الجزء 2: Echinacoside يحمي من MPP plus - الخلايا العصبية الناتجة عن موت الخلايا المبرمج عن طريق تنظيم مسار ROS / ATF3 / CHOP

إشيناكوسايديحمي من موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن MPP plus عبر تنظيم مسار ROS / ATF3 / CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3،4 • Ling Ye5،6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com

الرجاء النقر هنا للجزء 1

الرجاء النقر هنا للجزء 3

سيستانش إشنكوسايدله خصائص مضادة للأكسدة

تلطيخ المناعي

1 مليمول / لتر MPP ؟، 4 0 LG / mL ECH ، أم مزيج من MPP؟ و ECH. تم تحضين الخلايا بعد ذلك في مخزن مؤقت مانع (3 بالمائة من مساحة سطح الجسم في برنامج تلفزيوني) عند درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تم تخفيف الأجسام المضادة لـ ATF3 ، أو anti-CHOP ، أو الكاسبيز 3 المضاد للانقسام إلى 1: 100 في عازل منع (1٪ BSA في PBS مع 0.3٪ Triton X -100) وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تحضين الخلايا بـ Alexa 488- goat anti-rabbit IgG (Life Technologies ، Carlsbad ، CA) في RT لـ

1 ح. تم تلوين النوى بـ Hoechst 33342. تم التقاط الصور بمجهر متحد البؤر (Leica SP8 ، Wetzlar ، ألمانيا).

مقايسة Deoxynucleotidyl Transferase بوساطة dUTP ذات نهاية رفيعة (TUNEL)

قمنا بتلوين كل قسم إكليلي عاشر (إجمالي 14-15) عبر SNc من بريجما -2. 92 نانومتر إلى -3 .64 ملم.

تم استخدام أربعة أقسام نموذجية من خلال SNc في نفس المستوى في كل مجموعة لحساب TH و TUNEL [10]. تم إجراء فحوصات TUNEL لتحليل موت الخلايا المبرمج في أقسام الأنسجة باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا في الموقع (Roche ، Rotkreuz ، سويسرا) ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بعد وسم الحمض النووي ، تم استخدام المقاطع لتلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ TH ، وتم التقاط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر (Leica SP8 ، Wetzlar ، ألمانيا). بعد ترسيم SNc بتأثير منخفض (10 9 أهداف) وفقًا لأطلس دماغ الفأر [20] ، تم حساب الخلايا الموجبة لـ TH / TUNEL والخلايا الموجبة المزدوجة لـ TH / TUNEL بتكبير أعلى ({{7} } أهداف) بواسطة مراقبين أعمى عن العلاج. تم حساب نسبة الخلايا الموجبة المزدوجة TH / TUNEL إلى الخلايا الإيجابية لـ TH.

سيستانشيشيناكوسيد لديهمضاد التهابالخصائص

تحليل احصائي

يتم تقديم جميع البيانات على أنها متوسط ​​± SD. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا بتحليل لاحق مع Tukey's HSD واختبار مقارنات متعددة Student-Newman-Keuls لأغراض إحصائية. تم اعتبار قيمة P \ 0. 05 ذات دلالة إحصائية.

نتائج

يقلل ECH من منتجات ROS ويضعف

MPP 1- موت الخلايا المبرمج المستحث

لقد ثبت أن ECH يحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج في النماذج الحيوانية ، وكذلك يقلل من مستويات السيتوكينات الأولية في خلايا الورم الأرومي العصبي [12]. ومع ذلك ، يبقى من غير الواضح ما إذا كانت ECH تعدل بشكل مباشر موت الخلايا المبرمج الناتج عن MPP ؟. أظهرت بياناتنا أن ECH لم يؤثر على تكاثر أو موت خلايا SH-SY5Y (الشكل 1 ب) ، وبقيت شكلها دون تغيير (الشكل 1 ج). ومن المثير للاهتمام ، أنه بعد تعرض خلايا SH-SY5Y لـ MPP؟ ، ازداد معدل البقاء على قيد الحياة بطريقة تعتمد على الجرعة بعد علاج ECH (10-40 lg / mL) (الشكل 1 ب ، ج).

أظهرت الدراسات السابقة أن MPP؟ يثبط بشكل خاص سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا ويرتبط أيضًا بتوليد ROS [6 ، 21]. باستخدام DCFH-DA كمسبار uorescent لتقييم التغييرات في مستويات ROS ، وجدنا أن صدى قمع بشكل ملحوظ توليد ROS الناجم عن MPP (الشكل 2A). كشف الفحص المجهري متحد البؤر أن منتجات ROS المنخفضة كانت مرتبطة بمستويات ECH (الشكل 2C). أظهر ECH أيضًا أنه يحمي غشاء الخلية ضد ROS ويقلل من مستويات MDA ، المنتج النهائي لأكسدة الدهون (الشكل 2 ب). إلتقطناها معا،

يعزز ECH بقاء الخلية عن طريق تقليل منتجات ROS الناتجة عن MPP في الخلايا العصبية.

يمنع ECH التعبير الجيني المستحث المتعلق بالإجهاد / MPP 1- ويزيد GDNF

التعبير في MPP 1- الخلايا المعالجة

لقد ثبت أن منتجات ROS تحفز استجابة البروتين غير المطوية وتحفز التعبير عن الجينات المرتبطة بالتوتر ، بما في ذلك ATF3 و ATF4 و CHOP [22]. يلعب ATF3 و CHOP دورًا مهمًا بشكل خاص في موت الخلايا المبرمج العصبي الناجم عن الإجهاد [9 ، 23]. يعد تعبير a-synuclein غير الطبيعي أيضًا أحد العلامات الحاسمة في علم أمراض PD [2]. باستخدام qRT-PCR ، قمنا بتحليل تعبير ATF3 و CHOP و SNCA وعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) في MPP؟ نموذج الخلية ووجدت أن MPP؟ عزز بشكل ملحوظ التعبير عن ATF3 و CHOP و SNCA مقارنة بمجموعة التحكم في PBS. لم تؤثر ECH على التعبير عن هذه الجينات في خلايا SH-SY5Y التي لم يتم علاجها بـ MPP ؟. ومع ذلك ، فإن ECH أبطل التعبير الناتج عن MPP (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، MPP؟ قمع بشكل كبير التعبير عن GDNF في خلايا SH-SY5Y ، لكن ECH عكس هذه الظاهرة جزئيًا (الشكل 3 ب).

يمنع ECH تنشيط MPP 1- Caspase المستحث -3 في خلايا SH-SY5Y

المستويات العالية من ATF3 و CHOP تعزز بشكل مباشر موت الخلايا المبرمج للخلايا العصبية [9 ، 23]. أظهرت بياناتنا أن ECH تثبط تعبير ATF3 و CHOP بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 4 أ). منعت ECH أيضًا caspase الناتجة عن MPP -3

النشاط (الشكل 4 أ ، ب). أظهر تحليل التألق المناعي للشكل المشقوق من الكاسبيز -3 كذلك أن ECH قلل بشكل ملحوظ من تعبير بروتين الكاسبيز المشقوق -3 في الخلايا المعالجة بـ MPP (الشكل 4 ج).

يعكس ECH MPP 1- تراكم ATF3 و CHOP المستحث في خلايا SH-SY5Y

بعد التعرض للسموم البيئية ، تتمركز بروتينات ATF3 و CHOP في السيتوبلازم والنواة [24 ، 25] ، وهذا يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. نتائجنا تشير إلى أن MPP؟ زاد العلاج من تعبير ATF3 و CHOP في النواة ، وخفف ECH بشكل فعال هذه العملية (الشكل 5 أ ، ب). أظهر تحليل النشاف الغربي أن MPP؟ زيادة ملحوظة في مستويات كل من البروتينات في السيتوبلازم والنواة. ومن المثير للاهتمام ، أن ECH ألغت MPP؟ التأثيرات وتراكم ATF3 و CHOP المكبوت في النواة (الشكل 5C-E).

يلعب ATF3 دورًا حاسمًا في موت الخلايا المبرمج المستحث في MPP 1- في خلايا SH-SY5Y

لقد ثبت أن ATF3 يحفز موت الخلايا المبرمج في خلايا SH-SY5Y [23] ، وتشير نتائج الدراسة الحالية إلى أن ECH يمنع بشكل كبير ATF3 mRNA وتعبير البروتين الناجم عن MPP؟ في هذه الخلايا. ومع ذلك ، ظل دور ATF3 في موت الخلايا المبرمج وحماية ECH لبقاء الخلية غير واضح. لذلك استخدمنا نوعًا صغيرًا من RNA (shRNA) لدبابيس الشعر من أجل ATF3 للتحقيق في ذلك ولم نجد أي فرق في الجدوى بين مجموعة ضربة قاضية ATF 3- ومجموعة التحكم في الظروف العادية (الشكل 6 أ). ومع ذلك ، فإن قمع ATF3 أو علاج ECH أنقذ بشكل كبير التغيرات المورفولوجية التي يسببها MPP؟ (الشكل 6 ب). تتمتع خلايا ضربة قاضية ATF 3- بصلاحية أعلى من المجموعة الضابطة بعد التعرض لـ MPP؟ (الشكل 6 ج). كانت مستويات البروتين لـ CHOP و caspase المنشط -3 أقل في خلايا ضربة قاضية ATF 3- عنها

في خلايا التحكم مع shRNA غير محدد (الشكل 6C ، D). أشارت هذه البيانات إلى أن ATF3 يلعب دورًا مهمًا في موت الخلايا المبرمج الناتج عن MPP لخلايا الورم الأرومي العصبي. لذلك ، تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن ECH يحمي خلايا SH-SY5Y ضد التأثيرات الناتجة عن MPP من خلال تقليل التنظيم لمسار ROS / ATF3 / CHOP. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت بياناتنا أن ECH أيضًا قد أعاق الزيادة الناتجة عن MPP لمستويات p53 و PUMA (p 53- المُعدِّل المنتظم لموت الخلايا المبرمج) في خلايا SH-SY5Y (الشكل 7).

سيستانشإشنكوسايدله تأثير في التعزيزحصانة

ECH يحمي الخلايا العصبية DA من موت الخلايا المبرمج

مستحث بواسطة MPP1 في المختبر أو MPTP في الجسم الحي

لتأكيد عمل ECH في PD ، تم علاج الخلايا العصبية DA الأولية باستخدام MPP؟ أو MPP؟ و ECH. كشفت التجارب في المختبر أن MPP؟ قلل بشكل كبير من صلاحية الخلايا العصبية DA وتم منع ذلك بواسطة ECH

(الشكل 8). قمنا أيضًا بتقييم موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DA في SNc بعد علاجات مختلفة في الفئران باستخدام PD والضوابط التي يسببها MPTP. تم العثور على عدد أكبر من الخلايا العصبية إيجابية TH في هذه المنطقة في مجموعة التحكم مقارنة بمجموعة MPTP (الشكل 9 أ). أظهرت فحوصات TUNEL أن NS و ECH لم يحرضا على موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DA في SNc ، لكن MPTP قام بذلك وقام ECH بحماية الخلايا العصبية ضده (الأشكال 9 ب ، S2). ومن المثير للاهتمام ، أن النشاف الغربي لمحلول SNc من نموذج الفأر لـ PD أظهر أن مستويات البروتين ATF3 و CHOP قد انخفضت أيضًا بواسطة ECH (الشكل 10).

سيستانشإشنكوسايدلديهتأثير مضاد للاستماتة