختلف التعبير عن هذه الجينات من خلال مراحل تطور الخلايا التائية وتفعيلها وتمايزها وكذلك في حالة الالتهاب المرضي.

الشكل 2. نقص MTHFD2 يضعف CD4^زائدتكاثر الخلايا التائية ووظيفتها

(أ - د) انتشار يقاس بتخفيف (أ) CellTrace البنفسجي (CTV) ، (ب) قابلية البقاء ، (ج) تعبير CD25 ، و (د) تعبير TF في CD4^زائدتمت معالجة مجموعات الخلايا التائية الفرعية بـ MTHFD2i لمدة 72 ساعة بعد التنشيط (متوسط ​​± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه ، تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية إجمالية).

يتم تنظيم MTHFD2 بدرجة عالية في CD4 المتسلل إلى الجهاز العصبي المركزي^زائدالخلايا التائية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي التجريبي (EAE) وفي CD4 المنشط^زائدالخلايا التائية في المختبر

لم يتم وصف تنظيم MTHFD2 جيدًا في خلايا CD4 plus T. لقياس التعبير عن MTHFD2 في الآفات الالتهابية في الجسم الحي ، CD4^زائدتم تنشيط الخلايا التائية من الفئران 2D2 المعدلة وراثيًا الخاصة بالمايلين ونقلها بالتبني إلى Rag1^{__ /__}الفئران للحث على EAE. بعد أن بدأت الفئران تظهر شللًا خلفيًا ، تم تحليل جزء ذنب الفرس من الحبل الشوكي بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC). أظهرت الفئران التي تلقت خلايا 2D2 T تخصيب MTHFD2 و CD3^زائدالخلايا التي كانت غائبة في عنصر التحكم (الشكل 1G). لتحديد ما إذا كان CD4^زائدنظمت الخلايا التائية MTHFD2 في الآفات الملتهبة ، وتم جمع الخلايا التائية من الطحال والحبل الشوكي للفئران المعرضة لبروتين سكري المايلين قليل التغصن (MOG) وتوكسين السعال الديكي (PTX) الناتج عن نموذج EAE للتحليل. تسلل الجهاز العصبي المركزي CD4^زائدأفرطت الخلايا التائية في التعبير عن MTHFD2 مقارنة مع CD4 الطحال المتطابق^زائدالخلايا التائية من الفئران التحكم و EAE ، كما تم قياسها بواسطة قياس التدفق الخلوي (الشكل 1 ح) و qRT-PCR (الشكل 1I). حركية تعبير MTHFD2 في CD4^زائدتم قياس الخلايا التائية في المختبر بعد ذلك. تم الكشف عن التنظيم القوي لـ MTHFD2 mRNA بعد 5 ساعات من التحفيز وبدأ في الانخفاض بمقدار 24 ساعة (الشكل 1J) ، في حين تم تمييز CD4^زائدحققت مجموعات الخلايا التائية الفرعية أعلى تعبير عن بروتين MTHFD2 بعد 48 ساعة من التنشيط (الشكل 1 ك). تظهر هذه البيانات أن MTHFD2 منظم في CD4^زائدالخلايا التائية مع التنشيط في المختبر وفي موقع الالتهاب في الجسم الحي.

CD4^زائدتتطلب مجموعات الخلايا التائية الفرعية بشكل تفاضلي MTHFD2 للتنشيط والتكاثر والبقاء وإنتاج السيتوكين

اختبرنا بعد ذلك دور MTHFD2 في تنشيط مجموعة فرعية من الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى التمايز والتكاثر والوظيفة. CD4^زائدتم تنشيط الخلايا التائية في المختبر في وجود السيتوكينات من أجل التمايز الأمثل لخلايا Th1 و Th17 و Treg أو مثبط MTHFD2 (MTHFD2i ؛ DS18561882) (Kawai et al. ، 2019). بعد 72 ساعة ، خفضت جميع المجموعات الفرعية الانتشار (الشكل 2 أ) وأعداد خلايا الدراجات الحية (الشكلان S2A و S2B). تم تقليل الجدوى في خلايا Th1 و Th17 (الشكل 2B) ، وتم تقليل التنشيط ، كما تم قياسه بواسطة تعبير CD25 ، في جميع المجموعات الفرعية (الشكل 2C). تم تقليل تعبير عامل النسخ (TF) الذي يميز النسب في خلايا Th1 (T-bet^زائد) ولكن لم يتغير في خلايا Th17 (ROR t^زائد) وتغيرت إلى الحد الأدنى في خلايا Treg (FoxP3^زائد) (الشكل 1 د). لقياس وظيفة خلية Teff ، تمت إعادة تنشيط الخلايا باستخدام أسيتات 12- ميريستات 13- (PMA) وأيونوميسين. أعرب عدد أقل بشكل ملحوظ من خلايا Th1 عن interferon-g (IFNg) ، وعبّر عدد أقل من خلايا Th17 عن IL -17 عند التفريق في وجود MTHFD2i (الشكل 2E). لم يكن هذا بسبب التنشيط الأولي الضعيف لأنه تم الحفاظ على هذه الأنماط الظاهرية عندما تأخر التعرض للعقاقير حتى 24 ساعة بعد التنشيط ، على الرغم من أن تعبير TF الذي يتميز بعمر الخط لم يتغير في هذا الإعداد (الأشكال S2C - S2F). وبالتالي ، فإن MTHFD2 مطلوب لأقصى CD4^زائدتنشيط الخلايا التائية ، والتكاثر ، والبقاء ، وإنتاج السيتوكينات.

للتحقق من صحة هذه التأثيرات الدوائية وراثيًا ، أنشأنا Mthfd2^{فلوريدا / فلوريدا}سلالة الفأر وعبرتها مع الفئران المعدلة وراثيا Cd 4- لتحقيق الحذف الجيني الشرطي. كما هو متوقع ، تنشيط CD4^زائدالخلايا التائية من مثفد 2^{فلوريدا / فلوريدا}قرص مضغوط 4- cre plus (CD4^{Δمثفد 2}) كان لدى الفئران تعبير أقل عن MTHFD2 مقارنة بخلايا Mthfd2^{فلوريدا / فلوريدا}قرص مضغوط 4- cre^زائد(البرية من النوع [WT]) القمامة (الشكل 2 و). في الأساس ، كان لدى الفئران CD4DMthfd2 عدد أقل قليلاً من CD4^زائدالخلايا التائية في الطحال مقارنة مع وزن (الشكل 2 ز). عند التنشيط والتمايز في المختبر ، وأرقام الخلايا وصلاحية CD4^{مثفد 2}كانت خلايا Th17 ، وبدرجة أقل ، خلايا Treg أقل بشكل ملحوظ (الشكل 2H). بالإضافة إلى ذلك ، انخفض تعبير CD25 في خلايا Th17 و Treg واتجه نحو الانخفاض في خلايا Th1 (الشكل 2I). أخيرًا ، CD4^{مثفد 2}كان لخلايا Th1 و Th17 تعبير أقل عن T-bet و ROR t ، على التوالي. ومع ذلك ، لم يتغير FoxP3 في خلايا Treg (الشكل 2J). على الرغم من التغييرات في تعبير TF ، أنتجت خلايا Teff التي تميزت كميات طبيعية من السيتوكينات (الشكل 2K). قد تعزى الاختلافات في النتائج بين النهج الدوائية والجينية إلى توقيت واكتمال فقدان وظيفة الإنزيم أثناء التطوير وآليات التعويض المحتملة.

يستحث MTHFD2i تعبير FoxP3 في خلايا Th17 ويعزز تمايز الخلايا Treg

نظرًا لاعتماد خلايا Teff على MTHFD2 ، اختبرنا تنظيم MTHFD2i لخلايا FoxP3 و Treg. والجدير بالذكر أن الانتفاخ الشاذ الناجم عن العلاج MTHFD2i لـ FoxP3 في Th1 وبشكل أكثر بروزًا في خلايا Th17 بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 3 أ). حدث هذا أيضًا عندما تأخر العلاج حتى 24 ساعة بعد التنشيط (الشكل 3 ب). ولوحظ اتجاه مماثل في خلايا CD4DMthfd2 Th17 (الشكل 3C). كان تنظيم FoxP3 هذا وظيفيًا لأن خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i اكتسبت قدرة قمعية عند زراعتها بالاشتراك مع CD8^زائدالخلايا التائية (الشكل ثلاثي الأبعاد). وبالتالي يمكن لـ MTHFD2i تعزيز الأنماط الظاهرية الشبيهة بالخلايا FoxP3 و Treg في خلايا Th17. عزز MTHFD2i أيضًا تمايز خلايا Treg المستحثة. تم تمييز خلايا Treg مع مجموعة من تركيزات عامل النمو المحول ب (TGF-b) في وجود MTHFD2i. في كل تركيز تم اختباره باستثناء أعلى تركيز ، زاد تعبير FoxP3 مع علاج MTHFD2i (الشكلان 3E و 3F). تم الحفاظ على هذا النمط الظاهري أيضًا مع علاج MTHFD2i المتأخر (الشكل 3G).

الشكل 3. نقص MTHFD2 يدفع التعبير FoxP3 ويعزز التحول نحو الفسفرة المؤكسدة

(أ) تعبير FoxP3 في خلايا Th1 و Th17 المعالجة بـ MTHFD2i 72 ساعة بعد التنشيط (متوسط ​​± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه ، تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية إجمالية).

(ب) تعبير FoxP3 في خلايا Th1 و Th17 تم تنشيطه لمدة 24 ساعة ثم معالجته بمركبة أو 500 نانومتر MTHFD2i لمدة 48 ساعة (متوسط ​​± SD ، اختبار t غير مقترن ، البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية كاملة).

(C) تعبير FoxP3 في خلايا Th1 و Th17 من رفقاء القمامة WT و CD4DMthfd2 72 ساعة بعد التنشيط (يعني ± SD ، اختبار t غير المقترن ، البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية إجمالية).

(د) قمع مقايسة قياس القدرة القمعية الشاذة لخلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i. تمت زراعة خلايا Th17 المعالجة مسبقًا بخلايا CD8 الملطخة بـ CTV بالإضافة إلى الخلايا التائية لقياس الانتشار عند التنشيط باستخدام الأجسام المضادة لـ CD3 والأجسام المضادة لـ CD28 (متوسط ​​± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه ، n=3 مكررات بيولوجية) .

(E) تعبير FoxP3 في خلايا Treg متمايزة بمجموعة من تركيزات TGF-b ومعالجتها باستخدام MTHFD2i (متوسط ​​± SD ، اختبار t غير مزدوج ، تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية إجمالية).

(و) مخططات التدفق الخلوي للبيانات المجدولة في (E).

(G) تعبير FoxP3 في خلايا Treg تم تنشيطه وتمييزه بتركيزات منخفضة من TGF-b لمدة 24 ساعة ثم تعامل مع MTHFD2i لمدة 48 ساعة (متوسط ​​± SD ، اختبار t غير مزدوج ، تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية كاملة ).

(H) تم إجراء اختبار إجهاد Seahorse XF Cell Mito على خلايا Th17 و Treg المعالجة بـ MTHFD2i (متوسط ​​± SD ، n=3 مكررات بيولوجية). (I) Basal ECAR ، basal OCR ، max OCR ، and basal OCR / ECAR تم قياس النسبة في (H) (متوسط ​​± SD ، اختبار t غير مزدوج ، البيانات تمثل تجربتين مستقلتين مع 6 مكررات بيولوجية إجمالية). يتم تصنيف النتائج ذات الدلالة إحصائيًا (* p <0. 0 5 ، ** p <0. 0 1 ، *** p <0.001 ، **** p بالمائة 0.001).

تتمتع الخلايا Treg بعملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا أكبر من خلايا Th17 (Michalek et al. ، 2011). لتحديد العواقب الأيضية للعلاج MTHFD2i ، تم تقييم خلايا Th17 و Treg عن طريق تحليلات التدفق خارج الخلية. زاد MTHFD2i من معدل استهلاك الأكسجين الأساسي والأقصى (OCR) لخلايا Th17 للإشارة إلى تحول نحو تنفس الميتوكوندريا (الشكل 3H). على العكس من ذلك ، كان لخلايا Th17 و Treg معدل تحمض قاعدي خارج الخلية (ECAR) مع علاج MTHFD2i ، مما يشير إلى انخفاض تحلل السكر (الشكل 3I). تمت زيادة النسبة القاعدية لـ OCR إلى ECAR بشكل كبير في خلايا Th17 و Treg لأن MTHFD2i قام بتحويل برنامج التمثيل الغذائي من تحلل السكر إلى الفسفرة المؤكسدة. تُظهر هذه البيانات أن MTHFD2i يعزز تعبير FoxP3 في خلايا Th17 وخلايا Treg المتمايزة في ظل ظروف TGF-b منخفضة وينقل خلايا Th17 إلى استقلاب يشبه خلايا Treg.

يقلل نقص MTHFD2 في خلايا CD4 البشرية بالإضافة إلى الخلايا التائية من تكاثر خلايا Th17 وحيويتها مع زيادة تعبير FOXP3 وتثبيط نشاط mTORC1

لاختبار إمكانية ترجمة النتائج المذكورة أعلاه إلى الخلايا البشرية ، CD4^زائدتم تفريق الخلايا التائية المعزولة من الدم المحيطي للمتبرعين الأصحاء في المختبر إلى خلايا Th1 و Th17 و Treg وعلاجها بمركبة أو MTHFD2i من وقت التنشيط. انخفض الانتشار بشكل كبير في خلايا Th17 و Treg المعالجة بـ MTHFD2i (الشكل 4 أ) ، وأظهرت خلايا Th17 أيضًا زيادة موت الخلايا المبرمج (الشكل 4 ب). تم إعادة تلخيص التكاثر المنخفض في خلايا Th17 بنهج وراثي باستخدام RNA صغير متداخل (سيرنا) (الشكلان 4C و S2G). على غرار خلايا الفئران ، كان تعبير FOXP3 أعلى في خلايا Th17 البشرية التي عولجت بـ MTHFD2i واتجه إلى أعلى في خلايا Treg البشرية التي عولجت بـ MTHFD2i (الشكلان 4D و S2H). بالنظر إلى أن محور AMPK mTORC 1- بالغ الأهمية لتمايز الخلايا Th17 و Treg ، تم أيضًا قياس الفسفرة لبروتين الريبوسوم المستهدف mTORC1 S6 (الفوسفو- S6). أظهر هذا انخفاض نشاط mTORC1 في خلايا Th17 مع MTHFD2i أو siMTHFD2 (الشكل 4E). وبالتالي ، يمكن إعادة تلخيص فقدان القدرة التكاثرية وتحريض تعبير FOXP3 في خلايا Th17 و Treg في CD4 البشري الأولي^زائدالخلايا التائية.

الشكل 4. نقص MTHFD2 يضعف الانتشار ويحث التعبير FOXP3 في خلايا Th17 البشرية

(أ) الانتشار الذي يقاس بتخفيف CTV في مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4 البشرية والمعالجة بالمركبة أو 2 ملي مولار من MTHFD2i لمدة 72 ساعة بعد التنشيط باستخدام الأجسام المضادة لـ CD3 والأجسام المضادة لـ CD28 (اختبار t المقترن ، البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة مع 5 - 6 متبرعين أصحاء).

(ب) تم قياس موت الخلايا المبرمج بواسطة Annexin V في خلايا CD4 البشرية بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ MTHFD2i لمدة 72 ساعة (اختبار t المقترن ، تمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة مع 5-6 متبرعين أصحاء).

تعبير (C) Ki -67 في خلايا CD4 البشرية بالإضافة إلى الخلايا التائية المنقولة بواسطة NTC أو siMTHFD2 (اختبار t المقترن ، البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة مع 4 متبرعين أصحاء).

(D) تعبير FOXP3 في خلايا CD4 البشرية بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ MTHFD2i لمدة 72 ساعة (اختبار t المزدوج ، البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة مع 6-10 متبرعين أصحاء).

(E) التغيير في تعبير phospho-S6 في خلايا CD4 البشرية بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ MTHFD2i لمدة 72 ساعة أو نقلها باستخدام siMTHFD2 (متوسط ​​± SD ، اختبار t لعينة واحدة ، ممثل بيانات لثلاث تجارب مستقلة مع 4-6 متبرعين أصحاء). يتم تصنيف النتائج ذات الدلالة إحصائيًا (* p <0. {{1="" 0}}="" 5،="" **="" p=""><0. 01،="" ***="" p=""><0.001، ****="" ع="" في="" المئة="">

تعتمد الخلايا التائية على الوظيفة الأنزيمية لـ MTHFD2 ، ويمكن إنقاذ الأنماط الظاهرية عن طريق المنتج

مطلوب MTHFD2 لصيانة تجمع فورمات الميتوكوندريا لتخليق البيورين (Ma et al. ، 2017) ولكن قد يلعب أيضًا أدوارًا غير إنزيمية. دعم النشاط الأنزيمي الأساسي ، أدى علاج MTHFD2i إلى امتصاص تعويضي للفورمات من الوسط في مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى (الشكل 5 أ). يتم توفير وحدة 1C المستخدمة في تخليق الفورمات عن طريق تحويل السيرين إلى الجليسين ، وتراكم السيرين داخل الخلايا بينما تم استنفاد الجليسين باستخدام علاج MTHFD2i في جميع المجموعات الفرعية (الشكل 5 ب). كما تم زيادة تراكيز الميثيونين بشكل طفيف ، مما يشير إلى تثبيط دورة الميثيونين. كما هو متوقع ، نظرًا لأن خطوة تحويل سيرين-جليسين هي بداية MTHFD2 ، لم يتم إنقاذ هذه التغييرات من خلال توفير فورمات في الوسط.

الشكل 5. يتم إنقاذ تأثيرات MTHFD2i على مجموعات فرعية من الخلايا التائية بواسطة فورمات خارجية

(أ) امتصاص الصيغ المقاس بواسطة مطيافية بالرنين المغناطيسي H (MRS) في مجموعات فرعية من الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى المعالجة بالمركبة أو 500 نانومتر MTHFD2i لمدة 72 ساعة بعد التنشيط (يعني اختبار t غير المزاوج ± SD ، البيانات تمثل تجربتين مستقلتين مع إجمالي 6 مكررات بيولوجية).

(ب) التغيير في تركيزات السيرين والجليسين والميثيونين في CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ 500 نانومتر MTHFD2i أو 500 نانومتر MTHFD2i بالإضافة إلى 1 ملي فورمات لمدة 4-6 ساعات مقارنة بالمركبة ، تقاس بمقياس الطيف الكتلي (يعني ± SD ، n { {8}} مكررات بيولوجية).

(C) عدد الخلايا الحية ، والجدوى ، وتعبير CD25 في CD4 المعالج بـ MTHFD2i بالإضافة إلى الخلايا التائية التي تم إنقاذها باستخدام 1 ملي فورمات أو 60 ملي مولار من محلول الأدينين والجوانين البيورين لمدة 72 ساعة بعد التنشيط (يعني ± SD ، أحادي الاتجاه ANOVA ، البيانات هي ممثل ثلاث تجارب مستقلة مع 9 مكررات بيولوجية إجمالية).

(د) عدد الخلايا الحية ، والجدوى ، وتعبير CD25 في خلايا CD4 بالإضافة إلى T من زملاء WT أو CD4DMthfd2 الذين تم إنقاذهم باستخدام الفورمات أو البيورينات لمدة 72 ساعة بعد التنشيط (يعني ± SD ، أحادي الاتجاه ANOVA ، n=3 مكررات بيولوجية ).

قمنا بعد ذلك باختبار ما إذا كانت إضافة الفورمات أو محلول الأدينين والجوانين البيورين يمكن أن ينقذ الوظيفة الأنزيمية الناقصة وعكس التأثيرات النهائية لنقص MTHFD2. في الواقع ، استعاد 1 ملي فورمات الانتشار والجدوى والتفعيل في الخلايا المعالجة بـ MTHFD2i (الشكل 5C). أنقذت مكملات البيورين التكاثر في جميع المجموعات الفرعية والتنشيط في خلايا Th1 و Th17 ولكن ليس قابلية البقاء في جميع المجموعات الفرعية والتنشيط في خلايا Treg. أنقذ Formate أيضًا الانتشار والجدوى والتفعيل في CD4^{Δمثفد 2}الخلايا التائية (الشكل 5 د). تم عكس إنتاج السيتوكين الضعيف في خلايا Th1 و Th17 المعالجة بـ MTHFD2i إلى كميات المركبات مع إضافة فورمات أو البيورين (الشكل 5E). بشكل ملحوظ ، تم إنقاذ الانتفاخ الشاذ لـ FoxP3 في خلايا Th17 عن طريق إضافة البيورين ولكن ليس فورمات ، في حين أن إضافة الفورمات والبيورين قللت من تعبير FoxP3 إلى خط الأساس في خلايا Treg المتمايزة بتركيزات منخفضة من TGF-b (الشكل 5F). يبدو أن الأنماط الظاهرية لـ MTHFD2i تعتمد على صيانة MTHFD2 لمجمعات فورمات الميتوكوندريا أو البيورين.

ينظم MTHFD2 نشاط mTORC1 ومثيل الحمض النووي والهيستون في CD4^زائدالخلايا التائية

في الخلايا السرطانية الخالدة ، يمكن أن يؤدي نقص MTHFD2 إلى تراكم تخليق البيورين الوسيط GAR و SAICAR و AICAR ، والتي تعد أولًا لخطوات تكوين بوساطة FormylTHF 10- (Ducker et al. ، 2016). CD4^زائدتمت تربية مجموعات الخلايا التائية الفرعية لمدة 72 ساعة قبل التعرض لـ MTHFD2i لمدة 4-6 ساعات. تم اختيار هذا الإطار الزمني القصير لتجنب أي آثار ثانوية ، بما في ذلك التغييرات التعويضية. نتج عن العلاج العابر MTHFD2i تراكم GAR و SAICAR و AICAR في جميع المجموعات الفرعية (الشكل 6 أ). تم إنقاذ هذا التأثير بالكامل عن طريق إضافة فورمات 1 مم ، مما يدعم الدور الأنزيمي لـ MTHFD2. تم أيضًا استنفاد النيوكليوتيدات والقواعد النووية ، بما في ذلك الجوانين ، بواسطة MTHFD2i وتم إنقاذها بواسطة فورمات في خلايا Th17 و Treg (الشكل 6B).

الشكل 6: ينتج عن MTHFD2i تراكم وسيطة تخليق البيورين المبللة لنشاط mTORC1 وتغيير الحمض النووي ومثيل الهيستون

(أ) التغيير في تركيزات GAR و SAICAR و AICAR في CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ 500 نانومتر MTHFD2i أو 500 نانومتر MTHFD2i بالإضافة إلى 1 ملي فورمات لمدة 4-6 ساعات بالنسبة للمركبة ، تقاس بمقياس الطيف الكتلي (يعني ± SD ، واحد- طريقة ANOVA ،=3 مكررات بيولوجية).

(ب) التغيير في أنواع التمثيل الغذائي للنيوكليوتيدات في خلايا Th17 و Treg المعالجة بـ MTHFD2i مع أو بدون فورمات لمدة 4-6 ساعات بالنسبة للمركبة ، تقاس بمقياس الطيف الكتلي (ن=3 مكررات بيولوجية).

(C) الطعم المناعي للفوسفو S6 و S6 و Rheb و phospho-ACC و ACC و HIF -1 a و b-actin في CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية المعالجة بـ MTHFD2i مع أو بدون فورمات لمدة 72 ساعة بعد التنشيط (البيانات ممثل ثلاث تجارب مستقلة مع ن {9}} مكررات بيولوجية).

(د) التغيير في مستقلبات دورة TCA في خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i مع أو بدون فورمات لمدة 6 ساعات بالنسبة للمركبة ، مقاسة بمقياس الطيف الكتلي (متوسط ​​± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه ، n=3 مكررات بيولوجية).

(هـ) خرائط الحرارة لنسبة التحكم H3K27me3 إلى IgG في مناطق ± 10- كيلو بايت حول مروجي الجينات المعروفة UCSC في خلايا Th17 و Treg المعالجة بـ MTHFD2i ، والتي تم قياسها بواسطة CUT & RUN (البيانات المجمعة من 3 مكررات بيولوجية).

(F) خريطة الحرارة لمتوسط ​​تردد مثيلة الحمض النووي لموضع Foxp3 بواسطة موقع CpG في خلايا Th1 و Th17 المعالجة بمركبة أو 500 نانومتر MTHFD2i وفي خلايا nTreg من WT أو CD4DMthfd2 littermates (اختبار الحالة ،=3 مكررات بيولوجية).

(G) جدولة (F) بواسطة المروج القريب والمروج البعيد و TSDR (اختبار t المقترن). انظر أيضًا الشكلين S3 و S4. يتم تصنيف النتائج المهمة إحصائيًا (* p <0. 0="" 5،="" **="" p=""><0. 0="" 1،="" ***="" p=""><0.001، ****="" ع="" في="" المئة="">

AICAR والنيوكليوتيدات هما المنظمان المعتمدان لمحور mTORC {0}} AMPK (Emmanuel et al.، 2017؛ Kim et al.، 2016). في الواقع ، انخفض تعبير phospho-S6 مع علاج MTHFD2i في جميع المجموعات الفرعية واستعادته بالكامل بإضافة فورمات (الشكلان 6C و S3A). يمكن أن يكون بروتين Rheb المرتبط بـ GTP ، وهو منشط إلزامي لـ mTORC1 ، حساسًا لتوافر الجوانين داخل الخلايا (Emmanuel et al. ، 2017) ، وتم تخفيف تعبير Rheb بعلاج MTHFD2i (الشكلان 6C و S3B). AICAR هو نظير للأدينوزين ومنشط AMPK (Rae and Mairs ، 2019 ؛ Su et al. ، 2019). ومع ذلك ، بعد 72 ساعة من التنشيط ، لم تتغير فسفرة AMPK أو أهدافها ، و acetyl-coenzyme A (CoA) carboxylase (phospho-ACC) و Unc ​​-51- مثل تنشيط الالتهام الذاتي كيناز (phospho-ULK1) ، لم يتغير مع علاج MTHFD2i (الأشكال 6C و S3C و S3D). يعزز نشاط mTORC1 Th17 ويخفف تمايز الخلايا Treg جزئيًا من خلال تحريض HIF -1 استقلاب حال السكر المعتمد (شي وآخرون ، 2011). تمشيا مع هذا ، تم تقليل تعبير HIF -1 في الخلايا المعالجة بـ MTHFD2i و CD4DMthfd2 Th17 (الأشكال 6C و S3E و S3F). لم ترتبط هذه التغييرات في نشاط mTORC1 بأي عجز في إشارات TCR ، كما تم قياسه بواسطة تعبير Nur77 مع وبدون إعادة التحفيز (الشكل S3G). لم يتغير محول الإشارة والمنشط لنشاط النسخ 3 (STAT3) ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير خلية Th17 ، أو زاد بشكل متواضع مع علاج MTHFD2i (الشكل S3H). اقترح انخفاض نشاط mTORC1 والتحول من تحلل السكر نحو الفسفرة المؤكسدة مع معالجة MTHFD2i تغييرات في الوفرة النسبية لمركبات دورة حمض الكربوكسيليك (TCA). تم تخفيض تركيزات السكسينات والفومارات بشكل كبير بواسطة MTHFD2i ولكن تم إنقاذها بواسطة فورمات (الشكل 6 د).

مستقلبات TCA هي مثبطات معروفة للحمض النووي وديميثيلاز هيستون (Su et al. ، 2016) ، وقد يدعم استنفاد برك السكسينات والفومارات حالة hypomethylated. تم قياس H3K27 ثلاثي الميثيل (H3K27me3) عبر الجينوم بواسطة تسلسل CUT & RUN (الانقسام تحت الأهداف والإفراج باستخدام نوكلياز) (Skene and Henikoff ، 2017). في الواقع ، قللت خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i من H3K27me3 مقارنةً بالمركبة (الشكلان 6E و S4A). تم أيضًا قياس مثيلة الحمض النووي في موضع Foxp3 عن طريق تسلسل ثنائي كبريتات لتحديد ما إذا كانت المثيلة التفاضلية قد ساهمت في تنظيم FoxP3 الناجم عن MTHFD2i. على الرغم من اختلاف العديد من مواقع CpG في تردد المثيلة بين ظروف السيارة و MTHFD2i ، لم يكن هناك نمط يمكن تمييزه في المنطقة المنزوعة الميثيل الخاصة بخلايا Treg (TSDR). لم تكن هناك أيضًا اختلافات بين خلايا nTreg (CD4 بالإضافة إلى CD25 plus) المعزولة من الفئران WT و CD4DMthfd2 (الشكل 6F) ، على الرغم من أن نقاء كل مجموعة مخصبة كانت منخفضة (الشكل S4B). ومع ذلك ، كان هناك انخفاض كبير في تردد مثيلة الحمض النووي على منطقة المروج القريبة Foxp3 في خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i مقارنةً بالمركبة (الشكل 6G) ، مما يشير إلى تعزيز محتمل للنسخ باستخدام MTHFD2i.

بالإضافة إلى الحفاظ على تجمع الفورمات داخل الخلايا ، يساهم نشاط MTHFD2 في توازن الأكسدة والاختزال الخلوي من خلال تحويل NAD^زائدإلى NADH و NADP^زائدإلى NADPH (شين وآخرون ، 2017) ودعم مسار تحويل الكبريت وتخليق الجلوتاثيون اللاحق. خفضت خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i تركيزات NAD^زائد، NADH ، NADP^زائد، و NADPH ، الذي تم إنقاذه بالفورمات (الشكل S4C). ومع ذلك ، NAD^زائد/ NADH و NADP^زائد/ لم تتغير نسب NADPH عبر الظروف. يشير هذا ، جنبًا إلى جنب مع عدم وجود تغيير في أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) وأكسيد الميتوكوندريا الفائق (الشكل S4D) ، إلى أنه من غير المرجح أن تكون التغييرات في حالة الأكسدة والاختزال مساهماً رئيسياً في النمط الظاهري لـ MTHFD2i.

نقص MTHFD2 في الجسم الحي يقلل من شدة الأمراض الالتهابية المتعددة

تم اختبار فعالية MTHFD2 كهدف علاجي بعد ذلك في نموذج فرط الحساسية المتأخر من النوع المعتمد على الخلايا التائية في الجسم الحي (DTH). تم تحصين الفئران وتحديها على الأذن باستخدام الهيموسيانين ذو ثقب المفتاح (KLH) للحث على الالتهاب الموضعي وعلاجها باستخدام المركبات الفموية أو MTHFD2i. لم تظهر المعالجة أي سمية صريحة لأن الحيوانات حافظت على وزنها (الشكل S5A). الأهم من ذلك ، تمت زيادة سماكة ووزن الأذن في الفئران الضابطة DTH ولكن ليس في الحيوانات المعالجة بمثبطات ، مما يشير إلى الحماية من الالتهاب عند علاج MTHFD2i (الأشكال 7A و 7 B و S5B). تم أيضًا تقليل الغلوبولين المناعي G (IgG) الخاص بـ KLH عند أعلى جرعة من المثبط ، مما يشير إلى التأثيرات المحتملة التي تمتد إلى وظيفة الخلية B (الشكل 7C).

الشكل 7. استهداف MTHFD2 في الجسم الحي يقلل من شدة المرض في نماذج DTH و EAE و IBD

(A و B) سماكة الأذن (A) النسبية ووزن الخزعة (B) بعد 1 0 يومًا من KLH مع تحصين CFA و 3 أيام بعد تحدي KLH للحث على DTH (ANOVA أحادي الاتجاه). عولجت الفئران مرتين يوميًا باستخدام 0 أو 100 أو 300 مجم / كجم من MTHFD2i عن طريق الفم (يعني ± SEM ، n=8 مكررات بيولوجية).

(C) تركيزات IgG الخاصة بـ KLH في اليوم 10 من DTH الناجم عن KLH (يعني ± SEM ، اختبار Kruskal-Wallis ، n=8 مكررات بيولوجية).

(D) متوسط ​​الدرجة السريرية بمرور الوقت في رفقاء القمامة WT و CD4DMthfd2 المحصنين بـ MOG مع CFA و PTX للحث على EAE (يعني ± SEM ، اختبارات Mann-Whitney المتعددة ، البيانات تمثل تجربتين مستقلتين ، لكل منهما 5 مكررات بيولوجية).

(E) عدد الخلايا وتكرار خلايا CD4 بالإضافة إلى T في الحبل الشوكي لفئران EAE في ذروة شدة المرض (يعني ± SEM ، اختبار t غير المقترن ، البيانات تمثل تجربتين مستقلتين مع 9 مكررات بيولوجية كاملة).

(F) تعبير CD25 و CD44 في خلايا CD4 بالإضافة إلى T من الحبل الشوكي لفئران EAE (يعني ± SEM ، اختبار t غير المقترن ، n=4 مكررات بيولوجية).

(G و H) عدد خلايا (G) T-bet plus و RORgt plus و FoxP3 plus و FoxP3 plus / T-bet plus ratio و FoxP3 plus / RORgt plus ratio و (H) IL -17 plus و IFNg plus ، و IL -17 بالإضافة إلى IFNg plus CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من الحبل الشوكي لفئران EAE (يعني ± SEM ، اختبار t غير المقترن ، البيانات تمثل تجربتين مستقلتين مع 9 مكررات بيولوجية كاملة).

(I) تلطيخ H&E و CD3 IHC و Luxol Fast Blue (LFB) للميلين في الحبل الشوكي لفأر WT بدون تحصين وزملاء WT و CD4DMthfd2 مع EAE في ذروة المرض (تكبير 2003 ، ممثل 5 مكررات بيولوجية ).

(J) التغيير في وزن الجسم بمرور الوقت من Rag1^__/__حقنت الفئران بروتوكول الإنترنت بخلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية WT أو CD4DMthfd2 للحث على التهاب القولون IBD (يعني ± SEM ، اختبارات t متعددة ، n=8 مكررات بيولوجية).

(K و L) عدد الخلايا (K) إجمالي CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية و (L) T-bet plus و RORgt plus و FoxP3 بالإضافة إلى خلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية من MLNs لفئران IBD (يعني ± SEM ، اختبار t غير مزدوج n { {4}} مكررات بيولوجية). انظر أيضًا الشكلين S5 و S6. يتم تصنيف النتائج ذات الدلالة إحصائيًا (* p <0. 0="" 5،="" **="" p=""><0. 0="" 1،="" ***="" p=""><0.001، ****="" ع="" في="" المئة="">

وبالمثل ، كان مثبط MTHFD1 / 2 المزدوج LY345899 (Gustafsson et al. ، 2017) فعالًا في تخفيف المرض في نموذج EAE. تم تحفيز EAE باستخدام MOG و PTX ، وعولجت الفئران يوميًا بالحقن داخل الصفاق (ip) لـ DMSO أو LY345899. أدى العلاج المثبط إلى انخفاض ملحوظ في شدة المرض والنتيجة السريرية التراكمية مقارنة بالمركبة (الشكلان S5C و S5D). تم التضحية بالفئران في اليوم 26 ، وتم جمع خلايا النخاع الشوكي المتسللة من أجل التنميط المناعي. بشكل ملحوظ ، عدد أقل بشكل ملحوظ من CD45^زائد، CD4^زائدو CD8^زائدتسللت الخلايا إلى النخاع الشوكي للفئران المعالجة LY 345899- (الأشكال S5E-S5G). لم تكن هناك تغييرات في وتيرة ROR t^زائدأو FoxP3^زائدالخلايا بين التسلل CD4^زائدالخلايا التائية (الشكل S5H). ومع ذلك ، كان هناك انخفاض في تواتر IFNg plus IL -17 بالإضافة إلى الخلايا وزيادة في IL -17 بالإضافة إلى الخلايا (الشكل S5I) ، مما يشير إلى إمكانية التحول إلى النمط الظاهري أقل مسببات الأمراض.

لاختبار الاعتماد الجوهري للخلايا التائية على MTHFD2 في الجسم الحي ، تعرض زملاء WT و CD4DMthfd2 لثلاثة نماذج مختلفة: EAE ، ومرض التهاب الأمعاء (IBD) ، وأمراض مجرى الهواء التحسسي. تم إحداث EAE مرة أخرى باستخدام MOG و PTX ، وعلى غرار تجربة المانع ، خفضت الفئران CD4DMthfd2 بشكل ملحوظ من شدة المرض على مدار 26 يومًا (الشكل 7 د). تم التخلص من مجموعة منفصلة في ذروة المرض في اليوم 15 بعد تحريض التنميط الظاهري للخلايا التائية (الشكلان S6A و S6B). على الرغم من أن CD4^زائدأو CD8^زائدلم يتغير تعداد الخلايا التائية في الطحال (الشكل S6C) ، وانخفض تسلل الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى الحبل الشوكي بشكل كبير (الشكل 7E). كان لدى خلايا CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية التي تتسلل إلى الحبل الشوكي في الفئران CD4DMthfd2 تعبير CD25 مماثل مثل WT ولكنه قلل من التعبير عن CD44 ، مما يشير إلى ضعف التنشيط جزئيًا (الشكل 7F). أعداد T-bet^زائدتم أيضًا تقليل خلايا ROR t plus و FoxP3 plus (الشكل 7G) ، بالإضافة إلى خلايا IL -17 plus و IFNg plus (الشكل 7H) ، في الحبل الشوكي لفئران CD4DMthfd2 بالنسبة إلى WT. والجدير بالذكر أن نسب FoxP3 plus إلى خلايا T-bet plus و RORgt plus كانت مرتفعة في الفئران CD4DMthfd2 مقارنة مع WT في ذروة المرض ، مما يعكس النتائج المختبرية لتعبير FoxP3 المتزايد مع نقص MTHFD2 (الشكل 7G). على الرغم من أن تواتر الخلايا التي تعبر عن TF بين الخلايا المتسللة يميل بشكل عام إلى الأعلى ، إلا أن تواتر التعبير الخلوي لم يتغير (الشكلان S6D و S6E). أنسجة الحبل الشوكي لفئران التحكم بدون EAE و WT و CD4^{مثفد 2}أظهرت الفئران المصابة بـ EAE زيادة في الخلوية وإيجابية CD3 في الحبل الشوكي في الفئران WT التي ارتبطت بإزالة الميالين ، كما يتضح من تلطيخ Luxol Fast Blue (الشكل 7I). كانت هذه التغييرات غائبة في تحكم no-EAE و CD4^{مثفد 2}الفئران.

تم اختبار دور MTHFD2 بعد ذلك في نماذج أمراض الأمعاء الالتهابية وأمراض مجرى الهواء التحسسي. تم نقل خلايا WT و CD4DMthfd2 الساذجة CD4 بالإضافة إلى T إلى Rag1 / المستلمين لبدء IBD. على الرغم من أن الفئران التي تلقت خلايا WT بدأت في فقدان الوزن مع تقدم مرض التهاب الأمعاء ، استمر متلقو الخلايا التائية CD4DMthfd2 في زيادة الوزن (الشكل 7J). تم العثور على أعداد وترددات أقل بكثير من خلايا CD4DMthfd2 T في الطحال (الشكل S6F) والعقد الليمفاوية المساريقية (MLNs) التي تستنزف القولون (الشكلان 7K و S6G). تم أيضًا تقليل عدد خلايا T-bet plus و ROR t plus و FoxP3 بالإضافة إلى CD4DMthfd2 T في MLNs ، ولكن تم زيادة تواتر خلايا FoxP3 plus (الشكلان 7L و S6H). ومع ذلك ، لم تكن هناك اختلافات في نسب عدد خلايا FoxP3 / T-bet و FoxP3 / RORgt في MLNs في هذه المرحلة الزمنية المتأخرة (الشكل S6I). على غرار نتائج MTHFD2 كضربة متواضعة في شاشة CRISPR لالتهاب مجرى الهواء في الجسم الحي (الشكل 1C) ، كان لدى الفئران CD4DMthfd2 التي تعرضت لمرض مجرى الهواء التحسسي الناجم عن Alternaria اتجاه إلى انخفاض وفرة العدلات في سائل غسل القصبات الهوائية (BALF) ، على الرغم من عدم لوحظت تغييرات في تعداد الخلايا الليمفاوية BALF ، الحمضات ، والبلاعم (الشكل S7A).

أخيرًا ، تم اختبار تأثير MTHFD2i على النشاط المناعي العام. OT-II CD45.2 خاص بـ OVA^زائدCD4^زائدتم نقل الخلايا التائية بالتبني إلى CD45.1^زائدالفئران ، التي تم تحصينها بعد ذلك تحت الجلد بمستحلب من OVA مع مساعد Freund الكامل (CFA) وعولجت يوميًا باستخدام المركبات الفموية أو MTHFD2i. لم يتغير وزن الجسم تحت جميع الظروف (الشكل S7B). توسيع OT-II CD45.2 المنقولة^زائدتأخرت الخلايا قليلاً في الفئران المحصنة المعالجة بـ MTHFD2i لكنها وصلت إلى عدد المركبات بحلول اليوم السابع (الأشكال S7C-S7E). ومع ذلك ، تم تقليل تواتر IFNg plus الخلايا في استنزاف LNs (الشكل S7F). تُظهر هذه البيانات أن علاج MTHFD2i في الجسم الحي يسمح بتوسيع الخلايا التائية الخاصة بالمستضد بعد التحفيز الحاد ، على الرغم من إنتاج السيتوكين الالتهابي الرطب.

نقاش

يتطلب تنشيط الخلايا التائية وتمايزها ووظيفتها إعادة برمجة أيضية مناسبة لتلبية متطلبات الخلايا المتزايدة للطاقة ، ولبنات البناء الحيوية ، وجزيئات الإشارات. في هذه الدراسة ، درسنا وظيفة التمثيل الغذائي 1C في CD4 الأولية بالإضافة إلى الخلايا التائية. باستخدام مزيج من بيانات الفحص والتعبير الجيني المستندة إلى الخلايا التائية الأولية في الجسم الحي ، تم تحديد MTHFD2 كهدف محتمل للعلاجات المضادة للالتهابات. أدى تثبيط MTHFD2 أو نقصه عمومًا إلى انخفاض تكاثر الخلايا التائية CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية. والجدير بالذكر أن هذا كان مرتبطًا بتحريض تعبير FoxP3 والوظيفة القمعية في خلايا Th17 بالإضافة إلى تمايز خلايا Treg المحسن. تشير هذه البيانات إلى أن MTHFD2 قد يعمل كنقطة تفتيش استقلابية في محور الخلية Treg 17- ، مع علاج MTHFD2i الذي يخيط التوازن من النمط الظاهري الممرض إلى النمط الظاهري الأكثر مضادًا للالتهابات. في الواقع ، أدى تثبيط MTHFD2 أو النقص الوراثي إلى تخفيف حدة المرض في نماذج متعددة في الجسم الحي للمناعة الذاتية وفرط الحساسية.

يتكون التمثيل الغذائي 1C من استقلاب السيرين-جلايسين ، ودورة الفولات ، ودورة الميثيونين ، وهو أمر أساسي للعديد من العمليات ، بما في ذلك تخليق دي نوفو البيورين ، وتوليد مانح الميثيل ، وتنظيم الأكسدة والاختزال (يانغ وفوسدن ، 2016). يشارك التمثيل الغذائي 1C بقوة مع تحفيز TCR (Tan et al. ، 2017) والمطلوب لدعم توسع الخلايا التائية (Ma et al. ، 2017). يتم تقسيم دورة الفولات إلى مكونات عصارية خلوية وميتوكوندريا. في العصارة الخلوية ، يحول MTHFD1 5 ، 10- ميثيلين THF ، 10- فورميل THF ، وفورمات. في الميتوكوندريا ، يتم تحقيق نفس التفاعلات بواسطة MTHFD2 و MTHFD1L. تُستخدم هذه المواد الوسيطة الناتجة لدعم خطوات الصياغة في تخليق دي نوفو البيورين. يمكن لـ MTHFD1 و MTHFD2 أيضًا تعديل حالة الأكسدة والاختزال من خلال توليد NAD (H) و NADP (H) (Ducker and Rabinowitz ، 2017). على الرغم من أن بعض أنواع الخلايا تظهر مرونة في التحول إلى مصدر العصارة الخلوية في ظل إعدادات خلل في مسار الميتوكوندريا (Ducker et al. ، 2016) ، فقد تم اقتراح الخلايا التائية مسبقًا للاعتماد في الغالب على مسار الميتوكوندريا لتوفير وحدات 1C وأنواع مختزلة (Ron- Harel et al.، 2016). ثبت أيضًا أن الخلايا التائية تعتمد على امتصاص السيرين ، ويمكن تعديل الاستجابات المناعية في الجسم الحي بكميات السيرين الغذائية. يتم التوسط في تأثيرات تجويع السيرين عن طريق الحد من التخليق الحيوي للبيورين حتى في وجود مسارات إنقاذ سليمة ويمكن تجاوزها عن طريق توفير الجلايسين والفورمات (Ma et al. ، 2017). تضيف بياناتنا إلى هذه النتائج وتشير إلى MTHFD2 كمنظم مهم يؤثر على CD4^زائدتكاثر الخلايا التائية والتمايز.

إيكانيكوسايد

على الرغم من أن استقلاب 1C يلعب دورًا واسعًا في استقلاب الخلية ، وجدنا أن بعض الوظائف كانت مميزة لاختيار مجموعات فرعية من الخلايا التائية. تكاثرت جميع الخلايا التائية البشرية والفأرية بدرجة أقل مع نقص MTHFD2 ، مما يشير إلى وظيفة مشتركة لـ MTHFD2 لدعم نمو الخلايا التائية وانقسامها. آثار نقص MTHFD2 على تمايز الخلايا التائية ووظيفة المستجيب ، ومع ذلك ، اختلفت في كل مجموعة فرعية تم اختبارها. أظهرت خلايا Th1 تمايزًا ضعيفًا مع انخفاض تحريض T-bet وانخفاض إنتاج السيتوكين. غيرت خلايا Th17 أيضًا التمايز وخفضت إنتاج السيتوكين. على الرغم من عدم تغيير ROR t ، إلا أن خلايا Th17 الناقصة في MTHFD 2- نظمت خلية Treg TF FoxP3 واكتسبت القدرة على قمع تكاثر الخلايا التائية CD8 المنشطة. أظهرت خلايا Treg تمايزًا معززًا في ظل ظروف TGF-b منخفضة. لقد ثبت الآن جيدًا أن كل مجموعة من هذه المجموعات الفرعية يمكن أن يكون لها متطلبات أيضية مميزة (Bantug et al. ، 2018 ؛ Buck et al. ، 2015). تظهر بياناتنا أن MTHFD2 مطلوب أيضًا بشكل انتقائي لخلايا Teff مع تعزيز مصير خلايا Treg ووظيفتها. من الجدير بالملاحظة أن هذه النتائج تختلف عن عيوب GLUT1 أو GLS أو ASCT2 التي تضعف أو تغير تمايز خلايا Teff مع وجود تأثيرات متواضعة لتعزيز تمايز الخلايا Treg أو تمايز الخلايا Treg بشكل مباشر إلى خلايا Treg (جونسون وآخرون ، 2018 ؛ Macintyre وآخرون ، 2014 ؛ Nakaya et al. ، 2014).

يبدو أن مصائر الخلايا التائية المتميزة هذه تعتمد على النشاط الأنزيمي لـ MTHFD2 لأن تأثيرات نقص MTHFD2 تم إنقاذها باستخدام القواعد النووية فورمات أو البيورين. على الرغم من أننا لم نجد أي تأثير كبير لتغير توازن الأكسدة والاختزال مع نقص MTHFD2 ، يبدو أن التوليف المتغير لـ de novo purine أمر بالغ الأهمية. أدى العلاج بـ MTHFD2i إلى انخفاض تركيزات البيورين ، خاصة الجوانين بينما تسبب في تراكم مركبات البيورين الوسيطة GAR و SAICAR و AICAR. تتطلب هذه المواد الوسيطة صياغة لمزيد من التخليق الحيوي ، وتم إنقاذ التأثيرات عندما تمت إضافة فورمات المستقلب المشتق MTHFD 2- إلى الوسط ، مما يدعم آلية كيميائية حيوية على الهدف لـ MTHFD2i. يعد تخليق النيوكليوتيدات De novo لدعم تخليق الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) ضروريًا لتكاثر الخلايا التائية (Que´ me´ neur et al. ، 2003 ، 2004). وبالتالي ، يبدو أن أحد مكونات الآلية التي يضعف بها MTHFD2i تمدد الخلايا التائية هو توليد غير كافٍ للنيوكليوتيدات.

فلافونويد

قد يؤدي الفشل في تصنيع النيوكليوتيدات الكافية إلى تثبيط الخلايا التائية المؤثرة من خلال آليات متعددة. يعد AMPK و mTORC1 من المحركات الرئيسية لإعادة البرمجة الأيضية مع أدوار متعارضة بشكل عام في خلايا Teff و Treg (Bantug et al. ، 2018 ؛ Buck et al. ، 2015). لقد أظهرنا أن علاج MTHFD2i في الخلايا التائية أدى إلى تراكم حاد لـ AICAR ، وهو مستقلب ملحوظ كمنشط للأدينوزين ومنشط AMPK (Rae and Mairs ، 2019 ؛ Su et al. ، 2019). ومع ذلك ، لم يكن هناك دليل على زيادة نشاط AMPK في النقاط الزمنية المحددة. قد يعكس هذا تنظيمًا إضافيًا لـ AMPK ، ولكن يمكن أن يكون لـ AICAR أيضًا تأثيرات مستقلة عن AMPK (Dembitz et al. ، 2019). mTORC1 حساس أيضًا لتركيزات البيورين لأن انخفاض توافر الجوانين يثبط نشاط منشط mTORC1 Rheb (Emmanuel et al. ، 2017 ؛ Hoxhaj et al. ، 2017). قد يساهم تراكم AICAR وانخفاض نشاط mTORC1 في ضعف توليد خلايا Th1 و Th17 المعالجة بـ MTHFD2i وتوليد محسن لخلايا Treg. قد يساهم كبت إشارات mTORC1 أيضًا في التحول في برنامج التمثيل الغذائي من تحلل السكر إلى تنفس الميتوكوندريا وتغيير وفرة مستقلب TCA في خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i. يلعب مسار mTORC1 دورًا مركزيًا في تعزيز التمثيل الغذائي الابتنائي ويمكن أن يؤدي إلى تراكم TF ATF4 ، والذي بدوره يمكن أن يحفز تعبير MTHFD2 (Ben-Sahra et al. ، 2016).

يرتبط التدفق الأيضي بالتنظيم اللاجيني لأن المستقلبات تساهم في العديد من التعديلات اللاجينية (شارما وراندو ، 2017) ، بما في ذلك استقلاب 1C لتوليد مانح الميثيل العالمي S-adenosyl methionine (SAM) للبروتين ومثيلة الحمض النووي. ومع ذلك ، تشير تجارب تتبع الكربون في الخلايا التائية المنشطة إلى أن وحدات 1C المشتقة من السيرين المشتق من الجلوكوز والخارجي لا تساهم بشكل فعال في دورة الميثيونين والميثيلين (Ma et al. ، 2017). قد يؤثر التدفق الأيضي أيضًا على أنماط المثيلة من خلال التغييرات في وفرة نواتج أيض TCA ، بما في ذلك alpha-ketoglutarate و fumarate و succinate. على وجه التحديد ، يمنع الفومارات والسكسينات الحمض النووي وديميثيلاز هيستون (Su et al. ، 2016). تمشيا مع استنفاد هذه المستقلبات في خلايا Th17 المعالجة بـ MTHFD2i ، تم تقليل H3K27me3 على نطاق واسع عبر الجينوم ، وتم تقليل مثيلة الحمض النووي على وجه التحديد في محفز Foxp3 القريب ، والذي قد يساهم في النمط الظاهري التمايز. لم يتم إنقاذ النمط الظاهري لتمايز الخلايا Th17 عن طريق مكملات الفورمات ، مما يشير إلى أن المسارات الإضافية من المحتمل أن تساهم في تنظيم FoxP3 ، مثل نشاط آليات استشعار تركيز النوكليوتيدات الأخرى

أكتيوسيد (فيرباسكوسايد)

تم الإبلاغ أيضًا عن أن MTHFD2 يلعب أدوارًا غير إنزيمية قد تساهم في الإجراءات المؤيدة للالتهابات لهذا الإنزيم. في الخلايا السرطانية ، يمكن أن يكون لـ MTHFD2 وظائف نووية ، بالتشارك مع مواقع تكرار الحمض النووي لتعزيز تقدم دورة الخلية (Gustafsson Sheppard et al. ، 2015). في الخلايا الجذعية للفئران ، ثبت أن MTHFD2 يعدل إصلاح الحمض النووي للحفاظ على الاستقرار الجيني (Yue et al. ، 2020). في سرطان الخلايا الكلوية ، وجد أن MTHFD2 ضروري لإعادة برمجة التمثيل الغذائي عبر مثيلة mRNA (Green et al. ، 2019). على الرغم من أن هذه الأدوار لـ MTHFD2 لا تتعارض مع نتائجنا ، فإن قدرة فورمات على إنقاذ العديد من الأنماط الظاهرية لنقص MTHFD2 في الخلايا التائية تشير إلى أن النشاط الأنزيمي MTHFD2 هو المحرك الأساسي لتكاثر الخلايا التائية ومصيرها.

تم اعتبار MTHFD2 إلى حد كبير هدفًا دوائيًا في البيئات المضادة للسرطان. قد يكون أيضًا هدفًا واعدًا مضادًا للالتهابات ويقدم تأثيرات ضارة أقل مقارنة بمضادات الفولات المتوفرة حاليًا ، نظرًا لانخفاض التعبير في معظم أنسجة البالغين. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن أحد أهداف MTX ، DHFR ، على نطاق واسع في أنسجة البالغين (Nilsson et al. ، 2014). لذلك ، يمكن أن تترافق MTX مع مجموعة متنوعة من الآثار الضارة ، بما في ذلك السمية المعدية المعوية. علاوة على ذلك ، تظل آلية عمل MTX غير مفهومة جيدًا على الرغم من تاريخها الطويل (Cronstein and Aune ، 2020). قد يؤدي التعبير المنظم للغاية عن MTHFD2 وإمكانية التكرار مع مسار MTHFD1 العصاري الخلوي إلى اعتماد انتقائي لمجموعات خلايا معينة على MTHFD2. تحدد النتائج التي توصلنا إليها MTHFD2 كنقطة تفتيش حرجة في التمثيل الغذائي في CD4^زائدالخلايا التائية. على الرغم من وجود تداخل واسع بين بيولوجيا الخلايا السرطانية وبيولوجيا الخلايا التائية سريعة الانتشار ، نجد أن مجموعات الخلايا الفرعية CD4 + T تظهر حساسية إضافية من خلال تعديل تمايز الخلايا ووظيفتها. من المحتمل أن استهداف MTHFD2 في علاجات السرطان قد يقيد المناعة المضادة للورم. ومع ذلك ، قد تكون الإعدادات مثل سرطان القولون والمستقيم ، حيث يساهم الالتهاب الخلوي Th17 في المرض ، مناسبة تمامًا لـ MTHFD2is. قد تكون حساسية الخلايا التائية تجاه MTHFD2 شكلًا فعالًا من العلاج المناعي في إعدادات CD4^زائدالالتهاب الناتج عن الخلايا التائية يتجاوز السرطان ويؤدي إلى آثار ضارة أقل من العوامل العلاجية المتاحة حاليًا.

حدود الدراسة

يحتوي MTHFD2i المستخدم في هذه الدراسة على قيمة IC5 0 تبلغ 0. 0063 mM for MTHFD2 و 0.57 ملي مولار لـ MTHFD1 ؛ لذلك ، لا يمكن استبعاد التأثيرات الطفيفة غير المستهدفة للتثبيط المزدوج لـ MTHFD2 و MTHFD1. بالنظر إلى أن تنظيم FoxP3 الشاذ في خلايا TH17 لم يتم إنقاذه من خلال توفير فورمات ولكن نشاط mTORC1 كان ، فإن الآلية الكامنة وراء هذا النمط الظاهري تتطلب مزيدًا من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء جميع النماذج في الجسم الحي باستخدام علاج MTHFD2i أو الاستئصال الجيني من وقت تحريض المرض ، وتم إجراء التنميط الظاهري للخلايا التائية في نقطة زمنية واحدة. لتوصيف تأثير نقص MTHFD2 بشكل أفضل على التسبب في المرض ، يجب أن تشمل الدراسات الإضافية تجارب الدورة الزمنية مع التوصيف التسلسلي لمجموعات الخلايا التائية لتحديد ما إذا كانت مجموعات الخلايا الفرعية CD4 بالإضافة إلى T تتأثر بشكل تفاضلي في الجسم الحي. أخيرًا ، لتحسين ملاءمة هذه الدراسة للتطبيقات السريرية ، يجب اختبار فعالية علاج MTHFD2i بعد ظهور المرض.

طرق ★ النجوم

يتم توفير الطرق التفصيلية في النسخة الإلكترونية من هذه الورقة وتتضمن ما يلي:

• جدول الموارد الرئيسية

• توافر الموارد

• B يؤدي الاتصال

• توافر المواد ب

• ب توافر البيانات والرمز

  
  

• النموذج التجريبي وتفاصيل الموضوع

• B الفئران B الإنسان الخلايا التائية

• خطوط الخلية ب

  
  

• تفاصيل الطريقة

• B في الفأر المختبر CD4^زائدتنشيط الخلايا التائية والتمايز

• مقايسة قمع الخلية B Th17

• ب في المختبر البشري CD4^زائدشروط زراعة الخلايا التائية

• فحص ب كريسبر ب استقلاب مطياف الكتلة

• مطيافية الرنين المغناطيسي النووي البروتوني (1H-MRS)

• B المناعي

• B CUT & RUN B EpigenDx المستهدفة NextGen بيسلفيفيت التسلسل

• نماذج B In vivo EAE لـ IHC وقياس التدفق الخلوي

• B في علاج الجسم الحي LY345899 في نموذج EAE

• B في الجسم الحي DS18561882 العلاج في DTH النموذج B في الجسم الحي نموذج IBD مع WT و CD4^{مثفد 2}رفقاء القمامة

• B في نموذج أمراض مجرى الهواء التحسسي في الجسم الحي مع WT و CD4^{مثفد 2}رفقاء القمامة

• العلاج ب في الجسم الحي DS18561882 في نموذج التحصين OVA

  
  

• التحديد الكمي والتحليل الإحصائي

معلومات إضافية

يمكن العثور على معلومات تكميلية عبر الإنترنت على https://doi.org/10.1016/j. مناعة .2021.10.011.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مختبر Rathmell للمساهمة في هذا المشروع. نشكر Thomas Aune على توفير بيانات RNA-seq و J. Cools (VIB) لتوفير بناء gRNA-GFP pMx-U 6-. نشكر Max R. Van Belkum لتصميم البادئات MTHFD2 qPCR. نشكر Nello Mainolfifi و Vipin Suri و Adam Friedman و Mark Manfredi من Raze Therapeutics، Inc. (بوسطن ، ماساتشوستس) لتوفير مركب Raze 1459 ، والذي تم استخدامه لتأكيد النتائج (البيانات غير معروضة). تم إنشاء المخططات باستخدام BioRender. نعترف بالمورد المشترك لعلم الأمراض الانتقالية ، المدعوم من NCI / NIH Cancer Center منح دعم 5P30 CA 68485-19 ومنح الأجهزة المشتركة S10 OD 023475-01 A1 ، لـ Leica Bond RX. تم دعم هذا العمل من قبل جائزة William E. Paul المتميز للمبدع عن Lupus Research Alliance (إلى JCR) ، R01s DK105550 (إلى JCR) ، HL136664 (إلى JCR و DCN) ، CA217987 (إلى JCR) ، AI153167 (إلى JCR) ، AI137075 (إلى AKM) و T32 DK101003 (KV) و T32 GM007347 (إلى AS).

الكاتب الاشتراكات

صممت AS و GA و JCR البحث. AS و GA و KV و DRH و XX و MZM و XY و KLB و NC و MMW و ACY و DLG و AES و SKS و SNF و AMC و PF و TB و JCG-C. أجرى البحث. تم تحليل البيانات AS و GA و XY و JK و DCN و AKM و JDR و JCR. كتب AS و JCR الورقة مع مساهمات من المؤلفين الآخرين.

إعلان المصالح

JCR هو مؤسس وعضو مجلس استشاري علمي وحامل أسهم في Sitryx Therapeutics ؛ عضو مجلس استشاري علمي ومساهم في Caribou Biosciences ؛ عضو في المجلس الاستشاري العلمي لـ NirogyTherapeutics ؛ استشار شركتي Merck و Pfizer و Mitobridge خلال السنوات الثلاث الماضية ؛ وتلقى دعمًا بحثيًا من Incyte Corp. و CalitheraBiosciences و Tempest Therapeutics. JDR هو مؤسس مشارك ومساهم في Raze Therapeutics و Toran و Serien Therapeutics و Farber Partners ومستشار ومساهم في Agios Pharmaceuticals و Kadmon Pharmaceuticals و Bantam Pharmaceuticals و Colorado Research Partners و RafaelHoldings و Barer Institute و LEAF Pharmaceuticals ؛ حصل على رسوم استشارية وتمويل أبحاث من شركة Pfizer و Rafael وهو مخترع براءات الاختراع التي تحتفظ بها جامعة برينستون. AMC و PF و TB هم موظفون في Sitryx Therapeutics.

الشمول والتنوع

لقد عملنا على ضمان التوازن الجنسي في اختيار المواد غير البشرية. يعرّف واحد أو أكثر من مؤلفي هذه الورقة أنفسهم على أنهم أقلية عرقية ممثلة تمثيلا ناقصا في العلوم. أثناء الاستشهاد بالمراجع ذات الصلة علميًا بهذا العمل ، عملنا أيضًا بنشاط لتعزيز التوازن بين الجنسين في قائمتنا المرجعية. تتضمن قائمة مؤلفي هذه الورقة المساهمين من الموقع الذي تم إجراء البحث فيه والذين شاركوا في جمع البيانات والتصميم والتحليل و / أو تفسير العمل.

المراجع

Anderson، GR، Winter، PS، Lin، KH، Nussbaum، DP، Cakir، M.، Stein، EM، Soderquist، RS، Crawford، L.، Leeds، JC، Newcomb، R.، et al. (2017). مشهد من التعاون العلاجي في سرطانات KRAS المتحولة يكشف عن مبادئ للتحكم في تطور الورم. ممثل الخلية 20 ، 999-1015.

Aune و TM و Crooke و PS و 3rd و Patrick و AE و Tossberg و JT و Olsen و NJ و Spurlock و CF والثالث (2017). التعبير عن RNAs طويلة غير مشفرة في المناعة الذاتية والارتباط بوظيفة المحسن والمتغيرات الجينية لأمراض المناعة الذاتية. J. الذاتي. 81 ، 99-109.

Bantug ، GR ، Galluzzi ، L. ، Kroemer ، G. ، and Hess ، C. (2018). طيف استقلاب الخلايا التائية في الصحة والمرض. نات. القس إمونول. 18 ، 19 - 34. بن صحرا ، I. ، Hoxhaj ، G. ، Ricoult ، SJH ، Asara ، JM ، and Manning ، BD (2016). يستحث mTORC1 تخليق البيورين من خلال التحكم في دورة رباعي هيدروفولات الميتوكوندريا. العلوم 351 ، 728-733.

Brown، PM، Pratt، AG، and Isaacs، JD (2016). آلية عمل الميثوتريكسات في التهاب المفاصل الروماتويدي ، والبحث عن المؤشرات الحيوية. نات. القس الروماتول. 12 ، 731-742.

باك ، دكتوراه في الطب ، أوسوليفان ، د. ، وبيرس ، إل (2015). يحرك استقلاب الخلايا التائية المناعة. ياء إكسب. ميد. 212 ، 1345-1360.

كانتور ، جيه آر ، أبو رميلة ، إم ، كاناريك ، إن ، فرينكمان ، إي ، جاو ، إكس ، لويسان ، أ. ، جونيور ، لويس ، كاليفورنيا ، و ساباتيني ، مارك ألماني (2017). الأيض الخلوي لإعادة الأسلاك المتوسطة الفسيولوجية ويكشف عن حمض اليوريك كمثبط داخلي لمركب UMP Synthase. الخلية 169 ، 258-272.e17.

كرونشتاين ، بي إن ، وأوني ، TM (2020). الميثوتريكسات وآليات عمله في التهاب المفاصل الالتهابي. نات. القس الروماتول. 16 ، 145-154.

Dembitz، V.، Tomic، B.، Kodvanj، I.، Simon، JA، Bedalov، A.، and Visnjic، D. (2019). يحث Ribonucleoside AICAr على تمايز سرطان الدم النخاعي عن طريق تنشيط ATR / Chk1 عبر استنفاد البيريميدين. J. بيول. تشيم. 294 ، 15257-15270.

Dendrou ، CA ، Fugger ، L. ، and Friese ، MA (2015). أمراض المناعة من التصلب المتعدد. نات. القس إمونول. 15 ، 545-558.

دكر ، جي إس ، ورابينوفيتش ، دينار (2017). التمثيل الغذائي للكربون الواحد في الصحة والمرض. ميتاب الخلية. 25 ، 27-42.

Ducker، GS، Chen، L.، Morscher، RJ، Ghergurovich، JM، Esposito، M.، Teng، X.، Kang، Y.، and Rabinowitz، JD (2016). عكس تدفق الكربون خلوي واحد يعوض عن فقدان مسار حمض الفوليك في الميتوكوندريا. ميتاب الخلية. 23 ، 1140-1153.

إيمانويل ، إن ، راغوناثان ، إس ، شان ، كيو ، وانغ ، إف ، جياناكو ، إيه ، هوسر ، إن ، جين ، جي ، مايرز ، جي ، أبراهام ، آر تي ، وأونسال كاكماز ، ك. (2017). توافر النوكليوتيدات البيورين ينظم نشاط mTORC1 من خلال قاعدة Rheb GTP. ممثل الخلية 19 ، 2665-2680.

Farber، S.، Diamond، LK، Mercer، RD، Sylvester، RF، and Wolff، JA (1948). الهفوات المؤقتة في ابيضاض الدم الحاد لدى الأطفال الناتجة عن مضادات حمض الفوليك ، 4- aminopteroyl-glutamic acid. إنجل. جيه ميد. 238 ، 787-793.

فيلد ، إم إس ، كامينينا ، إي ، واتكينز ، دي ، روزنبلات ، دي إس ، وستوفر ، بي جي (2015). رؤى جديدة في المحددات الأيضية والتغذوية لنقص المناعة المشترك الشديد. نادرة ديس. 3 ، e1112479.

Fuseini ، H. ، Yung ، JA ، Cephus ، JY ، Zhang ، J. ، Goleniewska ، K. ، Polosukhin ، VV ، Peebles ، RS ، Jr. ، and Newcomb ، DC (2018). يقلل التستوستيرون من النوع 2 الناجم عن عث غبار المنزل وإل -17 التهاب مجرى الهواء A. J. إمونول. 201 ، 1843-1854.

جوفينداراجو ، في ، يونج ، ك. ، ومودسلي ، إيه إيه (2000). التحولات الكيميائية للرنين المغناطيسي النووي البروتوني وثوابت اقتران مستقلبات الدماغ. NMR بيوميد. 13 ، 129-153.

Green، NH، Galvan، DL، Badal، SS، Chang، BH، LeBleu، VS، Long، J.، Jonasch، E.، and Danesh، FR (2019). يربط MTHFD2 مثيلة الحمض النووي الريبي بإعادة البرمجة الأيضية في سرطان الخلايا الكلوية. الجين الورمي 38 ، 6211-6225.

Gustafsson، R.، Jemth، A.-S.، Gustafsson، NMS، F € arnega˚rdh، K.، Loseva، O.، Wiita، E.، Bonagas، N.، Dahllund، L.، Llona-Minguez، S. ، H € aggblad ، M. ، وآخرون. (2017). التركيب البلوري لهدف السرطان الناشئ MTHFD2 في مركب مع مثبط قائم على الركيزة. الدقة السرطان. 77 ، 937-948.

غوستافسون شيبارد ، إن ، جارل ، إل ، ماهاديسيان ، دي ، ستريتماتر ، إل ، شميدت ، إيه ، مادهوسودان ، إن ، تيجنير ، جي ، لوندبيرج ، إي كيه ، أسبلوند ، إيه ، جين ، إم . ، ونيلسون ، ر. (2015). الإنزيم المقترن بحمض الفوليك MTHFD2 هو بروتين نووي ويعزز تكاثر الخلايا. علوم. مندوب. 5 ، 15029.

Hoxhaj، G.، Hughes-Hallett، J.، Timson، RC، Ilagan، E.، Yuan، M.، Asara، JM، Ben-Sahra، I.، and Manning، BD (2017). تستشعر شبكة إشارات mTORC1 التغيرات في مستويات نيوكليوتيدات البيورين الخلوية. ممثل الخلية 21 ، 1331-1346.

جونسون ، مو ، وولف ، إم إم ، مادن ، إم زد ، أندريجيفا ، جي ، سوجيورا ، إيه ، كونتريراس ، دي سي ، ماسيدا ، دي ، ليبرتي ، إم في ، باز ، كيه ، كيشتون ، آر جي ، وآخرون. (2018). تنظيم مميز لتمايز الخلايا Th17 و Th1 عن طريق التمثيل الغذائي المعتمد على الجلوتاميناز. الخلية 175 ، 1780-1795 هـ 19.

Ju، H.-Q.، Lu، Y.-X.، Chen، D.-L.، Zuo، Z.-X.، Liu، Z.-X.، Wu، Q.-N.، Mo، H.-Y. ، وانج ، Z.-X. ، وانج ، D.-S. ، Pu ، H.-Y. ، وآخرون. (2019). تعديل استتباب الأكسدة والاختزال عن طريق تثبيط MTHFD2 في سرطان القولون والمستقيم: الآليات والآثار العلاجية. ج. ناتل. معهد السرطان. 111 ، 584-596.

Kawai، J.، Toki، T.، Ota، M.، Inoue، H.، Takata، Y.، Asahi، T.، Suzuki، M.، Shimada، T.، Ono، K.، Suzuki، K.، وآخرون. (2019). اكتشاف مثبط MTHFD2 قوي وانتقائي ومتوفر عن طريق الفم (DS18561882) مع نشاط مضاد للورم في فيفو. جيه ميد. تشيم. 62 ، 10204-10220.

Kim، J.، Yang، G.، Kim، Y.، Kim، J.، and Ha، J. (2016). منشطات AMPK: آليات العمل والأنشطة الفسيولوجية. إكسب. مول. ميد. 48 ، e224.

كوفاريس ، سي ، جالاج ، إس ، يانج ، تي ، لاو ، سي-إتش ، فالبوينا ، جي إن ، وكيون ، HC (2016). قمع MTHFD2 في MCF -7 خلايا سرطان الثدي تزيد من تحلل السكر ، والاعتماد على الجلايسين الخارجي ، والحساسية لنضوب حمض الفوليك. J. بروتيوم الدقة. 15 ، 2618-2625.

Li، W.، Xu، H.، Xiao، T.، Cong، L.، Love، MI، Zhang، F.، Irizarry، RA، Liu، JS، Brown، M.، and Liu، XS (2014). يتيح MAGeCK تحديدًا قويًا للجينات الأساسية من شاشات خروج المغلوب CRISPR / Cas9 بمقياس الجينوم. جينوم بيول. 15 ، 554.

Ma، EH، Bantug، G.، Griss، T.، Condotta، S.، Johnson، RM، Sambourska، B.، Mainolfifi، N.، Suri، V.، Guak، H.، Balmer، ML، et al. (2017). سيرين هو مستقلب أساسي لتوسيع الخلايا التائية المستجيبة. ميتاب الخلية. 25 ، 345–357.

Macintyre، AN، Gerriets، VA، Nichols، AG، Michalek، RD، Rudolph، MC، Deoliveira، D.، Anderson، SM، Abel، DE، Chen، BJ، Hale، LP، et al. (2014). يعتبر ناقل الجلوكوز Glut1 ضروريًا بشكل انتقائي لتنشيط خلايا CD4 T ووظيفة المستجيب. ميتاب الخلية. 20 ، 61-72.

Michalek و RD و Gerriets و VA و Jacobs و SR و Macintyre و AN و MacIver و NJ و Mason و EF و Sullivan و SA و Nichols و AG و Rathmell و JC (2011). أحدث التقنيات: تعد برامج التمثيل الغذائي المتميزة للجليكوليتيك والدهون ضرورية لمجموعات الخلايا الفرعية CD4 بالإضافة إلى الخلايا التائية المستجيبة والتنظيمية. J. إمونول. 186 ، 3299-3303.

ناكايا ، م ، شياو ، واي ، زهو ، إكس ، تشانغ ، ج.- إتش ، تشانج ، إم ، تشينج ، إكس ، بلونسكا ، إم ، لين ، إكس ، أند صن ، S.-C . (2014). تعتمد استجابات الخلايا التائية الالتهابية على تسهيل ASCT2 لناقل الأحماض الأمينية لامتصاص الجلوتامين وتفعيل كيناز mTORC1. مناعة 40 ، 692-705.

Nilsson، R.، Jain، M.، Madhusudhan، N.، Sheppard، NG، Strittmatter، L.، Kampf، C.، Huang، J.، Asplund، A.، and Mootha، VK (2014). يبرز تعبير إنزيم التمثيل الغذائي دورًا رئيسيًا لـ MTHFD2 ومسار حمض الفوليك في السرطان. نات. كومون. 5 ، 3128.

Palmer، LD، Maloney، KN، Boyd، KL، Goleniewska، AK، Toki، S.، Maxwell، CN، Chazin، WJ، Peebles، RS، Jr.، Newcomb، DC، and Skaar، EP (2019). يحمي البروتين المناعي الفطري S100A9 من نوع الخلايا التائية المساعدة 2- الذي يتوسطه التهاب مجرى الهواء التحسسي. أكون. J. ريسبير. خلية مول. بيول. 61 ، 459-468.

Pikman ، Y. ، Puissant ، A. ، Alexe ، G. ، Furman ، A. ، Chen ، LM ، Frumm ، SM ، Ross ، L. ، Fenouille ، N. ، Bassil ، CF ، Lewis ، CA ، et al. (2016). استهداف MTHFD2 في ابيضاض الدم النخاعي الحاد. ياء إكسب. ميد. 213 ، 1285-1306.

Qu me´ neur ، L. ، Gerland ، L.-M ، Flacher ، M. ، Ffrench ، M. ، Revillard ، J.-P ، and Genestier ، L. (2003). التحكم التفاضلي في دورة الخلية ، والتكاثر ، والبقاء على قيد الحياة للخلايا اللمفاوية التائية الأولية بواسطة نيوكليوتيدات البيورين والبيريميدين. J. إمونول. 170 ، 4986-4995.

Qu me´ neur، L.، Beloeil، L.، Michallet، M.-C، Angelov، G.، Tomkowiak، M.، Revillard، J.-P.، and Marvel، J. (2004). تقييد التخليق الحيوي للنيوكليوتيدات دي نوفو يتداخل مع التوسع النسيلي والتمايز إلى خلايا CD8 T المستجيبة والذاكرة. J. إمونول. 173 ، 4945-4952.

راي ، سي ، ومايرز ، آر جيه (2019). تنشيط AMPK بواسطة AICAR يحسس خلايا سرطان البروستاتا للعلاج الإشعاعي. Oncotarget 10 ، 749-759.

Ron-Harel، N.، Santos، D.، Ghergurovich، JM، Sage، PT، Reddy، A.، Lovitch، SB، Dephoure، N.، Satterstrom، FK، Sheffer، M.، Spinelli، JB، et al. (2016). يعزز التولد الحيوي للميتوكوندريا وإعادة تشكيل البروتين عملية التمثيل الغذائي للكربون الواحد لتنشيط الخلايا التائية. ميتاب الخلية. 24 ، 104-117.

Shahi و SK و Freedman و SN و Murra و AC و Zarei و K. و Sompallae و R. و Gibson Corley و KN و Karandikar و NJ و Murray و JA و Mangalam و AK (2019). بريفوتيلا هيستيكولا ، أمعاء بشرية ، فعالة مثل COPAXONE في نموذج حيواني لمرض التصلب المتعدد. أمامي. إمونول. 10 ، 462.

Shalem ، O. ، Sanjana ، NE ، Hartenian ، E. ، Shi ، X. ، Scott ، DA ، Mikkelson ، T. ، Heckl ، D. ، Ebert ، BL ، Root ، DE ، Doench ، JG ، and Zhang ، F. (2014). فحص بالضربة القاضية بتقنية CRISPR-Cas9 على نطاق الجينوم في الخلايا البشرية. العلوم 343، 84-87.

شارما ، يو ، وراندو ، أو جي (2017). المدخلات الأيضية في Epigenome. ميتاب الخلية. 25 ، 544-558.

شي ، إل زد ، وانج ، آر ، هوانج ، جي ، فوجل ، بي ، نيل ، جي ، جرين ، دي آر ، وتشي ، هـ. (2011). ينظم مسار التحلل السكري المعتمد على HIF1alpha نقطة تفتيش استقلابية للتمييز بين الخلايا T H17 و Treg. ياء إكسب. ميد. 208 ، 1367–1376.

شين ، إم ، مومب ، جي ، أند أبلينج ، دكتور (2017). الميتوكوندريا البشرية MTHFD2 عبارة عن عامل مساعد ثنائي خاص بعامل الأكسدة والاختزال ميثيلين تتراهيدروفولات ديهيدروجينيز / ميثيل تيتراهيدروفولات سيكلوهيدرولاز. ميتاب السرطان. 5 ، 11.

سكين ، بي جيه ، وهنيكوف ، س. (2017). استراتيجية نوكلياز مستهدفة فعالة لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع ربط الحمض النووي. eLife 6، e21856.

Su، C.-C، Hsieh، K.-L.، Liu، P.-L.، Yeh، H.-C، Huang، S.-P.، Fang، S.-H.، Cheng، دبليو سي ، هوانغ ، كيه ، تشيو ، إف- واي ، لين ، آي إل ، وآخرون. (2019). يستحث AICAR موت الخلايا المبرمج ويمنع الهجرة والغزو في خلايا سرطان البروستاتا من خلال مسار يعتمد على AMPK / mTOR. كثافة العمليات J. مول. علوم. 20 ، 1647.

Su، X.، Wellen، KE، and Rabinowitz، JD (2016). التحكم الأيضي في الميثلة والأستلة. بالعملة. رأي. تشيم. بيول. 30 ، 52-60.

Tan ، H. ، Yang ، K. ، Li ، Y. ، Shaw ، TI ، Wang ، Y. ، Blanco ، DB ، Wang ، X. ، Cho ، J.-H ، Wang ، H. ، Rankin ، S. ، وآخرون. (2017). يكشف تحديد خصائص البروتيوميات التكاملية والبروتيوميات الفوسفورية عن شبكات الإشارات الديناميكية ومسارات الطاقة الحيوية الكامنة وراء تنشيط الخلايا التائية. مناعة 46 ، 488-503.

توفاليني ، إف ، كالين ، إيه ، فاندنبيرجي ، بي ، بيير ، بي ، ميشو ، إل ، كولز ، جيه ، ديمولين ، ج. (2009). تهرب بروتينات الاندماج TEL-PDGFR و FIP1L 1- PDGFR من التواجد والتدهور. Haematologica 94 ، 1085-1093.

Wan، X.، Wang، C.، Huang، Z.، Zhou، D.، Xiang، S.، Qi، Q.، Chen، X.، Arbely، E.، Liu، C.-Y.، Du، P. ، and Yu ، W. (2020). يمنع Cisplatin SIRT 3- نزع الأسيتيل MTHFD2 لخلل توازن الأكسدة والاختزال الخلوي في خلية سرطان القولون والمستقيم. ديس موت الخلية. 11 ، 649.

Wang، L.، Xing، X.، Chen، L.، Yang، L.، Su، X.، Rabitz، H.، Lu، W.، and Rabinowitz، JD (2019). أعلى محرك للتعليقات التوضيحية والتحقق من أجل الأيض LC-MS غير المستهدف. شرجي. تشيم. 91 ، 1838-1846.

يانغ ، إم ، وفوسدن ، كيه إتش (2016). استقلاب السيرين والكربون الواحد في السرطان. نات. القس السرطان 16 ، 650-662.

Yue، L.، Pei، Y.، Zhong، L.، Yang، H.، Wang، Y.، Zhang، W.، Chen، N.، Zhu، Q.، Gao، J.، Zhi، M.، وآخرون. (2020). Mthfd2 يعدل وظيفة الميتوكوندريا وإصلاح الحمض النووي للحفاظ على تعدد القدرات للخلايا الجذعية للفأر. تقارير الخلايا الجذعية 15 ، 529-545.

Zhu ، Z. ، و Leung ، GKK (2020). أكثر من مجرد إنزيم استقلابي: MTHFD2 كهدف جديد للعلاج المضاد للسرطان؟ أمامي. اونكول. 10 ، 658.

طرق ★ النجوم

جدول الموارد الرئيسية

توافر الموارد

يؤدي الاتصال

يجب توجيه المزيد من المعلومات والطلبات للحصول على الموارد والكواشف وسيتم تنفيذها عند الانتهاء من MTA المناسب بواسطة جهة الاتصال الرئيسية ، الدكتور جيفري راثميل (jeff.rathmell@vumc.org).

توافر المواد

سيتم توفير البلازميدات وخطوط الماوس التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة عند الانتهاء من MTA المناسب عند الطلب.

توافر البيانات والرمز

تم إيداع بيانات التسلسل CUT & RUN في GEO وهي متاحة للجمهور اعتبارًا من تاريخ النشر (GSE180356). سيتم مشاركة بيانات الفحص المجهري وصور اللطخة الغربية الأصلية الواردة في هذه الورقة من قبل جهة الاتصال الرئيسية عند الطلب. أي معلومات إضافية مطلوبة لإعادة تحليل البيانات الواردة في هذه الورقة متاحة من جهة الاتصال الرئيسية عند الطلب.

انقر فوق Cistanches للحصول على حصانة