الجزء 2: يحفز إشيناكوسيد موت الخلايا السرطانية المبرمج عن طريق تثبيط إنزيم تعقيم تجمع النيوكليوتيدات MTh1

يحفز إشيناكوسيد موت الخلايا السرطانية المبرمج عن طريق تثبيط إنزيم تعقيم تجمع النيوكليوتيدات MTh1

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com

سيستانش إشنكوسايدلديهامضاد للسرطانومضاد موت الخلايا المبرمجتأثيرات

الرجاء النقر هنا للجزء 3

الرجاء النقر هنا للجزء 1

نتائج

تحديد Echinacoside كمثبط MTh 1

للبحث عن مركبات طبيعية قادرة على تثبيط MTH1 ، استخدمنا MTH 1- التفاعل الأنزيمي المحفز باعتباره إنتاجية عالية في اختبار الفحص المخبري. إلى جانب نيوكليوتيدات البيورين المؤكسدة ، يمكن لـ MTH1 أيضًا تحلل ثلاثي فوسفات deoxyguanosine العادي لتوليد أحادي فوسفات deoxyguanosine و pyrophosphate. في ظل وجود فائض من البيروفوسفاتيز غير العضوي ، يتم تحويل جميع البيروفوسفات إلى فوسفات غير عضوي ، والذي يمكن قياسه باستخدام مقايسة الامتصاص ذات الأساس الأخضر من الملكيت ، مما يسمح بالقياس غير المباشر لنشاط MTH1. تأثير (S) -crizotinib ، مركب ذو فاعلية مثبتة كمثبط MTH1. وآخرون (72 نانومتر) .33 كان هذا على الأرجح بسبب الاختلافات في طرق الكشف أو مصادر المواد الكيميائية والإنزيمات. اعتمدنا نهجًا أقل حساسية للكروموجينيك ، بينما استخدم Huber وآخرون طريقة تلألؤ بيولوجي شديدة الحساسية .33 مع وضع ذلك في الاعتبار ، قمنا بفحص 12 مركبًا طبيعيًا متاحًا تجاريًا (الجدول S1) ، كل منها مكون رئيسي من الأعشاب التقليدية مع مضادات الأورام المحتملة. نشاط.إشيناكوسايد، مركب منقى من نبات طبي طفيلي Cistanche salsa (الشكل 1C) ، منع بشكل كبير التفاعل (الشكل 1B) ، مع IC50 من 7.01 ± 2.13 ميكرومتر (الشكل 1D). إضافة 50 مرة أكثر من البيروفوسفاتيز ليس له تأثير على النتيجة بينما إضافة خمسة أضعاف أكثر من بروتين MTH1 يقلل بدرجة كبيرة من درجة التثبيط ، مما يشير إلى أنإشيناكوسايديمنع على وجه التحديد نشاط MTH1 في المقايسة الأنزيمية في المختبر.

يثبط Echinacoside الخلوي MTh 1 لزيادة الأكسوج داخل الخلايا 8-

بعد ذلك ، سألنا إذاإشيناكوسايديمكن أن تمنع نشاط MTH1 داخل الخلايا. سيؤدي تثبيط MTH1 الخلوي إلى زيادة 8- oxoG داخل الخلايا. لقد ثبت أن Avidin يرتبط بـ 8- oxoG بدقة عالية ؛ 42 لذلك ، استخدمنا تلطيخ الفلورسنت المناعي مع Cy 3- أفيدين المقترن لمقارنة مستويات oxoG داخل الخلايا 8- في خطوط الخلايا السرطانية المختلفة قبل و بعد، بعدماإشيناكوسايدعلاج او معاملة. MG البشري {0} الساركوما العظمية ، SK-HEP -1 سرطان الكبد ، MCF -7 سرطان الثدي ، وخلايا سرطان القولون والمستقيم SW480 تمت معالجتها بـ 0 ميكرومتر ، 15 ميكرومتر ، 30 ميكرومتر ، 60 ميكرومتر أو 80 ميكرومتر إشيناكوسايد لمدة 5 ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة. أظهر التلوين باستخدام Cy 3- أفيدين المقترن أن العلاج باستخدام 60 ميكرومتر من إشيناكوسايد لمدة 24 ساعة أدى بشكل واضح وكبير إلى زيادة مستوى 8- مادة oxoG الخلوية (Cy 3- avidin التفاعلية) في هذه الخلايا السرطانية ( الشكل 2 أ و ب). تركيز أعلى (80 ميكرومتر) منإشيناكوسايدأدى إلى تلطيخ خلوي أقوى 8- oxoG (الشكل 2 ب) ، مما يشير إلى وجود علاقة بين الجرعة والاستجابة. تم الحصول على نتائج مماثلة

عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر -8- oxoG (الشكل S1A) .43 تركيزإشيناكوسايد(60 ميكرومتر) المطلوبة لزيادة كبيرة في أوكسوج الخلوي 8- كان أعلى بكثير من IC50 (7.01 ميكرومتر) من الفحص في المختبر. كان هذا على الأرجح بسبب الاختلاف في حساسية المقايسين. التلوين المناعي أقل حساسية بكثير من المقايسة الأنزيمية في المختبر ؛ علاوة على ذلك ، يتأثر عدد جزيئات المثبط التي يمكن أن تصل وتتفاعل مع MTH1 الخلوي بالعمليات البيولوجية المعقدة ؛ بالإضافة إلى ذلك ، في الفحص في المختبر ، يتم استخدام dGTP الأقل تفضيلاً كركيزة ، وبالتالي قد يكون من الأسهل (تناول مثبطات أقل) تثبيط MTH1 ، مما يؤدي إلى انخفاض IC50 في الاختبار في المختبر.

المضاد للسرطانومضادات الأكسدةآثارإشنكوسايدمنسيستانشالصحراء

يتم إنتاج oxoG الخلوي بواسطة ROS ، الذي يعاديه مضادات الأكسدة. وبالتالي ، فإن الزيادة في ROS الخلوية أو قمع نشاط مضادات الأكسدة سيؤدي أيضًا إلى زيادة في مستوى oxoG الخلوي 8-.إشيناكوسايدهي نفسها أحد مضادات الأكسدة القوية ، وبالتالي يجب أن تعزز نشاط مضادات الأكسدة بدلاً من كبتها. لفحص ما إذا تم تغيير مستوى ROS الخلوي بواسطةإشيناكوسايدالعلاج ، تم علاج نفس الخلايا السرطانية بـ 0 ميكرومتر ، 15 ميكرومتر ، 30 ميكرومتر ، 60 ميكرومتر ، أو 80 ميكرومتر إشيناكوسايد لمدة 5 ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة ثم تم تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد التلوين بالفلوريسنت مسبار 2 ′ ، 7′-dichlorofluorescein ثنائي أسيتات. وأظهرت النتائج أن أيا من هذه العلاجات غيرت مستويات ROS الخلوية (الشكل 2C و D). وبالتالي ، فإن زيادة مستوى oxoG الخلوي 8- ناتج على الأرجح عن تثبيط MTH1 بواسطة Echinacoside.

إشنكوسايدتسبب في أضرار واسعة النطاق للحمض النووي في الخلايا السرطانية تحديدًا ، سيؤدي دمج 8- oxoG في الحمض النووي إلى تحفيز BER و MMR ، مما يؤدي إلى حدوث فجوات وثغرات في الحمض النووي أحادية السلسلة. آليات الإصلاح التي تنطوي على ملء الفجوة والربط بواسطة بوليميرات الحمض النووي والليغازات. لفحص ما إذا كانإشيناكوسايد- أدت الزيادة الناتجة في 8- oxoG الخلوية إلى تلف الحمض النووي ، وفحصنا إحدى العلامات المبكرة لتلف الحمض النووي ، 53BP1 ، والذي يرتبط بمواقع DSB باعتباره أول استجابة خلوية لـ DSB.48 The MG -63 ، SK-HEP -1 و MCF -7 و SW48 0 خطوط الخلايا السرطانية وخلايا الخلايا غير السرطانية في الكبد الطبيعي البشري L-O2،49 الكلية الجنينية البشرية HEK 293 والأرومة الليفية للفأر NIH / تمت معالجة 3T3 بـ 0 ميكرومتر ، 15 ميكرومتر ، 30 ميكرومتر ، 60 ميكرومتر ، أو 80 ميكرومتر إكيناكوسيد لمدة 5 ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة. أظهر التلوين المناعي الفلوري أن العلاج بـ 60 ميكرومتر من إشيناكوسايد لمدة 24 ساعة على وجه التحديد زاد من عدد الخلايا التي تحتوي على خمسة أو أكثر من بؤر 53BP1 النووية الملطخة بقوة في جميع أنواع السرطان ولكن ليس في أي من خطوط الخلايا غير السرطانية (الشكل 2E و F). شوهد زيادة كبيرة في عدد الخلايا زائد 53BP1 في أقرب وقت 5 ساعات بعد بدء العلاج Echinacoside (الشكل 2F). أدى التركيز العالي (80 ميكرومتر) من Echinacoside أو وقت العلاج الأطول (12 ساعة و 24 ساعة) إلى زيادات أكبر في كل من عدد الخلايا زائد 53BP1 (الشكل 2F) وعدد البؤر الخلوية 53BP1. تشير هذه النتائج معًا إلى أن تثبيط MTH1 بواسطة Echinacoside تسبب في 8- تراكم oxoG وتلفًا واسعًا للحمض النووي في السرطان ولكن ليس في الخلايا غير السرطانية.

قمع إشنكوسايد تكاثر الخلايا السرطانية

في خلايا الدوران ، ستؤدي فواصل حبلا الحمض النووي غير المعالجة إلى انهيار شوكات تكرار الحمض النووي ، مما سيؤدي بعد ذلك إلى إعاقة تكاثر الخلايا عن طريق تحريض إيقاف دورة الخلية والاستماتة .50 للتحقق من آثارإشيناكوسايدفيما يتعلق بنمو الخلايا وتكاثرها ، حللنا أولاً نمو الخلايا السرطانية المعالجة بإكينيكوزيد MG -63 ، و SK-HEP -1 ، و MCF -7 ، و SW480 عن طريق فحص تكوين المستعمرة. أظهرت النتائج أن الخلايا السرطانية عولجت بـ 60 ميكرومتر أو 80 ميكرومترإشيناكوسايدشكلت مستعمرات أقل بكثير ، وكانت المستعمرات التي تشكلت أصغر بكثير (الشكل 3 أ و ب) ، مما يشير إلى إمكانات النمو المكبوتة إلى حد كبير. بعد ذلك ، قمنا بتحليل تكاثر هذه الخلايا السرطانية ، جنبًا إلى جنب مع الخلايا غير السرطانية L-O2 و HEK 293 و NIH / 3T3 عن طريق اختبار MTT. أظهرت النتائج أن جرعة إشيناكوسايد التي تعتمد على الجرعة تمنع انتشار السرطان ولكن ليس الخلايا غير السرطانية (الشكل 3 ج). أظهرت دراسة الدورة الزمنية للخلايا السرطانية المعالجة بـ 60 ميكرومتر من إشيناكوسايد أنه بعد 5 ساعات ، لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعات العلاج غير المعالجة ، ولكن بعد 12 ساعة ، تم منع تكاثر الخلايا السرطانية بشكل كبير بمقدار 60 ميكرومتر.إشيناكوسايد(الشكل ثلاثي الأبعاد).

كشفت مراحل دورة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي ذلكإشيناكوسايدخفضت جرعة العلاج بالاعتماد على النسبة المئوية للخلايا في كل من مرحلتي S و G2 / M ، بينما زادت النسبة المئوية للخلايا في المرحلة G1 (الشكل 4C و D). بعد معالجة 8 0 ميكرومتر من Echinacoside لخلايا MG -63 لمدة 24 ساعة ، انخفضت الخلايا في طور G2 / M من 15 بالمائة إلى ما يقرب من الصفر ، وانخفضت الخلايا في المرحلة S من 37 بالمائة إلى 17 بالمائة ، بينما زادت الخلايا في مرحلة G0 / 1 من 43 بالمائة إلى 80 بالمائة (الشكل 4E). تشير هذه النتائج إلى أن العلاج بـإشيناكوسايدتسبب في توقف دورة الخلية وحظر الخلايا السرطانية في المرحلة G1.

يسبب موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية

تمشيا مع الملاحظات على تكاثر الخلايا ، أظهر تحليل اللطخة الغربية أن العلاج بـ 60 ميكرومتر و 80 ميكرومترإشيناكوسايدلمدة 24 ساعة زادت مستويات الكاسباس النشط -3 والبوليميريز المشقوق بولي (ADP-ribose) في الخلايا السرطانية (الشكل 5 أ و ب) ، مما يشير إلى تحريض موت الخلايا المبرمج المعتمد على كاسباس. ثم قمنا بفحص العديد من العلامات الخلوية لموت الخلايا المبرمج. أولا ، مورفولوجيا النوويةإشيناكوسايدتم الكشف عن الخلايا السرطانية المعالجة عن طريق تلطيخها بصبغة الحمض النووي DAPI ، والتي أظهرت أن العلاج لمدة 24 ساعة بـ 60 ميكرومتر و 80 ميكرومترإشيناكوسايدزيادة عدد السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج ، بما في ذلك التقرح والكروماتين المكثف (نوى أكثر إشراقًا) (الشكل 5 ج). ثانيًا ، تم تحليل الحمض النووي المستخرج من الخلايا السرطانية المعالجة بالمثل عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام الاغاروز ، مما كشف عن نمط سلم موت الخلايا المبرمج النموذجي (الشكل S1B). أخيرًا ، تم اكتشاف الكاسبيز النشط الخلوي -3 من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي ، والذي كشف عن إشارات كاسباس نشطة قوية -3 فيإشيناكوسايد- علاج الخلايا السرطانية (الشكل S1C).

بعد ذلك ، تم قياس النسبة المئوية للخلايا المبرمجية بواسطة تلطيخ مزدوج في Annexin V-FITC و PI وقياس التدفق الخلوي. تحليل الخلايا المعالجة بـ 0 ميكرومتر ، 15 ميكرومتر ، 30 ميكرومتر ، 60 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، أو 160 ميكرومترإشيناكوسايدلمدة ساعتين أو 5 ساعات أو 12 ساعة أو 24 ساعة أظهرت أن 60 ميكرومتر أو تركيزات أعلى منإشيناكوسايدتسبب في موت الخلايا المبرمج الكبير في الخلايا السرطانية MG -63 و SK-HEP -1 و MCF -7 و SW480 (الشكل 6 أ) ، ولكن ليس في الخلايا السرطانية L-O2 و HEK 293 و خلايا NIH / 3T3 (الشكل S2). بعد معالجة خلايا MG -63 بـ 60 ميكرومتر ، 80 ميكرومتر ، أو 160 ميكرومترإشيناكوسايدلمدة 24 ساعة ، زادت نسبة الخلايا المبرمج من 8.89 في المائة إلى 33.72 في المائة و 39.01 في المائة و 48.12 في المائة على التوالي (الشكل 6 أ). أظهرت دراسة الدورة الزمنية أنه بعد 5 ساعات ، لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعات المعالجة والمعالجة ، ولكن لوحظ موت الخلايا المبرمج بشكل كبير بعد العلاج بتركيزات 60 ميكرومتر أو أعلى من Echinacoside لمدة 12 ساعة (الشكلان 6B و S3).

أخيرًا ، أظهر قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا بواسطة الصبغة الفلورية JC -1 بوضوح فقدًا بارزًا لإمكانات غشاء الميتوكوندريا بعد العلاج بـ 60 ميكرومترإشيناكوسايدلمدة 12 ساعة (الشكل 6 ج) ، ولكن ليس بعد 5 ساعات ، مما يشير إلى تنشيط مسار الاستماتة الجوهري بعد تلف الحمض النووي الناتج عن oxodG 8- المرتفعة.

المضاد للسرطانوالآثار المضادة للالتهاباتcistanche إشنكوسايد

مناقشة

إشيناكوسايدهو مركب طبيعي معزول عن النباتات الطبية Cistanche و echinacea 51،52 وقد ثبت أنه يمتلك خصائص ترويجية صحية ووقائية متعددة الاستخدامات ، بما في ذلك الحماية العصبية ، وحماية الكبد ، ومضادات الالتهاب ، ومضاد التعب ، ومضاد التورم ، ومضادات السكري ، والأنشطة المضادة للأورام. 53-58 أفضل نشاط حيوي معروف ومقبولإشيناكوسايدهو تأثيره المضاد للأكسدة وكسح ROS ؛ 44،45 ومع ذلك ، فقد ثبت أيضًا أنه يسبب أضرارًا مؤكسدة للحمض النووي في الخلايا السرطانية ، مع بقاء الآليات الأساسية غير واضحة. الفحص ، وجدنا ذلكإشيناكوسايدمنع التفاعل الأنزيمي المحفز MTH 1- بشكل فعال. أدت زيادة كمية إنزيم MTH1 إلى تقليل درجة التثبيط بينما لم تؤثر زيادة كمية البيروفوسفاتاز غير العضوي على التثبيط ، مما يشير إلى أن إشيناكوسايد يثبط على وجه التحديد نشاط MTH1 في الفحص في المختبر. تسبب علاج سلالات الخلايا السرطانية البشرية المختلفة باستخدام Echinacoside في ارتفاع ملحوظ في مستوى oxoG الخلوي 8- دون تغيير مستوى ROS الخلوي. بالنظر إلى أن Echinacoside نفسه هو أحد مضادات الأكسدة القوية ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن زيادة مستوى oxoG داخل الخلايا من المحتمل أن يكون ناتجًا عن تثبيط MTH1 الخلوي بواسطة Echinacoside.

العلاج بإشيناكوسايدتسبب في أضرار واسعة النطاق للحمض النووي وزيادة كبيرة في تنظيم مانع G1 / S-CDK p21 ، والذي أعقبه موت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ وقمع تكاثر الخلايا على وجه التحديد في السرطان ولكن ليس في الخلايا غير السرطانية. علاوة على ذلك ، هناك خسارة بارزة في إمكانات غشاء الميتوكوندريا بعد

إشيناكوسايدأشار العلاج إلى تنشيط مسار الاستماتة الجوهري.إشيناكوسايد- لوحظ حدوث تلف في الحمض النووي الناجم عن انتفاخ البروتين p21 في غضون 5 ساعات من العلاج ، بينما لوحظ موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية ، وتعطل إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتثبيط النمو بعد 12 ساعة من بدء العلاج. تدعم هذه البيانات أن موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية وتثبيط النمو كانا نتيجة لأضرار واسعة النطاق للحمض النووي بسبب تثبيط MTH1. أظهرت الدراسات الحديثة أن تقليل حجم تجمع dNTP الخلوي يمكن أن يؤدي أيضًا إلى إجهاد تكرار الحمض النووي وتلف الحمض النووي. 59،60 ومع ذلك ، فإن زيادة بنسبة 200 في المائة في مستوى أوكسوج 8- في الخلايا السرطانية المعالجة بإكيناكوزيد يعارض احتمال انخفاض حجم تجمع dNTP ، و Bcl2 ، وهو بروتين يقلل من حجم تجمع dNTP ، انخفض بشكل ملحوظ 60 في الخلايا السرطانية SW480 المعالجة بـ Echinacoside ؛ علاوة على ذلك ، أظهرت بياناتنا بوضوح أن Echinacoside يثبط بشكل مباشر MTH1 ، والذي يمكن أن يكون على الأقل مسؤولة جزئياً عن أضرار الحمض النووي والتأثيرات الخلوية التي يسببها إشيناكوسايد.

يعتبر تجمع dNTP هدفًا حاسمًا لـ ROS ، وتعد dNTPs المؤكسدة مصادر مهمة لأضرار الحمض النووي المؤكسد. عدم التجانس ومعدلات الطفرات العالية في الخلايا السرطانية. في المقابل ، يستهدف تثبيط MTH1 النمط الظاهري الذي يميز معظم الخلايا السرطانية عن الخلايا الطبيعية ، وبالتالي يمثل استراتيجية جديدة مضادة للسرطان لا تقتصر على التكيفات الجينية. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم تطوير مضادات الجزيئات الصغيرة للبروتين المضاد للخلايا Bcl266،67 ومناهضات بروتين proapoptosis Bax68 وتم إثبات أنها عوامل جديدة واعدة مضادة للسرطان. نظرًا لآليات عملها التكميلية ، فإن الجمع بين مثبطات MTH1 والمواد الكيميائية المعززة للاستماتة سيخلق جيلًا جديدًا مثيرًا من الأدوية المضادة للسرطان.

لأول مرة ، أظهرنا وظيفة جديدة لـ Echinacoside كمركب طبيعي مضاد للسرطان. في الفحص في المختبر ، قام Echinacoside بتثبيط MTH1 بـ IC50 من 7.01 ميكرومتر. قيمة IC50 هذه أعلى من تلك الخاصة بمثبطات MTH1 التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن. ، من المرجح أن يكون IC الفعلي 50 من Echinacoside أقل. ومع ذلك ، لتطويره كعامل علاجي ، من المحتمل أن تكون هناك حاجة إلى تحسين فعالية جزيء Echinacoside الطبيعي. كمنتج طبيعي تم استخدامه كدواء عشبي لفترة طويلة ، يمكن أن يكون Echinacoside بمثابة سقالة كيميائية جيدة لتطوير مثبطات MTH1 الفعالة والآمنة. لتصميم الأدوية المعتمد على الهيكل العقلاني ، 70 نهجًا مشابهًا لما استخدمناه هنا ،

جنبًا إلى جنب مع الاهتمامات الواسعة بالمنتجات الطبيعية لاكتشاف الأدوية ، ستكون مفيدة في العثور على عقاقير جديدة فعالة وآمنة تعتمد على الهدف.

سيستانشإشنكوسايدلديهامضاد للسرطانوتعزيز المناعة