التنميط الأيض القائم على الرنين المغناطيسي النووي لخصائص الكسح الجذري ومكافحة الشيخوخة الجزء 2

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

2.5 تصنيف مستخلصات الأعشاب عن طريق تحليل المكونات الرئيسية

تم تحليل تباين المستقلب بين أوراق الأعشاب المختبرة بشكل أكبر باستخدام تحليل البيانات متعدد المتغيرات (MVDA). تحليل المكون الرئيسي (PCA) ، طريقة التعرف على الأنماط ، هو أسلوب غير خاضع للإشراف MVDA يوفر فهمًا كبيرًا للارتباط بين العينات. أظهرت مخططات نقاط PCA فصل الأعشاب إلى مجموعات ، بينما أبرزت قطع التحميل المستقلبات التي توفر الفصل [85 ، 86]. أظهر نموذج PCA لياقة جيدة (R2X =0. 997) وإمكانية توقع عالية (Q 2=0. 993) حيث كان الاختلاف بين R2X (نائب الرئيس) و Q2 (نائبًا) أقل من 0 .3 ، مما يشير إلى أن كل من مستخلصات الأعشاب ساهمت بالتساوي والتساوي في انفصال المجموعة المرصودة. كانت هذه الملاحظة متوافقة مع Wheelock et al. [87].

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

أظهرت مؤامرة درجة تحليل المكون الرئيسي أن الأعشاب المختارة تم فصلها إلى مجموعتين دون أي قيم متطرفة ملحوظة كما هو موضح في الشكل 4 أ. أظهر المكون الرئيسي (PC) 1 أكبر تباين في العينة ، ثم تبعه PC2. ساهم PC1 و PC2 في النسبة المئوية للتباين عند 29.7 بالمائة و 24.9 بالمائة على التوالي. لذلك ، تم وصف التباين الكلي البالغ حوالي 54.6 بالمائة بواسطة أجهزة الكمبيوتر هذه. كشفت النتائج المأخوذة من مخطط عمود التحميل عن المستقلبات المسؤولة عن فصل الأعشاب إلى الجانب الإيجابي لـ PC1 (V.negundo و C.longa) والجانب السلبي لـ PC1 (P. C. caudatus) (الشكل 4 ب).

اكتشفت البيانات من مخطط عمود التحميل لـ PC1 أن المركبات الفينولية ، وخاصة مجموعة الفلافونويد والأحماض الفينولية ، كانت مسؤولة عن فصل الأعشاب المختارة. كيرسيتين (1) ، كيرسيتين -3- O-rhamnoside (2) ، كيرسيتين -3- O-glucoside (3) ، كيرسيتين -3- O-glucuronide (4) ، كيرسيتين -3- O-arabinofuranoside (5) ، روتين (6) ، مشتقات mvricetin (7) ، catechin (8) ، يبيكاتشين (9) ، isorhamnetin (10) ، استراغالين (11) ، حمض الكلوروجينيك (12) ، حمض الغاليك (13) ، كانت محتويات حمض الكوماريك (14) وحمض الأسكوربيك (15) وحمض الفورميك (21) وحمض الفوماريك (22) و 3- ميثيل زانثين (26) والأبيجينين (28) أعلى في الغالب في P. ناقص ، P. إنديكا ، C. caudatus و O.javanica حيث كانوا موجودين في الجانب السلبي من المؤامرة. في المقابل ، تم التمييز بين كل من V.negundo و C.longa عن الأعشاب الأخرى من خلال وجود السيروتونين (27) و D-limonene (29) في مستخلصاتهما.

2.6. الارتباط بين النشاطات الحيوية والأيضات باستخدام تحليل المربعات الصغرى الجزئي (PLS)

من أجل فهم الارتباط بين الأنشطة الحيوية المقاسة والمستقلبات الموجودة في الأعشاب المختبرة ، تم تطبيق PLS ، كمنهجية MVDA الخاضعة للإشراف ، لربط بيانات المتغيرات المستقلة (التحول الكيميائي NMR من المستقلبات) ببيانات المتغيرات التابعة ، والتي تم تثبيط فحوصات DPPH و ABTS و ORAC ، بالإضافة إلى أنشطة مكافحة الإيلاستاز ومكافحة الكولاجيناز. تم تطبيق هذه المنهجية لأن PLS حقق إنجازًا كبيرًا في ربط الأنشطة الحيوية المختبرة بالمستقلبات ، وبالتالي يمكن أن يوفر نموذجًا للتنبؤ [88]. من خلال تحليل PLS ، يمكن إنشاء العلاقة بين الأنشطة الحيوية مثل أنشطة الكسح الجذري والخصائص المضادة للشيخوخة مع المستقلبات في العينات. وبالتالي ، يمكن بعد ذلك اقتراح المستقلبات التي كانت مسؤولة كواسمات نشطة بيولوجيًا.

إن biplot عبارة عن مزيج من الدرجات ومخططات التحميل الناتجة عن تحليل PLS ، كما أفاد Mediani et al. [8 0]. أظهر biplot المربعات الصغرى الجزئية لنشاط الكسح الجذري (الشكل 5 أ) والخصائص المضادة للشيخوخة (الشكل 5 ب) أن جميع العينات كانت منفصلة جيدًا ومتجمعة دون القيم المتطرفة البارزة. قام PC1 بفصل أوراق P. minus و C.caudatus و P. indica عن V. negundo و O.jaoanica و C. استنادًا إلى أنشطة الكسح الجذري والخصائص المضادة للشيخوخة في biplots ، قدم النموذج قيم لياقة جيدة (R'Y) تبلغ {{1 {14}}}. 988 و 0. 966 ، على التوالي. وفي الوقت نفسه ، كانت القدرة على التنبؤ (Q4) لأنشطة الكسح الجذري وخصائص مكافحة الشيخوخة 0.984 و 0.951 على التوالي.

كما هو موضح من PLS biplot لأنشطة الكسح الجذري (الشكل 5 أ) ، تم توجيه الأنشطة الحيوية (DPPH و ABTS و ORACassay) إلى الجانب الإيجابي من biplot ، والذي كان أكثر المناطق نشاطًا والأقرب إلى P.minus و P. إنديكا وجيم كاوداتوس. في المقابل ، تم توجيه V. negundo و O.javanica و C. مع الأنشطة الحيوية. في هذه الحالة ، تجمعت P. mimus و P. إنديكا و C.caudatus بعيدًا عن الأعشاب الأقل نشاطًا ، مما يشير إلى أن هذه الأعشاب أظهرت تأثيرًا أقوى في إزالة الجذور ، مما يشير إلى أن مستخلصات الأعشاب قد تحتوي على مستويات أعلى من الفينول. مجمعات سكنية. من بين الأعشاب الثلاثة الأكثر نشاطًا ، وجد أن P. ناقص أكثر ارتباطًا بمقايسة DPPH و ABTS ، تليها مقايسة ORAC.

كانت هذه النتيجة متوافقة مع النتائج المختبرية لأنشطة الكسح الجذري التي تم إجراؤها. أظهرت النتائج أن P. minus أظهر تأثيرًا قويًا في إزالة الجذور الحرة مقارنة بالأعشاب الأخرى. أوضحت النتائج أن P. ناقص هو أكثر الأعشاب نشاطًا في القضاء على أنواع الأكسجين التفاعلي. تم تحديد المستقلبات الثانوية الهامة التي ساهمت في نشاط الكسح الجذري لـ P. ناقص مثل كيرسيتين وكيرسيتين {{0} O-rhamnoside و catechin و isorhamnetin و astragalin و apigenin.oteflavonoidتم تحديد موقع كل هذه المستقلبات بالقرب من P. ناقص وأيضًا إلى مقايسات الكسح الجذري DPPH و ABTS. دراسة سابقة بواسطة Mediani وآخرون. [80] اكتشف أيضًا أن عينة من النباتات المجففة بالتجميد أظهرت كمية أعلى من الجلوكوز والجلوكوز والكاتشين وحمض الكلوروجينيك ، والتي ربما تكون قد ساهمت في قدرة النبش الجذري القوية لعشب DPPH. ومع ذلك ، يمكن أيضًا أن يساهم تأثير المسح الجذري العالي لـ P.minus من خلال المستقلبات غير المحددة في المستخلص.

تم العثور على نتائج مماثلة أيضا لخصائص مكافحة الشيخوخة. يعرض الشكل 5 ب biplot التي تم الحصول عليها من PLS لخصائص مكافحة الشيخوخة. تم عرض الأنشطة الحيوية (الأنشطة المضادة للإيلاستاز والكولاجيناز) على الجانب الإيجابي من biplot ، والتي كانت المنطقة الأكثر نشاطًا وكانت أقرب إلى P.minus و P. indica و C.caudatus. في المقابل ، تم توجيه كل من V.negundo و O.javanica و C.longa إلى الجانب السلبي من biplot ، والذي كان يعتبر أقل منطقة نشاطًا وكان بعيدًا عن أنشطة مكافحة الإيلاستاز والمضادة للكولاجيناز. أظهر هذا ارتباطًا سلبيًا أو أضعف بالنشاطات الحيوية. في هذه الحالة ، تم تجميع P.mimus و P.indica و C. caudatus بعيدًا عن الأعشاب الأقل نشاطًا ، مما يشير إلى أن هذه المستخلصات العشبية أظهرت قدرًا أكبر من تثبيط الإيلاستاز والكولاجيناز. من بين الأعشاب الثلاثة الأكثر نشاطًا ، وجد أن P. ناقص مرة أخرى لها علاقة قوية بهذه الخصائص المضادة للشيخوخة مقارنة بالأعشاب الأخرى.

كانت هذه النتيجة متوافقة مع النتائج المختبرية للخصائص المضادة للشيخوخة التي تم إجراؤها في وقت سابق. أظهرت النتائج أن P.minus كان أكثر الأعشاب نشاطا في تثبيط إنزيمات الإيلاستاز والكولاجيناز. تم تحديد المستقلبات الثانوية الهامة التي ساهمت في الخصائص المضادة للشيخوخة لـ P. سالب مثل كيرسيتين ، كيرسيتين -3- O-rhamnoside ، ومشتقات myricetin ، و catechin ، و isorhamnetin ، و astragalin ، و apigenin. قد تكون المستقلبات الأخرى مثل الجلوكوز والجلوكوز وحمض الفوماريك والأحماض الدهنية مسؤولة أيضًا عن الأنشطة الحيوية. تم تحديد موقع كل هذه المستقلبات بالقرب من P. ناقص وإلى أنشطة مكافحة الإيلاستاز والمضادة للكولاجيناز.

يمكن للسيستانش مكافحة الشيخوخة

كان تمييز هذه الأعشاب المختارة متفقًا مع عينات نشاط الكسح الجذري العالي بشكل خاص. ناقص ، حالة الهند و C. هذه الأعشاب [67-79 ، 89-92].

تم توثيق مساهمة المركبات النشطة بيولوجيًا من المستخلصات النباتية في القدرة على إزالة الجذور الحرة والنشاط المضاد للشيخوخة من خلال دراسات مختلفة [66،72،75،79 ، 92-101]. بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات أن المستقلبات مثل الفلافونويد (كيرسيتين ، كايمبفيرول ، ميريسيتين ، إيبيكاتشين ، كاتشين) وغيرها من الفينولات مثل ريسفيراترول وبروسياندين B2 ، تثبط بشكل كبير الإيلاستاز والكولاجيناز [69-71 ، 79].

في هذه الدراسة ، تم تحديد إشارات المستقلب ذات الأهمية المتغيرة في قيم الإسقاط (VIP) ومراجعتها للحصول على أهم المستقلبات المرتبطة بالنشاطات الحيوية المختبرة. تم القيام بذلك لزيادة سلامة النتائج المقدمة هنا ، والتي فحصت الإمكانات التمييزية للمستقلبات المحددة.البيوريتان فيتامين جGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}. 5 تم أخذها في الاعتبار لتكون مهمة للتمييز [102]. في هذه الدراسة ، يمكن تصنيف جميع المستقلبات المساهمة في أنشطة الكسح الجذري والخصائص المضادة للشيخوخة على أنها نواتج تمييزية مهمة نظرًا لأن قيم VIP الخاصة بها كانت أعلى من 1.0 (الجدول 2). تم التحقق من صحة نموذج PLSbiplots باستخدام 100 تبديل عشوائي ، لتأكيد الصلاحية (R2) والقدرات التنبؤية (Q2) للنموذج الأصلي مع العديد من النماذج ، مقارنة بملاءمة الملاءمة. أوضح R2 أن ملاءمة النموذج كانت مهمة وشرح درجة متغيرات Y في النموذج ، بينما عرض Q2 جودة تنبؤية للنموذج مماثلة لتلك التي أبلغ عنها Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0 8). كشفت النتائج أن جميع تقاطعات المحور Y لـ R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>سيستانشكانت قيمتا التقاطع R2 و Q2 في النطاق 0. 0367-0. 0872 و -0. 444 إلى -0. 492 ، على التوالي ، مما يشير إلى أن كلا نموذجي PLS كانا صالحين ولم تظهر الزائدة. لذلك ، يمكن تصنيف هذين النموذجين من نماذج PLS كنماذج أداء جيدة وزادت هذه النتائج من موثوقية النماذج.

2.7. الكمي النسبي للأيضات الثانوية

يظهر القياس الكمي النسبي لبعض المستقلبات الثانوية التي تم تحديدها من الأعشاب المختارة في الشكل 6. تم العثور على هذه المستقلبات في الغالب أعلى في الأعشاب الأكثر نشاطًا مثل P. ناقص ، وتقع على الجانب الإيجابي من biplots ، وكانت أقرب إلى جميع الأنشطة الحيوية التي تم اختبارها تقريبًا.ما هو cistancheأظهرت هذه النتائج أن المستقلبات الثانوية خاصة من مجموعة مركبات الفلافونويد الموجودة بكميات كبيرة في P. ناقص قد تكون قد ساهمت في القضاء على الجذور الحرة وخصائص مكافحة الشيخوخة لهذه العشبة.

عند المقارنة مع الهياكل المختلفة للفلافونويد التي يمكن أن تكون قد ساهمت في فعاليتها ، لوحظ أن نمط الهيدروكسيل في الحلقة B قد يكون أحد العوامل المهمة لتأثير تثبيط المستقلبات على نشاط إنزيمات الشيخوخة [80] . سيم وآخرون [104] كشف أيضًا أنه على مستوى كل من البروتين و mRNA ، أصبح التأثير المثبط لمركبات الفلافونويد هذه قويًا مع عدد متزايد من المجموعات في الحلقة B ، وقاموا بفحص ارتباط النشاط البنيوي لبعض مركبات الفلافونويد في MMP -1 التعبير الجيني في الخلايا الليفية الجلدية البشرية المشعة بالهواء فوق البنفسجي.

3. المواد والطرق

3.1. المواد الكيميائية والكواشف

تم توفير الميثانول المذاب d4 (CH3OH-d4) ، KH2PO4 غير منزوع الدوتريوم ، أكسيد ديوتيريوم الصوديوم (NaOD) ، ملح الصوديوم ثلاثي ميثيل سيليل ، حمض البروبيونيك d4 (TSP) ، الإيثانول ، والميثانول بواسطة شركة Merck Millipore International (دارمشتات ، ألمانيا). كيرسيتين ، عازلة الفوسفات ، 2 ، 2- ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، 2 ، 2- أزينوبيس (3- إيثيل بنزوثيازولين -6- حمض سلفونيك) [ABTS ] ، ترولوكس ، بيرسلفات البوتاسيوم ، 2،2'-azobis (2- ميددينوبروبان) [AAPH ، epigallocatechin gallate (EGCG) ، HEPES buffer ، إنزيمات الإيلاستاز ، N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro ، N تم توفير ميثوكسيسوكسينيل-ألا-علاء-برو-فال-ف-نيتروانيليد وأكسيد الديوتيريوم (D2O) من قبل شركة سيجما (ألدريتش ، ألمانيا).

3.2 المواد النباتية وأخذ العينات

تم جمع الأوراق الطازجة من O.jacanica و P. minus و C.longa من Felda Sungai Koyan Satu و Raub و Pahang. تم الحصول على أوراق V.negundo من معهد العلوم البيولوجية ، جامعة بوترا ماليزيا. تم حصاد الأوراق الطازجة من P. إنديكا في حديقة الزراعة الجامعية ، جامعة بوترا ماليزيا ، وتم جمع الأوراق الطازجة لأوراق C. caudatus في المعهد الزراعي ، سيردانج ، سيلانجور. تم وضع عينة قسيمة من هذه الأعشاب في المعشبة ، معهد العلوم البيولوجية ، جامعة بوترا ماليزيا ، وتم التحقق من صحة كل عينة من قبل عالم النبات.مكافحة الشيخوخةتم حصاد جميع الأوراق بشكل منتظم في الصباح ، في الأيام المشمسة لضمان موثوقية محتوى المستقلبات. تم فصل قطعة الأرض في الحقل المفتوح لكل عشب إلى ستة أجزاء وتم جمع كل عينة من كل قطعة على شكل ستة مكررات.

3.3 تحضير العينة

بمجرد الحصاد ، يتم غسل الأوراق الطازجة تحت ماء الصنبور الجاري لإزالة جميع البقايا ، وتجفيفها بورق مناديل المختبر ، وتجميدها على الفور بالنيتروجين السائل لإيقاف جميع التفاعلات الأنزيمية والحفاظ على المستقلبات قبل التجفيف بالتجميد. تم بعد ذلك تجفيف العينات في مجفف تجميد LABCONCO (كانساس سيتي ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) حتى يصل الوزن الثابت ومحتوى الرطوبة إلى أقل من 10 في المائة. تم طحن جميع العينات المجففة باستخدام خلاط معمل إلى مسحوق ناعم ونخلها باستخدام منخل اختبار معمل (ENDECOTTS LTD. لندن ، إنجلترا) بحجم 300 ميكرون للحصول على الحجم الموحد. كانت عينات المسحوق معبأة في عبوات من الألومنيوم لحمايتها من التعرض للضوء والرطوبة وتخزينها في درجة -80 قبل التحليل.

3.4. اِستِخلاص

تم وصف إجراء الاستخراج بواسطة Mediani et al. [105] أعقب مع بعض التعديلات. باختصار ، تم غمر 10 جم من كل عينة مسحوق في 100 مل من الإيثانول بنسبة 60 في المائة في دورق مخروطي كهرماني اللون وصوتها لمدة ساعة واحدة باستخدام جهاز صوت حمام بالموجات فوق الصوتية (WiseClean ، طراز WUC-D10H ، سيول ، كوريا) تحت درجة حرارة مضبوطة (أقل من 40 درجة) . تم ترشيح العينات من خلال ورق الترشيح Whatman رقم 1 وأعيد استخراج البقايا مرتين وتصفيتها بعد اكتمال الاستخراج الأول. تم بعد ذلك تجميع المستخلصات وتركيزها باستخدام مبخر دوار تحت فراغ عند 40 درجة. تم بعد ذلك تجفيف المواد اللزجة المشتقة باستخدام مجفف التجميد LABCONCO لضمان التخلص الشامل من الماء وتخزينها عند درجة -80 حتى استخدامها مرة أخرى. أخيرًا ، تم تخفيف مستخلصات الخام المجففة إلى التركيزات اللازمة لجميع الفحوصات التي أجريت.

3.5 نشاط الكسح الجذري DPPH

تم تحديد نشاط المسح الجذري للعينات باتباع التقنية التي طورها كونغ وآخرون. [1 0 6] ، والتي تم تطويرها من طريقة معدلة بواسطة Brand-Williams et al. [1 0 7] مع تعديل طفيف. باختصار ، تمت إضافة مستخلصات عينة 50 ميكرولتر في الميثانول بتركيزات مختلفة (0 إلى 500 ميكروغرام / مل) باستخدام محلول 195 ميكرولتر مُعد حديثًا 0.2 ملي ميثانوليك 2 ، 2- ثنائي فينيل -1- بيكريل هيدرازيل (DPPH) وتخزينه. تم تحضير جميع عينات الاختبار في صفيحة بئر 96. تم تسجيل عملية Thedecolourizing عند 515 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (قارئ الصفيحة الدقيقة Biotek EL 800 ، Bio-Tek ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية) بعد 60 دقيقة من الحضانة في الظلام ومقارنتها بالتحكم الإيجابي والعينات الفارغة. تم قياس نسبة نشاط الكسح الجذري وفقًا للمعادلة التالية:

حيث يكون التحكم هو امتصاص عنصر التحكم بدون مستخلصات نباتية والبسيط هو امتصاص المستخلصات النباتية.

تم حساب المستخلصات النباتية أو تراكيز التحكم الإيجابية التي نحت 50 في المائة من DPPH الجذور الحرة المستقرة على أنها دوائر متكاملة باستخدام الرسم البياني الخطي لنسبة نشاط الكسح الجذري مقابل

مستخلصات نباتية / تراكيز تحكم إيجابية. أشار ICso السفلي إلى نشاط مضاد للأكسدة أعلى. تم إجراء جميع التجارب في ستة مكررات باستخدام Trolox و quercetin كعناصر تحكم إيجابية.

3.6.ABTS مقايسة الكسح الجذري

لمقايسة الكسح الجذري ABTS ، تم إجراء التحليل باتباع الإجراء الذي وصفه Arnao وآخرون. [1 0 8] مع بعض التعديلات. كانت المحاليل المحضرة 7 ملي مولار من محلول ABTS بالإضافة إلى 2.45 ملي مولار من محلول بيرسلفات البوتاسيوم. من أجل تحضير محلول العمل ، تم خلط حلين المخزون بنفس الكميات وتركها للتفاعل في الظلام لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تم تخفيف محلول العمل بالماء المقطر للحصول على امتصاص يبلغ 0. 700 ± 0.005 وحدة عند 734 نانومتر باستخدام مقياس طيف ضوئي (UV -1650 مقياس طيف ضوئي للكمبيوتر الشخصي ، شيمادزو ، كيوتو ، اليابان) والمعروف باسم حل ABTS plus. تم تحضير حل ABTS plus حديثًا لكل اختبار. تم السماح لمحلول ABTS plus （900 ميكرولتر） بالتفاعل مع 100 ميكرولتر من مستخلصات الأعشاب لمدة دقيقتين. ثم تمت قراءة الامتصاصية عند 734 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تم تطوير المنحنى القياسي الذي يشتمل على 3.1 ميكروغرام / مل إلى و 50 ميكروغرام / مل من ترولوكس ، وتم التعبير عن النتائج على شكل ملجم ترولوكس سعة مضادات الأكسدة المكافئة / جم عينة (ملجم عينة TEAC / جم).

3.7 مقايسة الكسح الجذري ORAC

تم تنفيذ اختبار ORAC لقياس فعالية الكسح الجذري للبيروكسيل كما هو مذكور بواسطة Huang et al. [109] باستخدام قارئ الفلورة الفلورية FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH ، Ortenberg ، ألمانيا). تم تحضير كل مستخلص عشبي و Trolox (قياسي) في محلول عازل فوسفات 75 ملي مولار （PBS） pH 7.4. في 96- صفيحة ميكروسكوبية سوداء جيدة ، تمت إضافة إجمالي 150 ميكرولتر من الفلورسين 10 نانومتر مذاب في PBS） متبوعًا بـ 25 ميكرولتر من Trolox أو المستخلصات النباتية أو PBS فارغة. تم تجفيف هذه الحلول في ثلاث آبار. تم تحضين الصفيحة الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة ومغطاة بغطاء. تم قياس التألق بطول موجة الإثارة عند 458 نانومتر وطول موجة الانبعاث عند 520 نانومتر. تم تحديد إشارة الخلفية بأخذ القياس كل 90 ثانية.

بعد ذلك ، تم تقديم 25 uL 2،2'-azobis (2- midinopropane) (AAPH ، 240 ملي مولار في برنامج تلفزيوني) عن طريق الحقن الموجودة على متن الطائرة. تم أخذ اضمحلال التألق بعد ذلك حتى 90 دقيقة باستخدام نفس الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات. تم إجراء التقييم للمناطق الواقعة أسفل المنحنى للعينات (الفلورة مقابل الوقت) مطروحًا منها المنطقة الواقعة أسفل المنحنى للفراغ ومقارنتها بالمنحنى القياسي （25-400 ميكرومتر ترولوكس）. تم حساب قيم ORAC المتعلقة بـ Trolox باستخدام المعادلة على النحو التالي:

3.8 مقايسة تثبيط الإيلاستاز

تم تحديد النشاط المثبط للإيلاستاز وفقًا للتقنية التي وصفها Krause وآخرون. [11 0] ، مع تعديلات طفيفة بواسطة Ndlovu et al. [75]. احتوت آبار العينة على 25 ميكرولتر 0.1 متر HEPES عازلة （pH 7.5） ، 25 ميكرولتر من مستخلص الأعشاب （100 ميكروغرام / مل ، و 25 ميكرولتر من إنزيم الإيلاستاز （1 ميكروغرام / مل）. احتوت الآبار الفارغة فقط على 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES واحتوت آبار التحكم السلبية على 50 ميكرولتر من محلول HEPES و 25 ميكرولتر من إنزيم الإيلاستاز. احتوت آبار التحكم الإيجابية على 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES ، و 25 ميكرولتر من N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro 10 ميكروغرام / مل） ، و 25 ميكرولتر من إنزيم الإيلاستاز. احتوت آبار التحكم في المذيبات على 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES ، و 25 ميكرولتر من 10 في المائة من الميثانول ، و 25 ميكرولتر من إنزيم الإيلاستاز. عناصر تحكم فارغة لمستخلص الأعشاب （لعناصر التحكم في اللون لكل مستخلص تم اختباره تحتوي على 150 ميكرولتر من محلول HEPES و 25 ميكرو لتر من مستخلص الأعشاب. ثم تم تحضين لوحة البئر الصغير لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تمت إضافة ركيزة 100 ميكرولتر （N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide ، 1 مم). ثم تم تحضين الأطباق لمدة 40 دقيقة إضافية عند 25 درجة. بعد الحضانة ، تمت قراءة الامتصاصية باستخدام مقياس الطيف الضوئي (قارئ الصفيحة الدقيقة Biotek EL800) عند 405 نانومتر. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط مستخلصات الأعشاب باستخدام المعادلة على النحو التالي:

حيث يكون التحكم هو امتصاص المخزن المؤقت مع الإيلاستاز والمذيب و Atest هو امتصاص المخزن المؤقت والإيلاستاز ومستخلص الأعشاب أو N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9 فحص تثبيط الكولاجين

تم إجراء نشاط تثبيط الكولاجين باتباع طريقة Van-Wart و Steinbrink [111] (1981) مع تعديلات بواسطة Madrone et al. [92]. تم تنفيذ الاختبار في محلول TES سعة 5 0 ملي مولار (pH7.4 مع 0. 36 ملي مولار CaCl2). تم تحضير إنزيم كولاجيناز من Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) بتركيز 0 .8 وحدات / مل (مذاب في محلول مخزون TES). تم تحضير الركيزة الاصطناعية N - [3- (2- furyl) acryloyl] -Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) بتركيز 2 ملي مولار في محلول مخزون TES المؤقت. احتوى الحجم الإجمالي 15 0 ميكرولتر لخليط التفاعل النهائي على 46.3 ميكرولتر من TESbuffer ، و 60 ميكرولتر من FALGPA 0.8 ملي مولار من FALGPA التركيز النهائي ، و 18.7 ميكرولتر من إنزيم الكولاجيناز （0.1 وحدة / مل تركيز نهائي） ، و 25 ميكرولتر من مستخلصات الأعشاب （ 100 ميكروغرام / مل. تم تحضين مستخلصات الأعشاب والإنزيمات في محلول TES في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إضافة الركيزة لبدء التفاعل الكيميائي. تم تنفيذ الضوابط السلبية باستخدام مخزن مؤقت TES. بعد إضافة الركيزة ، تمت قراءة الامتصاصية فورًا عند 340 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (Benchmark Plus Microplate ، Bio-Rad 170-6930 ، Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في 96 طبقًا دقيقًا جيدًا وقياسها بشكل مستمر لآخر 20 دقيقة. تم إجراء تحكم إيجابي باستخدام epigallocatechin gallate (EGCG) عند 12.5 ميكروغرام / مل. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط العينات باستخدام المعادلة على النحو التالي:

حيث يكون التحكم هو امتصاص TES buffer و Atest هو امتصاص محلول TES وإنزيم كولاجيناز ومستخلص نباتي أو FALGPA.

3.10.التوصيف المستقلب باستخدام قياس H-NMR

تم إجراء التنميط المستقلب باستخدام H-NMR للأعشاب المختارة بناءً على البروتوكول الموصوف بواسطة Kim et al. [47] مع تعديلات طفيفة. تم نقل مستخلصات الأعشاب الخام (25 مجم) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل. خليط من ميثانول d4 و KHPO4 عازلة في داو (الرقم الهيدروجيني 6. 0) يحتوي على 0. تمت إضافة 1 في المائة من ملح حمض الصوديوم تريميثيل سيلي بروبيونيك (TSP) إلى عينات الأعشاب بحجم إجمالي قدره { {1 0}}. 7 مل بنسبة (1: 1). تم بعد ذلك تدوير أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على مستخلصات الأعشاب لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة الغرفة متبوعة بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تم الطرد المركزي للخليط لمدة 1 0 دقيقة عند 5678 جم لفصل المادة الطافية عن أي مواد غير قابلة للحل. بعد ذلك ، تم دمج مادة طافية واضحة 0.6 مل في أنابيب الرنين المغناطيسي النووي وتعرض لتحليل H-NMR. تم إنجاز تحليل H-NMR عبر مطياف Varian INOVA NMR 500 ميجاهرتز (شركة فاريان ، بالو ألتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) والذي يعمل بتردد 499.887 ميجاهرتز وتم تسجيل الأطياف عند 26 درجة. يتكون كل طيف واحد من 64 عملية مسح مع 3.53 دقيقة من وقت الاستحواذ وعرض 20 جزء في المليون. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج Chenomx (الإصدار 6.2) (Clhenomx Inc ، Edmonton ، AB ، كندا) لإجراء التصحيح المرحلي والخط الأساسي مع إعداد ثابت. تم إجراء تحليل البيانات متعدد المتغيرات باستخدام برنامج SIMCA (الإصدار 13.0 ، Umetrics ، Umea ، السويد). 3.11. دلو أطياف H-NMR

تم تنفيذ Bucketingof H-NMR أطياف باستخدام Chenomxsoftware (الإصدار 6.2 ، Edmonton ، AB ، كندا). تم استبعاد جميع الأطياف من 0. 5-10. 0 منطقة pprn بنفس المعلمات. تضمنت المعلمات عرضًا طيفيًا للمادة 0 04 والتي حصلت على إجمالي 245 منطقة متكاملة لكل طيف من طيف الرنين المغناطيسي النووي. تم التخلص من التحول الكيميائي للماء والميثانول المتبقي عند δ4. {11}}. 90 و 3. 27-3 .35 على التوالي. ثم خضعت البيانات الموحدة الموحدة لتحليل البيانات متعدد المتغيرات (MVDA).

3.12. الكمي النسبي للأيضات

تم فحص المستقلبات المحددة لتقديرها الكمي النسبي والتي تم حسابها بناءً على متوسط ​​منطقة الذروة للإشارات بعد تجميع أطياف LH-NMR.

3.13. تحليل احصائي

تم التعبير عن جميع نتائج ستة مكررات كوسيلة ± الانحراف المعياري. لقياسات أنشطة الكسح الجذري ، وتثبيط أنشطة الإيلاستاز والكولاجيناز ، والتقدير النسبي للأيضات ، أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام Minitab 16 (الإصدار 16 ، Minitab Inc. ، State College ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تطبيق تحليلات التباين (ANOVA) لفحص الفروق المهمة بين الوسائل مع p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4 - نتائج

كان تطبيق تحليلات H-NMR المقترن بـ MVDA ناجحًا في التحقيق في التباين في مستقلبات الأعشاب المختارة. أظهرت مؤامرة نقاط PCA فصلًا واضحًا للأعشاب وفقًا لمجموعاتها. أوضحت هذه الدراسة أن P. ناقص يمتلك أعلى تأثير إزالة جذري من خلال مقايسات DPPH و ABTS وأظهر أعلى أنشطة مكافحة الشيخوخة. أثبتت ثنائية القطعتان في تحليل PLS صحة هذه النتيجة ، حيث تم العثور على ارتباط قوي بين المستقلبات المحددة في P. ناقص والأنشطة الحيوية التي تم اختبارها. تشتمل المستقلبات النشطة التي يُعتقد أنها تساهم في أنشطة الكسح الجذري والخصائص المضادة للشيخوخة في بكتيريا P.minus على كيرسيتين ، وكيرسيتين -3- O-rhamnoside ، ومشتقات myricetin ، و catechin ، و isorhamnetin ، و astragalin ، و apigenin. لذلك ، يمكن افتراض أن هذه المستقلبات كانت مسؤولة عن تأثير الكسح الجذري الفعال والخصائص العالية لمكافحة الشيخوخة لـ P. سالب. كانت هذه المستقلبات بشكل رئيسي من مجموعة مركبات الفلافونويد ، ولا سيما مركبات الفلافونول. لذلك ، يمكن اقتراح أن المستقلبات من P. ناقص يمكن أن تكون وسيلة واعدة للقضاء على الجذور الحرة ومثبط لإنزيمات الشيخوخة التي يمكن استخدامها لتأخير أعراض الشيخوخة وعلاج الأمراض المزمنة المرتبطة بالشيخوخة. ستساعد هذه النتائج في إثبات فاعلية P. ناقص كمصدر طبيعي محتمل للعوامل المضادة للشيخوخة وكمزيل طبيعي للجذور الحرة.

تم استخراج هذه المقالة من Molecules 2019 ، 24 ، 3208 ؛ دوى: 10.3390 / جزيئات 24173208 www.mdpi.com/journal/molecules