الجزء 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide يثبط فقدان العظام الناجم عن OVX في الفئران وتكوين الأرومة المستحثة بـ RANKL
Mar 02, 2022
مقدمة
هشاشة العظام - مرض يتسم بانخفاض كتلة العظام ، وبنية مجهرية غير طبيعية لأنسجة العظام ، وزيادة هشاشة العظام ، والكسر (De Martinis، Di Benedetto، Mengoli، Ginaldi، 2006) - يؤثر حاليًا على أكثر من 200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم ويقدم معلومات طبية و العبء الاجتماعي والاقتصادي على المجتمع الحديث (ستروم وآخرون ، 2011). يركز العلاج السريري لهشاشة العظام بشكل أساسي على العلاج بالهرمونات البديلة ، أو البايفوسفونيت ، أو العلاج بالدينوسوماب. هذه الطرق فعالة ولكنها تشكل آثارًا جانبية طويلة المدى مثل الخطر المحتمل للإصابة بسرطان الثدي وكسور عظم الفخذ غير النمطية (Black، Bauer، Schwartz، Cummings، & Rosen، 2012؛ Rachner، Khosla، & Hof- Bauer، 2011). وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لاستكشاف الأدوية التي لا يمكن أن تثبط فقطهشاشة العظامولكنها تمتلك أيضًا آثارًا جانبية غير مرغوب فيها أقل.
Cistanche Deserticola(CD) ، وهو من الأغذية المقوية والطبية المستخدمة على نطاق واسع في الصين ، والمعروف باسم "الجينسنغ الصحراوي" ، هو جذع عصاري مجفف بأوراق قشور منجيم الصحراءYC Ma (Gu، Yang، & Huang، 2016) وله متنوع وفعالالدوائيةأنشطة، مثل تنظيم المناعة ، ومضادات الأكسدة ، ومضاداتهشاشة العظامالخصائص (Hu et al.، 2020؛ Li et al.، 2012؛ Zhang et al.، 2014). ركزت الدراسات السابقة على المواد الفعالة للقرص المضغوط على علاج هشاشة العظام بشكل أساسيفينيليثانويدجليكوسيدات(Li، Jiang، & Gu، 2018؛ Xu، Zhang، Wang، Yao، & Ma، 2017). ومع ذلك ، يحتوي القرص المضغوط أيضًا على مكونات فعالة أخرى مثل إيريدويد ، قشور ،السكريات(Wang، Zhang، & Xie، 2012). التطبيق السريري للطب الصيني التقليدي (TCM) هو في الأساس إزالة المياه.السكرياتهي مكونات قابلة للذوبان في الماء ومن المرجح أن تكون المكونات الديناميكية الدوائية الرئيسية للطب الصيني التقليدي. تم الإبلاغ عن أن السكريات المستخرجة من الطب الصيني التقليدي تحتوي على مضاداتهشاشة العظامالتأثير وبعض الآثار الجانبية غير المرغوب فيها ، والتي تم استخدامها بشكل عام في العيادات (على سبيل المثال ، السكريات المستخرجة من Epimedium brevicornum (Zheng ، He ، Wu ، Cai ، & Wei ، 2020) ، Achyranthes bidentata (Zhang ، Zhang ، Zhang ، Wang ، & Yan، 2018) و Morinda officinalis (Yan et al.، 2019)). لذلك ، افترضنا ذلكCistanche Deserticolaعديد السكاريدقد يكون (CDP) المستخرج من القرص المضغوط دواءً آمنًا لعلاج هشاشة العظام.
عادةً ما يحافظ ارتشاف العظام وتكوين العظام على توازن ديناميكي أثناء إعادة تشكيل العظام بالتنسيق مع عدة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الآكلة للعظام وخلايا بانيات العظم وخلايا بطانة العظام والخلايا العظمية (Kular و Tickner و Chim و Xu ، 2012). يمكن أن يؤدي كسر هذا التوازن إلى مجموعة متنوعة من أمراض التمثيل الغذائي للعظام ، مثلهشاشة العظام(Zhu et al.، 2018) وتصلب العظام (Ihde et al.، 2011). ناقضات العظم ، كخلايا نهائية متمايزة مشتقة من سلالة أحادية النواة / البلاعم ، هي الخلايا الوحيدة التي لها وظيفة ارتشاف العظم (Teitelbaum ، 2000). هناك نوعان من السيتوكينات الرئيسية التي تشارك في تمايز ونضج ناقضات العظم (Koga et al. ، 2004): عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ومنشط مستقبلات العامل النووي κB (NF-B) يجند (RANKL). يتوسط M-CSF تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى أسلاف ناقضات العظم ويعزز تمايز ناقضات العظم عن طريق تنظيم التعبير عن مستقبلات RANK (Takayanagi ، 2007). ينتج عن ارتباط RANKL و RANK على سطح خلية ناقضة العظم ما يلي: (1) توظيف جزيئات محول الإشارة مثل العامل 6 المرتبط بمستقبلات TNF (TRAF6) ؛ (2) تفعيل العديد من الأهداف النهائية ، بما في ذلك NF- B و kinases البروتين المنشط بالميتوجين (MAPKs) ؛ و (3) تنظيم مستويات التعبير عن العامل النووي للخلايا التائية المنشطة ، السيتوبلازم 1 (NFATc1) (Liu et al. ، 2019 ؛ Yamashita et al. ، 2007). ينظم تنشيط مسارات الإشارات هذه بشكل مباشر التعبير عن جينات ناقضات العظم ، بما في ذلك حمض الفوسفاتاز 5 (Acp5) [ترميز الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAcP)] ، ومصفوفة البروتين المعدني 9 (MMP9) ، وكاثيبسين K (CTSK) (بويل ، سيمونيت) ، ولاسي ، 2003). لذلك ، فإن تثبيط مسارات الإشارات المرتبطة بتمايز ناقضات العظم التي يسببها RANKL هي طريقة علاجية محتملة لهشاشة العظام.
في هذه الدراسة ، هدفنا إلى تحديد آثار علاج CDP على المبايض المستحثة (OVX).هشاشة العظامنموذج الفأر في الجسم الحي وعلى نشاط ناقضات العظم المستحثة بـ RANKL في المختبر ، مع التركيز على التعبير عن الجينات الخاصة بخلايا العظم وتفعيل مسارات إشارات NFATc1 و NF-B و MAPKs. قد توفر النتائج التي توصلنا إليها رؤى جديدة حول إمكانات CDP كدواء آمن وفعال لعلاج هشاشة العظام.
للمزيد من المعلومات أرجو الأتصال:Joanna.jia@wecistanche.com
2. المواد والأساليب
2.1. جمع العينات والمواد الكيميائية
تم شراء القرص المضغوط (رقم 180801) من شركة Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co. تم شراء أقراص Estradiol Valerate من Bayer (Leverkusen ، شمال الراين - وستفاليا ، ألمانيا). متوسط أساسي بسيط معدّل ألفا
تم الحصول على (-MEM) ومصل بقري الجنين (FBS) من Gibco (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على البنسلين / الستربتومايسين ومجموعة تلطيخ TRAcP من Solarbio (بكين ، الصين). تمت معالجة الفأر المؤتلف M-CSF والفأر المؤتلف RANKL من أنظمة البحث والتطوير (مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الألواح المطلية بالهيدروكسيباتيت من Corning Life Sciences (سانت لويل ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). الأجسام المضادة الأولية لـ NFATc1 و CTSK (سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ IκB- و p65 و P-p65 و p38 و P-p38 و ERK1 / 2 و P-ERK1 / 2 و JNK و P-JNK (تقنية تشوير الخلايا ، Dan- vers ، MA ، USA) ؛ و -أكتين (CWBIO ، بكين ، الصين) تم الحصول عليها أيضًا. الكواشف الأخرى المستخدمة في هذه الدراسة كانت من الدرجة التحليلية ، وتمت تنقية الماء بواسطة نظام تنقية المياه Milli-Q (Millipore، Bedford، MA، USA).
2.2. استخراج CDP
تم طحن القرص المضغوط إلى مسحوق ناعم وخلطه مع الإيثر البترولي ثلاث مرات للتغلب عليه. تم جمع البقايا الصلبة بالترشيح ثم تجفف عند درجة حرارة الغرفة. الالسكرياتتم استخلاصها من العينات المعالجة مسبقًا ثلاث مرات بالماء لمدة ساعتين ، وتركيزها ، وترسبها بإضافة الإيثانول اللامائي إلى تركيز نهائي قدره 80 في المائة (حجم / حجم) ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. تم جمع الرواسب عن طريق الطرد المركزي عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة ، وتم إذابتها في الماء المقطر ، وتنقيتها (إزالة البروتينات الحرة) باستخدام طريقة Sevag (Zhao et al. ، 2019). المتعافىالسكرياتتم غسيلها وتجفيفها وتخزينها حتى استخدام آخر. علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج التركيب الكيميائي أن محتوى السكر الكلي وحمض اليورونيك والكبريتات والبروتين في CDP كان 67. 63 0. 98 بالمائة ، 21. 05 0. 49 بالمائة ، 1. {{7 }}. 24 في المائة ، و 8. 81 0. 36 في المائة.
تم عرض تركيبة السكاريد الأحادي وتحليل فورييه للأشعة تحت الحمراء لـ CDP في الشكل التكميلي 1 و 2.
2.3 نموذج ماوس هشاشة العظام الناجم عن OVX
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة قوانغتشو للطب الصيني (تمت الموافقة على SYXK 2019-0202). تم توفير ثلاثين 6- أسبوعا من الفئران C57BL / 6 من قبل مركز التجارب الحيوانية بجامعة قوانغتشو للطب الصيني. بعد التأقلم لمدة أسبوع ، خضعت مجموعة واحدة من الفئران لعملية صورية (مجموعة الشام) ، بينما خضعت الفئران المتبقية لعملية استئصال المبيض (مجموعة OVX). بعد الجراحة ، سمح للفئران بالتعافي لمدة 1- أسبوع. بعد ذلك ، تم تقسيم الفئران التي تم تصميمها بنجاح بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات ، مع 6 فئران لكل مجموعة:
(1) مجموعة الشام: تعامل بالماء المقطر ، (2) مجموعة OVX: تعامل بالماء المقطر ، (3) مجموعة OVX E2 (E2): تعامل بـ 0. 13 مجم / كجم من أقراص استراديول فاليرات ، (4) ) مجموعة الجرعات المنخفضة من OVX CDP (CDP-L): عولجت بـ 300 مجم / كجم من CDP ، (5) مجموعة جرعة عالية من OVX CDP (CDP- H): عولجت بـ 600 مجم / كجم من CDP. تم إعطاء الماء المقطر ، E2 ، أو CDP بالتزقيم مرة واحدة يوميًا. تم التضحية بجميع الفئران بعد فترة العلاج البالغة 12- أسبوعًا (الشكل 1 أ). تم جمع الرحم ووزنه ، وعظام الساق اليسرى من أجل الفحوصات اللاحقة. تم جمع عينات الدم الكامل وطردها عند 5000 دورة في الدقيقة
15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم شفط طاف المصل وتخزينه في
-80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
2.4 تحليل التصوير المقطعي الدقيق (micro-CT) وقياس نسيج العظام
تم إصلاح عظام الساق اليسرى بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة ثم تم وضعها في أنابيب طرد مركزي تحتوي على محلول ملحي عادي. تم مسح العينات الثابتة باستخدام أداة Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT ، Skyscan ، Kontich ، بلجيكا) باستخدام الإعدادات التالية: الفولتية ، 8 0 كيلو فولت ؛ تيار المصدر ، 100 μA ؛ مرشح Al ، 0.5 مم ؛ بكسل
الحجم ، 9.76 ميكرومتر ؛ وخطوة الدوران ، 0 .6◦. العديد من معلمات
تم قياس العظم التربيقي ، بما في ذلك الكثافة المعدنية للعظام (BMD) ، وكسر حجم العظام (BV / TV) ، وسطح العظام لكل حجم إجمالي (BS / TV) ، ورقم التربيق (Tb. N) ، والتباعد التربيقي (Tb. Sp) باستخدام برنامج CT- Analyser® (Bruker micro-CT ، Skyscan). تم إنشاء الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).
بعد تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، تم إزالة الكلس في عظام الساق اليسرى في محلول EDTA بنسبة 14 بالمائة وتم دمجها في البارافين للتقطيع. تم تقطيع العينات إلى أقسام 5 ميكرومتر باستخدام مشراح قبل تجارب تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) و TRAcP. تم فحص المقاطع الملطخة وتوثيقها باستخدام نطاق دقيق أوليمبوس CX 31 (شركة أوليمبوس الضوئية المحدودة ، طوكيو ، اليابان).
سيستانشيمكن أن يعزز كثافة العظام ويخفف من هشاشة العظام
2.5 تحليل المصل
تم تحديد تركيزات الكالسيوم (Ca) والفوسفور (P) وفقًا لتعليمات المجموعة التي صممها معهد Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing ، الصين). تم تحليل مستويات TRAcP -5 b و RANKL في المصل باستخدام مجموعة TRAcP -5 b ELISA (CUSABIO ، ووهان ، الصين) ومجموعة RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp. ، ووهان ، الصين) ، على التوالي.
2.6. في فحص تكوين الخلايا العظمية في المختبر
تم عزل BMMs من عظم الساق وعظم الفخذ 6- لإناث C57BL / 6 عمرها أسبوع من الفئران. تم استنبات الخلايا المعزولة في وسط MEM يحتوي على 25 نانوغرام / مل M-CSF ، و 10 بالمائة FBS ، و 1 بالمائة بنسلين / ستربتومايسين. عند الوصول إلى التقاء ، تم زرع BMMs (1 104 خلايا / بئر) في 96- لوحات جيدة وتم معالجتها باستخدام CDP في وجود 50 نانوغرام / مل من RANKL. تم استبدال الوسيط و CDP كل يومين. بعد 7 أيام ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد وملطخة لوجود TRAcP. تم حساب وتوثيق عدد الخلايا الآكلة للعظم ، التي تم تعريفها على أنها خلايا TRAcP- إيجابية مع ثلاثة أو أكثر من النوى ، باستخدام مجهر ضوئي.
2.7. فحص تكاثر الخلايا
تم زرع BMMs (1 × 1 0 4 خلايا / بئر) في 96- صفيحة جيدة واحتضانها طوال الليل. بعد ذلك ، عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من CDP (0 ، 0.625 ، 1.25 ، 2.5 ، 5 ، 10 ، 20 ، 40 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة. تم الكشف عن التقاء الخلايا وتحليلها باستخدام IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience ، Ann Arbor ، MI ، USA) ، وهو نظام تصوير ديناميكي طويل المدى في الوقت الحقيقي للخلايا الحية.
2.8. مقايسة امتصاص هيدروكسيباتيت
تم زرع BMMs ({0} خلايا / بئر) في صفيحة مغلفة بهيدروكسيباتيت ، ومعالجتها بـ CDP بالتركيزات المحددة (0 ، 5 ، و 10 ميكروغرام / مل) ، وتم تربيتها في -MEM كامل يحتوي على 25 نانوغرام / مل M-CSF و 50 نانوغرام / مل RANKL. بعد 7 أيام ، تم غسل الخلايا بمحلول مبيض بنسبة 10 في المائة لإزالة مكونات الخلية. تم التقاط صور مناطق امتصاص هيدروكسيباتيت باستخدام IncuCyte ZOOM® وتم تحليلها باستخدام برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية) (Abramoff ، Magelhaes ، & Ram ، 2003).
2.9 عزل الحمض النووي الريبي وتحليل PCR الكمي للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي
تم زرع BMMs ({0} خلايا / بئر) في 6- لوحة بئر وتحفيزها باستخدام RANKL و M-CSF في وجود CDP بتركيزات مختلفة (0 و 5 و 10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 أيام. تم عزل RNA الكلي من الخلايا أو الأنسجة العظمية للفئران باستخدام كاشف TRIzol (Sigma- Aldrich). تم تصنيع الحمض النووي التكميلي من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مجموعة النسخ العكسي (TransGen Biotech ، بكين ، الصين). تم تحضير تفاعلات RT-qPCR باستخدام PerfectStart ™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) واكتشافها بواسطة نظام ABI 7500 (مطبق
Biosystems ، Thermo Fisher Scientific ، Inc. ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعيين معلمات التدوير لـ PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. يتم عرض الاشعال المحددة المستخدمة في الجدول 1 ، وتم تطبيع كمية كل جين مستهدف إلى GAPDH (التحكم الداخلي).
2.10. تحليل لطخة غربية
تم زرع BMMs ({0}} خلية / بئر) في 6- لوحة بئر. بالنسبة لتجارب الدورة الزمنية القصيرة ، تم تحضين الخلايا مسبقًا بتركيزات مختلفة من CDP (0 و 5 و 10 ميكروغرام / مل) لمدة ساعة واحدة ، ثم تمت معالجتها بـ 50 نانوغرام / مل من RANKL لمدة 30 دقيقة. . لمدة طويلة ، تم تحفيز الخلايا بـ 50 نانوغرام / مل من RANKL في الأيام 3 و 5 و 7 في وجود CDP (0 ، 5 ، و 10 ميكروغرام / مل). تم استخراج البروتينات الكلية باستخدام محلول تحلل RIPA (CWBIO). تم فصل البروتينات بنسبة 10 بالمائة SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF. تم حظر الأغشية باستخدام حليب منزوع الدسم بنسبة 5 في المائة عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، وتم تحضينها باستخدام مادة أولية
بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، ثم مع المقابلة الثانوية
الأجسام المضادة لمدة 1.5 ساعة. تم تطوير الأغشية باستخدام كواشف ECL (Millipore Corp. ، Billerica ، MA ، USA) ، وتم التقاط الصور باستخدام Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology ، شنغهاي ، الصين).
سيستانشيمكن أن تعزز كثافة العظام
2.11. الكشف عن إزفاء NFATc1 باستخدام اختبار التألق المناعي
تم زرع BMMs على أغطية بئر {0} ، وتحفيزها باستخدام RANKL و M-CSF ، ومعالجتها بـ 10 ميكروغرام / مل CDP لمدة 5 أيام. تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة ، وغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتم تنفيسها بنسبة 0.1 في المائة تريتون X -100 لمدة 10 دقائق. تم خلط الخلايا مع 10 بالمائة من مصل الماعز (CWBIO) وحضنت لمدة ساعتين. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا بالجسم المضاد الأولي طوال الليل عند 4 درجات مئوية ثم باستخدام الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر Alexa Fluor 488 (Abcam ، Cambridge ، MA ، USA) في الظلام لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأغطية باستخدام PBS ، وتم تركيبها في كاشف Prolong Gold Antifade مع 4 ′ ، 6- ديميدينو -2- فينيل في دول (DAPI) (شمسي) ، و
تم الفحص باستخدام Zeiss LSM 800 مع مجهر Airyscan متحد البؤر (Carl Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا).
2.12. تحليل احصائي
تم تحليل جميع البيانات التجريبية باستخدام برنامج SPSS 25. 0 الإحصائي (شركة IBM ، أرمونك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم التعبير عن البيانات الخاصة بدراسات الحيوانات والخلية كوسائل ± SEM وتعني ± SD ، على التوالي. تستخدم النتائج تحليل التباين أحادي الاتجاه أو اختبار الطالب. قيم p <0. 05="" اعتبرت="" ذات="" دلالة="">
سيستانشيمكن أن تقللموت الخلايا المبرمجوتقوية العظامكثافة
