يضعف عقار أوباكونون تليف الكبد من خلال تعزيز التأثيرات المضادة للأكسدة لـ GPx -4 وتثبيط EMT

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص:أوباكونون ، وهو عبارة عن ترايتيربينويد ليمونين مستخرج من Phellodendronchinense Schneid أو نبات Dic-tamnus dasycarpusb Turcz ، يثير مجموعة متنوعة من التأثيرات الدوائية مثل مضادات الالتهاب ومضادات الأورام ومضادات الأكسدة والتليف الرئوي. ومع ذلك ، فإن التأثير المضاد للليف لمخروط أوبا والآلية الأساسية المفصلة في تليف الكبد لا تزال غير واضحة. تليف الكبد مرض منهك يهدد صحة الإنسان. عامل النمو المحول (TGF) - / P-Smad هو مسار رئيسي للتليف يتميز بالتحولات الظهارية - اللحمية المتوسطة (EMT) وترسبات الكولاجين ، مصحوبة بجذور مفرطة خالية من الأكسجين. يعمل Nrf -2 كمنظم رئيسي مضاد للأكسدة يقود تعبيرات الجينات المختلفة المرتبطة بمضادات الأكسدة. إن الجلوتاثيون بيروكسيديز -4 (GPx -4) هو أحد أعضاء عائلة الجلوتاثيون بيروكسيديز الذي يثبط بشكل مباشر أكسدة الفوسفوليبيد للتخفيف من الإجهاد التأكسدي. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى استكشاف دور العمود الفقري في نموذج تليف كبد الفأر الناجم عن رابع كلوريد الكربون (CCl4) وفي الخلايا النجمية الكبدية (خط الخلايا LX2) التي تواجه TGF-. أظهر Obacunone تأثيرات تحسينية قوية على تليف الكبد في كل من LX2 المنشط وفي أنسجة كبد الفئران بمستويات منخفضة من -SMA ، والكولاجين 1 ، والفيمنتين. قام Obacunone أيضًا بقمع إشارات TGF- / P-Smad وعملية EMT بشكل ملحوظ. وفي الوقت نفسه ، مارس أوباكونون تأثيرًا قويًا مضادًا للأكسدة عن طريق تقليل مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في كلا النموذجين. يُعزى التأثير المضاد للأكسدة في العمود الفقري إلى تنشيط GPx -4 و Nrf -2. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إزالة التأثير العلاجي للعمود الفقري على خلايا LX2 بشكل ملحوظ في المختبر بالإضافة إلى مضاد GPx -4 RSL3 ، بالتوازي مع المستويات المرتفعة لـ ROS.البيوريتان فيتامين جوبالتالي ، نوضح أن العمود الفقري قادر على تخفيف تليف الكبد عن طريق تعزيز إشارة GPx -4 وتثبيط مسار TGF- / P-Smad وعملية EMT.

الكلمات الدالة:تليف الكبد. EMT ؛ الخلايا النجمية الكبدية. GPx -4 ؛ TGF- ؛ الإجهاد التأكسدي

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

1 المقدمة

عادة ما يحدث التهاب الكبد المزمن بسبب التهاب الكبد الفيروسي ، والتنكس الدهني غير الكحولي ، والتهاب الكبد الكحولي ، والتهاب الكبد المناعي الذاتي. قد تؤدي الإصابة الكبدية المستمرة إلى تليف الكبد ، أو حتى سرطان الكبد ، مما يؤثر على صحة الإنسان [1]. تليف الكبد هو نوع من استجابة الجرح غير الملتئمة تحت عوامل الإصابة المستمرة التي تتميز بالتراكم المفرط للمصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشكيل الندبة [2]. عادة ما تكون الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) في حالة راحة في ظل الظروف العادية ، وتنشط بشكل شاذ في ظل إصابة الكبد المزمنة وتتميز بتكاثر وإفرازات عالية من ECM [3] ، والمشار إليها باسم الخلايا الليفية العضلية [4]. إن فهم آلية تنشيط HSC له قيمة كبيرة لتطوير علاجات جديدة لعلاج التليف الكبدي.

يعزز عامل النمو المحول (TGF-) الاستجابات الالتهابية عن طريق تحفيز تعبير إنترلوكين -1 (IL -1) وإنترلوكين -6 (IL -6) في الخلايا الأحادية [5]. علاوة على ذلك ، فإنه يحفز ورم خبيث السرطان عن طريق التحول الظهاري - اللحمية المتوسطة (EMT) والهروب المناعي للورم [6-8]. يشير EMT إلى عملية فسيولوجية ديناميكية حيث تفقد الخلايا الظهارية قطبيتها وتتحول إلى خلايا اللحمة المتوسطة مثل الخلايا الليفية والخلايا الليفية العضلية ، مما يؤدي إلى تطور التليف [9]. يرتبط حدوث EMT دائمًا بتقليل تنظيم E-cadherin وتنظيم علامات الخلايا الوسيطة ، مثل N-cadherin و snail [10]. تنشيط TGF - - يعد تنشيط Smad أحد المسارات الرئيسية داخل الخلايا في EMT بالإضافة إلى تكوين الأرومة الليفية العضلية [11].

يعتبر الإجهاد التأكسدي أحد الأسباب الرئيسية للتليف مع الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) [12]. يتسبب المستوى العالي من أنواع الأكسجين التفاعلية في حدوث أضرار هيكلية للجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما يؤدي في النهاية إلى إصابة الخلايا وتعزيز التليف [13]. تحت الإجهاد التأكسدي ، يتم فصل ثنائى Nrf -2- Keep -1 ، ويتم نقل عامل الجهاز التنفسي النووي -2 (Nrf -2) إلى النواة ، مما يؤدي إلى التعبير عن إنزيمات مضادات الأكسدة من خلال الارتباط بعناصر الاستجابة المضادة للأكسدة (ARE) تقلل من مستويات ROS [14]. يعمل الجلوتاثيون بيروكسيديز -4 (GPx -4) ​​كبروتين مضاد للأكسدة مع نشاط الجلوتاثيون بيروكسيديز ، وهو مسؤول بشكل أساسي عن تثبيط أكسدة الفوسفوليبيد وإنتاج ROS في عملية التسمم الحديدي [15].سيستانشأظهرت دراسات الفئران أن التليف يتفاقم بعد فقدان Nrf -2 أو GPx -4 [16،17].

يمكن لمكافحة الشيخوخة

في الوقت الحاضر ، هناك العديد من الأدوية المتاحة لعلاج تليف الكبد ، بما في ذلك الأدوية التي لها خصائص مضادة للالتهاب [18] ، ومضادات الأكسدة [19] ، ومستقبلات تنشيط البيروكسيسوم (PPAR) [20]. في دراسة حديثة ، وجد البروفيسور يو أن المرضى الذين يعانون من تليف الكبد لديهم مستويات أعلى من أكسدة الدهون مقارنة بالضوابط الصحية في العينات السريرية [21]. أظهرت العديد من الأدوية المضادة للأكسدة مثل ريسفيراترول [19] وحمض أورسوليك|13 تأثيرًا جيدًا على التليف. تشير هذه الأدلة بشكل تراكمي إلى أن مضادات الأكسدة هي استراتيجية واعدة لعلاج مضادات التليف.

Pirfenidone (PFD) هو دواء بيريدين للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، بينما يظهر أيضًا تأثيرًا علاجيًا جيدًا على تليف الكبد في دراسات متعددة [22،23]. وهكذا ، تم اختيار PFD كدواء تحكم إيجابي في هذه الدراسة. Obacunone (Oba) هو مركب ليمونويد طبيعي مستخرج من نباتات عصبية مثل Phellodendri و Dictamnus-dasycarpus [24] ، والتي تمتلك خصائص بيولوجية مختلفة مثل مضادات الالتهاب|25 ، ومضادات الأكسدة [26] ، والمضادة للأورام [27]. كشفت التقارير الحديثة أن Oba هو ناهض Nrf -2 قوي ، والذي يخفف بشكل فعال تليف الرئة عن طريق تحريض CCL4 والأضرار التأكسدية لخلايا MDA-MB -231 التي تسببها H ، O2. والأهم من ذلك ، أن أوبا غير سام للفئران [28]. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي تقارير عن تأثير Oba في تليف الكبد ، خاصةً على GPx -4 الذي يتوسط أكسدة مضادات الفوسفوليبيد ، وإشارات TGF - - Smad ، وعملية EMT. هنا ، نعتزم استكشاف تأثيرات Oba على تليف الكبد وتحديد الآليات الجزيئية الأساسية.

2. النتائج

2.1. تنشيط Oba Inhibited TGF - - Induced Lx -2

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 أوم أوبا. ومن المثير للاهتمام ، أنه مع زيادة تركيز أوبا ، فإن تأثير تثبيط α-SMA لم يزيد بشكل كبير （الشكل 1B）.ما هو cistancheوهكذا ، اخترنا تركيز 20 ميكرومتر للتجربة التالية ، مع استخدام PFD كعنصر تحكم إيجابي. قام Oba بشكل فعال بتثبيط مستويات البروتين في -SMA ، والكولاجين -1 ، والفيمنتين ، وعامل نمو النسيج الضام (CTGF) (الشكل 1 ج) ، في AHSCs [3،4]. بالإضافة إلى ذلك ، خفض أوبا مستويات التعبير مرنا من -SMA والكولاجين -1 والفيمنتين (الشكل 1 د). أثبتت نتائج التألق المناعي كذلك أن إشارات التلوين الإيجابية لـ -SMA قد تم تقليلها بشكل واضح بواسطة أوبا (بالنسبة إلى تلك الموجودة في مجموعة TGF ، حيث انخفض عدد الخلايا الحمراء بعد العلاج باستخدام أوبا) في Lx -2 (الشكل 1E). تشير هذه النتائج إلى أن Oba يمارس تأثير تثبيط جيد على تنشيط Lx -2.

2.2. منع أوبا إشارات TGF- / Smad ، وعملية EMT ، والتأثير المضاد للالتهابات

لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التأثيرات المضادة للتليف أعلاه ، لوحظت مستويات التعبير البروتيني لمستقبلات TGF ، و P-Smad ، و -SMA ، والتي تم تثبيتها بشكل كبير بواسطة Oba في aHSCs (الشكل 2 أ). تم تقليل مستويات التعبير عن N-cadherin والحلزون ، بينما تم ترقية مستوى التعبير البروتيني لـ E-cadherin (الشكل 2B) ، مما يشير إلى أن مسار EMT تم حظره أيضًا [3]. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن Oba تسبب في انخفاض مستوى IL -6 (الشكل 2C).مكافحة الشيخوخةلمزيد من تقييم تأثير Oba على الالتهاب ، قمنا أولاً بتحفيز خلايا HepG -2 (نوع من خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية) باستخدام 20 نانومول CCl4 ، متبوعًا بالعلاج بـ 20 أوم أوبا. أظهرت هذه النتائج أن Oba يمكن أن يقلل من مستويات التعبير عن mRNA والبروتين لـ IL -6 في CCl 4- حفز HepG -2 (الشكل 2D). عن طريق تثبيط إشارات TGF- / Smad ، وعملية EMT ، وكذلك مضادات الالتهاب.

2.3 كانت التأثيرات المضادة للتليف في أوبا تعتمد على قدرة مضادات الأكسدة المحسنة من خلال تنشيط GPXx -4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}. 75 ميكرومتر ، انخفضت صلاحية الخلية في Lx -2 بشكل كبير ؛ لذلك ، 0. 75- μM RLS تم اختياره للتدخل في التعبير عن GPx -4. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أنه عند إضافة RSL3 في aHSCs ، تم تقليل تعبير البروتين GPx -4 و تم عكس جميع العلامات الاحترافية بما في ذلك -SMA و vimentin بشكل ملحوظ ، مما يشير إلى أهمية GPx -4 في التوسط في تأثيرات Oba المضادة للتليف (الشكل 3D). وفي الوقت نفسه ، من الواضح أن Oba خفض مستوى ROS لـ aHSCs بواسطة كاشفات الفلورسنت ROS ، ومن الواضح أنه تم حظر هذا التأثير بواسطة RSL3 (الشكل). أشارت هذه البيانات إلى أن مستوى ROS المنخفض من الفوسفوليبيد الذي توسطه GPx -4 كان مضاد التليف الرئيسي إشارة أوبا.

2.4 أوبا يضعف CCl 4- تليف الكبد بالفأر

يُعد تليف الكبد الناجم عن CCl 4- أحد أكثر نماذج الفئران شيوعًا لدراسة تليف الكبد [3]. على المستوى النسيجي ، خفف أوبا بشكل كبير من أمراض الكبد ، كما يتضح من ترسبات الكولاجين المحسنة المشار إليها بتلطيخ ماسون وتلطيخ مضاد SMA. (الشكل 4 أ-د). بعد ذلك ، تم تحديد مستويات المصل من ألانين ترانس أميناز (ALT) / أسبارتاتي ترانساميناز (AST) لاختبار مستويات تلف الكبد ، مقارنة بفئران CCL4 ، خفضت مجموعة Oba ذات الجرعات المنخفضة ومجموعة PFD بشكل ملحوظ مستويات ALT (p.<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5 عزز أوبا تعبير GPx -4 ، وانخفاض الالتهاب ، وتعبيرات البروتين المرتبطة بـ EMT ، وخفض مستويات أكسدة الدهون في CCl 4- تليف الكبد المستحث

كما هو مبين في الشكل 5 أ ، قام Oba بتثبيط تعبيرات البروتين لـ IL -6 وحدوث EMT في الكبد الليفي للفئران مع انخفاض مستويات الحلزون و N-cadherin ولكن مستويات أعلى من E-cadherin. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن تعبيرات البروتين لـ Nrf -2 و GPx -4 زادت بعد العلاج بجرعات متوسطة وعالية من Oba (الشكل 5 ب).فوائد القسطأظهرت نتائج التلوين الكيميائي الهيستولوجي المناعي (IHC) أنه بالمقارنة مع مجموعة النموذج ، زادت أعداد الخلايا الإيجابية لـ GPx {{0} (البني) في مجموعات Oba ذات الجرعات العالية والمتوسطة بشكل ملحوظ (الشكل 5C ، E). قمنا بعد ذلك باختبار مستويات الإجهاد التأكسدي في كبد الفئران ووجدنا أنه ، مقارنةً بالتحكم ، كانت كثافة مضان ROS لمجموعة النموذج أعلى على ما يبدو. من ناحية أخرى ، انخفض مستوى ROS بشكل كبير بعد العلاج باستخدام Oba (الشكل 5D ، F).

3. مناقشة

التليف مرض مؤلم في العالم. مهما كانت المسببات ، بما في ذلك العدوى الفيروسية والتهاب الكبد الكحولي أو غير الكحولي واستجابات المناعة الذاتية ، فكلها تنتهي بالتليف بسبب إصابة الكبد المزمنة [1]. تنشيط HSCs هو الحدث المركزي الكامن وراء تليف الكبد. يتم تنشيط HSCs مع إنتاجات شاذة لمجموعة متنوعة من العوامل الليفية وترسبات ECM [2،3]. تم الإبلاغ عن تورط إشارات تنشيط Smad الأساسية ذات الصلة - - TGF وعملية EMT بالإضافة إلى الالتهاب المزمن المرتبط بـ IL -6- في العمليات المذكورة أعلاه [3،4]. من أجل تقييم التأثيرات المضادة للتليف لعقار أوبا على تليف الكبد ، فإننا نركز أولاً على تحديد تأثيره على تنشيط Lx -2 الناجم عن TGF- ، ثم التحقق من آثاره المضادة للتليف داخل الجسم باستخدام أحدثت CCl 4- نموذجًا لفئران تليف الكبد في النهاية.

أوبا هو مركب طبيعي ليمونويد [24] وتشمل آثاره البيولوجية بشكل أساسي وظائف مضادة للالتهابات [25] ومضادات الأكسدة [26] ومضادة للأورام [27]. في الآونة الأخيرة ، وجد أن أوبا هو ناهض Nrf قوي وفعال -2 ويمارس تأثيرات مضادة للتليف الرئوي في الفئران [28]. ومع ذلك ، فإن الدليل لا يزال يفتقر إلى آثاره المضادة لتليف الكبد والآليات الجزيئية ذات الصلة. هنا ، تم منع جميع التعبيرات الزائدة عن -SMA ، والكولاجين 1 ، و CTGF بواسطة Oba في نماذج Lx -2 التي تم تحفيزها باستخدام TGF-. يقوم Oba أيضًا بقمع إشارات EMT المحسنة بشكل فعال.

لقد تم التأكيد على أن الإجهاد التأكسدي هو مساهم مهم في التليف [12]. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هو مصطلح شامل للجزيئات المؤكسدة أو الأيونات ذات النشاط البيولوجي ، وقد يؤدي الإنتاج المفرط للعديد من أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا الكبد إلى موتها والتسبب في تليف الكبد [13]. على العكس من ذلك ، يتم تنشيط HSCs أثناء الراحة بعد إصابة خلايا الكبد وتضخيم ROS المفرط المزيد من تنشيط HSCs وينتهي بتليف الكبد [12]. لذلك ، فإن تخفيف الإجهاد التأكسدي المفرط يصبح علاجًا فعالًا للتليف.

Nrf -2 هو منظم مهم للإجهاد المضاد للأكسدة ، يتم نقل Nrf الفسفوري المنشط -2 إلى النواة لدفع التنظيم الأعلى للبروتينات المضادة للأكسدة في اتجاه مجرى النهر ، GST ، HO1 [15]. تم الإبلاغ عن أن العديد من المنشطات الكيميائية الطبيعية لـ Nrf2 تمتلك تأثيرات مضادة للتليف ، مثل ثلاثي بيوتيل هيدروكينون والكركمين. من بين جميع البروتينات المضادة للأكسدة ، الجلوتاثيون بيروكسيديز -4 (GPx -4) هو عضو في عائلة الجلوتاثيون بيروكسيداز (GPx 1-8) ويسهل توازن الأكسدة عن طريق تقليل الجلوتاثيون [ 30-32]. ثبت أن التعبيرات الأعلى من الجلوتاثيون بيروكسيديز -7 تثبط مرض الكبد الدهني غير الكحولي عن طريق تقليل إنتاج ROS [33]. خفض GPx -4 بيروكسيد الفوسفوليبيد على الغشاء الدهني لحماية الخلايا من الإصابة التأكسدية J15]. Kazuya Tsubouchi et al. وجد أن تعبير GPx -4 ينخفض ​​في أنسجة تليف رئة الفأر التي يسببها البليوميسين ، ويكون التليف أكثر حدة عندما يتم إخراج جين GPx -4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحسين بيروكسيد الدهون ومسار TGF- / P-Smad بشكل ملحوظ في الخلايا الليفية للرئة عندما يتم استنفاد جين GPx -4 [17]. في الآونة الأخيرة ، دعمت المزيد من الأدلة أن أنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة من الفوسفوليبيد متورطة في موت الخلايا الخاص ، الذي يُطلق عليه اسم الفيروس الحديدي. يتم استخدام مثبط GPx -4 ، RSL3 ، كمحفز للتطعيم الحديدي أيضًا [21،34].

في تجاربنا ، وجدنا أن Oba يبذل القدرة المضادة للأكسدة عن طريق التنظيم الأعلى Nrf -2 و GPx -4 و Nox الخافض للتنظيم -2. والجدير بالذكر أن التأثير المضاد للتليف لعقار أوبا قد ضعيف بشكل ملحوظ ، عندما تم تثبيط جين GPx -4 بواسطة RSL3 ، مثبط GPx -4. باستمرار ، تم توضيح مستوى ROS المنخفض من خلال علاج Oba أيضًا. دعمت هذه الملاحظات في المختبر بشدة أن GPx -4- الوسيط لمضادات الفوسفوليبيد ROS كانت حاسمة للتأثيرات الوقائية لـ Oba.

من أجل التحقق من صحة نتائج العلاج المضاد للتليف أعلاه لـ Oba في خلايا LX2 ، تم فحص تليف الكبد بالفئران 4- الذي يسببه CCl أيضًا. CCl4 هو نوع من السموم الموجهة للكبد ، ينتج عن الإنزيم الميكروسومي P450 بوساطة الجذور الحرة شديدة التفاعل لتدمير سلامة غشاء الخلية ، مما يؤدي بدوره إلى سلسلة من الخلل الوظيفي في الكبد والإصابة ، والتي تتطور في النهاية إلى تليف الكبد [35]. في تجربتنا ، أظهر أوبا تأثيرات علاجية جيدة على تليف الكبد الناجم عن CCl. خففت من تلف الكبد مع انخفاض مستوى إنزيم ناقلة الأسبارتات ، وأصبحت منطقة حزم ألياف الكولاجين أصغر ، وتعبيرات البروتين من أ-SMA ، و CTGF ، والكولاجين -1 ، والحلزون ، و N-cadherin ، و IL {{10 }} تم تخفيضها كلها. بينما كانت إشارات مضادات الأكسدة ، وتعبيرات البروتين لكل من Nrf -2 و GPx -4 مرتفعة أيضًا ، انخفضت المستويات الأعلى لـ ROS. أكدت هذه النتائج أيضًا التأثيرات المضادة للتليف في المختبر بواسطة Oba والإشارات ذات الصلة ، خاصة تثبيط EMT والتأثيرات المضادة للأكسدة بواسطة Nrf -2 و GPx -4.

باختصار ، خلصنا إلى أن Oba خفف من TGF - - تسبب في تنشيط HSCs و CCl 4- تسبب في التليف الكبدي من خلال مجموعة متنوعة من الآليات. أولاً ، أعاق أوبا إنتاج مسار TGF- / Smad الكلاسيكي ، و EMT ، وإنتاج IL -6. ثانيًا ، أظهر قدرة ممتازة على مضادات الأكسدة من خلال تعزيز تعبيرات Nrf -2 و GPx -4. كانت مادة ROS المضادة للفوسفوليبيد بوساطة GPx -4 تساهم بشكل أساسي في آثارها المضادة للتليف. لذلك ، قد يعمل أوبا كوصي كيميائي مرشح للوقاية من التليف وعلاجه.

أظهر أوبا بعض التأثير العلاجي على تليف الكبد الذي يسببه CCl 4- في الفئران C57. يمكن أن يقلل أوبا من تنظيم التعبير عن المؤشرات الحيوية لبروتين التليف ، مثل: -SMA و CTGF وما إلى ذلك. يُظهر علامات على نتائج أفضل إلى أوبا المنخفضة وعالية أوبا من حيث التعبير النسبي عن هذه البروتينات ، على الرغم من أنها ليست ذات دلالة إحصائية. ومع ذلك ، فقد أشارت إلى أن الجرعة المثلى يمكن أن تكون عاملاً حاسماً في هذه العملية ، وسوف نستكشف هذه الظاهرة في التجربة التالية. علاوة على ذلك ، وجدنا أن نسبة الأكسجين التفاعلية منخفضة ودرجة تليف الكبد مع تعبيرات تنظيمية أعلى من Nrf -2 و GPx -4. لذلك ، نعتقد أن Oba يمكن أن يخفف تليف الكبد من خلال تنظيم Nrf -2 و GPx -4. ومع ذلك ، قد يكون لـ PFD تأثير علاجي أفضل من Oba في كل من الجسم الحي والمختبر. ومع ذلك ، كان Oba أفضل من PFD من حيث التأثير المضاد للأكسدة ، فهو يساعد على زيادة إمكانية إيجاد دواء جديد للتأثير المضاد لتليف الكبد من الجانب المضاد للأكسدة ، ويساهم قليلاً في صحة الإنسان.

4. المواد والطرق

4.1 المواد الكيميائية والكواشف

تم شراء Oba (رقم B20553 ، نقاء أكبر من أو يساوي 98 بالمائة) و ​​RSL3 (رقم S81241 ، نقاء أكبر من أو يساوي 98 بالمائة) من YUANYE Bio-Technology Co.، Ltd. (شنغهاي ، الصين) وتم حلها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) (رقم R21950 ؛ YUANYE) بتركيز 72.64 مجم / مل و 6 مليمول ، على التوالي. بعد تعقيم المرشح ، تم حفظ المحلول الناتج عند -20 درجة مئوية. تمت إضافة المحلول إلى وسط المزرعة لتحقيق تركيز DMSO النهائي من<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2 ثقافات الخلية والتصميم التجريبي

تمت زراعة خط الخلايا النجمية الكبدية البشرية Lx -2 وخط خلايا سرطان الكبد البشري Hepg -2 (جميعها من قسم الصيدلة ، الجامعة الطبية العسكرية الرابعة ، الصين) في Dulbecco's Modified Eagle Medium ( DMEM) مع 10 في المائة من مصل الأبقار الجنيني و 1 في المائة من البنسلين (Thermo Fisher Scientific) والستربتومايسين (Thermo Fisher Scientific) ، ثم يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون و 95 في المائة من الهواء. لتقييم تأثير Oba على صلاحية الخلية Lx -2 ، تم لصق Lx -2 بـ 1 × 10 * خلية / بئر في لوحة بئر 96- واحتضانها لمدة 24 ساعة قبل الإضافة أوبا. بعد ذلك ، تمت معالجة Lx -2 بتركيزات مختلفة من Oba (10،20 ، و 40،80 ، و 160 wM وتم تربيتها لمدة 24،48 أو 72 ساعة. تم اختبار قابلية الخلية للبقاء بواسطة CCK8. لتقييم تأثير Oba على تنشيط Lx -2 ، Lx -2 تمت زراعته مسبقًا باستخدام وسط خالٍ من المصل لمدة 12 ساعة ، متبوعًا بالتحفيز باستخدام TGF- (10 نانوغرام / مل ، 24 ساعة) والعلاج باستخدام أوبا أو PFD. لتقييم تأثير Oba على الالتهاب ، تم تحفيز Hepg -2 بواسطة CCl4 (20 نانومتر ، 8 ساعات) ومعالجته بـ 20 ميكرومتر أوبا. في نهاية الثقافة ، تم جمع الخلايا وتعريضها النشاف الغربي وتحليل qPCR في الوقت الحقيقي.

4.3 الحيوانات والتصميم التجريبي

تم إيواء ذكور الفئران C57 التي يبلغ وزنها 2 0 ± 0.5 جم (مركز حيوانات المختبر التابع للجامعة الطبية العسكرية الرابعة) في ظل ظروف مناسبة تبلغ درجة حرارة 25 درجة ± 2 درجة و 12- ساعة ضوء / دورة مظلمة مع حرية الوصول إلى الماء والطعام. تم إجراء كل تجربة في هذه الدراسة وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الطبية العسكرية الرابعة لرعاية الحيوان. تم توزيع الفئران c57 بشكل عشوائي إلى 6 مجموعات (ن =6 في كل مجموعة) على النحو التالي: 1) مجموعة التحكم الشام ، 1) مجموعة النموذج ، 2) مجموعة أوبا العالية (CCl4 plus 6mg / kg Oba) ، io ) مجموعة Oba المتوسطة (CCl4 زائد 3 مجم / كجم Oba ، ø مجموعة Oba المنخفضة CCl4 زائد 1.5 مجم / كجم Oba ، و vi PFD group （CCl4 PFD）. عولجت المجموعة النموذجية بـ CCl4 (30 في المئة CCl4 / زيت الزيتون ، 5 مل / كجم حقن داخل الصفاق) ثلاث مرات في الأسبوع لمدة 6- أسبوع للحث على تليف الكبد. تم تغذية المجموعات الأخرى بجرعات مختلفة من Oba أو PFD وكميات متساوية من العدوى داخل الصفاق CCil4 من أجل فترة أسبوع 6-. تم ​​إعطاء كمية متساوية من زيت الزيتون بدلاً من CCl4 إلى C57 بواسطة ipas a sham control. تم إجراء كل تجربة في هذه المقالة وفقًا للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة الطبية العسكرية الرابعة للحيوان رعاية.

4.4 النشاف الغربي

تم تجانس كبد C57 أو الخلايا المستنبتة أو تحللها في محلول RIPA باستخدام جهاز لف الأنسجة أو كشط الخلية (الخدمة ، KZ -2). تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA. تم طرد المحللة (4 درجات ، 12 ، 000 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق) ، وتم جمع المادة الطافية. تم اتباع خطوات التشغيل كما ورد سابقًا [14]. تم مسح العينات تحت نظام التصوير والتحليل الكيميائي (Beijing Sage Creation Science Co، MiniChemi 610).

4.5 تحليل qPCR في الوقت الحقيقي

تم تجانس أو تحلل كبد C57 أو الخلايا المستنبتة في كاشف Trizol بمساعدة جهاز لف الأنسجة لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي. تم نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) إلى (كدنا) باستخدام مجموعة توليف RevertAid First Strand (كدنا). -الاكتين تم استخدامه كمرجع داخلي. تم إجراء RT-qPCR على 7500 نظام qPCR في الوقت الفعلي (الأنظمة الحيوية التطبيقية) باستخدام كواشف SYBR Premix Ex Taq. تم سرد بادئات الجينات البشرية المستخدمة في الجدول 1.

تم استخراج هذه المقالة من Molecules 2021 ، 26 ، 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules