تخليط التردد البصري لذبذبات ثيتا الحصين ينفصل استرجاع الذاكرة العاملة عن رموز الزمانية المكانية الحصين الجزء 3

تؤدي السرعة الضوئية للخلايا العصبية في مرض التصلب العصبي المتعدد إلى تزامن ثيتا غير الفسيولوجي

من المثير للدهشة أن التحفيز البصري الوراثي 8 هرتز المرتبط بسرعة تذبذبات ثيتا أدى إلى انخفاض الأداء عند تطبيقه أثناء تشفير أو استرجاع الذاكرة العرضية في مهمة NPOR، بالإضافة إلى استرجاع الذاكرة العاملة المكانية في مهمة DNMTS. لفهم تأثيرات سرعة ثيتا على فسيولوجيا الحصين، قمنا بتحليل قفل الطور لتذبذب ثيتا قبل وأثناء التحفيز البصري الوراثي بتردد 8 هرتز (الشكل التكميلي 7 أ) ووجدنا أن هذا التحفيز أدى إلى زيادة عصور التحفيز عبر تزامن الطور (الشكل التكميلي 7 ب). علاوة على ذلك ، قمنا بتحليل الارتباط المتبادل لتذبذبات ثيتا عبر CA1 الظهرية (مسافة ~ 1 مم بين الأقطاب الكهربائية على طول المحور الحاجز الصدغي (الشكل التكميلي 7 ج) ووجدنا أن سرعة إيقاعات ثيتا عند 8 هرتز أدت إلى زيادة الارتباط المتبادل بين هذين القطبين الكهربائيين ( الشكل التكميلي 7 د).

علم الوراثة هو العلم الذي يدرس الوراثة والتنوع الجيني، والذاكرة هي أحد الجوانب التي تحظى باهتمام كبير. إذًا، ما علاقة الجينات بالذاكرة؟ سوف تستكشف هذه المقالة القضايا المتعلقة بالذاكرة من منظور وراثي.

بادئ ذي بدء، نحن نعلم أن الجينات الوراثية هي أساس التطور الجسدي والفكري للإنسان، وما إذا كانت هذه الجينات متفوقة أم لا، فسوف يؤثر ذلك على ذاكرة الناس. تظهر أحدث الأبحاث أن معدل الذكاء والذاكرة لدى الأشخاص يتأثران بالعوامل الوراثية. تظهر الأبحاث أن الجينات الوراثية تلعب دورًا حاسمًا في الذكاء والذاكرة. ولذلك، يولد بعض الأشخاص بذاكرة أقوى، بينما يحتاج البعض الآخر إلى العمل الجاد والتدريب لتحسين ذاكرتهم.

ثانيا، العوامل البيئية هي أيضا عوامل مهمة في تطوير الذاكرة. نحن لا نحتاج فقط إلى دعم الجينات الوراثية، بل نحتاج أيضًا إلى تحسين ذاكرتنا من خلال التدريب العلمي والعادات المعيشية الجيدة. على سبيل المثال، يمكننا الإصرار على ممارسة الرياضة كل يوم، والحصول على قسط كاف من النوم، واتباع مبادئ مطابقة الوجبات، وما إلى ذلك، والتي يمكن أن تساعد في تحسين وظائف المخ والذاكرة.

وأخيرًا، لا يبالغ الأشخاص العاديون في التأكيد على تأثير العوامل الوراثية على تطور الذاكرة. ونظرًا لأن العوامل الوراثية ليست مطلقة، فلا يزال بإمكان ذاكرة الأشخاص وذكائهم تحسين أنفسهم من خلال تحسين جهودهم وتدريبهم. يجب علينا دائمًا الحفاظ على موقف التعلم الإيجابي والمستمر، واستكشاف وتطوير إمكانات ذاكرتنا باستمرار. أعتقد أنه بهذه الطريقة فقط يمكننا أن نصبح أكثر ذكاءً ويكون لدينا شعور أكبر بالإنجاز. باختصار، العلاقة بين علم الوراثة والذاكرة وثيقة جدًا، لكن لا ينبغي لنا المبالغة في التركيز على العوامل الوراثية، بل يجب علينا تحسين ذاكرتنا وذكائنا باستمرار من خلال تحسين الذات والتدريب.

يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche deserticola هي مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية اللحم المفروم من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك الأحماض والسكريات والفلافونويد وغيرها. ويمكن لهذه المكونات تعزيز صحة الدماغ بطرق مختلفة.

انقر فوق تعرف على 10 طرق لتحسين الذاكرة

مناقشة

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 خلية عصبية أثناء إجراء التحفيز البصري الوراثي للخلايا العصبية في مرض التصلب العصبي المتعدد بدقة أقل من ثانية للتحكم في إيقاعات ثيتا وتقييم دورها في فسيولوجيا الحصين والذاكرة. الأهم من ذلك، باستخدام مثيراتوريوبسين وإما التحفيز المخفوق أو 8 هرتز، تمكنا من إلغاء أو تسريع ثيتا الحصين بشكل متسق وقوي، على التوالي.

بالمقارنة مع تثبيط مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام إما opsin المثبطة أو المركبات الدوائية (مثل muscimol)، فإن نهجنا يتيح المقارنة داخل الموضوع بين حالتين متعارضتين (وتيرة مقابل إلغاء ثيتا) مع الحفاظ على مستويات النشاط في خلايا MS-PV. لقد جمعنا مهمة مسار خطي متجانسة، سمحت لنا، جنبًا إلى جنب مع مقاربات المعلومات النظرية، بفك رموز الحصين المكانية والزمانية. هذا الأسلوب يخفف من الحاجة إلى عتبات تعسفية، مما يتيح اتباع نهج موحد لتحليل تصوير الكالسيوم. في حين أن جزءًا كبيرًا من الخلايا العصبية الهرمية CA1 يعبر عن مزيج من الرموز الزمانية المكانية، فقد ركزنا تحليلاتنا على الخلايا العصبية التي تم ضبطها خصيصًا للمكان أو الزمان أو المسافة المقطوعة.

بينما تم التحقيق في الترميز المكاني على نطاق واسع في CA1، فقد اكتسبت الرموز الزمنية والمسافة مزيدًا من الاهتمام مؤخرًا. تم استخراج الرموز الزمنية 28،35–37 والمسافة 37 عن طريق تثبيت الإشارات البصرية المكانية أو استخلاصها تحليليًا باستخدام النماذج الخطية المعممة في نماذج الواقع الافتراضي 26،27،38. هنا، نقترح نهجًا لفك التشابك بين الرموز المكانية والزمانية والمسافة باستخدام نهج نظري للمعلومات والذي، جنبًا إلى جنب مع مهمة التناوب المتبادل، يتيح تحليل الرموز الزمانية المكانية والرموز المتعددة الإرسال في العالم الحقيقي في الحيوانات التي تتحرك بحرية. تقوم كمية كبيرة من الخلايا العصبية الهرمية CA1 بتشفير المعلومات المتعددة عن الموقع والمسافة والوقت كما تم الإبلاغ عنه مسبقًا بالإضافة إلى إشارات الحركة الذاتية مثل التسارع والسرعة والاتجاه.

لقد وجدنا أن تخليط التردد والتحفيز البصري الوراثي 8 هرتز قد ألغى أو إيقاع إيقاعات ثيتا بشكل كبير، على التوالي، وأدى إلى انخفاض النشاط العام في مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الهرمية CA1 بينما لم يسبب تغييرات كبيرة في نشاط الخلية المكانية، على غرار التقارير السابقة باستخدام إما التثبيط الدوائي . 46،47 أو optogenetic9،48 سرعة مرض التصلب العصبي المتعدد أو مدخلات الحاجز إلى الحصين. وبما أنه من المعروف أن الخلايا العصبية في مرض التصلب العصبي المتعدد هي المحرك الرئيسي لتذبذبات الحصين، فقد توقعنا أن يكون تحفيز مرض التصلب العصبي المتعدد مرتبطًا باضطراب الزمن أو نشاط الخلايا البعيدة في ظروف انخفاض إيقاعات ثيتا، ولكن لم تحدث أي تغييرات عندما تم إلغاء ثيتا أو إيقاعها. بالإضافة إلى ذلك، فإن وتيرة تذبذبات الحصين إلى 8 هرتز لم تؤد إلى تغييرات في جودة الرموز المكانية كما ورد سابقًا ولم تغير الرموز الزمنية كما لوحظ في النموذج السلوكي لدينا.

على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن خلايا الزمن (وليس المكان) يمكن أن تعتمد بشكل مباشر على مدخلات القشرة المخية الأنفية الداخلية (MEC)، إلا أن الأدلة التجريبية الحديثة تشير إلى أن آفات MEC لا تؤدي إلى أي تغييرات في فسيولوجيا الخلية الزمنية في الحصين. والجدير بالذكر أن تحقيقًا أحدث وجد أن السرعة الضوئية الوراثية لمرض التصلب العصبي المتعدد لم تعطل الرموز المكانية لخلايا الشبكة في القشرة المخية الأنفية الداخلية63، مما يشير أيضًا إلى أن نشاط مرض التصلب العصبي المتعدد لا يشارك بشكل مباشر في الرموز المكانية داخل تكوين الحصين. ويشير هذا، جنبًا إلى جنب مع نتائجنا، إلى أن الرموز الزمنية يمكن أن تكون إما نتيجة لحسابات تعتمد على مرض التصلب العصبي المتعدد داخل القشرة الأنفية الداخلية 63 (1) أو يتم إنشاؤها بشكل جوهري داخل الحصين نفسه (2).

في حين وجدت الدراسات المبكرة أن مرض التصلب العصبي المتعدد لعب دورًا أساسيًا في الحفاظ على خلايا الوقت ودعم الذاكرة العاملة، فإن الأدلة التجريبية الحديثة تظهر أن المساهمة الدقيقة لخلايا الوقت في أداء الذاكرة العاملة يمكن أن تكون أقل مما كان يعتقد سابقًا. نظرًا لأن الخلايا العصبية MS-PV من المحتمل أن تحافظ على مستويات نشاط كبيرة أثناء التحفيز البصري الوراثي لتشويش التردد (على عكس طرق التثبيط)، فإن نتائجنا تدعم بقوة دور نشاط الحاجز المحدد التوقيت بدقة في دعم الذاكرة العاملة، والذي تم افتراضه سابقًا. على الرغم من أننا لاحظنا انخفاضًا في أداء الذاكرة عند استخدام التحفيز البصري الوراثي أثناء الاسترجاع، إلا أن التحفيز أثناء مرحلة تشفير مهام DNMTS لم يكن مرتبطًا بانخفاض الذاكرة في مهمة DNMTS. أدى ضبط سرعة التذبذبات عند 8 هرتز أثناء مرحلة التشفير أو الاسترجاع لمهمة NOPR إلى ضعف استرجاع الذاكرة. تكشف تحليلاتنا الفيزيولوجية الكهربية أيضًا أن هذا التحفيز تسبب في احتجاز المناطق البعيدة من CA1 الظهرية في نفس المرحلة، مع قفل المرحلة غير الفسيولوجية. على الرغم من أننا لم نحقق بشكل مباشر في العلاقة السببية بين تغييرات الطور وأداء الذاكرة، فقد وجد أيضًا أن توقيت الارتفاع ومبادرة الطور مرتبطان بوظيفة الذاكرة العاملة المتغيرة على الرغم من ترك تشفير المكان سليمًا. علاوة على ذلك، فقد ثبت سابقًا أن قفل مرحلة الخلايا العصبية الهرمية أمام التذبذبات هو مؤشر على أداء الذاكرة.

والجدير بالذكر أن أحد القيود على النهج الذي نتبعه في إنشاء خصائص ضبط المسافة الزمنية هو أنه يتطلب أخذ عينات أكثر بأربع مرات من المسار الخطي العادي مما يزيد من فرص التبييض الضوئي عند إضافة شروط التحفيز إلى الجدول الزمني التجريبي. بينما وجدنا أن الرموز المكانية ظلت غير متأثرة بالتحفيزات الجينية الضوئية خلال نفس الجلسة، فإن أجهزة التصوير الأحدث التي تتضمن أجهزة استشعار ذات حساسية متزايدة يمكن أن تساعد في منع التبييض الضوئي وتسمح بجلسات تسجيل أطول، وبالتالي أخذ عينات من الخلايا الزمنية والمسافة جنبًا إلى جنب مع التحفيزات. لقد وجدنا أيضًا أن مجموعة الخلايا العصبية التي تشفر بشكل كبير ومحدد لمتغير واحد فقط تكون صغيرة مقارنة بعدد الخلايا العصبية الملتحمة، مما يجعل متطلبات أخذ العينات لهذه الخلايا العصبية المحددة للغاية أعلى بكثير.

نحن نقدم أدلة تجريبية على أن معالجة مرض التصلب العصبي المتعدد لا يغير السرعة الحركية، وعلى العكس من ذلك، فإن السرعة الحركية تملي تردد ثيتا. على الرغم من الحفاظ على رموز المكان والزمان أثناء تحفيز مرض التصلب العصبي المتعدد لدينا، تم تعديل جزء (~ 6٪) من الخلايا مباشرة ويمكن أن يفسر ضعف الذاكرة الذي لوحظ في فحوصاتنا السلوكية. سبق أن تم الإبلاغ عن أن الخلايا العصبية البينية الكهروضوئية الموجودة في الحصين هي جزء من الدوائر الدقيقة الأساسية في تنظيم توحيد الذاكرة،66،67، ويمكن أن ترتبط تلاعباتنا الوراثية البصرية بإسكات جزء من هذه الخلايا. علاوة على ذلك، على الرغم من أننا لم نلاحظ تغيرات في نطاقات التردد بخلاف ثيتا، لا يمكننا استبعاد أن توقيت ارتفاع الخلايا العصبية الهرمية CA1 يمكن تغييره بشكل كبير عند تخليط تذبذبات ثيتا، في حين تبين أن التحفيز بتردد 8 هرتز لا يؤدي إلى زيادة نشاط الحصين، وهو ما يمكن أن يفسر التأثيرات التفاضلية لـ تؤثر أنماط التحفيز تلك على أداء الذاكرة العاملة. من المحتمل أن تكون ضعفات الذاكرة التي لاحظناها غير كولينية: أولاً، في تجاربنا النسيجية المناعية، لم نجد تقريبًا أي تعبير عن ChrimsonR في الخلايا العصبية ChAT في مرض التصلب العصبي المتعدد. ثانيًا، لم ترتبط تحفيزاتنا الضوئية الجينية بالتغيرات في تموجات الحصين، بينما تشير التقارير السابقة إلى ذلك تحفيز ترتبط الخلايا العصبية ChAT بانخفاض تردد التموج . يعد ترنسفكأيشن ChrimsonR للخلايا العصبية MS VGLUT2 أمرًا غير محتمل أيضًا نظرًا لأن تنشيط هذه الخلايا العصبية يرتبط بزيادة مباشرة في النشاط الحركي 68، وهو ما لم نلاحظه.

على الرغم من أن الترتيب الزمني الدقيق للطفرات الهرمية CA1 يمكن أن يفسر، جزئيًا على الأقل، تأثيرات تحفيز مرض التصلب العصبي المتعدد على الذاكرة، إلا أنه ينبغي أخذ الآليات البديلة في الاعتبار. ومن الجدير بالذكر أنه بالإضافة إلى الحصين والقشرة المخية الأنفية الداخلية، تتجه الخلايا العصبية MS PV إلى القشرة خلف الطحال 3 ويمكن أن تكون مسؤولة عن بعض ضعف الذاكرة الذي لوحظ هنا.

باختصار، باستخدام تصوير الكالسيوم، وعلم البصريات الوراثي، والفيزيولوجيا الكهربية، وجدنا أنه يمكن ضبط إيقاعات ثيتا أو إلغاؤها باستخدام تحفيز مرض التصلب العصبي المتعدد. مثل هذا التحفيز يضعف العرضية وكذلك استرجاع الذاكرة العاملة. وكانت هذه التأثيرات غير كولينية ولم تعطل نشاط تموج الحصين. أخيرًا، في حين أن جزءًا صغيرًا من الخلايا العصبية الحصينية استجاب بشكل مباشر للتحفيز البصري الوراثي لمرض التصلب العصبي المتعدد، إلا أن خلايا المكان والزمان والمسافة لم تتعطل عن طريق التلاعب بتذبذبات ثيتا. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أنه على الرغم من أن مدخلات مرض التصلب العصبي المتعدد إلى الحصين تلعب دورًا أساسيًا في الذاكرة، إلا أن الرموز المتعددة الإرسال في الخلايا العصبية الهرمية CA1 قد لا تكون الركيزة المباشرة لمثل هذه الوظائف.

طُرق

الحيوانات

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة ماكجيل والمجلس الكندي لرعاية الحيوان (البروتوكول 2015-7650). إجمالي n=41 ذكر (n=20) وأنثى (n=21) بعمر 8-16 أسبوع، B6؛ 129P2 PV-Cre الفئران (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) تم استخدامها في هذه الدراسة. تم استخدام n=5 من الفئران للجمع بين علم البصريات الوراثي وتصوير الكالسيوم؛ تم زرع الفئران n=3 لتصوير الكالسيوم، وعلم البصريات الوراثي، والضوابط الفيزيولوجية الكهربية؛ تم استخدام عدد=4 من الفئران في الدراسات الفيزيولوجية الكهربية؛ تم نقل عدد=29 من الفئران وزرعها لإجراء فحوصات سلوكية. تم إيواء الفئران بشكل فردي في دورة الضوء/الظلام 12- عند درجة حرارة 22 درجة ورطوبة 40% مع الطعام والماء والشراب. تم إجراء جميع التجارب خلال الجزء الخفيف من دورة الضوء / الظلام.

النواقل الفيروسية المرتبطة بـ Adeno

تم استخدام الفيروس المرتبط بـ Adeno AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834، الذي تم الحصول عليه من جامعة بنسلفانيا Vector Core) في جميع تجارب تصوير الكالسيوم. تم الحصول على الفيروس المرتبط بـ Adeno (AAV) من النمط المصلي dj (قفيصة هجينة تم إنشاؤها من ثمانية أنماط مختلفة من AAV) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato من مرفق Vector Core في جامعة أوريغون للصحة والعلوم في بورتلاند، أوريغون. على الرغم من أنه جين تدبير منزلي، إلا أننا لم نلاحظ ترنسفكأيشن في الخلايا الكولينية (انظر "النتائج" والشكل 2 ب – هـ). تم استخدام بناء eYFP بدون تسلسل ChrimsonR كعنصر تحكم (يُطلق عليه التحكم YFP في هذه المخطوطة).

الإجراءات الجراحية

تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين (تحريض بنسبة 5%، صيانة بنسبة 0.5-1٪) ووضعها في إطار التجسيمي (David Kopf Instruments). وتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة تسخين، وتم ترطيب العينين باستخدام الجل (Optixcare) ويتم إعطاء الكاربروفين (10 مل/كجم) تحت الجلد. تم تطهير الجمجمة بالكامل من جميع الأنسجة الضامة وتم إجراء عمليات حج القحف الصغيرة باستخدام مثقاب الأسنان للحقن أو الزرع اللاحق.

الحقن الفيروسية. تم إجراء جميع الحقن الفيروسية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بحاقن Nanoject III (Drummond). تم تسليم 5 00 nl من AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (أو التحكم eYFP) إلى MS بمعدل 1 nL/s، عند الإحداثيات التالية بناءً على أطلس المجسم المرجعي 69 (المسافة من Bregma في مم): الأمامي الخلفي (AP) 0.85، الناصف الوحشي (ML) 0، الظهري المركزي (DV) −4.50 باستخدام زاوية 5 درجات في مستوى ML. بعد الجراحة، تم رصد الحيوانات حتى الشفاء.

زراعة الألياف الضوئية. بعد أسبوعين من الحقن، تم تخدير الفئران للزرع باتباع نفس الإجراء الجراحي. تم زرع الألياف الضوئية بقطر 200 ميكرومتر مع الطويق الخزفي (Thorlabs) في نفس الإحداثيات. تم تثبيت الغرسات في مكانها باستخدام C&B-Metabond® (باترسون لطب الأسنان). تم تطبيق طلاء الأظافر الأسود على الأسمنت السني لمنع انبعاث الضوء أثناء التحفيز البصري الوراثي.

يزرع القطب. تم تخفيض مجموعة من 7 أقطاب كهربائية دقيقة من التنغستن (~ 1 MΩimpedance) في CA1 الظهرية الممتدة عبر الستراتومبيراميديل (pyr) والطبقة المشععة (rad) والطبقة lacunosummoleculare (lm). كانت البراغي الموضوعة في العظم فوق القشرة الأمامية والمخيخ بمثابة الأرض والمرجع، على التوالي. بعد وضع القطب الكهربائي والأرضي والمرجعي، تم تطبيق الأسمنت السني لتأمين الغرسة بشكل دائم في الجمجمة.

زرع لتصوير الكالسيوم. لقد حقننا فيروس AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL عند 1 nl s−1) في الحصين CA1 باستخدام الإحداثيات التالية: الأمامي الخلفي (AP) - 1.86 مم من bregma، الناصف الجانبي (ML) 1.5 مم، الظهري المركزي (دف) 1.5 ملم. وبعد أسبوعين من الحقن، تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين وتم تطهير الجمجمة. أ<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

تصوير الكالسيوم في وقت واحد والتسجيلات الكهربية. للتحكم في تأثيرات غرسات GRIN على ثيتا الحصين بالإضافة إلى الحديث المتبادل بين مصابيح الإثارة ذات النطاق المصغر ومصابيح الإثارة الضوئية، قمنا بتوصيل أقطاب كهربائية دقيقة من التنغستن إلى عدسات GRIN. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا بوضع عدسات GRIN أفقيًا تحت مجهر منخفض التكبير في بيئة خالية من الغبار. تم وضع قطب كهربائي دقيق من التنغستن بلطف على الحافة العلوية لعدسة GRIN باستخدام معالج دقيق. استخدمنا القطر المعروف لعدسة GRIN كوحدة مرجعية لتقدير النتوء المطلوب للقطب الكهربائي (حوالي 50 ميكرومتر، ويتم تقييمه رقميًا بعد أخذ صورة مجهرية للتحضير) من خلال إحداثيات الزرع المخطط لها. تم ترسيب كميات صغيرة (~ 50 ميكرولتر) من الغراء الفائق على الحافة العلوية لعدسة GRIN مع وضع القطب الكهربائي في مكانه وتركه حتى يجف لمدة 10 دقائق تقريبًا، قبل تطبيق الطبقة التالية من الغراء. تم استخدام خمس طبقات رقيقة للحفاظ على القطب الكهربائي المتصل بعدسة GRIN. بعد زرع مجموعات أقطاب GRIN هذه باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه، تم ثني الأسلاك البارزة بلطف وإخفائها تحت غطاء واقي (ارتفاعه 1-1.5 سم) تم استرجاعه من كمثرى ماصة الشفط اليدوية كبديل لـ Kwik-Sil.

في الإجراءات السلوكية في الجسم الحي

التعود. تم التعامل مع الفئران بلطف لمدة 5 دقائق تقريبًا على مدى أسبوع واحد، مع التعود التدريجي على إجراء التوصيل (الألياف البصرية، والمنظار الصغير، والحبال الكهربية المضخمة مسبقًا). تم بعد ذلك جدولة المياه للحيوانات (ساعتان للوصول يوميًا).

تسجيلات مينيسكوب. تم تجميع Miniscopes (V3) باستخدام تعليمات مفتوحة المصدر (miniscope.org). تم الحصول على بيانات التصوير باستخدام مستشعر التصوير CMOS (Aptina، MT9V032) وتم مضاعفة إرسالها عبر كابل متحد المحور خفيف الوزن. تم الحصول على البيانات باستخدام صندوق الحصول على البيانات (DAQ) المتصل عبر وحدة تحكم مضيف USB (Cypress، CYUSB3013). تم تسجيل سلوك الحيوان باستخدام كاميرا ويب مخصصة للمستهلك (Logitech) مثبتة فوق البيئة. تم تسجيل الكالسيوم والبيانات السلوكية باستخدام برنامج miniscope.org، مصدر DAQ المخصص. حصل DAQ في الوقت نفسه على تدفقات تصوير سلوكية وخلوية بتردد 30 هرتز كملفات غير مضغوطة.avi مكونة من 1000 إطار لجلسات تسجيل دقيقة 15-، إلى جانب الطوابع الزمنية المقابلة لتمكين المحاذاة الزمنية الدقيقة لبيانات التصوير السلوكي والكالسيوم.

في الجسم الحي التسجيلات الكهربية. بعد أسبوع واحد من التعافي بعد الجراحة وأسبوع واحد من التعود على إعداد الربط، تم تسجيل LFP من الفئران المزروعة. تم تضخيم جميع الإشارات المسجلة من الأقطاب الكهربائية المزروعة بواسطة مضخم الصوت المسبق قبل ترقيمها عند 22 كيلو هرتز باستخدام نظام تسجيل رقمي (Neuralynx، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حفظ تسجيلات كل إشارة قناة جنبًا إلى جنب مع تسجيلات الفيديو وإشارات TTL من الصمام الثنائي الليزري للتحليل اللاحق.

التحفيز البصري. تم تسليم التحفيز بالليزر من خلال سلك الألياف الضوئية (قطره 200 ميكرون) باستخدام مصدر ضوء ألياف الصمام الثنائي بالليزر (عدسات دوريك). تمت معايرة شدة الضوء وتصحيح الطول الموجي باستخدام حزمة عداد الطاقة مع وحدة التحكم PM100D وS130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). تم إجراء كل تحفيز للسرعة (بما في ذلك 8 هرتز) باستخدام نبضات مربعة تبلغ 5 مللي ثانية. لتطبيق تحفيز الضوء المخفوق، استخدمنا متحكم Arduino لتوليد إشارة تذبذب ضوضاء بيضاء يتم تغذيتها مباشرة في المدخلات التناظرية لمشغل الصمام الثنائي الليزري. لإجراء تحفيز تردد تم اختياره عشوائيًا، استخدمنا بروتوكول تشغيل قياسي لمدة 5 ثوانٍ وإيقاف تشغيل لمدة 5 ثوانٍ، ولكن لكل عصر تحفيز، استخدمنا متحكم Arduino لتحديد تردد التحفيز بشكل عشوائي في نطاق ثيتا. عند تطبيق التحفيز البصري الوراثي أثناء السلوك، تم تركيب قطعة فضفاضة من أنابيب الانكماش الحراري حول الوصلة بين الحبل المرقعة وزرع حلقة الفأرة للحد من انبعاث الضوء المرئي. يتم التعبير عن شدة الإضاءة كقوة اسمية، كما يتم قياسها عند طرف مجموعة الحبل المزروع بالألياف الضوئية (قبل الوضع الجراحي)، ويتم تصحيحها لطول الموجة المناسب.

المقايسات السلوكية

نغمة خطية متتابعة. تمت جدولة المياه للفئران ولم تتمكن من الوصول إلى المياه إلا لمدة ساعتين يوميًا من الساعة 6 إلى 8 مساءً. لفك التشابك بين الرموز المكانية والزمانية والمسافة، قمنا ببناء مسار خطي بطول 134 سم باستخدام طوب Lego® ذو اللون الرمادي المتوسط، والذي يسمح بإجراء تعديلات وتنفيذ سهلة دون الحاجة إلى استخدام طوب Lego® ذي اللون الرمادي المتوسط. تحتاج إلى تعديل هيكل المتاهة بشكل دائم. تم وضع أجهزة استشعار كهروضوئية عند كل طرف من طرفي المسار الخطي وتم توصيلها بمتحكم Arduino الدقيق. أدى كل اكتشاف إلى ظهور نغمة جديدة بالتسلسل، تشير إلى التقدم المحرز في تسليم المكافأة. تم استخدام النغمات التالية وتسليمها باستخدام مكبر صوت apiezo: إشارة صوتية لمدة ثانية واحدة عند تردد 2000 هرتز، إشارة صوتية مدتها 250 مللي ثانية عند تردد 3000 هرتز، ونغمة مستمرة عند تردد 4000 هرتز. عندما تم إطلاق النغمة المستمرة الأخيرة، تم تسليم مكافأة (10٪ سكروز في الماء) في بداية المسار الخطي في غطاء أنبوب فالكون سعة 15 مل. تم اعتبار التغييرات في اتجاه التشغيل قبل تشغيل النغمة التالية بمثابة أخطاء ولم تؤدي إلى تسليم المكافأة. تم قياس الأداء بقسمة عدد التجارب الصحيحة (بدون خطأ) على عدد التجارب الإجمالية.

التعرف على مكان الكائن الجديد. في اليوم الأول، سُمح للفئران باستكشاف حقل مفتوح رمادي داكن مقاس 45 × 45 سم يحتوي على إشارات مرئية (شبكات أفقية ورأسية بيضاء كبيرة) على جدرانه لمدة 10 دقائق. في اليوم الثاني، تم تقديم جسمين متطابقين (قاعدة يد المساعدة) لمدة 10 دقائق. وفي اليوم الثالث، سمح للفئران باستكشاف نفس الحقل المفتوح بينما تم تغيير موقع أحد الجسمين. للتحكم في تحيزات التفضيل المكانية المحتملة، تم اختيار كل من الموضع الأولي والموضع المزاح للأشياء بطريقة عشوائية. وقد نسبت الفئران ترتيبًا عشوائيًا للاختبار ظل متطابقًا طوال أيام الاختبار الثلاثة. تم تسجيل السلوك بكاميرا فيديو (لوجيتك) وتحليله دون الاتصال بالإنترنت. تم إجراء التحليل السلوكي بشكل أعمى عن النمط الجيني والعلاج. تم تعريف استكشافات الكائنات على أنها العصور التي يكون فيها أنف الفئران على بعد 1 سم من الجسم. تم حساب RI على النحو التالي:

عدم تطابق مؤجل مؤجل مع مهمة العينة. تمت جدولة المياه للفئران وتدريبها في متاهة T مستمرة لمهمة عينة متأخرة غير متطابقة. باختصار، تم تقسيم كل تجربة إلى مرحلتين: العينة والاختبار. في مرحلة العينة، تم حظر ذراع واحدة واضطرت الفئران لاستكشاف الذراع المعاكس، حيث تلقوا 50 ميكرولتر من مكافأة ماء السكروز بنسبة 10٪. بعد الانتهاء من مرحلة العينة، تعرضت الفئران لتأخير (10 ثانية) في حجرة البداية. بعد ذلك، خلال مرحلة الاختبار، يمكن استكشاف كلا الذراعين، ولكن تم طعن الذراع المعاكس (غير المستكشف) فقط، بحيث كان على الفئران التبديل بين المواقع بين مرحلتي العينة والاختبار. تم إخضاع الفئران لعشر تجارب (عينة + اختبار) يوميًا، لمدة 10 أيام متتالية، وتم حساب معدل النجاح اليومي على أنه عدد التجارب الصحيحة مقسومًا على العدد الإجمالي للتجارب.

التحليلات النسيجية بعد الوفاة

بعد الانتهاء من الاختبارات السلوكية، تم تخدير الفئران بعمق باستخدام خليط من الكيتامين/الزيلازين/الأسيبرومازين (100، 16، 3 ملغم/كغم، على التوالي، الحقن داخل الصفاق) وإرواءه عبر القلب باستخدام بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني. تم استخراج العقول وتثبيتها بين عشية وضحاها في PFA عند 4 درجات ثم غسلها في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة إضافية عند 4 درجات. تم تبريد العقول والأقسام في محلول 30٪ جلايكول الإيثيلين، 30٪ جلسرين، و 40٪ برنامج تلفزيوني حتى استخدامها. تم بعد ذلك تقسيم كل دماغ عند 50 ميكرومتر باستخدام مبضع الاهتزاز: تم جمع كل قسم بالتتابع في 4 أنابيب مختلفة سعة 1.5 مل للسماح بتحليلات مختلفة (موقع القطب، الكيمياء المناعية).

علم المناعة. باستخدام أنبوب واحد من أقسام الدماغ التي تم جمعها (أخذ عينات بنسبة 25٪) لكل تحليل، تم غسل المقاطع لمدة 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني لإزالة محلول الحماية من البرد. تم تحضين المقاطع طوال الليل باستخدام PGT (0.45% جيلاتين و0.25% تريتون في PBS) عند 4 درجات. بعد ذلك، تم تحضين الشرائح بالأجسام المضادة الأولية: إما 1:200 غوتانتي-كولين-أسيتيل - نقل من Millipore أو 1: 500 فأر مضاد لـ PVmonoclonal IgG1 من Sigma-Aldrich في PGT عند درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة أو ساعتين على التوالي. بعد الغسل لمدة 10 و20 و30 دقيقة، تم بعد ذلك تحضين المقاطع بأجسام مضادة ثانوية [1: 2000 حمار مضاد للماعز مقترن بـ Alexa 488 أو 1: 500 عنزة IgG1 مضاد للفأر مقترن بـ Alexa 488 (تقنيات الحياة)] في PGT لـ 45 دقيقة. بعد الغسيل لمدة 10،20 و30 دقيقة في برنامج تلفزيوني، تم بعد ذلك تركيب المقاطع على شرائح زجاجية وتم تغطيتها بشكل دائم باستخدام وسيط تركيب Fluoromount الذي يحتوي على DAPI. تم تضمين فقط الفئران مع موضع الغرسات المؤكد تشريحيا في هذه الدراسة. بالنسبة إلى عدسات GRIN، يجب أن يكون سطح العدسة كذلك<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

تحليل البيانات

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 سم ث−1 على المسار الخطي).

التتبع الآلي للسلوك. لاستخراج معلومات حول موضع الفئران وسرعتها واتجاه رأسها، استخدمنا DeepLabCut70,71. باختصار، قمنا بتدريب نموذج للكشف عن آذان الفئران والأنف والجسم وقاعدة الذيل. تم تقدير اتجاه الرأس باستخدام الزاوية بين كل أذن أو الأنف والجسم، اعتمادًا على توفر القياس. تم تحريف بيانات الموقع إلى تردد أخذ عينات تصوير الكالسيوم باستخدام الاستيفاء الخطي. تم استخراج السرعة عن طريق حساب Δd/Δt حيث d هي المسافة والوقت t ثم تم تسهيل النتيجة لاحقًا من خلال تطبيق مرشح Gaussian مع sigma=33 ms لإزالة آثار الكشف. تم استخدام إشارات السرعة لتحديد فترات النشاط الحركي وحساب تعديل المكان والزمان والمسافة للنشاط خصيصًا لتلك الفترات.

تحليل صورة الكالسيوم تم إجراء تحليل بيانات تصوير الكالسيوم باستخدام MATLAB 2020a وPython 3.8.4. تم تحليل تسجيلات الفيديو باستخدام خط أنابيب تحليل Miniscope (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnapsy). باختصار، تم تطبيق تصحيح الحركة الصارم (الدوران والترجمة) باستخدام NoRMCorre72، وتم تقليص حجم مقاطع الفيديو مكانيًا (3 ×) قبل التسلسل. تم استخراج آثار الكالسيوم باستخدام CNMFe51 باستخدام المعلمات التالية: gSig=3 بكسل (عرض النواة الغوسية)، gSiz=20 بكسل (قطر العصبون التقريبي)، الخلفية _ النموذج='حلقة'، خوارزمية مكانية _='hals'، الحد الأدنى_corr=0.8 (الحد الأدنى لعتبة ارتباط البكسل)، الحد الأدنى _PNR {{17 }} (الحد الأدنى لنسبة الذروة إلى الضوضاء).

تمت تصفية آثار الكالسيوم الخام لإزالة التقلبات عالية التردد وتم تحويلها إلى ثنائي: باختصار، تم اعتبار الخلايا العصبية نشطة عندما تجاوزت سعة إشارة الكالسيوم الطبيعية انحرافين معياريين، وكان المشتق من الدرجة الأولى أعلى من 0 (انظر المرجع 52 للحصول على تفاصيل إضافية على المنهجية52). لاستخراج ضبط الخلايا العصبية لمتغيرات محددة، تم إهمال الموقع والوقت والمسافة (الموقع: صناديق 3 سم؛ الوقت: صناديق 1 ثانية؛ المسافة: صناديق 3 سم). ومن خلال الإشارات الثنائية، قمنا بحساب الاحتمال الهامشي لأن تكون الخلايا نشطة والتي نستخدمها كبديل للنشاط العصبي. والأهم من ذلك، أننا نقوم بعد ذلك باستخلاص احتمالية النشاط أو "احتمال النشاط نظرًا لحالة المتغير" PA j Si باستخدام المتغيرات المحذوفة:

حيث M هو العدد الإجمالي للحالات السلوكية المحتملة، وP(Si∩Aj) هو الاحتمال المشترك لوجود الحيوان في الصندوق I بالتزامن مع مستوى النشاط j (0 أو 1). لتقييم أهمية قيمة MI التي تم الحصول عليها، قمنا بعد ذلك بإنشاء 1000 بديل عشوائي باستخدام التباديل الدائرية العشوائية. لقد اخترنا التباديل الدائرية لأنها تزيل العلاقة الزمنية بين نشاط الخلايا العصبية وسلوكها، مع الحفاظ على البنية الزمنية لنواقل الكالسيوم، وبالتالي تؤدي إلى نتائج أكثر تحفظًا (على عكس التوزيع العشوائي الكامل لكل نقطة بيانات، مما يؤدي إلى تضخيم قيمة أهمية النتائج). نظرًا لأن البدائل المختلطة لم يتم توزيعها بشكل طبيعي بشكل منهجي، فقد استخدمنا نهجًا غير معلمي حيث تتوافق القيمة p (pN) مع عدد نقاط البيانات من التوزيع العشوائي الذي يكون أكبر من البيانات الفعلية لكل صندوق، مقسومًا على عدد التباديل52، 73.

لتحديد تعديل الخلايا عن طريق التحفيز البصري الوراثي، استخدمنا نهجًا مشابهًا ولكننا قمنا بحساب MI بين النشاط العصبي وإشارات التحفيز الثنائية (وبالتالي تم التعامل معها كحالة سلوكية). ثم تم استخدام نفس إجراء الخلط الدائري لاستخراج الأهمية الإحصائية.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 سم ث−1، تم إنشاء مجموعة بيانات التدريب باستخدام 90٪ من البيانات. وتم استخدام الـ 10% المتبقية من البيانات للاختبار. تم حساب خطأ في فك التشفير باستخدام 50 بديلاً مبدئيًا ومجموعة مكونة من 160 خلية باستخدام نقاط بيانات تم اختيارها عشوائيًا مع الاستبدال. من المفترض أن تكون كل خلية عصبية مستقلة عن بعضها البعض، وهذا ليس هو الحال عمليًا ويؤدي إلى أخطاء أكبر في إعادة البناء، ولكنه يقلل من الوقت الحسابي. تم اشتقاق الاحتمال الخلفي للمجتمع من المعادلة التالية:

تتبع الخلايا على مدى عدة أيام. تم تتبع الخلايا العصبية على مدار عدة أيام باستخدام CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). باختصار، تمت محاذاة البصمات المكانية باستخدام المحاذاة الصارمة لتصحيح عمليات التدوير والترجمات. بعد المحاذاة، اعتبرنا مجموعات الخلايا المرشحة هي نفس الخلايا العصبية إذا كانت المسافة القصوى لها<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

التحليل الكهربي. تم إجراء تحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام MATLAB 2020a باستخدام كل من معالجة الإشارات بالإضافة إلى صندوق أدوات المويجات. تم تطبيق التواء المويجات على إشارات LFP باستخدام مويجات Morlet المعقدة ('cmor1–1.5' في MATLAB) عندما كانت دقة مجال الوقت والتردد مطلوبة. تم استخدام تحريك نافذة فورييه (نافذة 2 ثانية في نطاق ثيتا، نافذة 5 ثوان في نطاق جاما، خطوات متحركة 10 مللي ثانية) عندما تم تمييز دقة مجال التردد على دقة المجال الزمني (على سبيل المثال، التردد السائد في أعلى السطح عند السرعة باستخدام علم البصريات الوراثي). تم إجراء تحليل الكثافة الطيفية للطاقة عندما كانت الفئران تعمل عند 5 سم ث −1 أو أعلى ما لم ينص على خلاف ذلك.

قوة التذبذب. تم حساب نظام التشغيل على أنه نسبة الكثافة الطيفية للطاقة التراكمية حول تردد ذروة التذبذب ± 1 هرتز إلى قدرة النطاق التراكمي في نطاق ثيتا (4-12 هرتز). يصبح هذا المقياس 1 عندما تقع كل الكثافة الطيفية للقدرة ضمن تردد ذروة التذبذب (على سبيل المثال 8 هرتز في حالة التحفيز عند هذا التردد).

كشف وتحليل SWRs. لمراقبة SWRs، تم السماح للفئران باستكشاف حقل مفتوح بحرية لمدة 10 دقيقة أثناء التسجيل. تم إجراء التحفيزات (المخلوطة أو 8 هرتز) باستخدام نموذج 5 s ON و 5 s OFF. تم أخذ فترات الراحة الهادئة في الاعتبار فقط للتحليل. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا بحساب نسبة z المسجلة لقدرة ثيتا/دلتا بعد التصفية لكل نطاق تردد، وإجراء تحويل هيلبرت، والفترات التي تم النظر فيها فقط حيث كانت القيمة الناتجة أقل من 0. للكشف عن SWRs، قمنا بتصفية إشارات LFP في النطاق 150-250 نطاق التردد هرتز وبعد ذلك سجل Z. تم اكتشاف التموجات باستخدام دالة findpeaks في MATLAB، مع المعلمات التالية: العتبة=4 sd، minpeakwidth=0 s، minpeakdistance=0.03 s.

مراجع

1. كولجين، LL إيقاعات شبكة الحصين. نات. القس نيوروسكي. 17، 239-249 (2016).

2. Tóth، K.، Freund، TF & Miles، R. إزالة تثبيط خلايا الحصين الهرمية للفئران بواسطة عناصر GABAergic من الحاجز. J. Physiol.500، 463-474 (1997).

3. Unal، G.، Joshi، A.، Viney، TJ، Kis، V. & Somogyi، P. أهداف متشابكة لإسقاطات الحاجز الإنسي في الحصين والقشرة خارج الحصين للماوس. جيه نيوروسي. 3515812–15826 (2015).

4. سيمون، أ.ب.، بونديسوس-جزات، ف.، دوتار، ب.، إيبلباوم، ج. وباسانت، م.-هـ. خصائص إطلاق الخلايا العصبية التي تم تحديدها تشريحيا في الحاجز الإنسي للفئران المقيدة المخدرة وغير المخدرة. جيه نيوروسي. 26، 9038-9046 (2006).

5. سكوتي، F. وآخرون. الخصائص الفيزيولوجية الكهربية المميزة للخلايا العصبية الحاجزية الحصينية للفئران الجلوتاماتيرجيكية والكولينية والغابايرجيكية: آثار جديدة على إيقاع الحصين. جي فيسيول. 551,927–943 (2003).

6. Manseau، F.، Danik، M. & Williams، S. شبكة عصبية جلوتاماتيرجيكية وظيفية في الحاجز الإنسي ومنطقة الشريط القطري. جي فيسيول. 566، 865–884 (2005).

7. أملهون، ب. وآخرون. Parvalbumin interneurons من النشاط السكاني لضبط الحصين على تردد ثيتا. الخلايا العصبية 86، 1277-1289 (2015).

8. إتر، ج. وآخرون. تحفيز غاما البصري ينقذ ضعف الذاكرة في نموذج الفأر المصاب بمرض الزهايمر. نات. مشترك. 10، 1–11 (2019).

9. زوتشي، آي وآخرون. تستجيب الدوائر العصبية الحصينية للإيقاع البصري الوراثي لترددات ثيتا عن طريق توليد ترددات تذبذب متسارعة. العملة. بيول. 28، 1179-1188.e3 (2018).

10. بندر، F. وآخرون. تنظم تذبذبات ثيتا سرعة الحركة عبر مسار الحاجز من الحصين إلى الجانبي. نات. مشترك. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com