الجزء 1: يزيد إشيناكوسايد من كمية الحيوانات المنوية في الفئران عن طريق استهداف مستقبل الأندروجين تحت المهاد

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1،2، Bo Zhou2، Xinping Li2، Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1،2

الرجاء النقر هنا للجزء 2

يعد العقم عند الرجال مشكلة صحية كبيرة حيث يقدر معدل انتشار العقم عند الذكور بنسبة 4.2٪ في جميع أنحاء العالم. أظهر عملنا المبكر ذلكمقتطفات Cistancheحماية ضد تلف الحيوانات المنوية في الفئران وذاكإشنكوسايد(ECH) هو أحد المكونات النشطة الرئيسية. هنا نُبلغ عن دور أساسي لـ ECH ، وهو منتج طبيعي يعكس أو يحمي من قلة النطاف في الفئران. تم تقييم ECH بواسطة HPLC ، وتم تقييم كمية ونوعية الحيوانات المنوية وتم تحديد مستويات الهرمون بواسطة مقايسة الممتز المناعي الإشعاعي. خفضت ECH مستويات مستقبلات الأندروجين (AR) والجينات الرئيسية المرتبطة بالستيرويد كما هو محدد بواسطة اللطخة الغربية وتحليل qPCR. تم تقييم التفاعل بين ECH و AR بواسطة ELISA غير المباشر والالتحام الجزيئي. أظهرت النتائج أن ECH مع AR المهاد في جيب Met -894 و Val -713 لمنع انتقال AR من السيتوبلازم إلى النوى في منطقة ما تحت المهاد. في حين تم تثبيط ردود الفعل السلبية لتنظيم هرمون الجنس ، تم تحفيز ردود الفعل الإيجابية لزيادة إفراز الهرمون اللوتيني والتستوستيرون وبالتالي تعزيز كمية الحيوانات المنوية. تُظهر هذه البيانات مجتمعة أن ECH يمنع نشاط AR في منطقة ما تحت المهاد لزيادة كمية الحيوانات المنوية والحماية من قلة النطاف في الفئران.

سيستانش

يتم تنظيم إنتاج هرمون التستوستيرون في خلايا الخصية بقوة من خلال المحور الوطائي - النخامي - الغدد التناسلية (HPG) من خلال تشكيل حلقة تغذية مرتدة متجانسة 1. يمكن أن يحفز هرمون إفراز الغدد التناسلية (GnRH) ، الذي يفرزه الوطاء ، إفراز الهرمون اللوتيني (LH) من الغدة النخامية ، مما يحفز إنتاج هرمون التستوستيرون في خلايا Leydig الخصية. يتم تصنيع التستوستيرون حيويًا عن طريق سلسلة من الإنزيمات الستيرويدية. كواحد من المسارات الرئيسية ، يمكن أن ينقل البروتين التنظيمي الحاد الستيرويدي (StAR) الكوليسترول من المصادر داخل الخلايا إلى الميتوكوندريا 2 حيث يتعرض لإنزيم الكوليسترول الانقسام في السلسلة الجانبية (CYP11A1) ، 3 - هيدروكسيستيرويد ديهيدروجينيز (HSD3) ، { {10}} هيدروكسيلاز (CYP17A1) و 17 - هيدروكسيستيرويد ديهيدروجينيز (HSD 17) اللذان يحفزان تحويل الكوليسترول إلى هرمون التستوستيرون 3،4. ثم يتغذى التستوستيرون سلبًا على عنصر HPG لخفض تنظيم إفراز LH بطريقة تعتمد على الجرعة.

يحدث تأثير التستوستيرون على حلقة التغذية المرتدة لمحور HPG عن طريق الارتباط بمستقبلات الأندروجين (AR) ، الموجودة في كل من الوطاء والغدة النخامية. في الفئران ، يؤدي استئصال AR والحد الأدنى من إنتاج هرمون التستوستيرون إلى زيادة مستويات LH وهرمون تحفيز الجريب (FSH) ، مما يشير إلى أن AR يشارك في تنظيم حلقة التغذية السلبية. تحدث الآلية الجينومية الكلاسيكية لإشارات التستوستيرون عندما ينتشر التستوستيرون في الخلية ويرتبط بـ AR. ثم ينتقل مجمع مستقبلات اللجند هذا إلى النواة حيث يرتبط بعناصر استجابة الأندروجين (AREs) في المناطق التنظيمية للجينات المستجيبة لهرمون التستوستيرون لتعديل انتقالها. يحفز التستوستيرون أيضًا المسار غير الكلاسيكي لعمل هرمون الستيرويد ، والذي يتميز بأحداث سريعة تؤدي إلى تنشيط سلاسل إشارات العصارة الخلوية التي يتم تشغيلها عادةً بواسطة عوامل النمو. تساهم مسارات التستوستيرون الكلاسيكية وغير الكلاسيكية في الحفاظ على تكوين الحيوانات المنوية والخصوبة. ومع ذلك ، فإن وظيفة AR أكثر أهمية في المسار الكلاسيكي حيث يعمل التستوستيرون على زيادة جودة الحيوانات المنوية.

إشيناكوسايد(ECH) هو أحد المكونات النشطة بيولوجيًا المشتقة من أنواع النباتات الطبية في إشنسا 9 وسيستانش10. مع مجموعة واسعة من الأنشطة الدوائية ، مقتطفات إشنسا هي 1Research Center of Modern Biotechnology، School of Biotechnology and Food Engineering، Anyang Institute of Technology، Anyang، Henan، 455000، China. 2 كلية الطب البيطري ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانجلينج ، شنشي ، 712100 ، الصين. 3D قسم العلوم الطبية الحيوية ، كلية أونتاريو البيطرية ، جامعة جيلف ، جيلف ، أونتاريو ، N1G 2W1 ، كندا. يجب توجيه المراسلات وطلبات المواد إلى XZ

واحدة من المكملات العشبية الأكثر شعبية في أوروبا والولايات المتحدة بسبب خصائصها المضادة للأكسدة وقدرتها على منع نزلات البرد. ومن المثير للاهتمام،مقتطفات Cistanche وقد تم استخدام ECH تقليديًا كعامل منشط لعلاج الخلل الوظيفي التناسلي ولتعزيز النشاط الجنسي للذكور في الطب الصيني التقليدي. بعض منتجات OTC منسيستانش تم تطوير الاستخراج كمكملات مغذية واكتسب شعبية في أسواق الأغذية الصحية في الصين وبعض الدول الآسيوية الأخرى (إدارة الغذاء والدواء الصينية) 13. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية لعمل ECH غير واضحة.

يُعد العقم عند الذكور مشكلة صحية كبيرة حيث يقدر معدل انتشار العقم عند الذكور بنسبة 4.2٪ في جميع أنحاء العالم. يعتمد تشخيص العقم عند الذكور حاليًا على دراسة جودة الحيوانات المنوية بما في ذلك تحليل المعلمات المنوية مثل تركيز الحيوانات المنوية وحركتها وتشكلها. يعتبر Bisphenol A (BPA) المحاكي للإستروجين ملوثًا بيئيًا واسع النطاق تمت دراسته لتأثيره على خصوبة الذكور في العديد من أنواع الحيوانات والبشر. يعطل BPA المحور الوطائي - النخامي - الغدد التناسلية ، ويثبط تعبيرات إنزيمات الخصية الستيرويدية وتوليف التستوستيرون في ذكور الجراء ، مما يتسبب في حالة قصور الغدد التناسلية. في هذه الدراسة ، نتحرى تأثير ECH على جودة الحيوانات المنوية ومستويات الهرمونات. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختيار BPA كعامل نموذج لإصابة الحيوانات المنوية لمزيد من دراسة التأثير الوقائي لـ ECH ضد جودة الحيوانات المنوية الضعيفة.

مقتطفات Cistanche

نتائج

يعزز ECH كمية الحيوانات المنوية. يتم عرض عدد الحيوانات المنوية في ذيل البربخ ، وحيوية الحيوانات المنوية ، وحركة الحيوانات المنوية في الجدول 1. أدى العلاج بـ 80 ملغم / كغم من ECH و 15 ملغم / كغم من بروبيونات التستوستيرون (TP) إلى زيادة كبيرة في عدد الحيوانات المنوية في البربخ. ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير في حيوية الحيوانات المنوية وحركتها.

يزيد ECH من مستويات هرمون التستوستيرون و LH في المصل والدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية. أدى علاج ECH بشكل ملحوظ إلى زيادة مستويات LH في المصل والدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية (الشكل 1 أ). في مجموعة ECH (H) ، زادت مستويات LH بشكل ملحوظ بمقدار 1. 1- أضعاف في المصل ، 1. 4- أضعاف في الدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية ، و 1. 2- أضعاف في الخصية. تمت زيادة التستوستيرون بشكل ملحوظ بمقدار 1.5 و 1. 3- أضعاف في الدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية ، على التوالي ، ولكن ليس في المصل بعد علاج ECH (H). بعد علاج TP ، زادت مستويات هرمون التستوستيرون بشكل ملحوظ بمقدار 1.6 و 1.8 و 1. 4- ضعف في المصل والدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية.

زادت ECH من التعبير الجيني عن إنزيم الستيرويد. زادت ECH بشكل كبير من تعبيرات الإنزيمات الستيرويدية الرئيسية في الخصية (الشكل 1 ب). تمت زيادة مستويات الرنا المرسال لـ CYP11A1 و CYP17A1 و HSD 3 1 / 2 و HSD17 في مجموعة ECH (H) أكثر من 3- ضعف ، بينما لم تظهر مستويات StAR mRNA أي اختلافات كبيرة مع جميع علاجات ECH (ع> 0. 05). لم يغير TP بشكل ملحوظ تعبير CYP11A1 و CYP17A1 و HSD 3 1 / 2 و HSD17. ينعكس هذا في تحليل خريطة الحرارة الشامل لتأثير ECH على تعبير إنزيم الستيرويد الذي يشير إلى أن ECH زاد بشكل كبير من مستويات mRNA لـ CYP11A1 و CYP17A1 و HSD 3 1 / 2 و HSD17 ، وخاصة HSD 3 1 / 2 (الشكل 1 ج).

يمكن أن تعبر ECH الحاجز الدموي الدماغي وبدرجة أقل حاجز الدم في الخصية. لتقييم حلقة التغذية المرتدة للأندروجين على محور HPG ، تم تقييم قدرة ECH على دخول منطقة ما تحت المهاد في سلسلة من دراسات PK. تم الكشف عن تركيزات ECH في منطقة ما تحت المهاد بعد 12 ساعة من الإعطاء الفموي الفردي 3 0 ملغم / كغم من ECH ، وأظهرت ECH نفاذية ملحوظة في منطقة ما تحت المهاد بمتوسط ​​ما تحت المهاد / البلازما بنسبة 33.92 بالمائة (الشكل 2 أ). كانت قيم T1 / 2 2.61 ± 0. 42 ساعة و 1.88 ± 0. 22 ساعة في البلازما والمهاد ، على التوالي (الشكل 2 ب). ومع ذلك ، تم الكشف عن وصول محدود للغاية من ECH في الخصية باستخدام HPLC. كانت تركيزات ECH في الخصية 0. 0 83 ميكروغرام / مل ، 0. 043 ميكروغرام / مل و 0.028 ميكروغرام / مل عند 0.5 ساعة و 1 ساعة و 1.5 ساعة على التوالي ، بعد علاج او معاملة.

يقلل ECH من إزاحة الوطاء AR إلى النواة. لاختبار تأثير ECH على إزفاء AR ، تم تحديد تعبير AR في السيتوبلازم ونواة الخصية والوطاء باستخدام تحليل اللطخة الغربية. كما هو مبين في الشكل 3 أ ، فإن بروتين AR الخاضع للتنظيم من ECH في نوى الوطاء بالثني مقارنة بمجموعة التحكم. أدى العلاج باستخدام إنزالوتاميد ، وهو أحد مثبطات AR ، إلى خفض مستويات بروتين AR في نوى الوطاء بمقدار 4. 8- أضعاف. والجدير بالذكر أن AR السيتوبلازمية كانت أعلى مع علاج ECH ومعالجة الإنزالوتاميد مقارنة بالضوابط ، مما يشير إلى أن ECH يمنع انتقال AR من السيتوبلازم إلى النواة في منطقة ما تحت المهاد. كما هو متوقع ، لا يمنع ECH نقل AR من السيتوبلازم إلى النواة في الخصية (الشكل 3 ب).

زادت ECH من تعبيرات الجينات المرتبطة بمحور HPG. زادت ECH بشكل كبير من تعبيرات LH و LHR و GnRH 1 و Gnrhr في برك خليط الدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية ، ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير في مستويات GnRH 1 بعد علاج TP. يُظهر تحليل خريطة الحرارة أن تعبيرات GnRH 1 و LH كانت الأعلى بين الجينات المرتبطة بمحور HPG.

الشكل 1. تأثير ECH على مستويات LH والتستوستيرون والإنزيمات الستيرويدية الرئيسية. ملاحظة: (A) مستويات LH في المصل والدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية (mIU / mL ، يعني ± SD) ؛

مستويات T في المصل والدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية والخصية (نانوغرام / مل ، يعني ± SD) ؛ (ب) التعبير عن الانزيمات الستيرويدية الرئيسية.

(ج) التجميع الهرمي للتعبير عن مرنا للأنزيمات الستيرويدية المختلفة في الخصية. تمثل الألوان الخضراء والأخضر والأحمر والأحمر منخفضًا ،

وفرة متوسطة وعالية ، على التوالي ، n=7. أ ، ب ، ج تشير الأحرف المختلفة إلى مجموعات مختلفة إحصائيًا (p <0.>

الشكل 2. التوزيع والمعلمات الدوائية من ECH في منطقة ما تحت المهاد. ملاحظات: (أ) تم حساب نسب ما تحت المهاد / البلازما (النسبة المئوية) بناءً على التعرض للبلازما وما تحت المهاد لـ ECH (التركيز) عند 0. 5 ساعات ، 1. 0 ساعة ، 1.5 ساعة ، 2. { {8}} س ، 2.5 س ، 3. 0 س ، 6. 0 س ، 9. 0 س و 12. 0 س بعد تناوله عن طريق الفم. (ب) معلمات الحرائك الدوائية (PK) لـ ECH في البلازما والوطاء. T1 / 2 ، نصف العمر ؛ Cmax ، ذروة التركيز ؛ Vz / F ، الحجم الظاهر للتوزيع ؛ MRT ، يعني وقت الاحتفاظ ؛ AUC ، المنطقة الواقعة تحت منحنى وقت التركيز.

AR هو هدف من ECH. لتأكيد العلاقات بين ECH و AR ، تم تصنيع ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) بنجاح (الشكل 5 أ ، ب). الوزن الجزيئي لـ ECH-OVA أكبر من OVA ، لذلك لديهم معدلات تنقل مختلفة (الشكل 5 أ) ، وقمة الامتصاص لـ ECH-OVA بين ECH و OVA (الشكل 5 ب) ،

مقتطفات Cistanche

شكل 3. تأثير ECH على النقل بالواقع المعزز في الخصيتين وما تحت المهاد. ملحوظات: (A) تأثير ECH على النقل بالواقع المعزز في منطقة ما تحت المهاد. تم تحديد مستويات البروتين AR من خلال تحليل لطخة غربية وتمثل القضبان قياسًا كميًا لقياس الكثافة للواقع المعزز النووي الذي تم تطبيعه إلى Lamin B و AR السيتوبلازمي الذي تم تطبيعه لـ GAPDH. تمثل كل قيمة متوسط ​​± SD لست تجارب مستقلة. أ ، ب ، ج تشير الأحرف المختلفة فوق الأشرطة إلى مجموعات مختلفة إحصائيًا (p < 0.05);="">B) تأثير ECH على النقل بالواقع المعزز في الخصية.

مما يشير إلى أن ECH تم اقترانه بنجاح مع OVA. تظهر نتائج ELISA غير المباشرة (الشكل 5C) أن الجسم المضاد لـ AR قادر على اكتشاف بروتين AR الموجود في الآبار التي تحتوي على ECH-OVA (المشار إليها بواسطة الجسم المضاد لـ OVA) مما يشير إلى أن ECH يمكن أن يرتبط ببروتين AR.

يتم دمج ECH مع جيب AR لـ Met -894 و Val -713. تم إرساء مركب ECH إلى موقع AF2 على سطح AR البشري ، وتم عرض وضع الربط النظري لـ ECH و AR في الشكل 5D. اعتمد مجمع ECH ارتباطًا مضغوطًا للتشكيل في جيب AR البشري. ترتبط مجموعتي فينيل من ECH في المجال الكارثي للماء بجيب AR وتحافظ على اتصالات قريبة كارهة للماء مع البقايا Leu -712 ، Val -716 ، Met -734 ، Ile -737 و Met -894 و Ile -898 ، بينما تم وضع الجانبين الآخرين من ECH عند مدخل الجيب ولم يتم إجراء سوى عدد قليل من جهات الاتصال. أظهر التحليل التفصيلي أن كلاً من Met -894 (طول الرابطة: 2.4 Å) و Val -713 (طول الرابطة: 2.7 Å) شكلا روابط هيدروجينية مع مجموعات هيدروكسي 1 من ECH ، والذي كان التفاعل الرئيسي بين ECH والواقع المعزز البشري.

يخفف ECH الضرر الإنجابي الناجم عن BPA. للتحقق من تأثير ECH على الضرر التناسلي ، تم فحص جودة الحيوانات المنوية ومستويات الهرمونات الجنسية والإنزيمات الستيرويدية في الفئران التي يسببها BPA. كما هو مبين في الشكل 6 ، أدى العلاج بـ BPA إلى انخفاض ملحوظ في عدد الحيوانات المنوية وحركة الحيوانات المنوية بنسبة 26.5٪ و 39.2٪ على التوالي. منعت إدارة ECH انخفاض عدد الحيوانات المنوية وحركة الحيوانات المنوية بنسبة 35.5 في المائة و 30.1 في المائة على التوالي. أدى استخدام BPA أيضًا إلى انخفاض كبير في إفراز LH و T ، وزاد ECH بشكل كبير من مستويات LH و T بنسبة 24.1 في المائة و 18.3 في المائة على التوالي مقارنة بمعالجة BPA وحدها (الشكل 6 أ ، ب). زادت مستويات الرنا المرسال لكل من StAR و CYP17A1 و 3 - HSD و 17 - HSD في علاج BPA-ECH بشكل ملحوظ مقارنةً بمعالجة BPA (الشكل 6C ، D).

الشكل 4. التغييرات في التعبير الجيني المرتبط بـ HPA بعد علاج ECH. ملاحظات: تمثل القضبان (A-D) مستويات الرنا المرسال لـ LH و LHr و Gnrh 1 و Gnrhr في الدماغ بالإضافة إلى الغدة النخامية. أ ، ب ، ج تشير الأحرف المختلفة فوق الأشرطة إلى مجموعات مختلفة إحصائيًا (ص <0. 05).="" (هـ)="" التجميع="" الهرمي="" للتعبير="" عن="" مرنا="" للأنزيمات="" الستيرويدية="" المختلفة.="" تمثل="" الألوان="" الأخضر="" والأخضر="" والأحمر="" وفرة="" منخفضة="" ومتوسطة="" وعالية="" على="" التوالي="" ،="" n="7." مجموعة="" التحكم="" (تمت="" معالجتها="" بمحلول="" ملحي="" عادي="" 10="" مل="" كجم)="" ،="" ech="" (l)="" (تمت="" معالجتها="" بـ="" ech="" 5="" مجم="" كجم)="" ،="" مجموعة="" ech="" (m)="" (تمت="" معالجتها="" بـ="" ech="" 20="" مجم="" كجم)="" ،="" ech="" (h)="" (تمت="" معالجتها="" بـ="" ech="" 80="" مجم="" كجم)="" tp="" (تمت="" معالجته="" بـ="" tp="" 15="" مجم="">