الجزء 1: Acteoside يتعارض مع إنترلوكين -1 - عمليات تقويضية مستحثة من خلال تعديل كينازات البروتين المنشط بالميتوجين ومسار الإشارات الخلوية NFκB

يتعارض Acteoside مع إنترلوكين -1 - عمليات تقويضية مستحثة من خلال تعديل كينازات البروتين المنشط بالميتوجين ومسار الإشارات الخلوية NFκB

HyangI Lim، 1 Do Kyung Kim، 1 Tae-Hyeon Kim، 1 Kyeong-Rok Kang، 1 Jeong-Yeon Seo، 1،2 Seung Sik Cho، 3 Younghee Yun، 4،5 Ye-yong Choi، 4،5 Jungtae Leem ، 4،5 Hyoun-Woo Kim، 6 Geon-Ung Jo، 6

Chan-Jin Oh ، 6 Deuk-Sil Oh ، 6 Hong-Sung Chun ، 2 و Jae-Sung Kim 1

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com

1 معهد علوم الأسنان ، جامعة تشوسون ، جوانجو 61452 ، جمهورية كوريا

2 أقسام العلوم الطبية الحيوية ، جامعة تشوسون ، جوانجو 61452 ، جمهورية كوريا

3D قسم الطب الحيوي ، علوم تقارب الصحة والحياة ، BK21 Four ، كلية الصيدلة ، جامعة موكبو الوطنية ،

جيونام 58554 ، جمهورية كوريا

4 معهد تشونغ يون الطبي ، جوانجو 61949 ، جمهورية كوريا

5Research and Development Institute، CY Pharma Co.، Seoul 06224، Republic of Korea

6 معهد جيولانامدو لموارد الغابات ، ناجو ، جيولانامدو ، 58213 ، جمهورية كوريا

يجب توجيه المراسلات إلى Jae-Sung Kim ؛ js _ kim@chosun.ac.kr

تم استلامه في 2 يوليو 2020 ؛ تمت المراجعة في 15 فبراير 2021 ؛ تم القبول في 6 مارس 2021 ؛ تم النشر في 25 مارس 2021

المحرر الأكاديمي: Joël R. Drevet

حقوق النشر © 2021 HyangI Lim et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه ضمن CreativeCommonsAttributionLicense ،

الذي يسمح بالاستخدام والتوزيع غير المقيدوالاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.

يمكن علاج أمراض الكلى وتحسين وظائف الكلى

هشاشة العظام (OA) هي أكثر أمراض المفاصل التنكسية شيوعًا مع آلام المفاصل المزمنة الناتجة عن التنكس التدريجي للغضروف المفصلي في المفاصل الزليليّة.أكتوسيد، جليكوسيد ca eoylphenylethanoid glycoside ، له أنشطة بيولوجية مختلفة مثل مضادات الميكروبات ، ومضاد in-nadatory ، ومضاد للسرطان ، ومضادات الأكسدة ، و cytoprotective ، والتأثيرات العصبية. علاوة على ذلك ، تناوله عن طريق الفمأكتيوسيدبجرعة عالية لا يسبب سمية جينية. لذلك ، فإن الهدف من هذه الدراسة هو التحقق من التأثيرات المضادة للتقويضأكتيوسيدضد هشاشة العظام ومسار إشاراته المضادة للتقويض.أكتوسيدلم تقلل من قابلية خلايا الفئران L929 التي تستخدم في خلايا الفئران الطبيعية والخلايا الغضروفية الأولية للجرذان.أكتوسيدتصدت لـ IL -1 - فقدان البروتيوغليكان المستحث في الخلايا الغضروفية والغضروف المفصلي عن طريق قمع التعبير وتفعيل الإنزيمات المهينة للغضروف مثل مصفوفة البروتين المعدني- (MMP-) 13 و MMP -1 و MMP {{ 6}}. بالإضافة إلى،أكتيوسيدمنع التعبير عن الوسطاء الداخليين مثل سينثاز أكسيد النيتريك المحرض ، وانزيمات الأكسدة الحلقية -2 ، وأكسيد النيتريك ، والبروستاغلاندين E2 في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المعالجة بـ IL -1. بعد ذلك ، انخفض التعبير عن السيتوكينات الطليعية بمقدارأكتيوسيدفي الخلايا الغضروفية للجرذان الأولية المعالجة بـ IL -1. علاوة على ذلك ، فإن الأكتوزيد لم يقمع فقط فسفرة كينازات البروتين المنشط بالميتوجين في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المعالجة بـ IL -1 ولكن أيضًا منع انتقال NFκB من العصارة الخلوية إلى النواة من خلال قمع الفسفرة. أدى تناول 5 و 10 ملجم / كجم أكتيوسيد عن طريق الفم إلى تخفيف التدهور التدريجي للغضروف المفصلي في نموذج الفأر المصاب بالتهاب المفاصل الناتج عن زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن أكتيوسيد هو عامل واعد محتمل مضاد للتقويض أو مكمل لتخفيف أو منع التنكس التدريجي للغضروف المفصلي.

الرجاء النقر هنا للجزء 2

1 المقدمة

هشاشة العظام (OA) هي أكثر أمراض المفاصل التنكسية شيوعًا مع آلام المفاصل المزمنة الناتجة عن التنكس التدريجي للغضروف المفصلي في المفاصل الزليليّة [1].

بسبب الزيادة في متوسط ​​العمر المتوقع ، فإن انتشار التهاب المفاصل مع فقدان الحركة وآلام المفاصل المزمنة الناتجة عن التنكس التدريجي للغضروف المفصلي في المفاصل الزليلي يُقدر بنسبة 18 في المائة و 9.6 في المائة لدى النساء بعد انقطاع الطمث وعند الرجال ، على التوالي [2 ]. على الرغم من زيادة انتشار التهاب المفاصل في جميع أنحاء العالم سنويًا ، إلا أن المسببات الفيزيولوجية المرضية للزراعة العضوية لا تزال غير معروفة. قد يكون ناتجًا عن عوامل خطر معقدة للغاية ومتعددة العوامل مثل الشيخوخة والجنس والميراث الجيني وإصابة المفاصل الرضحية وحمل المفصل الميكانيكي الشديد. علاوة على ذلك ، فإن العلاقات العصبية المرضية بين التنكس التدريجي للغضروف المفصلي وتطور آلام المفاصل المزمنة غير معروفة [3]. ومن ثم ، فإن الهدف من الإدارة السريرية للمرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل هو الحفاظ على حركة الجسم ووظيفة المفاصل الميكانيكية من خلال التخفيف من آلام المفاصل المزمنة ، باستخدام الأساليب الدوائية وغير الدوائية وجراحة استبدال المفاصل. يتزايد الطلب على تطوير تدخل فعال أو مكملات ، مع سلامة بيولوجية طويلة الأجل ، لمنع أو التخفيف من الزراعة العضوية للحفاظ على جودة الحياة من خلال الحفاظ على وظيفة المفاصل الميكانيكية في السكان المسنين.

كما هو مبين في الشكل 1 ،أكتيوسيد(رقم سجل المستخلصات الكيميائية 61276-17-3 ؛ C29H36O15) عبارة عن جليكوسيد ca eoylphenylethanoid معزول من عدة نباتات عشبية مثل كلوريد فيرباسكوم [4] ، بودليجا جلوبوسا [5] ، وبلانتاجو أستراليا [6]. يحتوي Acteoide على أنشطة بيولوجية مختلفة مثل مضادات الميكروبات [5] ، ومضاد الإنزيم [7] ، ومضاد السرطان [8] ، ومضاد الأكسدة [9] ، والحماية الخلوية [9] ، وتأثير الحماية العصبية [10]. علاوة على ذلك ، تناوله عن طريق الفمأكتيوسيدبجرعة عالية لا يسبب السمية الجينية [11].

ومن ثم ، افترضنا أن الأكتوزيد ذو السلامة البيولوجية المضادة للالتهاب له تأثيرات مضادة للتقويض مرتبطة بحماية الغضروف المفصلي من التدهور التدريجي للغضروف المفصلي من خلال قمع العوامل التقويضية مثل السيتوكينات الطليعية ، والوسطاء الذكوريين ، والإنزيمات المتزامنة الغضروفية في المفصل. . لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق فيأكتيوسيد-التأثيرات المضادة للتقويض المستحثة ومسار الإشارات الخلوية في المختبر ، باستخدام الخلايا الغضروفية الأولية المعزولة من الغضروف المفصلي لمفصل ركبة الفئران ، وفي الجسم الحي ، باستخدام نموذج حيواني OA تم إنشاؤه عن طريق زعزعة الاستقرار الجراحي للغضروف الإنسي في مفصل الركبة لدى الفئران.

أكتيوسيدفيcistancheيستطيعتحسنحصانة

2. الطرق

2.1. زراعة الخلايا.

تم عزل الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان من الغضروف المفصلي للجرذ (5- مفاصل الركبة بعمر يوم ؛ سبراغ داولي) ، وفقًا للبروتوكول (CIA- CUC 2019- A0027) المعتمد من قبل المؤسسة لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة تشوسون ، جوانجو ، جمهورية كوريا. تم الحفاظ على الغضروفية المعزولة للجرذان الأولية في خليط Dulbecco Modi ed Eagle المتوسط/المغذيات F -12 (DMEM/F12) (Thermo Scienti ، Ford ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) المكملة بنسبة 10 في المائة من السير البوفيني الجيني (FBS) ، جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، مضادات حيوية (50U / مل بنسلين و 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك. تم شراء خط خلية الماوس العادي L -929 من American Type Culture Collection (ATCC). وفقًا للتعليمات المقدمة من ATCC ، تمت زراعة خلايا L -929 في الوسط الأساسي الأدنى لـ Eagle ، والذي يحتوي على 10 بالمائة من FBS ، ونُمت في حاضنة رطبة عند 37 درجة مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

2.2. فحص جدوى الخلية

تم إجراء مقايسة ملح ثنائي ميثيل ثيازوليل ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) لتقييم جدوى خلايا خط خلايا أجنة الفئران L929 المستخدمة كخلية طبيعية وخلايا غضروفية أولية للجرذان تمت معالجتها باستخدام أكتيوسيد. تم تربيتها بخلايا Brie y و L929 وخلايا الفئران الأولية بكثافة خلية 8 × 105 خلايا/مل في لوحات الثقافة لمدة 24 ساعة ثم تعامل مع 2.5 و 5 و 10 و 25 و 50 و 100 ميكرومترأكتيوسيدلمدة 24 ساعة. بعد العلاج بمحلول MTT ، تمت زراعة كل من خلايا L929 والخلايا الغضروفية لمدة 4 ساعات. بعد الحضانة ، تم تعليق بلورات MTT المتكونة بالكامل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد وتم قياسها للامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف (مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة ، BioTek® ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقييم قابلية الخلية للحياة.

2.3 فحص الخلية الحية / الميت.

تم إجراء بقاء الخلية باستخدام مجموعة فحص الخلية الحية / الميتة (مجسات جزيئية ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والتي تتكون من كالسين- AM الأخضر لوضع العلامات على الخلايا الحية (مع تألق أخضر) ومُجانس إيثيديوم -1 لوضع العلامات الميتة الخلايا (ذات التألق الأحمر). تم تربيتها بكثافة خلية تبلغ 8 × 105 خلايا/مل ، كل من خلايا L929 وخلايا الفئران الأولية. 50 و 100 ميكرومتر أكتيوسيد لمدة 24 ساعة. بعد الزراعة ، تم إجراء اختبار بقاء الخلية وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ذلك ، تم تصوير الخلايا الملطخة باستخدام مجهر الإيقاع (Eclipse TE200 ؛ Nikon Instruments ، ميلفيل ، نيويورك).

2.4 فحص ثنائي ميثيل الميثيلين الأزرق (DMMB).

تم إجراء فحص DMMB لتقييم تغيير محتوى البروتيوغليكان في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية التي عولجت بالأكتيوسايد لمدة 21 يومًا في وجود أو عدم وجود IL -1. للحفاظ على خصائص الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان لمدة 21 يومًا ، تم تعليق الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان (2 × 10 خلايا) في 1 مل من 1.2 بالمائة من الجينات ثم تغليفها بتقطير تعليق الخلية / الألجينات إلى محلول 105 ملي مولار CaCl2. تمت زراعة الخلايا الغضروفية الأولية للفئران المغلفة في الجينات لمدة 24 ساعة في DMEM / F12 (تحتوي على 10 بالمائة FBS ، 50U / مل بنسلين ، 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك) ثم تم تكييفها لمدة 24 ساعة في DMEM / F12 تحتوي على 1 بالمائة الأنسولين المصغر - الترانسفيرين - السيلينيوم (mini-ITS) و 50 ميكروغرام / مل من حمض الأسكوربيك. بعد ذلك ، عولجت الخلايا الغضروفية بـ 50 أو 100 ميكرومترأكتيوسيدفي وجود أو عدم وجود 1ng / mL IL -1 لمدة 21 يومًا. في اليوم الحادي والعشرين ، تم جمع الخلايا الغضروفية الأولية للفئران لتقييم محتوى البروتيوغليكان باستخدام مقايسة DMMB ، كما هو موضح سابقًا [12]. بالإضافة إلى ذلك ، لقياس محتوى البروتيوغليكان لكل خلية وتقييم تكاثر الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان ، تم قياس أرقام الخلايا عن طريق فحص الحمض النووي باستخدام PicoGreen (مجسات جزيئية ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 7 أيام. في نهاية فترة الاستزراع ، تم جمع العينات وتثبيتها في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 72 ساعة للتحليل النسيجي.

2.6. التحليل النسيجي.

تم إجراء التحليل النسيجي باستخدام safranin-O والتلوين الأخضر السريع للتحقق من فقدان البروتيوغليكان في الغضروف المفصلي المعالج بـ 100 ميكرومتر من أكتيوسيد في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 7 أيام. كانت عينات الغضروف المفصلي المفصلي ، محددة في حمض الإيثيلينيتيليتيتريتيك ، ثم مضمّن في الفكر. بعد ذلك ، تم تقطيع كتل الفقرة المحضرة المحتوية على غضروف مفصلي بشكل متسلسل إلى سمك 5 ميكرومتر ووضعها على شرائح. تم إجراء Safranin-O والتلوين الأخضر السريع لاحقًا لتقييم فقدان البروتين الجليكان في المادة الأرضية للغضروف المفصلي. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين لمراقبة التشكل العام للغضروف المفصلي.

2.7. النشاف الغربي.

تم إجراء النشاف الغربي للتحقيق في التعبير عن العوامل التقويضية بما في ذلك MMP -13 و MMP -1 و MMP -3 وسينثاز أكسيد النيتريك المستحث (iNOS) وانزيمات الأكسدة الحلقية -2 (COX -2) وتغيير جزيئات الإشارات الخلوية مثل كينازات البروتين المنشط بالميتوجين والعامل النووي كابا ب (NFκB). تم علاج الخلايا الغضروفية الأولية الفئران مع 50 أو 100μm acteoside في وجود أو عدم وجود 10ng/ml il -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم حصاد الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان عن طريق الطرد المركزي وتم تحللها باستخدام أداة التحلل (تقنية تشوير الخلايا ، دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بالإضافة إلى ذلك ، للتحقق من النقل النووي لـ NFκB ، عولجت الخلايا الغضروفية الأولية للفئران بـ 50 أو 100 ميكرومتر من Acteoside في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم استخراج الكسور الخلوية والنووية باستخدام NE-PER ™ كواشف الاستخلاص النووية والهيولية (Thermo Sci- enti c ، Rockford ، IL ، USA) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد تركيز البروتين الكلي المستخرج من الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسينشونينيك (Thermo Scienti c ، Rockford ، IL ، USA) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. بالإضافة إلى ذلك ، تم جمع الوسط المكيف للكشف عن مستويات الإنزيمات المهينة للغضروف التي تفرز من الخلايا الغضروفية. تم إرسال كميات متساوية من البروتين والوسط المكيف بالكهرباء على هلام الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) ثم نقلها إلى أغشية النيتروسليلوز. بعد ذلك ، تم إجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الأولية المستهدفة ضد MMP -13 ، MMP -1 ، MMP -3 ، iNOS ، COX -2 ، phospho-ERK1 / 2 ، المجموع -ERK1/2 ، Phospho-P38 ، Total-P38 ، Phospho-JNK ، Total JNK ، Phospho-NFκB ، Total NFκB ،-Actin ، و Lamin B. ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة ثم تم تصويرها بواسطة جهاز Microchemi (DNR Bioimaging Systems ، القدس ، إسرائيل).

2.8. تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) و تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).

عولجت الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان بـ 50 أو 100 ميكرومترأكتيوسيدفي وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا الغضروفية للفئران الأولية باستخدام كاشف TRIzol (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم قياس إجمالي تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام NanoDrop 2000 (Thermo Scienti c، Rockford، IL، USA). لتجميع cDNA ، تم نسخ 1ug RNA عكسيًا باستخدام نظام النسخ العكسي ThermoScript-PCR (Invitro- gen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء qPCR لـ cDNA باستخدام 2 × TOPsimple ™ DyeMIX-Taq (Enzynomics ، سيول ، جمهورية كوريا) وأشعال محددة على جهاز TaKaRa PCR الحراري Cycler (TaKaRa Bio Inc. ، Shiga ، اليابان). بعد ذلك ، تم إمداد منتجات PCR بالكهرباء على هلام agarose لتحديد مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة. تم استخدام Glyceraldehyde 3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH) كعنصر تحكم داخلي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لـ qRT-PCR ، تم تضخيم cDNA باستخدام نظام Eco ™ Real-Time PCR (شركة Illumine Inc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). - تم استخدام الأكتين كعنصر تحكم داخلي. تم تلخيص تسلسل البادئات المستخدمة في qPCR و qRT-PCR في الجدولين 1 و 2 على التوالي.

2.9 الجيلاتين Zymography.

تم إجراء الجيلاتين zymography لتقييم تنشيط MMPs في الخلايا الغضروفية الفئران الأولية. Brie y y ، عولجت chondrocytes الفئران الأولية بـ 5 0 أو 1 0 0 μM acteoside في وجود أو عدم وجود 10ng/ml il -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم فصل حجم متساوٍ من الوسط المكيف بالكهرباء على هلام بولي أكريلاميد 10 بالمائة مشترك مع 0.2 بالمائة (1 مجم / مل) من جيلاتين جلد الخنازير. بعد الرحلان الكهربي ، تم تحضين الهلام في الزيموجرام لإعادة المعالجة (50 ملي مولار تريس- حمض الهيدروكلوريك (pH7.6) ، 10 ملي مول كلوريد الكالسيوم ، 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 0.05 بالمائة بريج -35) عند 37 درجة لمدة 72 ساعة. بعد إعادة تشبع MMPs ، تم تلوين الجل بنسبة 0.1 بالمائة Coomassie Brilliant Blue R250. تم الكشف عن الأشرطة الجيلاتينية على أنها أشرطة شفافة على خلفية ملونة بشكل موحد باللون الأزرق الفاتح ثم تم تصويرها باستخدام كاميرا رقمية.

2.10. قياس أكسيد النيتريك (NO).

تم علاج الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان باستخدام 50 أو 100 ميكرومتر من Acteoside في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم تفاعل 50 ميكرولتر من الوسط المكيف مع 50 ميكرولتر من كل من السلفانيلاميد و N -1- naphthyl ethylenediamine dihydrochloride. تم قياس الامتصاصية بعد ذلك بطول موجة 540 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي (مقياس الطيف الضوئي Epoch ، BioTek ، Winooski ، VT ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.11. فحص البروستاجلاندين E2 (PGE2).

عولجت الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان بـ 50 أو 100 ميكرومترأكتيوسيدفي وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم قياس تركيز PGE2 باستخدام مجموعة مقايسة معلمة PGE2 (R&D Systems Inc. ، Minneapolis ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة.

2.12. صفيف السيتوكين.

تم علاج الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان باستخدام 50 ميكرومتر من Acteoside في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم استخلاص البروتينات الكلية وقياسها كما هو موصوف سابقًا [13]. بعد ذلك ، تم إجراء مجموعة من السيتوكينات للتحقيق في التغيير في إنتاج السيتوكين ، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (RayBiotech ، Inc. ، Norcross ، GA ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.13. فحص النقل النووي.

عولجت الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان بـ 50 و 100 ميكروغرام / ملأكتيوسيدفي وجود 1 0 ng / mL IL -1. بعد 30 دقيقة ، تم تشديد الخلايا الغضروفية الأولية للفئران بنسبة 1 في المائة من بارافورمالدهيد ، وتم نفاذها في 0.2 في المائة من تريتون X -100 ، وغسلها على نطاق واسع بمحلول ملحي بالفوسفات. تم حظر الإشارات غير النوعية باستخدام مصل الماعز العادي. بعد غسلات متعددة ، تم تحضين الخلايا الغضروفية مع الأجسام المضادة لـ NFκB للأرانب تليها الحضانة مع IgG المضادة للأرنب (Thermo Fisher Scienti ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بين عشية وضحاها في 4 درجات. بعد ذلك ، تم تصوير الخلايا الملطخة باستخدام نظام مجهر مسح متحد البؤر بالليزر (Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا) في فرع Gwangju من معهد كوريا للعلوم الأساسية (Gwangju ، جمهورية كوريا).

2.14. جيل من الحيوانات العظمية.

لإنشاء حيوانات هشاشة العظام ، تم زعزعة استقرار الغضروف الإنسي (DMM) جراحيًا في مفاصل الركبة لفئران BALB / c (متوسط ​​وزن الجسم 19: 3 ± 0: 5 جم) وفقًا لإرشادات IACUC (CIACUC {{4} } A0029). تمت معالجة الحيوانات المستحثة بالزراعة العضوية عن طريق الفم باستخدام 5 و 10 ملجم / كجم أكتيوسيد محلول في 5 في المائة من الإيثانول (مجموعة تجريبية ؛ n =5) أو مركبة (5 في المائة من الإيثانول) (مجموعة DMM ؛ n =5) كل يوم آخر لمدة 8 أسابيع. في نهاية فترة الاستنبات ، تم تشريح مفاصل الركبة وتشريحها باستخدام 5 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 7 أيام لإجراء التقييمات النسيجية. بعد safranin-O والأنسجة المصوَّرة ذات الصبغة الخضراء السريعة للغضروف المفصلي تم فحصها وفقًا لدرجة مانكين [14 ، 15].

2.15. تحليل احصائي.

تم تقديم البيانات التجريبية على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري وتمت مقارنتها باستخدام تحليل التباين ، متبوعًا بمقارنات متعددة لاحقة (اختبار Tukey) باستخدام برنامج SPSS الإصدار 25 (IBM Corp.) تم الحصول على جميع البيانات ، باستثناء دراسة الحيوانات. من ثلاث تجارب مستقلة.

أكتيوسيدفيcistanche

3. النتائج

3.1. لا يؤثر Acteoside على خلية L929 وحيوية خلية غضروفية الفئران الأولية.

تم التعامل مع خط الخلية L929 الخاص بالماوس المستخدم كخلايا طبيعية باستخدام أكتيوسيد 2.5 و 5 و 10 و 25 و 50 و 100 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار MTT لتقييم السمية الخلوية للأكتيوسايد على خلايا L929. كما هو موضح في الشكل 2 (أ) ، تم تحديد قابلية البقاء النسبية لخلايا L929 لتكون 94: 8 ± 8 بالمائة ، 93: 6 ± 7 بالمائة ، 100 ± 5 بالمائة ، 103: 9 ± 5 بالمائة ، 126: 1 ± 8 بالمائة ، و 122: 7 ± 4 في المائة عند 2.5 و 5 و 10 و 25 و 50 و 100 ميكرومتر أكتيوزيد ، على التوالي ، مقارنة بالتحكم (100: 02 ± 3 بالمائة). علاوة على ذلك ، للتحقق من السمية الخلوية لأكتيوسيد على الخلايا الغضروفية للجرذان الأولية ، تم إجراء فحص MTT كما هو موضح في الشكل 2 (ب). تم تحديد قابلية الخلايا الغضروفية للجرذان الأولية المعالجة بـ 2.5 و 5 و 10 و 25 و 50 و 100 ميكرومتر أكتيوسيد على أنها 114 ± 4 بالمائة ، 117: 8 ± 6 بالمائة ، 123: 9 ± 5 بالمائة ، 132: 6 ± 4 بالمائة ، 153: 1 ± 7 بالمائة ، و 142: 1 ± 6 بالمائة ، على التوالي ، مقارنةً بالتحكم (100: 4 ± 5 ​​بالمائة). علاوة على ذلك ، لتأكيد تأثير الأكتيوسايد على صلاحية كل من خلايا L929 والخلايا الغضروفية الأولية للجرذان ، تم إجراء فحص الخلية الحية / الميتة كما هو موضح في الشكل 2 (ج). لم يزد عدد الخلايا الميتة الملطخة باللمعان الأحمر لكل من خلايا L929 وخلايا غضروفية الفئران الأولية التي عولجت بـ 50 و 100 ميكرومتر من Acteoside لمدة 24 ساعة. أظهرت هذه البيانات باستمرار أن الجرعة المحددة منأكتيوسيدلم يؤثر على جدوى خلايا L929 وخلايا غضروف الفئران الأولية. وهكذا ، تم استخدام 50 ميكرومتر أكتيوسيد و 100 ميكرومتر أكتيوسيد ، وهما جرعات غير سامة في كل من خلايا L929 والخلايا الغضروفية الأولية للجرذان ، للتحقق من آثاره المضادة للتقويض في الدراسات المختبرية باستخدام الخلايا الغضروفية الأولية للجرذان.

3.2 يتعارض Acteoside مع IL -1 - فقدان البروتيوغليكان المستحث في الخلايا الغضروفية للجرذان الأولية.

عولجت الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المضمنة في خرز الجينات بـ 50 و 100 ميكرومتر من الأكتوزيد في وجود أو عدم وجود 1ng / mL IL - 1 لمدة 21 يومًا. بعد ذلك ، تم إجراء اختبار DMMB لتقييم التغيير في محتوى البروتيوغليكان كما هو موضح في الشكل 3 (أ). تم تحديد محتويات البروتيوغليكان النسبية على أنها 88: 3 ± 18: 1 بالمائة و 86: 8 ± 16: 3 بالمائة في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المعالجة بـ 50 و 100 ميكرومتر أكتيوسيد ، على التوالي ، مقارنةً بالتحكم (103: 8 ± 32: 3 في المائة). على الرغم من انخفاض محتويات البروتيوغليكان النسبية بواسطة الأكتوزيد ، إلا أن هذه النتائج لم تكن مهمة. ومع ذلك ، انخفض المحتوى النسبي للبروتيوغليكان بشكل ملحوظ بنسبة 37: 1 ± 14: 7 في المائة في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المعالجة بـ 1 نانوغرام / مل IL -1 ، ولكن 50 و 100 ميكرومتر أكتيوسيد قلل بشكل ملحوظ محتوى البروتيوغليكان بنسبة 57 ± 12: 4 بالمائة و 64 ± 14: 5 بالمائة ، على التوالي ، بوجود 1ng / mL IL -1. بعد ذلك ، للتحقق مما إذا كان الأكتيوسايد يثبط فقدان البروتيوغليكان الناجم عن IL -1 - ، تمت معالجة الغضروف المفصلي الذي تم تشريحه من مفاصل ركبة الفئران باستخدام أكتيوزيد 100 ميكرومتر في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 7 أيام. بعد ذلك ، تم إجراء التقييمات النسيجية باستخدام تلطيخ H&E و safranin-O وتلطيخ أخضر سريع كما هو موضح في الشكل 3 (ب). لم يلاحظ التغيير المورفولوجي باستخدام تلطيخ H&E ؛ ومع ذلك ، أظهر Safranin-O والتلوين الأخضر السريع أن البروتيوغليكان الملون مثل اللون الأحمر لم يتغير في الغضاريف المفصلية المعالجة بـ 100 ميكرومتر من Acteoside مقارنةً بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة. ومع ذلك ، فقد تم إحداث فقدان شديد للبروتيوغليكان بواسطة 10 نانوغرام / مل -1 في الغضروف المفصلي ، و 100 ميكرومتر أكتيوسيد بشكل كبير قام بقمع فقدان البروتيوغليكان في الغضروف المفصلي المعالج بـ 10 نانوجرام / مل IL - 1. بشكل جماعي ، تُظهر هذه البيانات باستمرار أن الأكتوزيد له تأثير مضاد تقويضي يؤخر تنكس الغضروف المفصلي من خلال مقاومة فقدان البروتيوغليكان الناجم عن IL -1 -.

أكتيوسيدفيcistancheلها تأثيرات جيدة علىمضادات الأكسدة

3.3 Acteoside له تأثير مضاد تقويضي يمنع تعبير MMP وتنشيطه في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية المعالجة بـ IL -1.

للتحقق مما إذا كان التأثير المضاد للتقويض الناجم عن أكتيوسيد مرتبطًا بقمع تعبير MMP وتنشيطه ، تمت معالجة الخلايا الغضروفية للفئران الأولية بـ 50 و 100 ميكرومتر في وجود أو عدم وجود 10ng / mL IL -1 لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم التحقيق في التعديلات في MMPs. كما هو موضح في الشكل 4 (أ) ، على الرغم من زيادة التعبير عن الإنزيمات المهينة للغضروف مثل MMP -13 و MMP -1 و MMP -3 بشكل ملحوظ في الوسائط المكيفة للفئران الأولية تمت معالجة الخلايا الغضروفية بـ 10ng / mL IL -1 ، وانخفضت بمقدارأكتيوسيدبطريقة تعتمد على الجرعة. علاوة على ذلك ، كشفت نتائج كل من qPCR (الشكل 4 (ب)) و qRT-PCR (الشكل 4 (ج)) أن IL -1 زاد بشكل كبير من مستويات mRNA لـ MMPs مثل MMP -13 ، MMP { {6}} و MMP -3 في الخلايا الغضروفية للفئران الأولية. ومع ذلك ، فقد انخفضوا اعتمادًا على الجرعة في الخلايا الغضروفية للجرذان الأولية التي عولجت بـ 50 و 100 ميكرومتر من Acteoside. علاوة على ذلك ، قام 50 و 100 ميكرومتر من Acteoside e بشكل فعال بقمع تنشيط MMPs في الخلايا الغضروفية الأولية للفئران المعالجة بـ 10ng / mL IL -1 (الشكل 4 (د)). مجتمعة ، تشير هذه البيانات باستمرار إلى أن الأكتوزيد له تأثير مضاد تقويضي يثبط التعبير عن الإنزيمات المهينة للغضروف وتنشيطها.