اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

الرجاء النقر هنا للجزء 2

Cistanche له تأثير اعصاب جيد جدا

غابرييل غونزاليس 1،2 ، جيوري غرز 1 ، كوزيمو والتر ديكونتو 1 ، بيتر كا أونوفسك 2 وميروسلاف سترناد 1،2 ، *

1 - مختبر منظمات النمو ، معهد علم النبات التجريبي التابع لأكاديمية العلوم التشيكية ،

وكلية العلوم ، جامعة Palacký ، Šlechtitel ˚u 27 ، CZ -78371 Olomouc ، جمهورية التشيك ؛

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (جي جي) ، jiri.gruz@upol.cz (JG) ، waldacun@gmail.com (CWD)

2. قسم المخ والأعصاب بمستشفى أولوموك الجامعي وكلية الطب وطب الأسنان.

جامعة Palacký أولوموك ، CZ {{0} أولوموك ، جمهورية التشيك ؛ Petr.Kanovsky@fnol.cz

* المراسلات: miroslav.strnad@upol.cz ؛ هاتف: بالإضافة إلى 420-585-634-850

الملخص: السيتوكينينهي هرمونات نباتية قائمة على الأدينين تنظم العمليات الرئيسية في النباتات ، مثل انقسام الخلايا والتمايز ، ونمو الجذور والبراعم ، والهيمنة القمية ، والتفرع ، وإنبات البذور. في الدراسات الأولية ، أظهروا أيضًا أنشطة وقائية ضد الأمراض التنكسية العصبية التي تصيب الإنسان. لتوسيع المعرفة بالحماية (النشاط الوقائي) الذي يقدمونه ، قمنا بالتحقيق في الأنشطة الطبيعيةالسيتوكينيناتضد السمية الناتجة عن السالسولينول (أمرض الشلل الرعاشنموذج) والموت الناجم عن الغلوتامات (Glu)الخلايا العصبيةمثل خلايا الدوبامين SH-SY5Y. وجدنا أن الكينتين -3- جلوكوزيد ، وسيز-زياتين ريبوسيد ، و N 6- إيزوبنتنيل أدينوزين كان نشطًا في نموذج PD المستحث بـ SAL. بالإضافة إلى ذلك ، أدى ترانس ، و cis-zeatin ، و kinetin جنبًا إلى جنب مع ديفيروكسامين (DFO) ومثبط نخر التنخر 1 (NEC -1) إلى خفض معدلات موت الخلايا بشكل ملحوظ في النموذج المستحث بالجلو. كشفت فحوصات اللاكتات ديهيدروجينيز أنالسيتوكينيناتالمقدمة أقلاعصابمن DFO و NEC -1. علاوة على ذلك ، فقد قللوا من أنشطة caspase apoptotic -3 / 7 بدرجة أقل من DFO. ومع ذلك ، فإنالسيتوكينيناتله تأثيرات مشابهة جدًا لـ DFO و NEC -1 على إنتاج جذور الأكسيد الفائق. بشكل عام ، أظهروا نشاطًا وقائيًا في نموذج SAL المستحث بـمرض باركنسونعصبيموت الخلايا والنموذج المستحث بالجلو للضرر التأكسدي بشكل رئيسي عن طريق تقليل الإجهاد التأكسدي.

الكلمات الرئيسية: سيتوكينين. هرمون نباتي. حماية الأعصاب. خلايا SH-SY5Y تشبه الخلايا العصبية ؛ السمية الخلوية. السالسولينول. الغلوتامات. الاكسدة؛ مرض الشلل الرعاش

مصنع cistancheعلى الآثارحماية الأعصاب

1 المقدمة

مرض الشلل الرعاش(PD) هو ثاني أكثر أمراض التنكس العصبي المرتبطة بالحركة شيوعًا ، ومن المتوقع أن يرتفع عدد الحالات المشخصة عالميًا من 6 ملايين في عام 2015 إلى أكثر من 12 مليون بحلول عام 2040 [1]. يتميز بأعراض حركية مرتبطة بتنكس معين وفقدان ما يقرب من 30-70 بالمائة من الدوبامين (DA)الخلايا العصبيةفي المادة السوداء بارس كومباكتا وإسقاطاتها على المخطط [2،3]. تتضمن بعض السمات المميزة الجزيئية المعروفة للـ PD الإجهاد التأكسدي والتأكسدي المعزز ، والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا [4-7] ، والإثارة [8] ، واليوبيكويتين / خلل في نظام البروتوزوم [9] ، وتضخم الخلايا العصبية [10]. العلاجات الحالية لها آثار جانبية مختلفة ولا تقدم سوى تخفيف الأعراض [11] ، لذلك هناك جهود مكثفة لتطوير عقاقير ذات تأثيرات علاجية فعالة على انحلال DAالخلايا العصبية. الموارد التي قد تساعد مثل هذه الجهود تشمل المركبات الطبيعية التي تميل إلى أن يكون لها آثار جانبية أقل. في جملة أمور ، مواد من Ginkgo Biloba (Ginkgetin ، Ginkgolide ، bilobalide) ، الجينسنغ (الجينوسيدات) ، وأظهرت Avonoids (Baicalein ، Kaempferol ، Rutin ، و Luteolin) نشاطًا واقعيًا واسعًا في الطرز المختل (بما في ذلك خط الخلايا العصبية البشرية. -SY5Y) وفي نماذج الجسم الحي من PD المستحثة بواسطة 1،1'-dimethyl -4 ، 4'-bipyridinium dichloride (باراكوات) ، 1- methyl - 4- phenyl -1 ، 2،3 و 6- تتراهيدروبيريدين (MPTP) و 1- ميثيل -4- فينيل بيريدينيوم (MPP plus) و 6- هيدروكسيدوبامين (6- OHDA) [12].

ركزت الدراسة المقدمة هنا على تأثيرات فئة من الهرمونات النباتية الطبيعية تسمىالسيتوكينينات(CKs) ومستقلباتها ، وهي منظمات معروفة جيدًا لانقسام الخلايا ، ونموها ، وتمايزها ، وشيخوخة الأوراق في النباتات [13]. من الناحية الهيكلية ، فإن CKs عبارة عن مشتقات أدينين يتم استبدالها في الموضع N 6- إما بسلسلة prenyl (isopentenyl) أو sidechain عطري. تشمل الأشكال الطبيعية 6- (E) -4- hydroxy -3- methyl ولكن -2- enylaminopurine (trans- zeatin، tZ) ، 6- (Z) -isomer ( cis-zeatin، cZ)، N 6- isopentenyl adenine (iP)، 6- benzyl amino purine (BAP)، 6- furfurylaminopurine (kinetin، K)، and ortho-، meta-، والمشتقات شبه الهيدروكسيلية أو الميثوكسيلية من BAP ، تسمى توبولين (oT ، mT ، pT ، MeoT ، MemT ، MepT). تحدث أيضًا العديد من 9- ريبوسيدات و 9- نيوكليوتيدات بالإضافة إلى 7- و 9 و O- جلوكوزيدات من هذه الأشكال بشكل شائع ، كما هو موضح في الجدول 1. بالإضافة إلى أدوارها الأصلية في النباتات ، أظهرت CKs نشاطًا قويًا مضادًا للأكسدة تجاه أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي توفر الحماية في العديد من نماذج الإجهاد في المختبر للاضطرابات المرتبطة بالشيخوخة [14].

الجدول 1. هياكلالسيتوكينيناتوعوامل التحكم الإيجابية.

على وجه الخصوص ، يقال أن CKs لها نشاط وقائي للخلايا في نماذج مثل H2O 2- الذي يسبب موت الخلايا من الخلايا الجذعية البشرية [15] والإجهاد السكري الناجم عن D-galactose في الخلايا النجمية للجرذان [16]. والأهم من ذلك أنهم أظهروا في هذا السياقاعصابالتأثيرات في النماذج المتعلقة بالأمراض التنكسية العصبية مثل PD العائلي ، ومثبط البروتوزوم MG {0}} المستحث أو السمية التي يسببها H2O 2- في خلايا SH-SY5Y [17] ، الضرر التأكسدي الناجم عن Glu لحصين الفئران HT22عصبيالخلايا [18] ، ونموذج خلية PC12 لمرض هنتنغتون [19]. تشير دراسات أخرى إلى أن الأنشطة الوقائية لـ CKs تتضمن تعديلًا مباشرًا [20،21] وغير مباشر [15،16،22] لأنظمة الأكسدة الخلوية. بالإضافة إلى الأنشطة المضادة للأكسدة المميزة لـ CKs ، يقال إن لها تأثيرات تنظيمية في الميتوكوندريا التي تعززعصبيقابلية البقاء [17]. علاوة على ذلك ، يمكن لـ K تثبيت إمكانات غشاء الميتوكوندريا وزيادة إنتاج ATP ، وبالتالي التخفيف من الموت الناجم عن Glu لخلايا HT22 [18]. ومع ذلك ، على الرغم من النتائج المتعلقة بتأثيراتها في العديد من النماذج ، هناك معرفة محدودة بالنشاط الوقائي لـ CKs في الشكل الأكثر شيوعًا (المتقطع) من PD.

لمعالجة فجوة المعرفة الموضحة أعلاه ، قمنا بتقييم منهجي لتأثيرات CKs الطبيعية ومستقلباتها في نموذجين في المختبر: نموذج مستحث بالسالسولينول (SAL) من PD ونموذج مستحث بالجلوتامات (Glu) للضرر التأكسدي فيالخلايا العصبية-مثل خلايا SH-SY5Y. تم استخدام هذا الخط بسبب النمط الظاهري للدوبامين ، والحساسية لسموم الدوبامين مثل SAL ، والتكوين الملائم لمجموعات مستقرة نسبيًا منعصبيخلايا ذات معدلات تكاثر منخفضة بعد التعرض لمدة 48 ساعة لحمض الريتينويك المتحول بالكامل (ATRA) لمدة 48 ساعة (ATRA) [23-25].

عصبونتم تعريض الخلايا المشابهة للسموم الداخلية / الذيفان الخارجي لتقليد أمراض PD من خلال خلل في نظام الأكسدة الخلوي: استنفاد الجلوتاثيون (GSH) ، وتثبيط كل من إنزيم مضادات الأكسدة (Cu / Zn superoxide disutase and catalase) وأنشطة الميتوكوندريا المجمعات (الأول والثاني) ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج والنخر [26]. في النموذج الآخر ، يتسبب Glu في حدوث ضرر مؤكسد مميت عن طريق تعطيل نظام الأكسدة والاختزال. تم استخدام كلا النموذجين في خط الخلايا SH-SY5Y سابقًا في دراسات الحماية العصبية [26،27].

تم اختبار الأنشطة الواقية للخلايا و / أو مضادات الأكسدة المتعلقة بالاضطرابات التنكسية لـ K و iP و BAP و iPR و tZR وقواعدها المجانية ، و (كما هو موضح أعلاه) تم العثور على بعض CKs لديها أنشطة وقائية فيعصبيالخلايا. ومع ذلك ، لم تفحص أي دراسات منشورة مسبقًا الهيكل-اعصابعلاقة النشاط (SAR) من CKs الطبيعية (الجدول 1). لذلك ، تم إجراء هذه الدراسة لفحصهااعصاب(مضاد-مرض باركنسون) أنشطة جميع CKs المعروفة التي تحدث بشكل طبيعي تقريبًا في نماذج SAL- و Glu المحددة للتنكس العصبي. أولاً ، قمنا بتقييم قدرة امتصاص جذري الأكسجين لكل من CKs (ORAC) و (في اختبارات السلامة) السمية الخلوية تجاهالخلايا العصبية-مثل خلايا SH-SY5Y. بعد ذلك ، قمنا بتقييم التأثيرات الوقائية للأعصاب للمركبات وتأثيرها على مستويات الإجهاد التأكسدي عن طريق قياس إنتاج الفائق (O2.) (dihy- droethidium ، DHE assay) و caspase apoptotic -3 ، 7 أنشطة. توفر النتائج أول مؤشرات منهجية تم الإبلاغ عنها للعلاقات بين هياكل CK الطبيعية واعصابأنشطة.

سيستانش هيربالديه جيد جدااعصابتأثير

2. النتائج والمناقشة

2.1. قدرة امتصاص الأوكسجين الجذري للسيتوكينين (ORAC)

نظرًا لأن الأمراض التنكسية العصبية مرتبطة بارتفاع الإجهاد التأكسدي ، فإن النشاط المضاد للأكسدة يلعب دورًا رئيسيًا في دفاعاتعصبيالخلايا. لتقييم الإمكانات البيولوجية لـ CKs في هذا الصدد ، تم تحديد قدرة مضادات الأكسدة بواسطة ORAC ، والتي تستخدم عادة لتحديد قدرة المواد المضادة للأكسدة [28]. تم التعبير عن قدرة مضادات الأكسدة كمكافئات ترولوكس (TE) ، والتي تحدد فعالية (أقل إلى أعلى) من المركبات من ترولوكس على أساس متساوي المولي. توضح النتائج الواردة في الجدول 1 أن التوبولين (oT و mT و pT) وريبوزيداتها (oTR و mTR و pTR) لها أنشطة عالية من مضادات الأكسدة ، والتي ربما ترتبط ارتباطًا وثيقًا بالنظام الغني بالإلكترون في C {{ 3}} بدائل هيدروكسي بنزيل الأمينية. على الرغم من قيم ORAC العالية ، لم يكن التوبولين عاليًااعصابنشاط. ومع ذلك ، فإن العديد من CKs غير المتجانسة بما في ذلك K (N {{0} furfurylaminopurine) وغير العطري cis-zeatin-O-glucoside (cZOG) ، والذي يحتوي على 4- هيدروكسي -3- methylbut {{7} } ar -1- yl) الأميني البديل ، أظهر أيضًا قدرة عالية من مضادات الأكسدة (الجدول 2). نواتج أيضات CK الأخرى - بما في ذلك كينتين -3- جلوكوزيد (K3G) ، كينتين ريبوسيد 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

فوائد cistanche الجذعيةعلىضد مرض الزهايمر

2.2. تمايز خلايا SH-SY5Y

لدراسة CKsاعصابالتأثيرات ، تم تمييز خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y (المختارة لأسباب موصوفة بالفعل [23]) بالتعرض لـ 10 ميكرومتر من ATRA لمدة 48 ساعة كما هو موضح سابقًا [23 ، 24]. تم تلطيخها بعد ذلك باستخدام مجموعة أدوات تلوين الأغشية لفحص الاختلافات المورفولوجية بين الخلايا غير المتمايزة والخلايا المتباينة. كما هو مبين في الشكل 1 أ ، فإن ملفالخلايا العصبيةشبيهة بالخلايا المتمايزة ، نمت بشكل أقل كثافة ، وأطول فترة ، وأنتجت عددًا أكبر من العصبونات (المشار إليها بالسهام الصفراء في الشكل) من الخلايا غير المتمايزة. تمت ملاحظة هذه التغيرات المورفولوجية المرتبطة بالتمايز سابقًا ، حتى بعد التعرض الأقصر (24 ساعة) لـ ATRA [24،30]. الأهم من ذلك ، أن عدد العصبونات يرتفع بشكل كبير إلى المستوى الذي يمكنهم فيه إنشاء شبكة نيوريت. لهذا السبب ، تم قياس صلاحية الخلية لمقارنة معدل انتشار خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة والمتباينة. تم اعتبار جدوى SH-SY5Y غير المتمايزة هي الحد الأقصى لمعدل الانتشار. النتائج موجودة في

يوضح الشكل 1 ب أن معدل الانتشار (الذي تم تقييمه بواسطة مقايسة جدوى Calcein AM) لـ SH-SY5Y قد انخفض بنسبة 23 بالمائة بعد 48 ساعة من علاج ATRA.

الشكل 1. (أ) الصور المجهرية الفلورية لخلايا SH-SY5Y ذات الأغشية الملطخة باستخدام مجموعة نمو Neurite (Invitro-gen ™): التحكم ، الخلايا غير المتمايزة (المعرضة لمحلول معالجة وهمي:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

الجدول 2. قدرة امتصاص جذور الأكسجين (ORAC) للاختبارالسيتوكينينات(CKs) معبرًا عنها كمكافئات ترولوكس (TE) على أساس متساوٍ. يتم عرض الأسماء والاختصارات والهياكل الخاصة بـ CKs في الشكل 1.

2.3 السمية الخلوية للسيتوكينينات تجاه خلايا SH-SY5Y الشبيهة بالخلايا العصبية

في اختبارات السمية الخلوية المحتملة لـ CKs باستخدام مقايسة جدوى Calcein AM [31] أظهر معظمها سمية منخفضة تجاهالخلايا العصبية-مثل خلايا SH-SY5Y. تم اعتبار انخفاض الصلاحية إلى أقل من 90 في المائة بمثابة عتبة للتأثير السمي العصبي. الاستثناءان الوحيدان هما KR (11.9 بالمائة) و ​​pTR (10.5 بالمائة) ، وفقًا للنتائج السابقة التي وجدها البعضسيتوكينينقد يكون للمستقلبات ، وخاصة الريبوسيدات ، تأثيرات سامة للخلايا [32]. لم تتسبب مبيدات الريبوسيدات الأخرى ، مثل cZR و iPR و oTR و mTR في انخفاض واضح فيالخلايا العصبية-مثل قابلية بقاء خلايا SH-SY5Y (الجدول 3). تم استخدام DFO [33،34] و NEC -1 [35،36] كعناصر تحكم إيجابية في نموذج المختبر الخاص بنا والتي أثبتت أيضًا من خلال دراسات أخرى على خلايا SH-SY5Y أنها غير سامة. في الختام ، أظهرت المشتقات KR و pTR بشكل أساسي قابلية أقل للبقاء من 90 في المائة ، وبالتالي اعتبرت أقل إثارة للاهتمام لمزيد من التقييم في كل من النماذج المختبرية للتنكس العصبي.

الجدول 3. صلاحية الخليةالخلايا العصبيةمثل خلايا SH-SY5Y بعد التعرض لهاالسيتوكينيناتلمدة 24 ساعة. يتم التعبير عن الصلاحية كنسبة مئوية من تحكم DMSO.

2.4 تحديد السيتوكينينات الواقية من الأعصاب في النموذج المستحث بـ SAL لـ PD

لهذه الاختبارات ،عصبيتم تمييز خلايا SH-SY5Y لمدة 48 ساعة ثم تمت معالجتها بالاشتراك مع 5 0 0 uM SAL وكل CK بثلاثة تركيزات (0.1 ، 1 ، 10 ميكرومتر). كما يتضح من الخط المنقط في الشكل 2 أ ، أدى تطبيق السم العصبي SAL عند 500 ميكرومتر إلى تقليل صلاحية خلايا SH-SY5Y المتمايزة ، وفقًا لمقايسة Calcein AM ، بنسبة 30 بالمائة. تم استخدام N-acetylcysteine ​​(NAC) كعنصر تحكم إيجابي في هذه الاختبارات نظرًا لتأثيره الوقائي العصبي الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا في نفس النموذج المختبر القائم على الخلية SH-SY5Y [37]. تم استخدام تركيزات 10 و 100 و 1000 ميكرومتر NAC للحث على الانتعاش الجزئي أو شبه الكامل في نموذج SAL. كان NAC قادرًا على زيادة قابلية بقاء الخلية عند تركيز 100 ميكرومتر و 1 ملي مولار ، وهو ما يقابل 83.39 ± 1.74 في المائة و 89.21 ± 2.89 في المائة ، على التوالي. تم استخدام النشاط الوقائي لـ NAC عند 100 ميكرون (المشار إليه بالخط المتقطع في الشكل 2 أ) كعتبة فاعلية لاختيار CKs لمزيد من الاختبارات. وفقًا لهذا الإعداد ، لوحظت أنشطة الحماية العصبية المهمة بيولوجيًا مع K3G عند 10 ميكرومتر (81.84 ± 2.36 بالمائة) ، cZR عند 0.1 ميكرومتر (81.14 ± 2.30 بالمائة) و ​​1 ميكرومتر (81.53 ± 2.24 بالمائة) و ​​iPR عند 1 uM (82.43 ± 2.51 بالمائة). وهكذا ، كان iPR و cZR فعالين في حماية الأعصاب بتركيزات منخفضة أو شبه ميكروية أقل من NAC. السيتوكينينكشف الفحص أيضًا أن العديد من المستقلبات الأخرى يمكن أن تزيد بشكل معتدل من قابلية خلايا SH-SY5Y المتمايزة المعرضة لـ SAL. ومع ذلك ، كان لبعض CKs المختبرة (بما في ذلك tZR و tZMP و mT و mTR و pT و pTR) تأثير وقائي ضئيل للغاية.

الشكل 2. (أ)اعصابنشاطالسيتوكينيناتو N-acetylcysteine ​​(NAC) في النموذج المستحث بـ SAL لـ PD onالخلايا العصبية-مثل خلايا SH-SY5Y. يُظهر الخط المتقطع عتبة تأثير NAC التي عندهاالسيتوكينيناتتم اختيارهم لمزيد من الاختبارات ؛ يحسب الخط المنقط بعد ذلك عدد الخلايا الحية في اختبار Calcein AM بعد معالجة الخلايا بـ 5 0 0 uM SAL ؛ خلايا تحكم صحية (CTR ، DMSO <0.1 بالمائة).="" ثلاث="" نسخ="" في="" ثلاثة="" أيام="" منفصلة="" على="" الأقل.="" (ب)="" موت="" الخلايا="" الطبيعي="" sh-sy5y="" بعد="" تلطيخ="" يوديد="" البروبيديوم.="" ثلاث="" نسخ="" في="" خمسة="" أيام="" مستقلة="" على="" الأقل.="" *="" p="" مقارنة="" بالمركبة="" مع="" 500="" um="" sal="" ،="" #="" p="" مقارنة="" بالمركبة="" بدون="" 500="" um="">

للتأكيد ، أكثر أنشطة CKs الطبيعية النشطة المضادة للـ PD ، تم تحديد معدلات موت الخلايا الإجمالية عن طريق تلطيخ بروبيديوم يوديد (PI) ، والذي (على عكس اختبارات الجدوى القائمة على التمثيل الغذائي للخلايا) يصنف فقط الخلايا التي تعاني من ضعف في سلامة الغشاء ، والخلايا الميتة ، والخلايا الميتة بالفعل [38]. تم تطبيع النتائج فيما يتعلق بمعدل موت الخلايا بعد العلاج بـ SAL وحده (تم تعيينه بنسبة 100 في المائة). كما هو مبين في الشكل 2 ب ، خفضت مادة التحكم الإيجابية في NAC بشكل ملحوظ معدلات موت الخلايا عند كل من 100 و 1000 ميكرومتر (إلى 77.3 ± 2.21 في المائة و 77.5 ± 4.44 في المائة ، على التوالي). بشكل عام ، أثبتت NAC أنها أاعصابعامل له أنشطة مماثلة لتلك المسجلة في دراسات أخرى بطريقة تعتمد على الجرعة (في نطاق 5 0 - 5 0 0 أوم) لخلايا SH-SY5Y [37]. أظهر اختبار PI أيضًا أن CKs cZR و K3G و iPR لها أنشطة وقائية ، خاصةً cZR ، مما أدى إلى خفض معدل موت الخلية إلى 71.6 ± 5.08 بالمائة عند 0.1 ميكرومتر. على عكس cZR ، عكست K3G التأثيرات المعتمدة على الجرعة ، مع أقصى نشاط عند 10 ميكرومتر (خفض معدل موت الخلية إلى 75.0 ± 3.69 بالمائة) وبلغ نشاط NPR ذروته عند 1 ميكرومتر (خفض المعدل إلى 73.9 ± 4.99 بالمائة). مجتمعة ، كما هو موضح في الشكل 2 ، قدمت CKs قابلة للمقارنةاعصابالنشاط إلى 100 ميكرومتر NAC وفقًا لمقايسات الجدوى والسمية الخلوية. علاوة على ذلك ، كانت التركيزات الفعالة لـ CKs مثل cZR و iPR أقل بكثير من تلك الموجودة في NAC ، في نطاقات الميكرومولار والميكرومولار. تشير الملاحظات السابقة التي تم الحصول عليها بعد التلوين المزدوج باستخدام PI والملحق V / PI إلى أن K قد يقلل موت الخلايا المبرمج [39] ، وبالتالي قمنا أيضًا بالتحقيق في تأثيرات CKs و NAC على الإجهاد التأكسدي و caspase -3 ، التنشيط 7 (بئر- علامة موت الخلايا المبرمج المعروفة).

2.5 تقلل السيتوكينينات من تكوين الراديكالي الناجم عن الأكسيد الفائق

الإجهاد التأكسدي (OS) هو مساهم مرضي رئيسي في العديد من الأمراض العصبية التنكسية ، وكلاهما SAL (عند> 1 0 0 أوم) ورباعي هيدرو إيزوكينولين هما محفزات قوية لنظام التشغيل [26،40]. وبالتالي ، قمنا أيضًا بقياس تكوين الأكسيد الفائق (علامة ROS وعلامة نظام تشغيل مهمة) في وجود SAL مع وبدون CKs أو NAC المحددة. للتأكد من أن SAL تسبب تلفًا كافيًا في نظام التشغيل في خلايا SH-SY5Y للكشف عن الاستجابات ، تم تعريض الخلايا لـ 500 ميكرومتر سال لمدة 24 ساعة ، كما في العمل السابق [37] ووفقًا للنتائج المعروضة أعلاه. تم تلطيخ الخلايا بعد ذلك بواسطة ثنائي هيدرو إيثيديوم (DHE) للكشف عن تكوين جذري للأكسيد الفائق [41،42]. كما يتضح من الشكل 3 أ ، لوحظت الخلايا بصريًا بعد وضع العلامات باستخدام DHE (الذي يوفر إشارات التألق الأحمر بعد التفاعل مع الأكسيد الفائق). تسبب SAL في حدوث ارتفاع واضح في تألق DHE ، بالنسبة إلى المستويات الموجودة في الخلايا الخاضعة للتحكم والخلايا المعالجة بـ NAC. علاوة على ذلك ، كان لثلاثة CKs (cZR و K3G و iPR) تأثيرات بصرية مماثلة لـ NAC (100 أوم) على تألق DHE. علاوة على ذلك ، كان القياس الكمي الطيفي فيما يتعلق بالمستويات المكتشفة في الخلايا التي عولجت بواسطة SAL وحده (تم تعيينه بنسبة 100 في المائة) ، متماشياً مع الملاحظة المجهرية. كما هو مبين في الشكل 3 ب ، كان مستوى الأكسيد الفائق الطبيعي في خلايا التحكم الصحية (CTR) أقل من 39 في المائة ، وقدمت مادة التحكم الإيجابية NAC انخفاضًا متوسطًا إلى كامل في إنتاج ROS الناجم عن SAL عند 100 و 1000 ميكرومتر (إلى 76.3) ± 4.33 و 44.3 ± 5.12 بالمائة) ، مما يشير إلى أن استنفاد الجلوتاثيون (GSH) يلعب دورًا رئيسيًا في النموذج [26]. ومن المثير للاهتمام ، أن SAL تسبب في انخفاض كبير في محتويات GSH لخلايا SH-SY5Y مصحوبًا بارتفاع نظام التشغيل ، إلى مستويات مماثلة لتلك التي لوحظت سابقًا في دراسة سجلت أيضًا تأثيرات NAC على قابلية الخلية للحياة وموت الخلايا ومحتويات الجلوتاثيون [43] . تظهر النتائج المقدمة هنا أن NAC خفضت أيضًا تكوين جذري للأكسيد الفائق إلى المستويات القاعدية (أي المستويات في عناصر التحكم المعالجة بـ DMSO). تم اختبار ريبوسيدات CK بتركيزات نشطة (0.1-1 ميكرومتر) جنبًا إلى جنب مع K3G ، وقلل بشكل كبير محتويات جذرية الأكسيد الفائق للخلايا إلى المستويات التالية (بالنسبة إلى تلك الموجودة في الخلايا المعالجة بـ SAL وحده): cZR 80.34 ± 5.99 بالمائة عند 0.1 ميكرومتر ؛ K3G 77.1 ± 4.89 بالمائة عند 10 أمتار ؛ iPR 79.2 ± 5.91 بالمائة عند 1 ميكرومتر ، مقارنة بتأثيرات 100 ميكرومتر NAC. بشكل جماعي ، تشير العروض المتعامدة بقوة إلى أن النشاط الفعال المضاد لنظام التشغيل يلعب دورًا رئيسيًا في التأثيرات الوقائية لـ NAC و CKs في نموذج PD المستحث بـ SAL. كما لاحظ مؤلفون آخرون وجود علاقة بين تحسين نظام التشغيل وحماية الأعصاب [29] ، ووجدت العديد من الدراسات أن K و BAP يمكنهما تحسين أنشطة نظام التشغيل بشكل مباشر [44] من خلال تكوين مجمعات تحتوي على أيونات Cu2 بالإضافة إلى أيونات ، مما يؤدي إلى ديسموتاز الفائق- مثل النشاط [45،46]. ومع ذلك ، فقد تم وصف CKs أيضًا كمضادات أكسدة غير مباشرة ذات تأثيرات توسطها تحريض العامل النووي الكريات الحمر 2- مسار الاستجابة لمضادات الأكسدة (iPR) المرتبط بالعامل 2 (NRF2) [22] أو الاستعادة الجزئية للجلوتاثيون بيروكسيديز وأنشطة SOD ( ك) [16]. بالإضافة إلى ذلك ، ورد أن K لديهاعصابأنشطة ضد إصابة نظام التشغيل التي يسببها H2O2 في خلايا SH- SY5Y [17]. يمكن أن يفسر كلا النوعين من النشاط المضاد لـ ROS المُبلغ عنه لـ CKs تأثيرات cZR و K3G و iPR في تقليل جذور الأكسيد الفائق في نموذج PD لخلية SH-SY5Y المستحثة بـ SAL [47-50].

الشكل 3. (أ) الصور الدقيقة التي تظهر الإجهاد التأكسدي الناجم عن SAL وأنشطة الحد من الإجهاد التأكسديالسيتوكينيناتمتمايزة في الإنسانالخلايا العصبية- مثل خلايا SH-SY5Y التي يتم تصورها بواسطة الفحص المجهري للإسراع بعد وضع العلامات على ثنائي هيدرو إيثيديوم (DHE). أشرطة=50 أم. تُظهر الصور الخلايا المعالجة بمحلول DMSO (عناصر التحكم) ، 5 0 0 uM salsolinol (SAL) وحده ، ومجموعات من 500 uM SAL و 1000 uM NAC (بالإضافة إلى NAC) ، و 0.1 uM cZR (بالإضافة إلى cZR) ؛ 10 uM K3G (بالإضافة إلى K3G) ، 1uM iPR (بالإضافة إلى iPR) لمدة 24 ساعة قبل تلطيخها باستخدام DHE. (ب) تشكيل جذري للأكسيد الفائق الناجم عن SAL وسيتوكينينأو نشاط وقائي N-acetylcysteine ​​(NAC). يوضح الرسم البياني التحديد الكمي للخلايا المصبوغة بـ DHE باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة In-nite M200 Pro (Tecan ، النمسا). ثلاث نسخ في خمسة أيام مستقلة على الأقل. * P مقارنة بالمركبة مع 500 uM SAL ، # P مقارنة بالمركبة بدون 500 uM SAL.