مستخلص أوراق الزيتون (OLE) ضعيف Vasopressin ، المستحثة Aquaporin ، 2 Trafcking من خلال تنشيط مستقبلات استشعار الكالسيوم

لمزيد من المعلومات. اتصل:tina.xiang@wecistanche.com

يزيد Vasopressin (AVP) من نفاذية الماء فيكلويجمع القنوات من خلال تنظيم تهريب الأكوابورين -2 (AQP2). ترتبط العديد من الاضطرابات ، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والإفراز غير المناسب للهرمون المضاد لإدرار البول (SIADH) ، بخلل في توازن الماء. لقد ثبت أن بعض المركبات النباتية مفيدة لصحة الإنسان. هنا ، تم تقييم تأثيرات مستخلص أوراق الزيتون (OLE) باستخدام نماذج في المختبر وفي الجسم الحي. أظهرت الدراسات متحد البؤر أن OLE يمنع انتقال AQP2 الناجم عن فاسوبريسين إلى غشاء البلازما في خلايا MCD4 والفئران.الكلى. يقلل الحضانة مع OLE من الزيادة المعتمدة على AVP لمعامل نفاذية الماء التناضحي (Pf). لتوضيح المؤثرات المحتملة لـ OLE ، تم تقييم الكالسيوم داخل الخلايا. يزيد OLE من الكالسيوم داخل الخلايا من خلال تنشيط مستقبل استشعار الكالسيوم (CaSR). ، وهو مثبط انتقائي CaSR ، ألغى التأثير المثبط لـ OLE على نفاذية الماء المعتمدة على AVP. كشفت التجارب في الجسم الحي أن العلاج باستخدام OLE يزيد من تعبير CaSR mRNA ويقلل AQP2 mRNA بالتوازي مع زيادة AQP 2- الذي يستهدف miRNA -137. تشير هذه النتائج معًا إلى أن OLE يعاكس عمل الفازوبريسين من خلال تحفيز CaSR مما يشير إلى أن هذا المستخلص قد يكون مفيدًا لتخفيف الاضطرابات التي تتميز بإشارات CaSR غير الطبيعية وتؤثر على إعادة امتصاص الماء الكلوي.

تم استخدام أوراق شجرة الزيتون على نطاق واسع كعلاجات تقليدية لعلاج العديد من الأمراض ، وخاصة في دول البحر الأبيض المتوسط. تستهلك الأوراق بشكل شائع في النظام الغذائي للإنسان كمستخلص أو مسحوق لتحضير الشاي أو الشاي العشبي. أظهر تحليل الخصائص الكيميائية أن أوراق شجرة الزيتون تحتوي على العديد من المركبات النشطة بيولوجيًا التي قد يكون لها آثار مفيدة في بعض الأمراض مثل متلازمة التمثيل الغذائي ، وخلل شحميات الدم ، وارتفاع ضغط الدم ، وفي المرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم الأساسي ، انخفض OLE ضغط الدم وانخفاض طفيف في نسبة السكر في الدم والكلس. تم العثور على العديد من البوليفينول مثل أوليوروبين ، هيدروكسي إيروسول ، وتيروسول مخصب في مستخلص أوراق الزيتون الأخضر (OLE) 5 ، ومن المعروف أنها تشارك في الوقاية من بعض الأمراض التي تتميز بالإجهاد التأكسدي. لذلك ، في السنوات القليلة الماضية ، ازداد الاهتمام بالتحقيق في الآثار المفيدة المحتملة لمستخلص أوراق الزيتون بين العلماء في مختلف مجالات البحث. أظهر OIE تأثيرًا كبيرًا مضادًا للتكاثر في خلايا ورم الظهارة المتوسطة الخبيث عن طريق تغيير ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا ، وربما استهداف T- اكتب قنوات Ca2 plus. ومن المثير للاهتمام ، وجد أن OLE تمارس تأثيرات خافضة للضغط على ارتفاع ضغط الدم الوراثي في ​​الفئران التي تعاني من ارتفاع ضغط الدم تلقائيًا (SHR) ، المتعلقة بتحسين وظيفة الأوعية الدموية *. يلعب امتصاص الماء المفرط دورًا مهمًا في التسبب في زيادة ضغط الدم. في مرضى ارتفاع ضغط الدم ، الذين عولجوا بمستخلص أوراق الزيتون ، تم العثور على انخفاض كبير في العديد من العوامل الالتهابية المرتبطة بانخفاض ضغط الدم. إلى جانب ذلك ، يميز احتباس الماء المفرط العديد من الاضطرابات مثل تليف الكبد ، وفشل القلب ، وإفراز الهرمون المضاد لإدرار البول غير المناسب (SIADH). يتم التحكم بإحكام في التوازن المائي في الجسم عن طريق هرمون فاسوبريسين المضاد لإدرار البول (AVP) الذي يتم إطلاقه في حالة الجفاف. يربط AVP مستقبله المشابه V2R المترجمة في الغشاء الجانبي القاعديةكلويتقوم الخلايا الرئيسية بالتالي بتنشيط مسار إشارة cAMP الذي ينتج عنه إزاحة حويصلات الأكوابورين -2 (AQP2) الحاملة للحويصلات من تجمع داخل الخلايا إلى غشاء البلازما القمي حيث يحدث إعادة امتصاص الماء. على المستوى الجزيئي ، قد تعدل عدة عوامل توازن الماء في الكلى ، حيث أدى المستوى المرتفع من الكالسيوم اللمعي إلى تقليل تهريب AOP2 المعتمد على الفازوبريسين على المدى القصير من خلال تنشيط مستقبلات استشعار الكالسيوم (CaSR) 1،12. من ناحية أخرى ، أدى تنشيط CaSR في الخلايا الظهارية الأنبوبية الدانية الكلوية الخاملة المشروط ، والمعزولة من البول البشري ، إلى زيادة كبيرة في الكالسيوم الخلوي ، وقلل بشكل كبير من الزيادة في cAMP التي أثارها forskolin (FK) ، وهو منشط مباشر لـ adenylate cvclase3 علاوة على ذلك. ، في خلايا MCD4 لقناة التجميع الكلوية ، التي تعبر بثبات عن قناة الماء AOP2 ، أدى تحفيز CaSR إلى تخفيف الزيادة المعتمدة على cAMP في فسفرة AQP2 في سيرين 256 وهو حدث محوري في سلسلة نقل الإشارة التي يتم تنشيطها بواسطة الفازوبريسين مما أدى في النهاية إلى زيادة نفاذية الماء 4 ، 15 علاوة على ذلك ، فيالكلىشرائح من كلية الفأر النخاعية الداخلية ، تسبب تنشيط CaSR باستخدام المحاكاة الكلسية NPS-R568 في زيادة ملحوظة في AQP 2- استهداف ميرنا -137 ، مما يؤكد وجود تفاعل محكم بين مسار إشارة CaSR و AQP { {4}} نفاذية الماء المعتمدة ل .17 في هذه الدراسة ، تم تقييم تأثيرات مستخلص أوراق الزيتون ، التي تم الحصول عليها من صنف Coratina المحلي ، على وظيفة AQP2 المستحثة بالفازوبريسين في خلايا MCD4 لقناة التجميع الكلوية التي تعبر بثبات عن AOP2 وفي dDAVP حقن الفئران المعالجة بالمستخلص. نحن نقدم دليلًا على أن علاج OLE يتعارض مع استجابة الفازوبريسين في خلايا الكلى ، مما قد يفسر جزئيًا تأثيره المدر للبول. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا التأثير يبدو أنه مرتبط بتنشيط CaSR الناجم عن OLE ، وهو مستقبل معروف بتفاعله السلبي مع مستقبلات الفازوبريسين.

تعرف على المزيد من آثار cistanche على الكلى

نتائج

آثار OLE على وظيفة AQP2 التي يسببها فاسوبريسين في خلايا MCD4. للتحقيق في التورط المحتمل لـ OLE في وظيفة AQP2 المعتمدة على فاسوبريسين ،كلويتم استخدام خلايا MCD4 للقناة ، التي تعبر بشكل ثابت عن مستقبلات فاسوبريسين 2 (V2R) و AQP2 البشري ، كنموذج تجريبي. كشفت الدراسات البؤرية (الشكل 1 أ) أنه ، مقارنة بالخلايا المعالجة بـ dDAVP ، حيث تلطيخ AQP2 موضعيًا لغشاء البلازما القمي ، منع العلاج بـ OLE توطين غشاء AOP2 الناجم عن التحفيز باستخدام dDAVP. تمشيا مع هذه الملاحظات ، أضعف علاج OLE الزيادة التي يسببها dDAVP للاستجابة التناضحية الزمنية (المشار إليها بـ 1 / t في الشكل 1B) (OLE / dDAVP =88. 70 ± 1. 86 بالمائة ، ن =292 خلية مقابل dDAVP =206. 8 ± 5.49 بالمائة ، ن =186 خلية ؛ ص<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

آثار OLE في كلى الفئران المحقونة بـ OLE.

لمزيد من التحقيق في إجراءات OLE ، تم إجراء دراسات في الجسم الحي. على وجه التحديد ، تم حقن الفئران بـ OLE (25 0 مجم / كجم / يوم) مرة واحدة يوميًا لمدة ثلاثة أيام. بدلاً من ذلك ، تمت معالجة الفئران باستخدام OLE ، لمدة 3 أيام ، و dDAVP ، لمدة 3 0 دقيقة. كشف تقييم CaSR mRNA الذي تم عزله من قناة التجميع الكلوي للفئران ومعالجته من أجل PCR في الوقت الحقيقي (الشكل 6) عن زيادة كبيرة في CaSR mRNA في OLE (OLE =1 .87 ± 0.29 ، n {{ 10}} الجرذان مقابل نسبة النقر إلى الظهور =1. 02 ± 0.17 ، n =5 الجرذان ؛ p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">الكلىتم إجراء تحليل النشاف الغربي ودراسات متحد البؤر (الشكل 9). في الفئران المحقونة OLE / dDAVP ، تم تقليل الفسفرة لـ AQP2 في سيرين 256 بشكل كبير مقارنة بالأنسجة الكلوية للحيوانات المعالجة بـ dDAVP (OLE / dDAVP =0. 77 ± 0. 16، n =5 الجرذان مقابل dDAVP =2. 16 ± 0. 25 ، n =5 الجرذان ؛ p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

مناقشة

الكالسيوم هو مرسال مهم داخل الخلايا ينظم عددًا كبيرًا من الوظائف الخلوية 2. قد تؤدي إشارات الكالسيوم غير الطبيعية إلى العديد من الأمراض بما في ذلك قصور القلب والسرطان وارتفاع ضغط الدم 23. لقد ثبت نجاح التحكم المحدد في التعبير ونشاط البروتينات التي تتحكم في إشارات الكالسيوم المتعددة داخل الخلايا في مواجهة العديد من الاضطرابات ، وبالتالي فهي جذابة لتطوير الأدوية. تقدم هذه الدراسة رؤى جديدة حول آلية عمل OLE من خلال إظهار قدرتها على تعديل إشارات الكالسيوم داخل الخلايا من خلال تحفيز CaSR الذي يشارك في ضبط تهريب AQP2 الناجم عن الفازوبريسين والتعبير عنه. في ظل الظروف الفسيولوجية ، يلعب AQP2 دورًا مهمًا في التحكم في توازن ماء الجسم. يؤدي تحفيز الآلية داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى توطين AQP2 في غشاء البلازما القمي ، إلى احتباس الماء بشكل غير طبيعي وما يترتب عليه من نقص صوديوم الدم كما هو الحال في متلازمة إفراز الهرمون المضاد لإدرار البول (SIADH) غير المناسب ، وتليف الكبد ، وفشل القلب الاحتقاني. نموذج SIADH ، المرتبط بمرض الكلى المتعدد الكيسات 1 ، نقص مستوى الكالسيوم داخل الخلايا بشكل ملحوظ مقارنة بالمستوى الذي تم قياسه في قنوات التجميع للفئران من النوع البري. أدى انخفاض الكالسيوم داخل الخلايا إلى تقليل نشاط بعض الإنزيمات بما في ذلك بروتين فوسفاتيز PP2A مما أدى إلى زيادة تنظيم الفسفرة AOP2 في سيرين 2561. على النقيض من ذلك. أدى تنشيط CaSR باستخدام المحاكاة الكلسية NPS-R568 إلى زيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وخفض مستوى cAMP في الخلايا التي تعاني من نقص PKD1. الأهم من ذلك ، يمكن للكالسيوم العصاري الخلوي أن يقلل من تنظيم إنزيم cyclase المثبط للكالسيوم وبالتالي ضبط المستوى داخل الخلايا لـ cAMP. في خلايا MCD4 ، في الواقع ، أدى تحفيز CaSR باستخدام NPS-R568 إلى تقليل AQP 2- pS256 من خلال تثبيط الأدينيلات cyclase4. في هذه الدراسة ، منع العلاج بـ OLE الزيادة المعتمدة على الفازوبريسين في cAMP و AOP 2- pS256 ، وربما ثانوي لزيادة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. وتجدر الإشارة إلى أن التعرض لمصدر خارجي لـ cAMP باستخدام نفاذية 8- Br-cAMP ، تصدى بشكل كبير للتأثير المثبط لـ OLE على مسار V2R.

قد يؤدي المستوى المرتفع من الكالسيوم العصاري الخلوي إلى موت الخلايا وموت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، أدت الزيادة المستمرة في الكالسيوم داخل الخلايا من 25 0 نانومتر إلى أكثر من 6 0 0 نانومتر إلى تعزيز بقاء الخلايا العصبية. وفي خلايا MCD4 ، لا يظهر العلاج باستخدام OLE عند 0.1 مجم / مل تأثير سام للخلايا. عند هذا التركيز ، زاد OLE (0.1 مجم / مل) زيادة طفيفة في مستوى الكالسيوم داخل الخلايا. أظهر تصوير الكالسيوم أن التحفيز الحاد باستخدام OLE تسبب في زيادة عابرة للكالسيوم داخل الخلايا من خلال تنشيط CaSR الذي يتم إلغاؤه عندما تم احتضان الخلايا مسبقًا بمضاد CaSR الانتقائي NPS2143 ، في خلايا الأنابيب الكلوية القريبة ، التنشيط الخيفي لـ CaSR مع I-ornithine خفض إنتاج ROS وبالتالي تقليل تنظيم الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا الذي تسبب في موت الخلايا المبرمج. علاوة على ذلك ، أظهرت دراستنا السابقة أن التعبير عن متغيرات اكتساب الوظيفة لـ CaSR قلل من إطلاق ROS و S-glutathionylation لـ AQP237. أدى الحضانة باستخدام OLE إلى تقليل توليد ROS في خلايا MCD4 مما يدل على قدرتها المضادة للأكسدة. ومع ذلك ، ليس من الواضح في الوقت الحالي ما إذا كان OLE يؤثر على AOP 2- S-glutathionylation. كشفت العديد من الدراسات أن OLE أو الأوليوروبين ، وهو المكون الرئيسي لـ OLE ، قد يكون لهما أدوار وقائية عن طريق تثبيط موت الخلايا ، ومع ذلك ، فقد تم وصف التأثيرات المعتمدة على الجرعة في الفئران التي تتلقى OLE. تم الحصول على ردود مفيدة بجرعات 250 و 500 ملغم / كغم. على النقيض من ذلك ، في التركيزات الأعلى ، قد يكون للعلاج باستخدام OLE آثار ضارة ربما بسبب الإجراءات المؤيدة للأكسدة للعديد من المركبات النباتية. في هذه الدراسة ، تم حقن الجرذان بـ OLE بجرعة 250 مجم / كجم لمدة ثلاثة أيام تظهر تنظيم CaSR. يتم زيادة مستوى التعبير لـ CaSR بواسطة مركبات معينة تعمل كمنشطات خيفية للمستقبلات. في الواقع ، قللت المحاكاة الكلسية من تكلسات الأوعية الدموية عن طريق زيادة التخليق الحيوي لـ CaSR في خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية 0. في هذه المسابقة ، لا يمكن استبعاد احتمال أن تعمل بعض المركبات في OLE كمعدلات خيفية لـ CaSR. من ناحية أخرى ، قد يؤدي التحفيز باستخدام الفازوبريسين إلى إطلاق IL -6 الذي قد يساهم في زيادة مستوى التعبير عن CaSR42.

في الكلى ، يرتبط تحفيز إشارات CaSR بتقليل تنظيم تعبير AQP2 ربما من خلال miR -137 جيل. miRNAs هي محولات محورية بعد النسخ. تم أيضًا وصف العديد من miRNAs المعتمدة على الفازوبريسين والتي تستهدف تعبير AQP2. ترنسفكأيشن مع miR -32 و miR -137 قلل بشكل كبير من مستوى تعبير AOP2 في خلايا mpkCCDc14. ومن المثير للاهتمام أن OLE يمكن أن يخفف الإشارات الالتهابية ويمارس تأثيرات وقائية من خلال تعديل مستوى التعبير للعديد من الجزيئات المجهرية ". وعلى وجه الخصوص ، في خلايا الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال ، شجع OLE التعبير عن جزيئات مختلفة من الرنا بما في ذلك مير -13745 الذي يشارك في تقليل تنظيم مسار إشارات Akt / mTOR 46. تجدر الإشارة إلى أن العلاج باستخدام الأوليوروبين يمنع إشارات Akt / mTOR من خلال تنشيط CAMK و AMPK المستحثين بالكالسيوم ". تنشيط CaSR مع NPS-R568 ينشط AMPK ويقلل من نشاط mTOR في الخلايا الأنبوبية القريبة البشرية 3. تمشيا مع هذه النتائج ، يزيد الحضانة باستخدام OLE من الكالسيوم الخلوي ، ويقلل من نشاط PKA ، ويقلل من حجم الكيس في نموذج ثقافة الخلية ثلاثية الأبعاد. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن OLE قد يكون مفيدًا في علاج الاضطرابات التي تتميز بخلل في تنظيم ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا المتعلقة بخفض تنظيم إشارات CaSR.

يتكون مستخلص أوراق الزيتون من عدة مكونات نشطة بيولوجيًا ، بما في ذلك البوليفينول والألياف والمعادن. في الوقت الحالي ، ليس من الواضح ما إذا كان مركب واحد أو مجموعة متآزرة من المركبات النباتية في OLE قد يكون مفيدًا في تعديل الاستجابات داخل الخلايا. تم استخدام المستخلص المستخدم في هذه الدراسة كمضاف غذائي محتمل ، وبالتالي من المهم تحديد التأثير الفسيولوجي للمستخلص نفسه مع الأخذ في الاعتبار أن العديد من الفينولات ، بما في ذلك هيدروكسي إيروسول ، يمكن ترشيحها بواسطة الكلى واستعادتها في البول. ستوفر المزيد من الدراسات فعالية مكونات محددة قد تنظم بنشاط إشارات الكالسيوم داخل الخلايا من خلال CaSR. في الختام ، تقدم هذه الدراسة دليلًا على أن OLE يمكن اعتباره مساعدًا جديدًا محتملًا مفيدًا للتخفيف من الاضطرابات التي تتميز بتقليل تعبير CaSR بالإضافة إلى إرسال الإشارات والتأثير على نفاذية المياه الكلوية.

المواد والأساليب

الكيماويات والأجسام المضادة.تم شراء جميع المواد الكيميائية والمضادات الحيوية من شركة Merck (Merck KGaA ، Darmstadt ، ألمانيا). تم شراء Calcein-AM و Fura -2- AM ووسائط زراعة الخلايا ومصل بقري الجنين (FBS) و Super Signal West Pico Chemiluminescent Substates من Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). {2}} (AQP2) تم اكتشافه باستخدام أجسام مضادة محددة (C-tail Ab) مرفوعة مقابل ببتيد اصطناعي يتوافق مع آخر 15 من الأحماض الأمينية الطرفية C من AQP2 البشري !. تم إهداء الأجسام المضادة لـ AQP 2- pS256 عن طريق البروفيسور بيتر دين. تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية المقترنة ببيروكسيداز الفجل الماعز للأرانب من شركة Merck (Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا). تم شراء الجسم المضاد الثانوي للماعز والأرنب المقترن بـ Alexa -488 من Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

إنتاج مستخلصات الفينول الغنية والتوصيف الكيميائي.تم إنتاج مستخلص غني بالفينول من أوراق الزيتون كما ورد في Ranieri et al. 35. بعد الطحن بخلاط (Waring-Commercial ، Torrington ، CT ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تمت إضافة ماء ddH2O (بنسبة 1/2 0 ، ث / ص) ثم تم إخضاعها للموجات فوق الصوتية (CEIA ، Viciomaggio ، إيطاليا) ثلاث مرات ، لمدة 30 دقيقة عند 35 ± 5 درجة في كل مرة. أخيرًا ، تم ترشيح المستخلصات من خلال ورق الترشيح ، وتجفيفها بالتجميد ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تم ترشيح المستخلصات التي تم الحصول عليها باستخدام مرشحات نايلون سعة 0.45 ميكرومتر ، Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا） واستخدامها في التوصيف الكيميائي. تم إجراء محتوى الفينول الكلي ، والنشاط المضاد للأكسدة ، وتحديد المركبات الفينولية الفردية وفقًا لـ Difonzo et al .. أظهر OLE محتوى من البوليفينول ، تم تحديده بواسطة Folin-Ciocalteu ، يساوي 195 مجم. معادلات حمض الغاليك (GAE) ونشاط مضاد للأكسدة ، تم تحديده بواسطة ABTS (2،2'-azino-bis (3- إيثيل بنزوثيازولين -6- ملح حمض السلفونيك ثنائي الأمونيوم） ، يمثل 750 ميكرولتر TE （مكافئات ترولوكس) .

زراعة الخلايا وعلاجاتها.تم استخدام خلايا MCD4 لقناة التجميع القشرية للفأر ، والتي تعبر بشكل ثابت عن AQP2 البشري والخيمري V2R-Rluc كنموذج تجريبي. نمت الخلايا في مزيج 1: 1 من وسط Dalbec-cos المعدل و {8}} مصل بقري جنيني مكمل بنسبة 5 بالمائة (y / y). 1 في المائة (y / y) L- الجلوتامين و 1 في المائة من البنسلين / الستربتومايسين ، 5 ميكرومتر ديكساميثازون ، 4 0 0 ميكروغرام / مل G418 （لمقاومة AQP2） و 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين (لمقاومة V2R-Rluc) ، في جو رطب بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة. تُركت خلايا MCD4 تحت الحالة القاعدية (CTR) أو المعالجة طويلة الأمد بـ OLE عند 0.1 مجم / مل O / N ، dDAVP عند 100 نانومتر لمدة 30 دقيقة ، أو تمت معالجتها باستخدام OLE و dDAVP أو NPS2143 عند l μM O / N بدلاً من ذلك ، تم تعريض الخلايا لـ 8- Br-cAMP عند 500 ميكرومتر لمدة 45 دقيقة ، وأجريت تجارب قصيرة المدى باستخدام OLE عند 1 مجم / مل لمدة 5 دقائق و NPS2143 عند 10 ميكرومتر لمدة 15 دقيقة. تم إجراء التجارب 3-5 مرة مستقلة باستخدام خلايا من مقاطع مختلفة.

نموذج الحيوان والعلاجات.تم إنجاز جميع الإجراءات بالاتفاق مع الإرشادات الوطنية الدنماركية لرعاية حيوانات التجارب والتعامل معها والمبادئ التوجيهية المنشورة للمعاهد الوطنية للصحة ، وقد تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل معهد الطب السريري. جامعة آرهوس ، وفقًا لتراخيص استخدام حيوانات التجارب الصادرة عن وزارة العدل الدنماركية (رقم الموافقة 2015-15-0201-00658). تم إجراء دراسات على ذكور فئران ويستار البالغة بوزن يبدأ من 200-225 جم. تم الحفاظ على الحيوانات على نظام غذائي قياسي للقوارض (Altromin ، Lage ، ألمانيا) وكان لها حرية الوصول إلى مياه الصنبور. أثناء التجارب ، تم إيواء الفئران في مجموعات من اثنين لكل قفص ، مع دورة مظلمة فاتحة تبلغ 12:12 ساعة ، ودرجة حرارة 21 ± 2 درجة مئوية ، ورطوبة 55 ± 2 في المائة. عولجت خمسة فئران بالحقن تحت الجلد لـ 1 نانوغرام dDAVP (سيغما-الدريتش ، جلوستروب ، الدنمارك) في 200 مل من محلول ملحي / حيوان ، وخمسة فئران عولجت بالمركبات كانت بمثابة عناصر تحكم. بعد 30 دقيقة ، تم قتل الفئران وتمت معالجة الكلى كما هو موضح أدناه.

الخلايا و IMCD lysates.نمت الخلايا على أطباق {0} ملم وأعيد تعليقها في مخزن مؤقت يحتوي على 22 0 ملي مولار مانيتول ، 7 0 ملي سكروز ، {{1 0}}. 5 M EGTA pH 8.0،0.5 M EDTA pH 8.0،1 M Tris-HCl pH 7.4 في وجود البروتياز (1 ملي PMSF ، 2 مجم / مل ليوببتين ، و 2 مجم / مل بيبستاتين A) والفوسفاتاز (10 ملي مولار NaF و 1 ملي orthovanadate الصوديوم) مثبطات. Alternativelv ، أقسام الكلى بحوالي 0.5 مم تم تحضيرها ومعايرتها لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت يحتوي على 1i8 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 16 ملي مولار Hepes ، 17 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 14 ملي مولار جلوكوز ، 3.2 ملي مول كلوريد ، 2.5 ملي كلوريد الكالسيوم ، 1.8 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 1.8 ملي KH2PO4 (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم فرم الحليمة الكلوية بالمقص في نفس المخزن المؤقت في وجود البروتياز (1 ملي مولار PMSF ، 2 مجم / مليوببتين ، و 2 مجم / مل بيبستاتين A) والفوسفاتاز (10 ملي مولار الصوديوم و 1 ملي مولار من الصوديوم orthovanadate). بعد سونيكا نشوئها (60 كيلوهرتز لمدة 5 ثوان) ، تم طرد المحللات عند 12 ، 000 × جم لمدة 10 دقائق. تم جمع المواد الطافية واستخدامها في دراسات التكتل المناعي '8.

المجهر متحد البؤر.تم إجراء دراسات متحد البؤر كما هو موضح سابقًا. باختصار ، نمت الخلايا على إدخالات PET لزراعة الخلايا وعولجت على النحو الموصوف أعلاه. بدلاً من ذلك ، تعرضت أقسام الكلى التي تم الحصول عليها من مجموعة التحكم و OLE و dDAVP و OLE مع الفئران المعالجة بـ dDAVP لتجارب التألق المناعي كما هو موضح سابقًا. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر ضوئي مسح بالليزر متحد البؤر Leica TCS SP2 (Leica Microsystems ، Heerbrugg ، سويسرا). الرحلان الكهربائي للهلام والتخيط المناعي. تم فصل البروتينات على مواد هلامية بولي أكريلاميد خالية من البقع بنسبة 12 بالمائة (Bio-Rad Laboratories، Inc.، Hercules، CA، US.A.) في ظل ظروف مخففة كما هو موضح سابقًا =5 ، 52. باختصار ، تم نقل عصابات البروتين إلى أغشية Immobilon-P (Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا) وتم تكديسها مناعيًا باستخدام الأجسام المضادة AQP2 (Pre-C-tail Ab) والمضادة لـ AQP 2- pS256. تم الحصول على إشارات مناعية باستخدام ركائز Super Signal West Pico Chemiluminescent مع نظام Chemidoc (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA). تم تطبيع النطاقات إلى البروتين الكلي باستخدام تقنية خالية من البقع (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، تم إجراء تحليل قياس الكثافة باستخدام ImageLab (Bio-Rad Laboratories، Inc.، Hercules، CA، USA) وتم تحليله باستخدام GraphPad Prism (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

فحص نفاذية الماء.تم قياس نفاذية الماء الاسموزي كما هو موضح سابقًا. باختصار ، نمت خلايا MCD4 على أغطية زجاجية 40- مم. بعد المعالجات ، تم تحميل الخلايا بـ 10 ميكرومتر من Calcein-AM المنفذ للغشاء لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة ، 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، في DMEM / F -12. تم تركيب Coverslips في غرفة نضح (FCS2 Closed Chamber System ، BIOPTECHS ، Butler ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء القياسات باستخدام مجهر TE المقلوب 2000- S (مجهر نيكون الكسوف ، طوكيو ، اليابان) مجهزًا لقياسات الفلورة أحادية الخلية وتحليل التصوير. كانت العينات المحملة بالكالسين- AM متحمسة عند 490 نانومتر. قياسات الإسفار ، التالية متساوية (140 ملي كلوريد الصوديوم 5 ملي بوكل ، 1 ملي MgCl. 1 ملي كلوريد الكالسيوم ، 10 ملي مولار حمض السلفونيك Hepes ، 5 ملي الجلوكوز ، الرقم الهيدروجيني 7.4) أو مفرط التماثل (محلول متساوي مع 135 ملي مانيتول) المحاليل . باستخدام برنامج Metafluor (الأجهزة الجزيئية ، MDS Analytical Technologies ، تورنتو ، كندا). تم تسجيل بيانات مضان الدورة الزمنية بعد نضح الخلايا بمحاليل متساوية ومفرطة التكاثر. تم قياس المسار الزمني لانكماش الخلية على أنه ثابت الوقت (Ki ، معبرًا عنه بـ 1 / r ، sec) ، معلمة مرتبطة بنفاذية الماء ، تم الحصول عليها عن طريق ملاءمة البيانات بوظيفة أسية تم تحليلها باستخدام GraphPad Prism (برنامج GraphPad ، سان دييغو) ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

قياسات نقل طاقة الرنين الفلوري.لتقييم تغييرات cAMP داخل الخلايا ، تم تطبيق تقنية نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET). بالنسبة لتجارب FRET ، تم نقل الخلايا باستخدام ترميز البلازميد لمستشعر H96 الذي يحتوي على نموذج إجماع ملزم لـ cAMP لـ EPAC1 مضمن بين بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) و cp173 فينوس فينوس كما هو موضح سابقًا. كان ترميز البلازميد للمسبار H96 هدية من الدكتور ك. جالينك. تم إجراء تصور للخلايا التي تعبر عن ECFP و / أو EYFP واكتشاف الحنق باستخدام مجهر TE المقلوب 2000- S (مجهر نيكون الكسوف ، طوكيو ، اليابان). تم تصحيح كل صورة وتحليلها كما هو موضح سابقًا.

قياسات الكالسيوم داخل الخلايا. تم إجراء قياسات الكالسيوم داخل الخلايا كما هو موضح سابقًا. باختصار ، تم تحميل خلايا MCD4 بـ 4 ميكرومتر Fura -2 AM لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة في DMEM / F -12. تم استخدام محلول رينجر لإرواء الخلايا أثناء التجربة التي تحتوي على 140 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد الصوديوم 1 ملي مول كلوريد ، 10 ملي مولار HEPES ، 5 ​​ملي مولار من الجلوكوز ، 1.8 ملي كلوريد الكالسيوم ، الرقم الهيدروجيني 7.4. في قياسات التألق ، تم تركيب الأغطية ذات الخلايا المحملة بشكل زائد في غرفة التروية (FCS2 نظام الغرفة المغلقة. BIOPTECHS. بتلر ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء القياسات باستخدام مجهر TE 2000- مقلوب (مجهر نيكون الكسوف ، طوكيو ، اليابان) ، تم رسم نسبة شدة التألق عند 340 و 380 نانومتر وتم حسابها على أنها التغيير في التألق. على وجه الخصوص ، تمت مقارنة التحفيز باستخدام OLE （1 مجم / مل أو NPS2143 （10 ميكرومتر） في نفس نوع الخلية مع تلك التي تم الحصول عليها بعد التحفيز بجرعة قصوى من ناهض الكالسيوم ATP 100 ميكرومتر） الذي تم استخدامه باعتباره الرقابة الداخلية (100 بالمائة).

تم قياس مستوى الكالسيوم داخل الخلايا في حالة مستقرة ومعايرة كما هو موصوف بواسطة Grynkiewicz. تم استخدام OLE و NPS2143 على المدى الطويل عند 0. 1 مجم / مل و l uM ، على التوالي ، وتمت معايرة كل عينة بإضافة 5 ميكرومتر أيونوميسين في وجود 1 ملي مولار EGTA Rm.） متبوعًا بـ 5 ميكرومتر أيونوميسين في 5 ملي كلوريد الكالسيوم ، (RMA).

تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ AQP2 و CaSR mRNA في السيطرة والفئران المعالجة.أجريت تجارب PCR في الوقت الحقيقي لقياس التعبير النسبي عن mRNA في قناة جمع النخاع الداخلية (IMCD) المعزولة عن الحليمات الكلوية للفئران المعالجة والمعالجة. شرائح الكلى بحوالي 0. تم ​​عمل 5 مم ومعايرتها لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت يحتوي على 118 ملي كلوريد الصوديوم ، 16 ملي مولار HEPES ، 17 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، 14 ملي مولار جلوكوز ، 3.2 ملي مول كلوريد ، 2.5 ملي كلوريد الكالسيوم. ملي MgSO4 ، و 1.8 ملي مولار KH2PO4 (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم عزل الحليمة الكلوية تحت مجهر مجسم. تم بعد ذلك فرم العينات المأخوذة من جرذان التحكم والمعالجة بمقص مباشرة في Trizol (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء النسخ العكسي على 2.5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وفقًا لاقتراحات الشركة المصنعة (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ؛ 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). تم إجراء تضخيم PCR في الوقت الحقيقي باستخدام TagMan Fast Advanced Master Mix مع مقايسات CaSR و AOP2 و GAPDH (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) في نظام StepOne Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية ) ، وضبط ظروف التدوير الحراري على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة (95 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ؛ 40 دورة بديلة عند 95 درجة مئوية لمدة ثانية واحدة و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية). تم التعبير عن النتائج كـ 2- القيم (التقدير الكمي النسبي) مع △ ACt=(Ct target-Ct GAPDH) تعامل- (Ct target-Ct GAPDH) Sham1.

تقييم ميرنا -137 في السيطرة والفئران المعالجة.تم تقييم محتوى miRNA {0} الموجود في قناة جمع النخاع الداخلي للجرذ والمعالج باستخدام TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR -137؛ Assay ID؛ 477904 mir؛ Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA .US.A) ، مما أتاح إخطارًا حساسًا للغاية ومحددًا لـ miRNA الناضج باستخدام PCR الكمي. تم صنع شرائح الكلى التي يبلغ حجمها حوالي 0.5 مم ومعايرتها لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت يحتوي على 118 ملي كلوريد الصوديوم ، و 16 ملي مولار HEPES ، و 17 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 14 ملي كلوكوز ، و 3.2 ملي مولار بوكل ، و 2.5 ملي كلوريد الكالسيوم ، و 1.8 ملي مولار MgSO4 ، و 1.8 ملي مولار. KH2PO4 (الرقم الهيدروجيني 7.4). تم عزل الحليمة الكلوية تحت المجهر الفراغي. تم بعد ذلك فرم العينات المأخوذة من جرذان السيطرة والمعالجة بمقص مباشرة في Trizol (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي. TaqMan المتقدم طقم توليف miRNA (كدنا) （كتالوج n²∶A25576 ؛ تم استخدام Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، USA للحصول على تخليق (كدنا) ، وفقًا للبروتوكول المقدم من قبل الشركة المصنعة (بولي (A) رد فعل ذيل ؛ رد فعل الربط ؛ رد فعل النسخ العكسي ؛ تفاعل مير- أمبير). تم تصنيع الحمض النووي الريبي الاصطناعي (UUAUUGCUAAGAAUACGCGUAG) مع 59- الفوسفور بواسطة Thermo Fisher Scientific واستخدامه لإجراء منحنى معايرة لاستيفاء قيم عينات miRNA وللحصول على تقييم دقيق (بالنانوجرام) لمحتوى miR -137 في عينات 16 ، باستخدام GraphPad Prism (برنامج GraphPad ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل احصائي.تم الإبلاغ عن جميع القيم كوسائل تحليل ± SEM الإحصائي تم إجراؤه بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار مقارنات متعددة Newman-Keuls باستخدام * p<0.05 considered="" statistically="" different="">

البيانات والموافقة الأخلاقية والموافقة على المشاركة.أجريت الدراسات على الحيوانات بالاتفاق مع الإرشادات الوطنية الدنماركية لرعاية حيوانات التجارب والتعامل معها والمبادئ التوجيهية المنشورة من المعاهد الوطنية للصحة. وافقت لجنة أخلاقيات رعاية الحيوان في معهد الطب السريري بجامعة آرهوس على بروتوكولات الدراسة ، وفقًا لتراخيص استخدام حيوانات التجارب الصادرة عن وزارة العدل الدنماركية (رقم الموافقة 2015-15-0201-00658). يؤكد المؤلفون أن جميع الطرق قد تم تنفيذها وفقًا للإرشادات واللوائح ذات الصلة. علاوة على ذلك ، يؤكد المؤلفون أن الدراسة أجريت وفقًا لإرشادات ARRIVE.

مراجع

1. شجرة الزيتون El، SN & Karakaya، S. (Olea europaea) تترك آثارًا مفيدة محتملة على صحة الإنسان. نوتر. القس 67 ، 632-638.

2. Javadi، H.، Yaghoobzadeh، H.، Asfahani، Z.، Reza Memarzadeh، M. & Mehdi Mirhashemi، S. آثار مستخلص أوراق الزيتون على الاستجابة الأيضية ، وظائف الكبد والكلى والمؤشرات الحيوية الالتهابية في مرضى ارتفاع ضغط الدم. PJBS 22، 342–348.

3. Saibandith ، B. ، Spencer ، JPE ، Rowland ، IR & Commane ، DM Olive polyphenols ، ومتلازمة التمثيل الغذائي. جزيئات

4. شريف ، س وآخرون. تجربة سريرية لمستخلص أوليا معاير في علاج ارتفاع ضغط الدم الشرياني الأساسي. J. فارم. بلج. 51 ، 69-71 (1996).

5. Difonzo ، GRA وآخرون. المستخلصات الخضراء من صنف الزيتون كورتينا توصيف مضادات الأكسدة والنشاط البيولوجي. J. Funct. الأطعمة 31 ، 8.

6. Herrero، M. et al. إمكانيات جديدة لتثمين المنتجات الثانوية لزيت الزيتون. تشروماتوجر. 1218 ، 7511–7520.

7. ماركيتي ، سي وآخرون. يؤثر مستخلص أوراق الزيتون المخصب بالأوليوروبين على ديناميكيات الكالسيوم ويضعف قابلية خلايا ورم الظهارة المتوسطة الخبيثة. eCAM 2015 ، 908493.

8. روميرو ، م وآخرون. التأثيرات الخافضة لضغط الدم لمستخلص أوراق الزيتون المخصب بالأوليوروبين في الجرذان المصابة بارتفاع ضغط الدم تلقائيًا. وظيفة الغذاء 7 ، 584-593.

9. هول ، JE القصور الكلوي ، بدلا من ضعف الأوعية الدموية غير الكلوي. يتوسط ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الملح. تداول 133 ، 894-906.

10. Wilson، JL، Miranda، CA & Knepper، MA Vasopressin وتنظيم الأكوابورين -2. كلين. إكسب. نفرول. 17 ، 751-764.