التأثيرات الوقائية لمغلي Wenshen Shengjing الجديد على الضعف الناجم عن السيكلوسبورين لتخليق التستوستيرون وموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

XIAOYAN PAN و XIYAN WANG و XUENAN WANG و WANSHENG ZHANG4 و ZHANXUAN SUN1 و XUAN XUAN LIANG و XUE ZHANG و WENJUN LI و ZHIXIN LI

الملخص

هدفت الدراسة الحالية إلى التحقيق في الآثار الوقائية المحتملة لمركب Wenshen Shengjing الجديد (WSSJD الجديد ؛ بما في ذلك Cornu Cervi Nippon Parvum و Panax ginseng و Cynomorium solarium وCistanche Deserticola، Radix Astragali ، Epimedium brevicornum ، و Angelica Sinensis) على الضعف الناجم عن السيكلوسبورين في تخليق التستوستيرون وموت الخلايا المبرمج في الفئران. تم تقسيم ما مجموعه 90 بالغًا من فئران كونمينغ الذكور إلى المجموعات الست التالية: التحكم (بدون تدخل) ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ؛ تلقى DMSO فقط) ، سيكلوسبورين A (CSA) ، سيترات الكلوميفين (CC ؛ CsA plus CC ، 15 مجم / كجم / يوم) ، WSSJD (CsA plus WSSJD ، عقار خام 12 جم / كجم / يوم) و WSSJD جديد (CsA بالإضافة إلى WSSJD جديد ، عقار خام 12 جم / كجم / يوم). تم علاج جميع الفئران لمدة 30 يومًا عن طريق الفم. تم بعد ذلك إصلاح الخصيتين وتلطيخهما بالهيماتوكسيلين ويوزين لتقييم تطور الظهارة المنوية. تم استخدام التقنيات الكيميائية المناعية للكشف عن التعبير عن مستقبلات الهرمون اللوتيني (LHR) وانقسام السلسلة الجانبية P450 (P450scc) في خلايا Leydig الخصية. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية في الخصيتين باستخدام اختبار وضع العلامات على نهاية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز النهائي بوساطة dUTP ، وتم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل معدل البقاء على قيد الحياة وموت الخلايا المبرمج المبكر للحيوانات المنوية في البربخ. بالمقارنة مع مجموعتي CsA و CC ، أدت الإدارة الجديدة لـ WSSJD إلى زيادة كبيرة في مستويات هرمون التستوستيرون في الدم وتعبيرات LHR و P450scc في خلايا Leydig الخصية (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">

Cistanche Deserticola

مقدمة

السيكلوسبورين أ (CSA) هو عامل مثبط للمناعة شائع الاستخدام يستهدف على وجه التحديد الخلايا التائية ويمنع إفراز الإنترلوكين -2 ، ويزيد بشكل كبير من معدل نجاح عمليات زرع الكبد والكلى والقرنية ، بالإضافة إلى معدل بقاء المستلمون (1-3). ومع ذلك ، فإن كبت المناعة الناجم عن استخدامات CsA طويلة المدى يزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، والعدوى ، والأورام الخبيثة (4). ذكر عيد وزملاؤه (5) أن تركيز الحيوانات المنوية وحركتها كانا مرتبطين سلبًا بتركيز مصل CsA في متلقي زراعة الكلى من الذكور ، مما يشير إلى أن CsA قد تسبب خللًا في الجهاز التناسلي لدى المتلقين الذكور. علاوة على ذلك ، فقد تم توثيق أن CsA قد تكون مسؤولة عن ضعف تكوين الحيوانات المنوية وتلف الجهاز التناسلي الذكري (6).

أظهرت الدراسات السابقة أن CsA يقلل من مستويات هرمون التستوستيرون في الدم عن طريق التأثير على التخليق الحيوي للتستوستيرون وإفرازه في الخصيتين. لاحظ هي وآخرون (7) أن الفئران التي عولجت بـ 40 مجم / كجم / يوم من CsA أظهرت مستويات أعلى بكثير من الهرمون اللوتيني (LH) ومستويات أقل بكثير من هرمون التستوستيرون في المصل ، مما أدى إلى ضعف نمو الخصية. أفاد علي وآخرون (8) أن العلاج باستخدام CsA قلل من التعبير عن مستقبلات LH (LHR) على غشاء خلايا Leydig ، مما أدى لاحقًا إلى انخفاض تخليق التستوستيرون بوساطة LH وإفرازه من خلايا Leydig. أفادت دراسة أخرى أجراها Seethalakshmi et al (9) أن CsA خفض مستويات هرمون التستوستيرون عن طريق تثبيط نشاط 17 alpha-hydroxylase بشكل غير متعاون و 17 - نشاط هيدروكسيستيرويد dehydrogenase بشكل تنافسي أثناء التخليق الحيوي لهرمون التستوستيرون ، وانقطاع الموقع الأساسي لتثبيط CsA الأدينوزين الدوري تحفيز أحادي الفوسفات. علاوة على ذلك ، أشار هذا التقرير إلى أن انخفاض إفراز هرمون التستوستيرون الناجم عن CsA في خلايا Leydig أثر بشكل مباشر على تطور الجهاز التناسلي الذكري والحفاظ على القدرة الإنجابية. قام Seethalakshmi et al (10) بحقن هرمون التستوستيرون الخارجي في الفئران المعالجة بـ CsA لزيادة مستويات هرمون التستوستيرون الذاتية. وقد لوحظ أن الجرعات المرتفعة من هرمون التستوستيرون الخارجي استعادت بشكل كبير وزن الأعضاء التناسلية ، ومستويات مصل الهرمون المنبه للجريب (FSH) ، وزيادة عدد الخلايا الجرثومية ، مما يشير إلى أن ضعف تكوين الحيوانات المنوية الناجم عن CsA قد يتم منعه جزئيًا عن طريق الخلايا الخارجية. إعطاء هرمون التستوستيرون (10). ومع ذلك ، وجد أن هرمون التستوستيرون الخارجي غير كافٍ في إصلاح أنسجة الخصية التالفة ، حيث لا يزال إفراز التستوستيرون وتكوين الحيوانات المنوية يتأثران بـ CsA ، ولوحظ ارتفاع معدلات موت الخلايا المبرمج في الحيوانات المنوية والخلايا المولدة للحيوانات المنوية (10).

يتكون Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) من 15 دواءً عشبيًا ، بما في ذلك بشكل أساسي Cornu Cervi Nippon Parvum ، و Panax ginseng ، و Cynomorium solarium ،Cistanche Deserticolaو Radix Astragali و Epimedium brevicorneum و Angelica Sinensis (11). لقد تم إثبات أن WSSJD يخفف من موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيكلوفوسفاميد (11). لزيادة تحسين التأثير العلاجي لـ WSSJD ، طورت الدراسة الحالية WSSJD جديدًا استنادًا إلى آلية تلف أنسجة الخصية الناجم عن CsA عن طريق ضبط جرعة مكونات WSSJD. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن مخمل قرن الوعل في WSSJD قد يعمل كهرمون جنسي (12) ؛ قد يحسن Radix Astragali تكاثر وإمداد المغذيات لخلايا Sertoli الخصية (13) ، وقد يقلل Panax ginseng مستويات فرط أكسيد الخصية ويمنع موت الخلايا المبرمج المنشأ للحيوانات المنوية (14). قد تؤدي الأدوية المذكورة أعلاه أيضًا إلى زيادة وظائف الكلى وتعزيز نمو الخلايا المولدة للحيوانات المنوية (12-14). تم إثبات أن سيترات الكلوميفين (CC) لها تأثير علاجي على عقم الذكور في الدراسات السريرية السابقة (15 ، 16). علاوة على ذلك ، ارتبط CC بتحسين معايير التستوستيرون والسائل المنوي ، وقد تكون آليات الحماية لـ CC مماثلة لتلك الخاصة بـ WSSJD (15،16). بالإضافة إلى ذلك ، في دراسة أجراها Wang et al (17) ، تم استخدام CC كعنصر تحكم في العلاج للتحقيق في تأثير الطب الصيني Shengjing على اضطرابات تكوين الحيوانات المنوية في الفئران. بناءً على ذلك ، تم استخدام CC كعنصر تحكم إيجابي في الدراسة الحالية.

في هذه الدراسة ، تم التحقيق في الآلية الكامنة وراء التأثير الوقائي لـ WSSJD الجديد في أنسجة الخصية لتحديد الفعالية العلاجية للطب المعدل. قد يوفر توضيح آلية الحماية أساسًا لاستخدام WSSJD الجديد في تخفيف الضرر الناجم عن CsA الناجم عن الحيوانات المنوية.

آثار Cistanche deserticola: منعضرر منوي

المواد والأساليب

الحيوانات. تم توفير ما مجموعه 90 ذكرًا من فئران كونمينغ (8- أسبوعًا ؛ 35-40 جم) بواسطة معهد تشانغتشون للمنتجات البيولوجية المحدودة (تشانغتشون ، الصين). أجريت الدراسة الحالية بموافقة لجنة الأخلاقيات بجامعة جيلين الطبية (تشانغتشون ، الصين). تم إيواء الفئران عند 21 ± 3 درجة مئوية ورطوبة نسبية 55-65 في المائة تحت 12 ساعة من دورة الضوء المظلم. تم منح الفئران حرية الوصول إلى نظام غذائي معياري للماوس والماء المعقم.

إعداد WSSJD. مكونات الطب الصيني الـ 15 لـ WSSJD ، بما في ذلك Cornu Cervi Nippon Parvum و Panax ginseng و Cynomorium solarium ،Cistanche Deserticola، Radix Astragali ، Epimedium brevicornum ، و Angelica Sinensis (11) ، تم شراؤها من Tongrentang (بكين ، الصين). تم فك هذه المواد وفقًا للطريقة التقليدية للديكوتيون الطبي الصيني (18). باختصار ، تم وزن المكونات وفقًا للوصفة ، وتمت إضافة ما مجموعه 250 مل من الماء المقطر لغمر الأعشاب. تم نقع الأعشاب لمدة 30 دقيقة ثم تسخينها بعد ذلك. تم غلي الأعشاب لأول مرة لمدة 10 دقائق ثم تم تقليل الحرارة إلى نار هادئة لمدة 20 دقيقة. بعد 30 دقيقة من التسخين ، تم فصل ديكوتيون السائل عن الأعشاب ، والتي تم فكها أكثر مع 200 مل من الماء المقطر عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. تكررت هذه العملية وتم ترشيح الحجم النهائي لسائل ديكوتيون من خلال 4-5 طبقات من الشاش. تم عصر السائل أيضًا من الأعشاب في مغلي المرشح. تم تسخين المرق بعد ذلك عند 80˚مئوية في حمام مائي لمدة 6‑7 ساعات حتى وصل التركيز إلى 2 جم من العقار الخام / مل ، وتم تخزين ديكوتيون عند 4˚مئوية قبل الاستخدام. تم تحضير WSSJD الجديد بناءً على صياغة WSSJD مع تعديلات طفيفة على جرعات Panax ginseng و Cynomorium solarium و Radix Astragali و Epimedium brevicornum. كانت طريقة فك التشفير هي نفس طريقة WSSJD. يتكون WSSJD الجديد مما يلي: Panax ginseng، 6 g؛ Cynomorium صولاريوم ، 9 جم ؛ Radix Astragali ، 12 جم ؛ Epimedium brevicornum ، 6 جم ؛ Cornu Cervi Nippon Parvum ، 1 جم ؛Cistanche Deserticola، 9 جم ؛ أنجليكا سينينسيس ، 6 جم ؛ بذور اللبن المسطح ، 9 جم ؛ ريزوما ديوسكوريا ، 15 جم ؛ جذمور Atractylodes كبيرة الرأس ، 6 جم ؛ Ligusticum wallichii ، 3 جم ؛ Radix Paeoniae Alba ، 6 جم ؛ قرفة كاسيا ، 1 جم ؛ Costustoot ، 1.5 غرام ، و Fructus Foeniculi ، 3 غرام.

تم تحديد تركيزات المستخلصات الدوائية الخام على النحو التالي: وزن المادة الخام / الحجم النهائي. تُستخدم طريقة الحساب هذه على نطاق واسع في دراسة الطب الصيني التقليدي (19-21). إدارة الأدوية. تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى 6 مجموعات (15 فأر لكل مجموعة) وتم إعطاؤهم الدواء داخل المعدة. وكانت المجموعات على النحو التالي: التحكم (محلول ملحي عادي) ؛ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ؛ CsA ؛ نسخة؛ WSSJD. و WSSJD الجديد. تم حقن الفئران في مجموعات CsA و CC و WSSJD ومجموعات WSSJD الجديدة داخل الصفاق (IP) بـ 15 مجم / كجم / يوم CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co. ، Ltd. ، Datong ، الصين) لمدة 30 يومًا ، كما هو موضح سابقًا (8) ). خضعت الفئران في مجموعتي التحكم و DMSO لحقن IP يوميًا بكمية متساوية من محلول ملحي عادي أو مذيب DMSO ، على التوالي ، طوال 30- يوم من الفترة التجريبية. كان تركيز DMSO المخفف في المحلول الملحي العادي 3.25٪ (حجم / حجم). تمت إدارة مجموعة CC بـ 21.6 مجم / كجم / يوم CC (GKH Pharmaceutical ، Ltd. ، قوانغتشو ، الصين) كما هو موضح سابقًا (13) ، والذي تم تخفيفه أيضًا في 3.25 بالمائة (ت / ت) DMSO (الرقم الهيدروجيني {{14} } .2). تم إعطاء الفئران في WSSJD ومجموعات WSSJD الجديدة بـ 12 جم من المخدرات الخام / كجم / يوم من WSSJD و WSSJD الجديد ، على التوالي.تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E). تم حصاد خصى الفئران وتثبيتها على الفور في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة (الرقم الهيدروجيني =7. 2) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة ، يليها تجفيف الإيثانول ، ومعالجة الزيلين لإزالة الإيثانول ، ودمج الشمع ، والتقطيع. تم الحصول على المقاطع النسيجية (5 ميكرومتر) باستخدام مشراح دوار. تم لصقها على شرائح زجاجية لتلطيخ H&E. تمت ملاحظة مقاطع الخصية باستخدام الفحص المجهري النسيجي المرضي لتقييم تطور الأنابيب المنوية والحصول على البيانات النسيجية. تم تقييم تطور الأنابيب المنوية باستخدام نظام تسجيل Johnsen (22).

إليسا. في اليوم الثالث 0 من العلاج ، تم تخدير الفئران بنسبة 10 بالمائة من هيدرات الكلورال (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co.، Ltd) عند 0.004 مل / جم من وزن الجسم قبل القتل الرحيم باستخدام ثاني أكسيد الكربون. تم حصاد دم الجذع وفصل المصل وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. لفترة وجيزة ، تم جمع الدم في أنابيب 1.5 ميكرولتر وتخزينها في 4 درجات مئوية طوال الليل. تم بعد ذلك طرد الأنبوب عند 1300 xg عند 4 درجات مئوية لمدة 6 دقائق وتم جمع المصل. تم استخدام مجموعات ELISA (Shanghai Elisa Biotech Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين) لتحديد محتويات مصل التستوستيرون (القط رقم EIA -2380) و LH (القط رقم EIA -2385 ) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد الكثافة البصرية (OD) باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية طراز 680 (Bio-Rad Laboratories ، Inc. ، Hercules ، CA ، USA) ، وتم تحديد مستويات التستوستيرون و LH بناءً على المنحنى القياسي.

المناعية. تم تثبيت أنسجة الخصية في 4٪ فورمالديهايد عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة وتم وضعها في البارافين. تم تقطيع مقاطع البارافين إلى أقسام 5 ميكرومتر ثم تم إزالتها بعد ذلك من الشمع. تم تحقيق استرجاع المستضد عن طريق احتضان الأقسام في 0. 0 1 M سيترات عازلة (درجة الحموضة =6. 0) عند 95-98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تم حظر الأقسام لاحقًا باستخدام 5 في المائة من ألبومين مصل الأبقار (Sigma ‑ Aldrich ؛ Merck KGaA ، Darmstadt ، Germany ؛ A3675) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحجب ، تم تحضين المقاطع بأجسام مضادة متعددة الأضلاع للأرنب ضد LHR (القط رقم L6792 ؛ Sigma-Aldrich ؛ Merck KGaA ؛ 1: 200) أو انشقاق السلسلة الجانبية P450 (P450scc ؛ القط رقم ab75497 ؛ Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة ؛ 1: 200) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في الظلام. تم استخدام طريقة مجمع الستربتافيدين-البيوتين (SABC) للكشف عن التعبير عن LHR و P450scc باستخدام مجموعة SABC (SA2010 ؛ Boster Biological Technology ، Pleasanton ، CA ، USA) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة للأنسجة المعزولة من فئران التحكم السلبية ، تم استبدال الجسم المضاد الأولي بـ PBS. اعتبرت خلايا Leydig ذات تلطيخ أصفر أو بني على الغشاء أو البلازما خلايا إيجابية LHR. تم الحصول على خمس شرائح من كل عينة وتم اختيار خمسة حقول في مناطق أنسجة Leydig بشكل عشوائي وتم تقييمها تحت مجهر مضان (التكبير ، × 400). تم الحصول على متوسط ​​OD للخلايا الإيجابية في مناطق أنسجة Leydig باستخدام برنامج Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics ، Inc. ، Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت تعبيرات LHR و P450scc متناسبة مع قيم OD ، مع قيم OD أعلى تمثل تعبيرات بروتين أعلى.

مقايسة deoxynucleotidyl transferase (TdT) بوساطة dUTP نيك نهاية الوسم (TUNEL). تم تشريح خصيتين الفئران ، وتضمينها في الشمع ، وتقطيعها. تم تلطيخ المقاطع (سمك {0}} ميكرومتر) بعد ذلك باستخدام مجموعة اختبار TUNEL (MK1024 ؛ Boster Biological Technology) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار ، تم تلوين أنسجة الخصية من السيطرة (محلول ملحي طبيعي) و DMSO و CsA و CC و WSSJD ومجموعات WSSJD الجديدة باستخدام تخفيف 1: 100 من الجسم المضاد للديجوكسين المسمى بالبيوتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم استخدام النسيج الظهاري الخلالي المصبوغ للجرذان (متوفر في المجموعة) كعنصر تحكم إيجابي ، وتم استخدام العينات المحتضنة باستخدام برنامج تلفزيوني بدلاً من الجسم المضاد للديجوكسين الذي يحمل علامة البيوتين كعنصر تحكم سلبي. تم تقييم تواتر الخلايا الإيجابية TUNEL التي تظهر تلطيخًا نوويًا أخضر باستخدام مجهر متحد البؤر المسح بالليزر. تم تقييم ما مجموعه 10 حقول عشوائية تحت التكبير العالي (× 400) وتم عد الخلايا الإيجابية. تم حساب متوسط ​​عدد الخلايا الإيجابية لكل حقل.

يوديد البروبيديوم (PI) أو تحليل تلطيخ وتدفق الأيزوثيوسيانات (FITC) الملحق V-fluorescein (FITC). تم حصاد ذيل البربخ بالتضحية التالية وتم قطع البشرة بشفرة لتحرير الحيوانات المنوية من البربخ إلى 2 مل PBS عند 37 درجة مئوية للحصول على معلقات البربخ. تم تحضين المعلقات في وقت لاحق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح للحيوانات المنوية بالسباحة. تم التخلص من تجمعات الحيوانات المنوية وعزل عينات الحيوانات المنوية المتبقية وتعليقها في برنامج تلفزيوني لتركيز 106 خلية / مل. تم تحليل موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام مجموعة أدوات اكتشاف Apoptosis V-FITC من Annexin (Nanjing KeyGen Biotech Co.، Ltd. ، Nanjing ، الصين) ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار ، تم تلوين 1 مل من تعليق الحيوانات المنوية بـ 10 ميكرولتر PI أو مع 500 ميكرولتر من محلول ربط مؤقت و 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC في الظلام لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة. تم تحليل الخلايا على الفور بواسطة قياس التدفق الخلوي Epics XL (Beckman Coulter ، Inc.) وباستخدام نظام TetraONE ™ (6915050 ؛ Beckman Coulter ، Inc.). تم تحديد الخلايا في المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج بواسطة تلطيخ أنكسين V إيجابي وخلايا نخرية تم تحديدها بواسطة تلطيخ إيجابي PI.

تحليل احصائي. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS 13. 0 (SPSS، Inc.، Chicago، IL، USA) وتم التعبير عنه على أنه متوسط ​​زائد أو ± الانحراف المعياري كما هو محدد. تم تقييم الاختلافات بين المجموعات من حيث الأهمية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق. ص<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Deserticola

نتائج

آثار WSSJD الجديد على تطور الأنابيب المنوية الخصية. للتحقيق في التأثير الوقائي المحتمل لـ WSSJD الجديد على تطوير الأنابيب المنوية للخصية الفأرية ، تمت مقارنة مورفولوجيا خصيتي الفئران الملطخة H & E تحت المجهر الضوئي. أظهرت الأنابيب المنوية للفئران من مجموعتي CsA و CC انكماشًا في هامش النبيبات ، وانخفاض أقطار النبيبات وتقليل طبقات الظهارة المنوية للخصية مقارنةً بالتحكم. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا المولدة للحيوانات المنوية ترتيبًا مضطربًا ، وانخفض عدد الخلايا المولدة للحيوانات المنوية ، وظهر القليل من الحيوانات المنوية الناضجة في التجويف (الشكل 1). في الفئران من مجموعات DMSO و WSSJD ومجموعات WSSJD الجديدة ، كانت طبقات أكثر من ظهارة الخصية المنوية مرئية وتم دمج هامش النبيبات المنوية بدون انكماش أو انهيار (الشكل 1). لم تختلف درجات Johnsen بشكل كبير بين مجموعة DMSO ومجموعات التحكم ، أو بين مجموعتي CC و DMSO. ومع ذلك ، فقد انخفضت درجة Johnsen بشكل ملحوظ في مجموعة CsA ومجموعة WSSJD مقارنة بمجموعة التحكم ، وزادت درجات WSSJD ومجموعات WSSJD الجديدة بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة CC أو CsA (P.<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">

آثار WSSJD الجديد على هرمون التستوستيرون و LH في الدم. تم قياس مستويات هرمون التستوستيرون و LH في مصل الدم لاحقًا. لم تتأثر مستويات هرمون التستوستيرون و LH في الدم بعد تناول DMSO. على النقيض من ذلك ، تم تقليل مستوى هرمون التستوستيرون في الدم بشكل كبير ، وتم تنظيم LH بشكل كبير في الفئران المعالجة بـ CsA ، مقارنةً بالضوابط (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">

تأثيرات WSSJD الجديد على تعبيرات LHR و P450scc. تم تقييم تعبيرات P450scc و LHR في خلايا Leydig الخصية بواسطة الكيمياء المناعية (الشكلان 3 و 4). في المجموعة الضابطة ، تم التعبير عن LHR على الأغشية الخارجية لخلايا Leydig بين الأنابيب المنوية (الشكل 3 أ) ، وتم التعبير عن P450cc في السيتوبلازم لخلايا Leydig الخصية (الشكل 4 أ). لم يكن للعلاج DMSO أي تأثير معنوي على تعبيرات LHR و P450scc. على النقيض من ذلك ، قلل علاج CsA بشكل كبير من تعبيرات LHR و P450scc مقارنة بفئران التحكم (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">

تأثير WSSJD الجديد على موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية. تم تحليل موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية في خصيتي الفأر بواسطة فحص TUNEL. لوحظت نوى الخلايا المبرمج بشكل أساسي في الحيوانات المنوية والخلايا المنوية الأولية (الشكل 5 أ). تكون الحيوانات المنوية أكبر من الخلايا المنوية وتقع بالقرب من الغشاء القاعدي (23). لم يكن للعلاج بالـ DMSO أي تأثير معنوي على عدد الخلايا المنوية في الخصيتين. على النقيض من ذلك ، أدى العلاج بـ CsA إلى زيادة كبيرة في عدد الخلايا المنوية الأبوطوزية مقارنة بمجموعات التحكم و DMSO (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">

آثار WSSJD الجديد على بقاء وموت الخلايا المبرمج المبكر للحيوانات المنوية. للتحقق من التأثيرات الوقائية لـ WSSJD الجديد ضد موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية الناجم عن CsA ، تم تحديد البقاء على قيد الحياة وموت الخلايا المبرمج المبكر للحيوانات المنوية في البربخ. تم تلوين الحيوانات المنوية البربخية بـ PI أو Annexin V وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي (الشكلان 6 و 7). بعد النتائج المذكورة أعلاه ، أدى علاج CsA إلى خفض نسبة الحيوانات المنوية الحية بشكل كبير وزيادة كبيرة في النسبة المئوية للحيوانات المنوية الأبوطوزية المبكرة (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">

مناقشة

تم توثيقه سابقًا أن استخدام CsA على المدى الطويل كعامل مثبط للمناعة يؤثر على القدرة الإنجابية (6). أفاد Xu (24) أن مورفولوجيا وحيوية الحيوانات المنوية في المرضى الذين عولجوا بـ CsA كانت أقل بكثير من تلك الموجودة في مجموعة غير معالجة ، كما لوحظ في عينات السائل المنوي لـ 26 متلقيًا لزراعة الكلى تم علاجهم بجرعات مختلفة من CsA و 12 متطوعًا سليمًا. ولوحظ أيضًا أن معدلات تشوه الرأس في الحيوانات المنوية كانت أعلى بشكل ملحوظ في المتلقين المعالجين بـ CsA (24). تشير هذه النتائج إلى أن CsA كان له تأثير يعتمد على الجرعة على معايير السائل المنوي. لذلك ، هناك ما يبرر الدراسات لتحديد العوامل الدوائية الجديدة القادرة على التخفيف من تلف الخصية الناجم عن CsA وتحسين القدرة الإنجابية للذكور بعد زرع الأعضاء.

تعزز البيئة المكروية المحددة للخصية تكوين الحيوانات المنوية ، وبالتالي فإن ضعف بنية ووظيفة الخصية قد يؤدي إلى توقف الحيوانات المنوية (25). عالج مونتيرو وآخرون (26) فئران ويستار بجرعة CsA بجرعة 15 مجم / كجم يوميًا لمدة 56 يومًا ، ولاحظوا زيادة في النسبة الحجمية للنسيج الضام وانخفاض النسبة الحجمية لخلايا Leydig في الفئران المعالجة بـ CsA. وقد لوحظ أيضًا أن CsA تسبب في تنكس الظهارة المنوية ، مما أدى إلى تفريغ خلايا سيرتولي ، ونطفة دائرية غير طبيعية وممدودة ، وتراكم السيتوبلازم المتبقي عند حدود الظهارة المجاورة للتجويف (26). في هذه الدراسة ، عولجت فئران كونمينغ بـ 15 مجم / كجم من CsA يوميًا لمدة 30 يومًا ، مما أدى إلى انكماش الأنابيب المنوية وانخفاض أقطارها ، وتقليل طبقات الظهارة المنوية ، وترتيب غير منتظم للخلايا المنوية ، وانخفاض في النضج. الحيوانات المنوية في التجويف وانخفاض درجة جونسن بشكل ملحوظ.

بالإضافة إلى ذلك ، تسبب العلاج بعلاج CsA في إلحاق أضرار بالغة ببنية الخصية. قيمت الدراسة الحالية أيضًا التأثيرات الوقائية لـ WSSJD الجديد ، كدواء صيني جديد ، على خصيتين الفئران المعالجة بـ CsA. لوحظ أن الطبقات الظهارية المنوية للخصية وترتيب الخلايا المنوية قد تمت استعادتها بعد العلاج باستخدام WSSJD الجديد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الفئران في مجموعة WSSJD الجديدة أنابيب منوية متكاملة دون انكماش أو انهيار وكانت درجة جونسن أعلى بكثير مقارنة بالفئران المعالجة بـ CsA. تشير هذه النتائج إلى أن WSSJD قد أصلح بشكل كبير تلف الخصية الناجم عن CsA ، مما يشير إلى أن مركب الأدوية العشبية هذا قد يكون علاجًا فعالًا في الوقاية من تلف الخصية الناجم عن CsA. ما إذا كان إصلاح الخلية يعتمد على مكانة داخل الظهارة أم لا هو سؤال مهم أيضًا ، والذي يجب التحقيق فيه في الدراسات المستقبلية.

يلعب المحور الوطائي - النخامي - الخصوي دورًا مهمًا في تنظيم النشاط التناسلي (27). يتم تنظيم تطور الأعضاء التناسلية الذكرية ووظائفها بواسطة هرمونات من منطقة ما تحت المهاد والغدة النخامية (28). عالج Krueger وآخرون (29) فئران Sprague Dawley بـ 25 مجم / كجم / يوم CsA أو 40 مجم / كجم / يوم CsA لمدة 6 أيام ولاحظوا أن مستويات المصل من LH و FSH زادت بمقدار 2-4 أضعاف ، بينما تعبير P450scc انخفض إلى 30 في المائة من ذلك في المجموعة الضابطة. بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت مستويات هرمون التستوستيرون في الدم بشكل كبير في الفئران المعالجة بـ CsA ، مما أدى إلى ضعف تكوين الحيوانات المنوية (29). في هذه الدراسة ، ثبت أن علاج CsA قلل بشكل كبير من التعبير عن LHR في خلايا Leydig. على الرغم من زيادة مصل LH ، فقد يكون انخفاض التعبير عن LHR قد أضعف الانتعاش بوساطة LH للتخليق الحيوي للتستوستيرون وقلل من التعبير عن P450scc ، باعتباره إنزيم يحد من معدل التخليق الحيوي للتستوستيرون (30) ، مما يؤثر على التخليق الحيوي لهرمون التستوستيرون بواسطة خلايا Leydig. المكونات الجديدة في WSSJD الجديدة ، مثل قرن الوعل ، تظهر تأثيرات مشابهة للهرمونات الجنسية (12) ، والتي قد تحسن مستويات هرمون التستوستيرون في الدم وتقليل مستويات LH في الدم ، وبالتالي زيادة تعبير LHR و p450scc في خلايا Leydig. والجدير بالذكر أن النتائج الحالية أشارت إلى أن WSSJD الجديد حفز التخليق الحيوي للتستوستيرون وإفرازه في خلايا Leydig لتعزيز تكوين الحيوانات المنوية.

الإجهاد التأكسدي الناجم عن CSA وتلف الخصية يؤدي إلى خلل التنسج في الحيوانات المنوية والخلايا المولدة للحيوانات المنوية (31). تم الإبلاغ عن أن علاج CsA طويل الأمد يضر بنظام مضادات الأكسدة في أنسجة الخصية الحيوانية ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات الجلوتاثيون ، والجلوتاثيون بيروكسيديز ، ومستويات بيروكسيد الهيدروجين وزيادة مستويات ديالديهايد المالونيك في الخصيتين (31). لذلك ، لا يمكن القضاء على المستويات الزائدة من أنواع الأكسجين التفاعلية في أنسجة الخصية ، مما يؤدي إلى أكسدة الدهون في غشاء الحيوانات المنوية ، وتلف الحمض النووي ، وانخفاض حيوية الحيوانات المنوية. في هذه الدراسة ، لوحظ أن علاج CsA زاد بشكل كبير من تكسر الحمض النووي ومعدل موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية في الأنابيب المنوية. كما انخفض معدل بقاء الحيوانات المنوية في البربخ ، بينما زادت نسبة الحيوانات المنوية المبكرة في موت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى تضرر نشاط الحيوانات المنوية في الخصيتين بشكل كبير. وثق Türk et al (32) أن التأثير الوقائي لحمض الإيلاجيك على تلف الخصية الناجم عن CsA كان مرتبطًا بالإجهاد التأكسدي في ذكور الجرذان. يحتوي WSSJD الجديد المستخدم في هذه الدراسة على مكونات مختلفة من مضادات الأكسدة ، بما في ذلك الأدوية العشبية الجينسنغ ، والتي سبق أن ثبت أنها تقلل بشكل كبير من مستويات فرط الأكسيد في الخصيتين (14).

في هذه الدراسة ، تم التحقيق في آثار WSSJD الجديد على ضعف تخليق التستوستيرون وموت الخلايا المبرمج الناتج عن CsA ، ولوحظ أن WSSJD الجديد قلل بشكل كبير من معدلات موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية والحيوانات المنوية ، وبالتالي إصلاح الأضرار التي لحقت الخصية المنوية. ظهارة. تم دراسة شكل الأنابيب المنوية للخصية وموت الخلايا المبرمج للخلايا المنوية والحيوانات المنوية باستخدام الكيمياء النسيجية وقياس التدفق الخلوي. على الرغم من عدم التحقيق في توزيع دورة الخلية والإنتاج اليومي للحيوانات المنوية ، إلا أنها ستكون محور الدراسات المستقبلية من قبل مجموعتنا.

زاد WSSJD بشكل كبير من مستويات هرمون التستوستيرون في الخصيتين وقلل من موت الخلايا المبرمج للخلايا المولدة للحيوانات المنوية والحيوانات المنوية ، مما أدى بشكل فعال إلى إصلاح تلف الخصية الناجم عن CsA. تشير هذه النتائج إلى أن WSSJD الجديد قد يكون عاملاً دوائيًا مفيدًا في العلاج والوقاية من تلف الخصية الناجم عن CsA.

Cistanche Deserticola كله روورتس

مراجع

1. Pedersen M و Seetharam A: العدوى بعد زرع الكبد المثلي. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360 ، 2014.

2. Vora GK و Ciolino JB: تفاعل الطعم الخيفي القرني المرتبط بالتهاب غير عيني. Digit J Ophthalmol 20: 29-31 ، 2014.

3. De Pasquale C و Veroux M و Indelicato L و Sinagra N و Giaquinta A و Fornaro M و Veroux P و Pistorio ML: الجوانب النفسية المرضية لزرع الكلى: فعالية فريق متعدد التخصصات. World J Transplant 4: 267-275 ، 2014.

4. El-Gowelli HM و El-Mas MM: التعديل المركزي لارتفاع ضغط الدم الناجم عن السيكلوسبورين. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361 ، 2015.

5. إيد إم إم ، عبد الحميد ع. ، صبحه ، السيدما: تقييم خصائص حركة الحيوانات المنوية لدى متلقي زراعة الكلى المصابين بالعقم باستخدام التحليل المحوسب. Int J Androl 19: 338-344 ، 1996.

6. زهرة أ ، غلام رضا ن ، فاروخي ف ، وشليزار جلالي أ: إضعاف الحيوانات المنوية التي يسببها السيكلوسبورين والتسمم الجنيني عن طريق المستخلص المائي لفاكهة كرياتيجوس مونوجينا. الخلية J 15: 198-205 ، 2013.

7. He Z و Qiu J و LiJ و Zhao D و Chen G و Chen L: التأثيرات طويلة المدى للتحول من السيكلوسبورين إلى الراباميسين على وظيفة الخصية والتشكل في نموذج زرع الفئران. Transplant Proc 45: 763-769 ، 2013.

8. AliRB و KlouzA و Boubaker S و LakhalM و BelkahiaC: نموذج حيواني لسمية الخصية بواسطة السيكلوسبورين: التقييم والحماية. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246 ، 2009.

9. Seethalakshmi L، Flores C، Malhotra RK، Pallas JD، Tharakan D، Khauli RB and Menon M: آلية عمل السيكلوسبورين في تثبيط التستوستيرون الحيوي بواسطة خلايا الفئران Leydig في المختبر. زرع 53: 190-195 ، 1992.

10. SeethalakshmiL و FloresC و CarboniAA و Menon M: الصيانة الكمية لتكوين الحيوانات المنوية في الفئران المعالجة بالسيكلوسبورين عن طريق الإعطاء الخارجي لبروبيونات التستوستيرون. جي أندرول 11: 491-497 ، 1990.

11. Pan XY و Wang XY و Wang XN و Sun ZX و Wang D و Wang X و Yang YY و Li ZX: تأثيرات "Wenshen Shengjing Decoction" على موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيكلوفوسفاميد وتضخم هيستون H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86 ، 2014 (بالصينية).

12. Xu ZH و Li SF و Wang JY و Zhou R و Tian SJ: استخراج هرمون الجنس من قرن الوعل المخملي باستخدام ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003 ، 2007 (بالصينية).

13. Zhao LP و Xu Z و Zhang M و Sun HC و Tang F: تأثيرات Fructus Lycii و Radix astragali على وظيفة خلايا سيرتولي في خصيتي الجرذان. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86 ، 2007 (بالصينية).

14. Xu L و Liu XH و Zhang L: تأثيرات الجينسنوسيدات الكلية على NO و NOS والقدرة المضادة للأكسجين الكلية في خصية الفأر. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508 ، 2006 (بالصينية).

15. Patel DP و Brant WO و Myers JB و Presson AP و Johnstone EB و Dorais JA و Aston KI و Carrell DT و Hotaling JM: سلامة وفعالية سيترات عقار كلوميفين في الرجال الذين يعانون من فرط الأندروجين وتحت الخصوبة. Int J Impot Res 27: 221-224 ، 2015.

16. الشيخ إم جي ، حسني إم بي ، الشنوفي أ ، الغمراوي هـ ، فياض أ و عبد الرحمن س: مزيج من فيتامين إي وسيترات كلوميفين في علاج المرضى الذين يعانون من قلة النطاف مجهول السبب مثل فقد النطاف: تجربة عشوائية محتملة. الذكورة 3: 864-867 ، 2015.

17. Wang R و Xu L و Zhang WX و Wu YF و Shi JH و Zhang YX: Shengjing Granule: دواء صيني فعال لاضطراب الحيوانات المنوية في الفئران. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049 ، 2008 (بالصينية).

18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy، Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68، 1997 (In Chinese).

19. Zhang J ، Li H ، Lu L ، Yan L ، Yang X ، Shi Z and LiD: إن صيغة Yiqi و Yangyin تخفف من إصابة الجهاز المكونة للدم الناجم عن تشعيع الجسم الكلي. J Radiat Res 58: 1-7 ، 2017.

20. Minami M و Konishi T و Jiang Z و Arai T و Makino T: تأثير Shin'iseihaito على تفاعل حساسية الفئران الناجم عن حساسية الأنف. J Tradit Complement Med 6: 252-256 ، 2015.

21. Rong R ، Li RR ، Hou YB ، Li J ، Ding JX ، Zhang CB ، and Yang Y: ماهوانج-إكسكسين-فوزي ديكوتيون يقلل من عدوى فيروس الأنفلونزا في الفئران متلازمة عوز يانغ. J Ethnopharmacol 192: 217-224 ، 2016.

22. Johnsen SG: حساب نقاط خزعة الخصية - طريقة لتسجيل تكوين الحيوانات المنوية في الخصيتين البشرية: القيم الطبيعية والنتائج في 335 من الذكور المصابين بقصور الغدد التناسلية. الهرمونات 1: 2-25 ، 1970.

23. Mays-Hoopes LL و Bolen J و Riggs AD و Singer-Sam J: تحضير الحيوانات المنوية والخلايا المنوية والنطفة المستديرة لتحليل التعبير الجيني باستخدام الفرز الخلوي الفلوري. بيول ريبرود 53: 1003-1011 ، 1995.

24. Xu LG: تأثير السيكلوسبورين أ على معايير السائل المنوي للمرضى بعد زراعة الكلى. J Clin Urol 20: 603-605 ، 2005.

25. Pintus E و Ros-Santaella JL و Garde JJ: ما وراء حجم الخصية: الروابط بين تكوين الحيوانات المنوية وخصائص الحيوانات المنوية في التكاثر الموسمي للثدييات. PLoS One 10: e0139240 ، 2015.

26. Monteiro JC و Predes FS و Matta SL و Dolder H: يقلل حقن Heteropterys aphrodisiaca من الآثار الجانبية للسيكلوسبورين A على الخصية. أنات ريك (هوبوكين) 291: 809-817 ، 2008.

27. Oseko F، Note S، Morikawa K، Endo J، Taniguchi A، and Imura H: تأثير فرط برولاكتين الدم المزمن الناجم عن الكبريتيد على محور ما تحت المهاد - الغدة النخامية - الخصية لدى الرجال الطبيعيين. فيرتيل ستيرل 44: 106-111 ، 1985.

28. Wisniewski P و Romano RM و Kizys MM و Oliveira KC و Kasamatsu T و Giannocco G و Chiamolera MI و Dias-da-Silva MR و Romano MA: إن تعرض البالغين للبيسفينول A (BPA) في فئران ويستار يقلل من جودة الحيوانات المنوية مع الاضطراب من محور ما تحت المهاد - الغدة النخامية - الخصية. علم السموم 329: 1-9 ، 2015.

29. Krueger BA و Trakshel GM و Sluss PM و Maines MD: اكتئاب سيكلوسبورين بوساطة مستقبلات الهرمون اللوتيني والتخليق الحيوي للهيم في خصيتي الفئران: آلية محتملة لانخفاض هرمون التستوستيرون في الدم. طب الغدد الصماء 129: 2647-2654 ، 1991.

30. Nolan CJ و Payne AH: يحدد النمط الجيني في موضع P450scc الاختلافات في كمية بروتين P450scc وإنتاج التستوستيرون الأقصى في خلايا Leydig الفأرية. مول إندوكرينول 4: 1459-1464 ، 1990.

31. Türk G و Ateşahin A و Sönmez M و Yüce A و Ceribaşi AO: يحمي اللايكوبين من السمية الخصية التي يسببها السيكلوسبورين في الجرذان. علم التوليد 67: 778-785 ، 2007. 32. Türk G ، Sönmez M ، Ceribaşi AO ، Yüce A ، و Ateşahin A: توهين الأضرار التي يسببها السيكلوسبورين A في الخصية والحيوانات المنوية المرتبطة بالإجهاد التأكسدي بواسطة حمض الإيلاجيك. Int Immunopharmacol 10: 177-182 ، 2010.