الجزء 2 من طفرات ERCC1 تعرقل إصلاح تلف الحمض النووي وتتسبب في اختلال وظائف الكبد والكلى لدى المرضى

جهة الاتصال: ali.ma@wecistanche.com

انقر هنا للجزء 1

الجزء 2

انقر فوق Cistanche NZ لمرض الكلى

مناقشة

حالة جديدة ثنائية الأليلاتERCC1الطفرات فردين فقط مع ثنائي الأليلاتERCC1تم الإبلاغ عن الطفرات حتى الآن ، وكلاهما عرض ميزات تشبه CS. كان لدى الفرد الأكثر تضررًا (165TOR) متغير هراء (Q158X) ومتغير خطأ F231L في نموذج (HhH) 2 من ERCC1 (الشكل S5 F) ، أظهر تأخرًا في النمو ، وفشلًا في النمو ، وتقلصات ، وتوفي بعد السنة الأولى من العمر بسبب الالتهاب الرئوي (Jaspers et al. ، 2007). كان الفرد المصاب الثاني (CS20LO) يعاني من تقلصات وصغر الرأس وفرط التوتر وكان متماثل الزيجوت بالنسبة لمتغير الخطأ F231L وتوفي في السنة الثانية من العمر (Kashiyama et al. ، 2013).

أبلغنا عن شقيقين مع ثنائي الأليلاتERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) وأليل فارغ بسبب حذف داخل الجين موروث من الأم. يحمل كل بروتين ERCC1 المتبقي المعبر عنه في خلايا من هؤلاء المرضى استبدال الأحماض الأمينية R156W ، والذي يعطل جسر الملح بين بقايا R156 موجبة الشحنة وبقايا D129 المتقابلة سالبة الشحنة الموجودة أسفل جيب ربط XPA مباشرة في المجال المركزي منERCC1. تأثير هذا الاستبدال ذو شقين: (1) يقلل بشدة من الاستقرار الكلي لـ ERCC1 وشريكه الملزم XPF ، و (2) يؤثر بشكل خاص على التفاعل مع XPA (الشكل 9).

انخفاض مستويات البروتين النووي لـ ERCC1 بسبب سوء التشكيل الجزئي

كشفت تحليلات اللطخة الغربية والتألق المناعي أن الإجماليERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) في الذاتيةERCC1موضع RPE 1- من خلايا hTERT. ومن المثير للاهتمام ، أن الخسارة الكاملة لـ ERCC1 في الفئران أدت إلى الموت في غضون 4 أسابيع ، بينما أدت زيادة مستويات البروتين إلى حوالي 15 في المائة من المستويات في الفئران WT إلى زيادة العمر الافتراضي خمسة أضعاف (Weeda et al. ، 1997) ، مما يشير إلى أنه حتى المستويات المنخفضة من ERCC1 زيادة كبيرة في إمكانية البقاء. تمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها ، أظهرت الدراسات السابقة أن الطفرات الخاطئة في المجال المركزيERCC1بشكل عام يسبب زعزعة الاستقرار (Sijbers et al.، 1996b) ، مما يشير إلى أن هذه المنطقة مهمة لاستقرار البروتين.

تم الإبلاغ مؤخرًا عن بنية المجهر الإلكتروني المبردة للطول الكاملERCC1-XPF heterodimer (جونز وآخرون ، 2020) يكشف أنERCC1R156يقع البقايا على حافة مغاير مغاير. نتوقع أن الزيادة الهائلة والهيكل الإلكتروني المتغير لاستبدال الأرجينين بالتريبتوفان لا يزعج فقط جيب ربط XPA ولكن أيضًا واجهة dimerization بين المجال المركزي لـ ERCC1 ومجال nuclease لـ XPF ، مما يتسبب في زعزعة الاستقرار العام (الشكل. S5 F). من المثير للاهتمام ، أن متغير الخطأ XPFR799W يقع في نفس الواجهة على جانب XPF (الشكل S5 F) ويؤدي أيضًا إلى زعزعة الاستقرار وانخفاض مستويات بروتين XPF بشدة (موري وآخرون ، 2018). في أحد الأفراد المتأثرين (CALIF1010) الذي قدم ميزات تشبه CS و progeroid القطاعية ، تم توريث متغير XPFR799W جنبًا إلى جنب مع حذف جيني في أليل XPF الآخر ، مما أدى إلى خلل NER قوي مقترن بعيب إصلاح خفيف لـ ICL (Mori et al.، 2018) ، على غرار الأشقاء المذكورين في هذه الدراسة.

تعبير خارج الرحم من نسخة محفزة منERCC1R156Wمكننا لمدة 24 ساعة من الوصول إلى مستويات WT لهذا البروتين الطافر ، مما أدى إلى تحديد موقع خاطئ في السيتوبلازم ، وتقليل التفاعل مع XPF ، وزيادة التفاعل مع مرافق طي البروتين ، كما اكتشفه مرض التصلب العصبي المتعدد. هذه النتائج كلها تدعم فكرة أنERCC1R156Wيتم طيها جزئيًا بشكل خاطئ ومتحلل في خلايا المريض ، مما يؤدي إلى انخفاض بنسبة -80 في مستويات البروتين النووي ERCC1. يدعم KI لـ ERCC1R156W في خلايا hTERT RPE 1- هذا الاستنتاج.

عند مقارنة ملفERCC1ومستويات البروتين XPF في خلايا PV46LD و PV50LD مع تلك الموجودة في خلايا الأفراد الأكثر تضرراً (165TOR و CS20LO) ، لاحظنا أن هذه المستويات كانت قابلة للمقارنة ، أو ربما أقل ، في خلايا الأشقاء الموصوفين في هذه الدراسة (الشكل 3). C and Fig. S3، E and F؛ Jaspers et al.، 2007؛ Kashiyama et al.، 2013). لاحظ أن CS20LO متماثل الزيجوت لـ ERCC1F231L ، بينما 165TOR متغاير الزيجوت ويحمل توقفًا سابقًا لأوانه على الآخرERCC1أليل (Q158X). تشير هذه النتائج إلى أنه بالإضافة إلى انخفاض مستويات البروتين ، يجب أن تؤخذ وظيفة البروتين الطافرة التي لا يزال يتم التعبير عنها والجمع بين الأليلين الطافرين في الاعتبار كمعدل محتمل لشدة النمط الظاهري والتعبيرية.

ERCC1R156W: التأثير التفاضلي على 1- مسارات إصلاح الحمض النووي المعتمدة على ERCC

لقد مكننا التعبير عن ERCC1R156W-GFP في خلايا KO 1- بمستويات مماثلة لـ ERCC1WT من فصل تأثير استبدال الأحماض الأمينية على استقرار البروتين من التأثير على وظائف البروتين. في حين أن البروتين ERCC1R156W الطافر كان ضعيفًا بشدة في تفاعله المستحث بالأشعة فوق البنفسجية مع XPA والأسماك وفشل في التوطين بكفاءة في مواقع آفات الحمض النووي المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية ، ما زلنا نكتشف نشاط إصلاح كبير (40 في المائة) في فحوصات UDS ، الناجين المستنسخين ، وفي المختبر NER المقايسات. تشير هذه النتائج إلى أن بروتين ERCC1 الطافر الذي يتفاعل بشكل ضعيف جدًا مع مركب NER لا يزال بإمكانه دعم مستويات كبيرة من نشاط NER (40 بالمائة) داخل الخلايا. تشير هذه النتائج معًا إلى أن مستوى التعبير المنخفض لـERCC1 (20 بالمائة) جنبًا إلى جنب مع نشاط GGR المتبقي للبروتينات الطافرة التي لا يزال يتم التعبير عنها يوفر حماية كافية لمنع PV46LD و PV50LD من تطوير XP كامل. في الواقع ، تم اكتشاف نشاط GGR المتبقي في ظل ظروف أكثر حساسية في فحوصات UDS عند مقارنتها بالخلايا الليفية من مريض XP-A شديد التأثر والمعرض للسرطان. ومع ذلك ، لا يزال كلا المريضين معرضين لخطر الإصابة بسرطان الجلد ، ولذلك ينصح بالحماية من أشعة الشمس. كان النشاط المتبقي في خلايا PV46LD و PV50LD إما مشابهًا أو أقل من نشاط الإصلاح الذي اكتشفناه في خلايا 165TOR أو CS20LO (الشكل 6 J ؛ Jaspers et al. ، 2007 ؛ Kashiyama et al. ، 2013). لذلك ، لا ترتبط الشدة السريرية بنشاط NER ولكن من المحتمل أن يكون ذلك بسبب دور ERCC1 خارج NER وهو أمر مهم أثناء التطوير.

على الرغم من النتائج التي توصلنا إليها والتي أظهرت أن ERCC1R156W أظهر تفاعلًا منخفضًا مع SLX4 وتم تجنيده أيضًا بكفاءة أقل في مواقع تحريض ICL المحلي ، فقد كشف التحليل الإضافي أن البروتين المتحور ERCC1R156W تأثر بشكل طفيف فقط في دعم إصلاح ICL عندما يتم التعبير عنه ظاهرًا في ERCC 1- خلايا KO. ومع ذلك ، كان التأثير على إصلاح ICL أكثر اعتدالًا من تأثير استبدال R156W على NER ، والذي ، جنبًا إلى جنب مع النتائج السابقة التي تفيد بأن إصلاح ICLs يتطلب بروتين ERCC1 أقل بكثير من إصلاح آفات الحمض النووي الخاصة بـ NER (Jaspers et al. ، 2007 ؛ Sijbers et al. ، 1996b) ، قد يفسر جيدًا التأثير الخفيف على إصلاح ICL. في الخلايا الليفية للمريض ، والتي خفضت مستويات ERCC1 بشدة ، اكتشفنا حساسية معتدلة ، بالإضافة إلى زيادة تكسر الكروموسوم عند التعرض لمركب MMC الذي يحفز ICL ، وإن كان أكثر اعتدالًا من الخلايا المأخوذة من مريض FA الذي تم تضمينه بالتوازي. الأهم من ذلك ، لم يظهر أي من PV46LD ولا PV50LD أي علامات علنية للميزات السريرية الشبيهة بـ FA ، مما يشير إلى أن البروتين المتحور ERCC1R156W يوفر حماية كافية ضد الحمل المنخفض الداخلي لـ ICL في هؤلاء المرضى.

يسبب نقص ERCC1 ضعف الكبد والكلى

الفئران التي هي KO إما لـ ERCC1 أو XPF لإظهار الجري الشديد (أي أصغر وأضعف من الفئران WT) وتموت قبل الأسابيع الأربعة الأولى من الحياة بسبب فشل الكبد الحاد (McWhir et al. ، 1993 ؛ Sijbers et al. ، 1996 ب ؛ Tian et al. ، 2004 ؛ Weeda et al. ، 1997). التعبير الخاص بالكبد عن ERCC1 في هذه الفئران صحح جزئيًا الحجم الأصغر وعمرًا ممتدًا يصل إلى 12 أسبوعًا ولكن أيضًا غير مقنع شديدضعف الكلىوالفشل الكلوي كسبب ثانوي للوفاة (Selfridge et al.، 2001). لا تظهر الفئران KO الخاصة بـ XP أو FA مرض الكبد ، مما يشير إلى أن هذا النمط الظاهري لا ينتج عن عيب إصلاح NER أو ICL. من المحتمل أن التكرار الجزئي بين هذين المسارين ، والذي فقد في الفئران ERCC 1- التي تعاني من نقص في كلا المسارين ، يمكن أن تفسر هذا النمط الظاهري. تمشيا مع هذه الفكرة ، فإن خلايا الكبد وخلايا الأنابيب الكلوية القريبةأصبحت متعددة الصيغ الصبغية في فئران KO 1- ERCC وتراكمت مستويات عالية من p53 (McWhir et al. ، 1993 ؛ Selfridge et al. ، 2001 ؛ Weeda et al. ، 1997) ، مما يشير إلى تراكم تلف الحمض النووي الداخلي في هذه الأعضاء قد يحدث. ومع ذلك ، لا تزال الطبيعة الدقيقة لآفة الحمض النووي الذاتية هذه غير واضحة.

ومن المثير للاهتمام ، أن الفئران التي لديها تعطيل مفصل لإصلاح كل من NER و ICL لا تظهر خللاً في وظائف الكبد ، مما يشير إلى أن التكرار بين مسارات إصلاح الحمض النووي ليس هو التفسير الوحيد وأن هناك وظيفة إضافية لـ ERCC 1- XPF خارج مسارات إصلاح الحمض النووي هذه تساهم إلى ضعف الكبد (Mulderrig and Garaycoechea ، 2020). من الممكن أن يكون ERCC 1- XPF متورطًا في مسارات إصلاح الحمض النووي الإضافية التي تتعامل مع تلف الحمض النووي الداخلي. على سبيل المثال ، أظهر ERCC 1- XPF مؤخرًا أنه يعمل على هياكل DNA بديلة ، مثل Z-DNA ، حيث يتعاون مع بروتينات إصلاح عدم التطابق بدلاً من عوامل إصلاح NER أو ICL (McKinney et al. ، 2020). بالإضافة إلى ذلك ، تبين أن ERCC 1- XPF متورط في مسار فرعي لإصلاح الختان الأساسي مع RECQ1 هليكاس (Woodrick et al. ، 2017).

أظهر الشقيقان (PV46LD و PV50LD) في هذه الدراسة فشلًا في النمو وقصر القامة ونقصًا في الدهون تحت الجلد ، وهو ما يذكرنا بالحجم الصغير الذي لوحظ في الفئران KO 1- ERCC (McWhir et al.، 1993؛ Selfridge et al.، 2001؛ Weeda et al.، 1997). علاوة على ذلك ، أصيب الأشقاء بضعف في الكبد مع صورة ركود صفراوي سائدة أدت إلى زراعة الكبد خارج الرحم قبل سن 9 سنوات. من الواضح أن هذا التدخل منع الموت المبكر ولكنه لم يحسن الفشل في النمو ، كما يتضح من نمو الوزن والطول ومحيط الرأس بعد الزرع أقل بكثير من المئوي الثالث.

من المثير للاهتمام ، أن مرض الكبد الصفراوي قد تم الإبلاغ عنه باعتباره سمة شائعة في مرضى CS المصريين ، مما يشير إلى أنه يجب مراقبة ذلك عن كثب في مرضى CS من خلفيات عرقية أخرى لمعرفة ما إذا كانت هذه سمة أكثر شيوعًا مما تم التعرف عليه سابقًا (Abdel Ghaffar et al. ، 2011). على الرغم من عدم وصف أي تشوهات في الكبد في مرضى XP ، إلا أن هناك بعض حالات التحلل الخلوي الكبدي (انهيار الخلايا أو انفجارها) في مرضى FA (Masserot-Lureau et al. ، 2012) ، والتي قد تكون مختلفة عن تشوهات الكبد التي لوحظت في ERCC 1- أشقاء ناقصون. كشف الفحص النسيجي لخزعة الكبد المأخوذة من الأخ الأكبر (PV50LD) عن تغيرات في مورفولوجيا خلايا الكبد مع تضخم وتنوع النواة ، كما هو مذكور في الفئران الناقصة 1- في ERCC (الشكل S1 D ؛ N´uñez et al. ، 2000) ).

السبب الثاني للوفاة في فئران ERCC 1- مع تعبير خاص بالكبد عن ERCC1 كان شديدًافشل كلوي(سلفريدج وآخرون ، 2001). يظهر كلا الشقيقين أيضًا ضعفًا كلويًا ، مع وجود سمات توحي بخلل أنبوبي قريب يؤدي إلى تقدمالكلىتلف. ومع ذلك ، استقرت وظيفة الأنبوب بعد زرع الكبد ، ولكنالكلىوظيفةيتطلب مراقبة مستمرة. النمط الظاهري الكلوي لـ ERCC {0}} فئران KO - مع الأنابيب المتوسعة التي تحتوي على مادة بروتينية متسربة تتوافق مع اعتلال الأنبوب (McWhir et al. ، 1993 ؛ Selfridge et al. ، 2001 ؛ Weeda et al. ، 1997) - مشابه إلى المرضى الموصوفين في دراستنا. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن القصور الكلوي ، وفي بعض الحالات ، الفشل في XP / CS مجتمعة (Ben Chehida et al. ، 2017 ؛ Kondo et al. ، 2016 ؛ Kralund et al. ، 2013) وكذلك CS (Funaki et al. ، 2006 ؛ Reiss et al. ، 1996 ؛ Sato et al. ، 1988) ، في حين أن الارتباط بين FA والتشوهات الهيكلية لـالكلىhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>أ) الذي توفي عن عمر يناهز 37 عامًا (جريج وآخرون ، 2011 ؛ إيموتو ، ك. ، وآخرون. 2007. المرضى الذين يعانون من عيوب في بروتينات إصلاح ختان النوكليوتيدات المتفاعلة ERCC1 أو XPF يظهرون جفاف الجلد المصطبغ مع تأخر ظهور التنكس العصبي الشديد [الملخص] J. Invest.Dermatol 127: S92). على الرغم من عدم الإبلاغ عن أي ضعف في الكبد ، فقد أصيب هذا المريض بضمور حاد في الدماغ في سن 15 عامًا ، والذي تطور إلى تنكس عصبي تدريجي مع الخرف. كما لوحظ ضمور دماغي خفيف في كلا الأشقاء في سن 13 و 11 ، مما يشير إلى أنه يجب مراقبة التطور العصبي لكلا الأشقاء بعناية.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>ج ؛ جاسبرز وآخرون ، 2007 ؛ Niedernhofer et al. ، 2006) مع نمط ظاهري مع بعض التداخل مع الأشقاء المذكورين هنا ، بما في ذلك الحساسية للضوء دون سرطان الجلد ، وقصر القامة ، ونقص الدهون تحت الجلد ، وتأخر النمو ، والقصور الكلوي (Niedernhofer et al. ، 2006). أظهر هذا الصبي ، المتميز عن الأشقاء المذكورين هنا ، ميزات progeroid قطعية واضحة ، لكن صورة كبد أكثر اعتدالًا بدون ركود صفراوي. يوضح الأشقاء الذين تم الإبلاغ عنهم هنا أن طفرات ERCC1 ثنائية الأليلات يمكن أن تسبب طيفًا من الأنماط الظاهرية ، من تلك التي تظهر عادةً في CS إلى النمط الظاهري الذي يشتمل على قصر القامة المعتدل ، وحساسية للضوء ، وكبد شديد والكلىتلف، ربما بسبب التأثير القوي المشترك على NER والتأثير المتزامن على إصلاح ICL ، والذي قد يؤثر بشكل خاص على هذه الأعضاء.

المواد والأساليب

تتوافق جميع الإجراءات التي تم إجراؤها في هذه الدراسة مع المعايير الأخلاقية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الإنسان في مستشفى الأطفال الملكي ، ملبورن ، فيكتوريا ، أستراليا (HREC36291C) ولجنة خدمات أخلاقيات البحث الوطنية بالمملكة المتحدة شمال شرق نيوكاسل وشمال تينيسايد 2. تم تجنيد المرضى في برامج الأمراض غير المشخصة للمرضى الأطفال الذين يعانون من اضطرابات مندلية "اليتيم" المفترضة. تم جمع عينات من اللعاب أو الدم من المرضى وأفراد أسرهم لاستخراج الحمض النووي الجيني بعد إعطاء الموافقة المسبقة الخطية. لقد منح الوالدان الإذن لعرض صور غير منقوصة للأشقاء المتأثرين في الشكل 1 أ.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>تم تحديد T في كل من الأفراد المصابين في exon 4 من 8 من جين ERCC1. عند الاستجواب الأولي لبيانات exome في كلا الأفراد المصابين ، ظهر هذا المتغير في حالة متماثلة اللواقح ولكنه كان موجودًا في حالة متغايرة الزيجوت في الأب وغائب في الأم ، مما يشير إلى احتمال حذف أليل الأم. يوجد متغير الخطأ في قاعدة بيانات gnomAD بمعدل تكرار 0. 01 بالمائة (22 متغاير الزيجوت ، بدون زيجوت متماثلة الزيجوت) ولم يتم الإبلاغ عنه مسبقًا في الأفراد المصابين. تم إيداع متغير الخطأ في قاعدة بيانات LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 و http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) وقاعدة بيانات ClinVar ( معرف الاختلاف: 978472).

الكشف عن الحذف بواسطة qPCR

لاكتشاف الحذف ، تم استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا الليمفاوية / الخلايا الظهارية ، وتم تضخيم المنطقة ذات الصلة من جين ERCC1 في qPCR. تم إجراء qPCR باستخدام مجسات وأشعال محددة (مدرجة في الجدول S1) مصممة باستخدام Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) وتم تصنيعها بواسطة Sigma-Aldrich. تم تصميم البادئات لتشمل المنطقة المحذوفة في exon 4 ومنطقة داخل الجين التي لم يتم حذفها كعنصر تحكم (exon 5). تم إجراء qPCR متعدد الإرسال باستخدام LightCycler R 48 0 مزيج تفاعل المسبار الرئيسي (Roche) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة لتضخيم منطقة الجين ERCC1 وتحديدها الكمي ، باستخدام جين CFTR (exon 27) كمعيار داخلي (الجدول) S1). تم إجراء qPCR على أداة LightCycler R 480 (Roche) ، وتم إجراء تحليل البيانات باستخدام إصدار برنامج LightCycler R 480 1.5.0 (Roche). تم اتباع إرشادات الكلية الأمريكية للطب الوراثي لتفسير اختلاف التسلسل.

الكشف عن متغير الخطأ عن طريق تسلسل سانجر

تم عزل الحمض النووي الجينومي عن طريق إعادة تعليق كريات الخلية في المخزن المؤقت للخلية الكاملة للخلية (5 0 ملي مولار بوكل ، 1 0 ملي تريس ، الرقم الهيدروجيني 8. 0 ، 25 ملي مولار كلوريد ، {{12} } .1 مجم / مل من الجيلاتين ، 0. 45 بالمائة توين -20 ، و 0.45 بالمائة NP -40) تحتوي على 0.1 مجم / مل من بروتيناز K (EO0491 ؛ ThermoFisher Scientific) واحتضان لمدة 1 h عند 56 درجة متبوعًا بـ 10- دقيقة تعطيل حرارة للبروتيناز K عند 96 درجة. تم تضخيم شظايا من -1 كيلو بايت تغطي طفرات الخطأ في PCR (تم سرد الاشعال التسلسلي في الجدول S1) متبوعًا بتسلسل Sanger باستخدام إما التمهيدي الأمامي أو العكسي.

خطوط الخلية

تم إنشاء خطوط الخلايا الليفية من خزعات الجلد من كل من الأفراد المصابين والآباء. تمت زراعة جميع سلالات الخلايا (المدرجة في الجدول S2) عند 37 درجة في جو من 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون الإنديوم (Thermo Fisher Scientific) مع إضافة البنسلين / الستربتومايسين (Sigma-Aldrich) و 10 بالمائة FBS (Bodinco BV). تم اختبار جميع خطوط الخلايا بشكل روتيني لعدوى الميكوبلازما.

تخليد الخلايا الليفية باستخدام HTERT

تم تخليد الأرومات الليفية WT (48BR) و PV50LD بواسطة النوى من p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid # 1774) باستخدام Amaxa Nucleofector (البرنامج U23). يحتوي كل ثقب كهربائي على 400 ، 000 من الخلايا الليفية و 2.5 ميكروغرام من DNA البلازميد. بعد التثقيب الكهربائي ، تم زرع الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة 25- سم 2 تحتوي على 5 مل DMEM و 10 بالمائة FBS. بعد يومين ، تم استبدال وسط المزرعة بوسط يحتوي على 20 ميكروغرام / مل نيومايسين.

/ الستربتومايسين (سيغما الدريتش) و 10 بالمائة FBS (بودينكو بي في). تم اختبار جميع خطوط الخلايا بشكل روتيني لعدوى الميكوبلازما.

يبني البلازميد

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>طفرات T في ERCC1. تم إدخال منتج PCR المتداخل باعتباره جزء NheI و AgeI لتوليد الكثير من CW 57- TO-ERCC1R156W-mVenus. تم إدخال ERCC1WT و ERCC1R156W كأجزاء NheI و AgeI في pcDNA 5- FRT-TO Puro-EGFP-N1 لإنشاء pcDNA 5- FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP و pcDNA 5- FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. تم استخدام الطفرات الموجهة بالموقع لإدخال طفرات نقطية في pMacro Bac-XPF-ERCC1WT باستخدام مجموعة الطفرات KOD-plus (Toyobo) كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة ، باستخدام pri mers المدرجة في الجدول S1. تم التحقق من جميع التسلسلات عن طريق تسلسل Sanger.

جيل من خلية KO

خطوط لإنشاء KOs و U2OS (FRT) و RPE 1- hTERT (PuroR / TP 53- dKO) تم نقل خلاياها باستخدام pLV-U6g-PPB لتشفير RNA من المركز الطبي لجامعة Leiden / Sigma -Aldrich Single-guide RNA (sgRNA) مكتبة (انظر الجدول S3 للبلازميدات والجدول S4 لتسلسلات sgRNA) التي تستهدف جينERCC1 مع تعبير ناقل ترميز Cas 9-2 A-GFP (pX458 ؛ Addgene # 48138) باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen). تم اختيار خلايا U2OS (FRT) المنقولة على بوروميسين (1 ميكروغرام / مل) لمدة 3 أيام ومطلية بكثافة منخفضة ، وبعد ذلك تم عزل الحيوانات المستنسخة الفردية. تم فرز خلايا RPE المنقولة 1- على FACS على BFP / GFP ومطلية بكثافة منخفضة ، وبعد ذلك تم عزل الحيوانات المستنسخة الفردية. تم التحقق من استنساخ KO من خلال تحليل لطخة ويسترن. تم تأكيد عدم وجود تكامل / تعبير مستقر Cas9 بواسطة لطخة ويسترن.

توليد خطوط خلوية مستقرة

تم استخدام استنساخ ERCC1 KO واحد في خلفية U2OS (FRT) (انظر الجدول S2) للتعبير بثبات عن ERCC1WT-GFP أو ERCC1R156W-GFP أو GFP-NLS عن طريق cotransfection لـ pcDNA 5- FRT-TO-Puroplasmid ترميز هذه cDNAs (2 ميكروغرام) ، مع pOG44 بلازميد ترميز Flp recombinase (0. 5 ميكروغرام). تم الحصول على مجموعة من الخلايا متعددة النسيلة بعد الاختيار على 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين و 4 ميكروغرام / مل بلاستيدين س.

توليد خطوط الخلايا KI

لإنشاء KIs متماثلة اللواقح ، تمت معالجة خلايا RPE {0} hTERT لأول مرة لمدة 30 دقيقة باستخدام مثبط 1 ميكرومتر DNA-PK (NU7441) لقمع إصلاح DSB المعرض للخطأ وزيادة استخدام الإصلاح المعتمد على التماثل. بعد ذلك ، تم تعليق 350 ، 000 خلية في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنيوكليوفكتور (V4XP -3032 ؛ Lonza) في وجود 4.5 ميكروغرام بلازميد يحتوي على Cas9 و sgRNA يستهدف جين ERCC1 (انظر الجدول S3 للبلازميدات والجدول S4 forsgRNA) و 100 ميكرومتر من المتبرع أحادي السلسلة DNA يحتوي على طفرة المريض بالإضافة إلى الطفرات الصامتة لتدمير موقع PAM لمنع إعادة التدوين بواسطة Cas9 والطفرات الصامتة لإدخال موقع تقييد HindIII لتسهيل فحص استنساخ KI. تم إمداد الخلايا بالكهرباء باستخدام anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) باستخدام برنامج EA -104. بعد التثقيب الكهربائي ، تم طلاء الخلايا بكثافة منخفضة في وسط مكوي بنسبة 10 بالمائة FBS. في اليوم التالي ، تم استبدال الوسيط بـ DMEM (10 بالمائة FBS و 1 بالمائة بنسلين / ستربتومايسين) ، وتم السماح للخلايا بتكوين مستعمرات. تم عزل ما يقرب من 400 مستعمرة وتوسيعها. تم عزل الحمض النووي الجينومي ، وتم تضخيم جزء يتضمن الطفرة المقدمة وموقع التقييد المقدم (HindIII) بواسطة PCR المتداخل (انظر الجدول S1 للبادئات). تم هضم شظايا PCR باستخدام HindIII (NEB) لمدة 3 ساعات عند 37 درجة ثم فصلها عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. تم تحليل الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على موقع تقييد HindIII المقدم بواسطة تسلسل Sanger (انظر الجدول S1 للاشعال). لقد حصلنا على نسختين متماثلتين من KI من بين 400 مستنسخة معزولة ، وهو ما يتوافق مع كفاءة KI تبلغ ∼0.5 بالمائة.

انتقال الفيروسة البطيئة

للتوصيل الفيروسي البطيء ، تم إدخال mVenus-ERCC1WT أو mVenus ERCC1R156W في ناقل الفيروسة البطيئة pLenti-CW 57- TO. تم نقل HEK293T بواسطة نواقل ترميز هذه الاندماجات ERCC1 و VSV-G و RRE و REV باستخدام JetPEI (Sigma Aldrich) لإنتاج الفيروس. تم جمع المادة الطافية المحتوية على الفيروس بعد 24 ساعة وتصفيتها باستخدام مرشح 0. 44- ميكرومتر. تم نقل الأرومات الليفية الأولية PV46LD و PV50LD بشكل عدائي في وجود البوليبرين (Sigma-Aldrich). تم اختيار الخلايا التي تحتوي على 15 ميكروجرام / مل من بوروميسين. تم إحداث التعبير عن بروتينات ERCC1 الموسومة بـ mVenus عن طريق إضافة 2 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين لمدة 24 ساعة.

فحوصات البقاء على قيد الحياة المستنسخة

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >تم تسجيل 20 خلية. تم إجراء تجارب البقاء على قيد الحياة في نسختين وتكررت مرتين على الأقل.

الترسيب المناعي لـ Co-IP

تم معالجة الخلايا بطريقة وهمية أو أشعة UV-C (2 0 J / m2) وتم حصادها بعد ساعة واحدة. تم تفريغ الكريات الخلوية لمدة دقيقتين 0 على الجليد في المخزن المؤقت لـ EBC -150 (50 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، و 0.5 بالمائة NP -40 ، و 2 ملي مولار MgCl2 ، ومثبط البروتياز كوكتيل [روش]) مع 500 وحدة / مل بنزوناز نوكلياز (نوفاجين). تم تحضين محللات الخلية لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات باستخدام حبات GFP-Trap A (Chromotek). تم بعد ذلك غسل الحبيبات ست مرات باستخدام محلول EBC -150 (50 ملي تريس ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5 بالمائة NP -40 ، 1 ملي مولار EDTA ، وكوكتيل مثبط البروتياز) وغليها في Laemmli-SDS عينة عازلة.

لطخة غربية

تم عصر الخلايا وغسلها باستخدام PBS وغليها لمدة 0 دقيقة في محلول Laemmli (4 0 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 6.8 ، و 3.35 بالمائة SDS ، و 16.5 بالمائة جلسرين ، و 0.0005 بالمائة بروموفينول بلو ، و 0.05 م ديثيوثريتول). تم فصل البروتينات على 4٪ -12٪ Criterion XT Bis-Tris gels (# 3450124 ؛ Bio-Rad) في محلول تشغيل NuPAGE MOPS (NP 0001-02 ؛ Thermo Fisher Scientific) وتم مسحها على أغشية فلوريد البولي فينيلدين (IPFL00010 ؛ EMD Millipore ). تم حظر الغشاء بمخزن مانع للتسرب (MB -070-003 ؛ أرض صخرية) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم تم فحص الغشاء باستخدام الأجسام المضادة (المدرجة في الجدول S5) كما هو محدد. تم استخدام نظام Odyssey CLx (LI-COR Biosciences) للكشف.

مقايسة استرداد الحمض النووي الريبي (RRS)

3 0 ، 000 تم زرع الخلايا على أغطية زجاجية 12- مم في 24- ألواح بئر في DMEM بنسبة 1 بالمائة FBS. بعد 24 ساعة ، تم تشعيع الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية بجرعة 6 جول / م 2 واحتضانها في وسط مكيف لفترات زمنية مختلفة ({{2 0}} ساعة ، 3 ساعات ، 18 ساعة). بعد الحضانة ، تم تصنيف النصوص الناشئة عن طريق احتضان الخلايا بـ 400 ميكرومتر 5- إيثينيل يوريدين (CLK-N 002-10 ؛ Jena Bioscience) ، والتي تم تصورها بعد ذلك باستخدام مزيج Click-iT الذي يتكون من 50 mM Tris buffer ، الأس الهيدروجيني 8.0 ، 60 ميكرومتر أتو أزيد (647N -101 ؛ ATTO-TEC) ، 4 ملي مولار CuSO4 • 5H2O ، 10 ملي مولار حمض الأسكوربيك (A0278 ؛ سيجما الدريش) ، و 0.1 ميكروغرام / مل DAPI (D1306 ؛ Thermo Fisher Scientific) لمدة 1 ساعة. تم غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني وتم تركيبها على شرائح مجهرية (Thermo Fisher Scientific) باستخدام Aqua Polymount (Brunschwig).

تألق مناعي

بالنسبة للتلوين المناعي ، تم زرع 25 0 ، 000 خلية على أغطية زجاجية 18- مم. في اليوم التالي ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 4 في المائة من بارافورمالدهيد ، تليها نفاذية مع {{1 0}. 5 في المائة تريتون X -100 لمدة 1 0 دقيقة. عولجت الخلايا بـ 100 جلايسينات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لمنع مجموعات الألدهيد غير المتفاعلة ، وشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني ، وتمت معايرتها في محلول غسيل (PBS يحتوي على 0.5 بالمائة من مساحة سطح الجسم و 0.05 بالمائة توين -20 ؛ سيجما ألدريتش) لمدة 10 دقائق. كانت خطوات الجسم المضاد ويغسلها في محلول غسيل. تم تحضين الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة ، تليها الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة و DAPI لمدة 5 دقائق. يتم سرد الأجسام المضادة الأولية والثانوية في الجدول 5. تم تحضين الخلايا باستخدام 0.1 ميكروغرام / مل من DAPI وتم تركيبها باستخدام Aqua Polymount.

تلطيخ H2AX

200 ، 000 تم زرع الخلايا على أغطية زجاجية 18- مم في 24- ألواح جيدة مع DMEM (10 بالمائة FBS و 1 بالمائة P / S). في اليوم التالي ، تم تعريض الخلايا للأشعة تحت الحمراء بواسطة مولد الأشعة السينية YXlon International (200 KV ، 4 مللي أمبير ؛ معدل الجرعة 2 Gy / min). في النقاط الزمنية المشار إليها ، تم إصلاح الخلايا بنسبة 3 في المائة من بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق وملطخة لـ H2AX لمدة ساعة واحدة (انظر أعلاه). تم قياس الصور باستخدام ماكرو مخصص في ImageJ أتاح التحليل التلقائي والموضوعي لعدد البؤر لكل خلية ، كما هو موضح سابقًا (Typas et al. ، 2015).

التحليل المجهري للخلايا الثابتة

تم الحصول على صور للعينات الثابتة على مجهر مضان واسع المجال من Zeiss AxioImagerM2 أو D2 مجهز بـ63 × PLAN APO (1.4 فتحة عددية [NA]) أهداف غمر بالزيت (زايس) ومصباح هاليد معدني HXP 120 يستخدم للإثارة. تم الكشف عن مجسات الفلورسنت باستخدام المرشحات التالية لـ DAPI (مرشح الإثارة: 350/50 نانومتر ؛ مرآة ثنائية اللون: 400 نانومتر ؛ مرشح الانبعاث: 460/50 نانومتر) ، Alexa 555 (مرشح الإثارة: 545/25 نانومتر ؛ مرآة ثنائية اللون: 565 نانومتر ؛ مرشح الانبعاث: 605/70 نانومتر) ، أو Alexa 647 (مرشح الإثارة: 640/30 نانومتر ؛ المرآة ثنائية اللون: 660 نانومتر ؛ مرشح الانبعاث: 690/50 نانومتر). تم تسجيل الصور باستخدام برنامج ZEN 2012 وتحليلها في ImageJ.

الأشعة فوق البنفسجية الليزر الدقيقة

نمت الخلايا على أغطية زجاجية {{0} مم كوارتز (UV-C) أو زجاج (UV-A) وتم وضعها في حجرة مغناطيسية Chamlide CMB حيث تم استبدال وسط النمو بـ CO 2- Leibovitz L المستقل { {4}} متوسط ​​(Thermo Fisher Scientific). تم عمل مسارات ليزر UV-C باستخدام الحالة الصلبة التي يتم ضخها بواسطة الصمام الثنائي 266- mm yttrium Aluminium Garnet laser (متوسط ​​الطاقة 5 ميجاوات ، ومعدل التكرار يصل إلى 10 كيلو هرتز ، وطول النبضة 1 نانوثانية). قبل تشعيع UV-Amicro ، تم توعية الخلايا إما بـ 6 ميكرومتر من ثلاثي أوكسالين لمدة ساعة واحدة لتوليد ICLs أو مع 15 ميكرومتر BrdU لمدة 24 ساعة لتوليد DSBs. تم عمل مسارات ليزر UV-A بواسطة ليزر Yttrium Aluminium Garnet الذي يتم ضخه بواسطة الصمام الثنائي (متوسط ​​الطاقة 14 ميجاوات ومعدل التكرار يصل إلى 200 هرتز). تم دمج كلا الليزرين في نظام UGA -42- Caliburn / 2L Spot Illumination (Rapp OptoElectronic).

تم الجمع بين التشعيع الجزئي والتصوير بالخلايا الحية في غرفة بيئية مضبوطة على 37 درجة على مجهر زايس أكسيو أوبزرفر 7 واسع المجال بالكامل من الكوارتز ، باستخدام هدف غمر الجلسرين فائق الترشيح 100 × (1.2NA) (UV-C) ) أو هدف الغمر بالزيت Plan-Neofluar 63 × (1.25 NA) (UV-A). يقترن نظام الليزر بالمجهر عبر TriggerBox ، ويعمل مرشح الكثافة المحايدة (ND -1) على حجب 90 بالمائة من ضوء الليزر. AnHXP 120- تم استخدام مصباح هاليد معدني V للإثارة. تم الحصول على الصور في Zeiss ZEN وقياسها كمياً في ImageJ.

فحص تكسر الكروموسوم

2 × 1 {{2 0} تم زرع 6 أرومات ليفية في قوارير زراعة الأنسجة 175- سم 2 باستخدام DMEM (10 بالمائة FBS) وتم تربيتها عند 37 درجة في وجود أو عدم وجود 50 نانومتر من MMC. بعد 48 ساعة ، تمت إضافة 600 ميكرولتر من demecolcine (10 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى كل قارورة مزرعة ، وتم تحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37 درجة للتخصيب من أجل الميتافاز. ثم تم تجريب الخلايا وتعليقها في 75 ملي مولار من البوتاسيوم وحضنت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم غزل الخلايا ، وتعليقها في 10 مل مثبت (75 بالمائة ميثانول و 25 بالمائة حمض أسيتيك) ، وحضنت لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ، وطردها مركزيًا. تم إعادة تعليق الكريات في 10 مل من المثبت وحضنت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكررت هذه الخطوة ، وأخيرًا ، تم تعليق الحبيبات في 0.5-1.0 مل من المثبت. تم إسقاط تعليق الخلية على شريحة وتركها حتى تجف. تم تلطيخ الشرائح لمدة 5 دقائق في محلول جيمزا بنسبة 3 في المائة ، وشطفها في ماء الصنبور ، وتركها حتى تجف. تم ترميز الشرائح ، ومن كل مزرعة مشفرة ، تم فحص 50 ميتافاز من أجل تلف الكروموسومات. بعد التسجيل ، تم فك تشفير الشرائح ، وتم تحليل النتائج كما تم عرضها (Stoepker et al. ، 2011).

UDS

18 0 ، 000 تم زرع الخلايا على أغطية زجاجية 18- مم في 12- ألواح بئر في DMEM بنسبة 1 بالمائة FBS. بعد 24 ساعة ، تم تشعيع الخلايا محليًا من خلال مرشح 5- ميكرومتر مع 3 0 جول / م 2 من الأشعة فوق البنفسجية-ج. تم تصنيف الخلايا لاحقًا باستخدام 20 ميكرومتر EdU (VWR) و 1 ميكرومتر 5- فلورو ديوكسيوريدين (Sigma-Aldrich) لمدة ساعة أو 4 ساعات. بعد وضع العلامات ، تم مطاردة الخلايا المتوسطة بـ 10 ميكرومتر من ثيميدين في DMEM بدون مكملات لمدة 30 دقيقة وثابتة لمدة 15 دقيقة مع 3.7 بالمائة من الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. تم نفاذية الخلايا لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني بنسبة 0.5 بالمائة Triton-X100 وتم حظرها في 3 بالمائة BSA (Thermo Fisher Scientific) في PBS. تم إقران EdU المدمج بـ Attoazide Alexa Fluor 647 باستخدام كيمياء Click-iT وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Invitrogen). بعد الاقتران ، تم تثبيت الخلايا لاحقًا بـ 2 في المائة من الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق وتم حظرها لاحقًا باستخدام 100 ملي جليكاين. تم تغيير طبيعة الحمض النووي باستخدام 0.5 مولار هيدروكسيد الصوديوم لمدة 5 دقائق ، متبوعًا بالحجب بنسبة 10 بالمائة من مساحة سطح الجسم لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد ضد ثنائيات البيريميدين الحلقي (انظر الجدول S5) لمدة ساعتين ، تليها الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة ، و DAPI لمدة 5 دقائق. تم تركيب الخلايا في Polymount (Brunschwig).

الحصول على بيانات MS

تم إجراء MS بشكل أساسي كما هو موضح سابقًا (Salas Lloret et al.، 2 0 19). تم إجراء جميع التجارب على نظام EASY-nLC 1 000 (Proxeon) المتصل بـ Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) من خلال مصدر أيون نانو بالرش الكهربائي. تم إقران Q-Exactive بباعث سيليكا 25- سم (FS 360-75-15- N -5- C25 ؛ NewObjective) داخل المنزل معبأ بـ 1.9 ميكرومتر C 18- خرز AQ (Reprospher -DE ؛ بور ؛ دكتور مانيش ، Ammerbuch-Entringen ، ألمانيا). تم تشغيل العينات في 40- تدرج كروماتوجرافي دقيق من 0 بالمائة إلى 30 بالمائة أسيتونيتريل ثم زيادتها إلى 95 بالمائة أسيتونيتريل قبل إعادة موازنة العمود بمعدل تدفق 200 NL / دقيقة. تم تشغيل مطياف الكتلة في وضع اكتساب يعتمد على البيانات باستخدام طريقة السبعة الأولى ونطاق مسح يتراوح بين 300 و 1600 م / ض. تم الحصول على أطياف MS كاملة المسح بقيمة مستهدفة تبلغ 3 × 106 ودقة 70 ، 000 ، وتم تسجيل أطياف الكتلة الترادفية للتفكك التصادمي الأعلى (MS / MS) عند القيمة المستهدفة 105 ، و بدقة تبلغ 35000 ، ونافذة عزل تبلغ 2.2 م / ع ، وطاقة تصادم طبيعية بنسبة 25 بالمائة. كان الحد الأدنى لهدف التحكم التلقائي في الكسب هو 104. كانت أقصى أوقات حقن MS1 و MS2 250 و 120 مللي ثانية ، على التوالي. تم استبعاد كتل أيونات السلائف للأيونات الممسوحة ضوئيًا ديناميكيًا من تحليل MS / MS لمدة 30 ثانية. تم استبعاد الأيونات ذات الشحنة 1 والأعلى من 6 من بدء تحليل MS2.

تحليل بيانات MS تم تحليل جميع البيانات الأولية باستخدام MaxQuant (الإصدار 1.6.6. 0) كما هو موضح سابقًا (Tyanova et al.، 2 0 16a). أجرينا البحث على البروتين المرجعي UniProt في السيليكو المهضوم للإنسان العاقل ، بما في ذلك المتواليات الكنسية والإيزوفورم (27 مايو ، 2 0 19). تم إجراء عمليات البحث في قاعدة البيانات وفقًا للإعدادات القياسية مع التعديلات التالية. تم استخدام الهضم مع التربسين / ف ، مما يسمح بأربعة انقسامات مفقودة. تم السماح بالأكسدة (M) والأسيتيل (بروتين N-term) كتعديلات متغيرة بحد أقصى ثلاثة. تم تعطيل كارباميدو ميثيل (C) كتعديل ثابت. تم تمكين القياس الكمي الخالي من الملصقات (LFQ) ، مع عدم السماح بـ Fast LFQ. تمت معالجة بيانات مخرجات Max-Quant بشكل أكبر باستخدام منصة Perseus الحسابية (الإصدار 1.6.6.0 ؛ Tyanova et al. ، 2016b). تم تحويل قيم شدة LFQ ، وتمت إزالة الملوثات والبروتينات المحتملة التي تم تحديدها بواسطة الموقع فقط أو تمت إزالة الببتيدات العكسية. تم تجميع العينات في فئات تجريبية ، كما تمت إزالة البروتينات التي لم يتم تحديدها في أربعة من كل أربعة مكررات في مجموعة واحدة على الأقل. تم احتساب القيم المفقودة باستخدام القيم الموزعة بشكل طبيعي مع انخفاض 1.8 (log2) وعرض عشوائي 0.3 (log2) مع مراعاة قيم المصفوفة بأكملها. تم إجراء التحليل الإحصائي (اختبارات t) لتحديد البروتينات المخصبة بشكل كبير. تم إنشاء قطع البركان ، وتمت معالجة جداول مخرجات التحليل الإحصائي في Microsoft Excel. تم إيداع بيانات بروتينات MS في ProteomeXchange Consortium عبر مستودع شريك PRIDE (Perez-Riverol et al. ، 2019) مع معرف مجموعة البيانات PXD017940.

تنقية ERCC المؤتلف 1- XPF

تم إجراء إنتاج Baculovirus كما هو موصوف باستخدام تركيبات pMacroBac-His-ERCC1 / XPF-HA (Enzlin و Sch¨ arer ، 2 0 0 2). تم دمج ERCC1WT و ERCC1R156W مع XPFWT من فيروس باكول واحد في خلايا الحشرات Sf9. تمت تنقية المقاييس غير المتجانسة على تقارب النيكل ، واستبعاد الحجم ، وكروماتوجرافيا الهيبارين كما هو موصوف (Enzlin and Sch¨ arer ، 2002). تمت إزالة ERCC 1- XPF من عمود الهيبارين عند حوالي 600 ملي مولار كلوريد الصوديوم. تراوحت تركيزات البروتين من 0.1 إلى 0.2 مجم / مل.

مقايسة نوكلياز

تم تلدين ركيزة ذات حلقة جذعية (GCCAGCGCTCGG (T) 22CCGAGCGCTGGC) تحتوي على صبغة فلورية Cy5 (5 0 pmol) عند 39 طرفًا (IDT) في 100- ميكرولتر (1 0 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 5 0 ملي كلوريد الصوديوم) عن طريق التسخين عند 95 درجة لمدة 5 دقائق والتبريد ببطء على مدى ساعتين. 2 0 تم استخدام 0 fmol من الركيزة الملدنة 20- ميكرولتر تحتوي على 25 ملي مولار HEPES ، pH8.0 ، 2 ملي مولار MgCl2 ، 10 بالمائة جلسرين ، 0.5 ملي مولار كابتو إيثانول ، 0.1 مجم / مل BSA ، 40 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و0-40 نانومتر من البروتين. تم تحضين التفاعلات عند 30 درجة لمدة 30 دقيقة وتوقفت بإضافة 10 ميكرولتر 90٪ فورماميد / 10 ملي مول EDTA. بعد التسخين عند 95 درجة لمدة 5 دقائق والتبريد على الجليد ، تم تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة على هلام بولي أكريلاميد 15 بالمائة تغيير طبيعة. تم تشغيل المواد الهلامية بسرعة 30 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة وتم تصور العصابات بواسطة مضان بواسطة Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

في الفحص المختبري NER

تم إنشاء مستخلصات الخلايا التي تعاني من نقص XPF (XP2YO) والبلازميد الذي يحتوي على آفة dG-AAF الخاصة بالموقع كما هو موضح سابقًا (Gillet et al.، 2 0 0 5؛ Shivji et al.، 1999) . لكل تفاعل ، 2 ميكرولتر من محلول الإصلاح (2 {{4 0}} 0 ملي مولار Hepes-KOH ، 25 ملي مولار MgCl2 ، 2.5 ملي مولار DTT ، 10 ملي مولار ATP ، 110 ملي مولار فوسفوكرياتين ، و 1.8 مجم / مل BSA ، الرقم الهيدروجيني النهائي 7.8) ، 0.2 ميكرولتر من محلول فوسفوكيناز الكرياتين (2.5 مجم / مل كرياتين فسفوكيناز من عضلات الأرانب [سيجما ألدريتش] ، 10 ملي جليسين ، درجة الحموضة 9.0 ، و 50 بالمائة من الجلسرين) ، 3 ميكرولتر من الخلية التي تعاني من نقص XPF تم تسخين المستخلص ، NaCl (حتى تركيز نهائي 70 ملي مولار) ، وبروتينات XPF المنقى ERCC 1- بحجم إجمالي 9 ميكرولتر عند 30 درجة لمدة 10 دقائق. تمت إضافة 1 ميكرولتر بلازميد يحتوي على dG-AAF (50 نانوغرام / ميكرولتر) إلى كل تفاعل ، وتم تحضين التفاعلات عند 30 درجة لمدة 45 دقيقة. تم بعد ذلك تبريد خليط التفاعل على الجليد لمدة 5 دقائق ، متبوعًا بإضافة 0.5 ميكرولتر من حبلا تكميلي 1 ميكرومتر د (GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC) ، وتم تغيير طبيعة خليط التفاعل بالتسخين عند 95 درجة لمدة 5 دقائق. بعد 15 دقيقة من التلدين عند درجة حرارة الغرفة ، تمت إضافة 1 ميكرولتر من خليط التسلسل (يحتوي على 0.13 وحدة U من التسلسل و 2.0 µCi [-32 P] dCTP لكل تفاعل). بعد الحضانة المسبقة عند 37 درجة لمدة 3 دقائق ، تمت إضافة 1.2 ميكرولتر من خليط ثلاثي فوسفات deoxyribonucleotide (50 ميكرومتر dCTP ، 100 ميكرومتر dTTP ، 100 ميكرومتر dATP ، و 100 ميكرومتر dGTP). تم تحضين خليط التفاعل عند 37 درجة لمدة 12 دقيقة ، وتوقف التفاعل بإضافة 8 ميكرولتر صبغة تحميل (80 بالمائة فورماميد و 10 ملي مولار EDTA). تم تسخين العينات عند 95 درجة لمدة 5 دقائق ، وتبريدها على الجليد ، وتحميلها على هلام بولي أكريلاميد مغير طبيعة بنسبة 14 في المائة. تم تشغيل المواد الهلامية عند 45 وات لمدة 2.5 ساعة وتم تصور العصابات باستخدام PhosphorImager (Typhoon RGB).

مواد تكميلية عبر الإنترنت

يوضح الشكل S1 القيم المختبرية لوظائف الكبد والكلى في الأخ 1 والأخت 2. يوضح الشكل S2 بيانات التسلسل الجيني التي تؤكد طفرة الخطأ والحذف داخل الجين في جين ERCC1. يوضح الشكل S3 التعبير البروتيني عن ERCC1 و XPF في الخلايا الليفية للمريض. يوضح الشكل S4 بروتينات ERCC1 و XPF المؤتلفة المنقاة و Co-IP لـ ERCC1WT و ERCC1R156W. يوضح الشكل S5 صورًا مجهرية لـ UDS ، وبؤر H2AX ، وموقع طفرات المريض في ERCC 1- XPF. يحتوي الجدول S1 على تسلسل جميع البادئات والمجسات المستخدمة في هذه الدراسة. يسرد الجدول S2 جميع خطوط الخلايا التي تم اختبارها في هذه الدراسة. يسرد الجدول S3 جميع البلازميدات المشاركة في هذه الدراسة. يوفر الجدول S4 تسلسل sgRNA للدراسة ويظهر الجدول S5 الأجسام المضادة. يوفر الجدول S6 عدد الخلايا المستخدمة في القياس الكمي في الأشكال. تعرض Data S1 جميع ملفات Western blot غير المقصوصة.

شكر وتقدير

يعترف المؤلفون بكل من الأشقاء وأولياء أمورهم للمساهمة في هذه الورقة ، سيلفي نورديرمير (المركز الطبي لجامعة ليدن [LUMC] ، ليدن ، هولندا) لـ thepLenti-CW 57- TO-GFP ناقل التعبير العدسي ونصائح حول إنشاء KI خلايا ، Joachim Goedhart (جامعة أمستردام ، أمستردام ، هولندا) من أجل mVenus cDNA ، بيرت فان ديركويج (LUMC ، لايدن ، هولندا) لمثبط DNA-PK ، Wim Vermeulen و Anja Rams (Erasmus MC ، روتردام ، هولندا) لتوفير خلايا 165TOR ، Tomoo Ogi (جامعة Nagoya ، اليابان) لتوفير خلايا CS20LO ، Alan Lehman (جامعة ساسكس ، المملكة المتحدة) لتوفير خلايا hTERT CSL16NG و CSL16NG ، وجوست شيميل (LUMC ، ليدن ، هولندا) للحصول على المشورة بشأن توليد خلايا KI .

تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة بحثية في المركز الطبي لجامعة ليدن ومنظمة Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI منحة (ALW.016.161.320) إلى MSLuijsterburg ، وهي منحة ابتدائية من مجلس البحوث الأوروبي (310913) إلى ACO Vertegaal ، منحة KWF Kankerigbestrijding. 11367) إلى R. Gonz´alez-Prieto ، منحة KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) إلى MA Rooimans ، andgrants من المعهد الكوري للعلوم الأساسية (IBS-R 022- A1) والمؤسسة الوطنية معهد السرطان (P01CA092584) إلى ODSch arer.

مساهمات المؤلفين: أنشأ K. Apelt خلايا KO وخلايا KI وخطوط خلوية مستقرة ؛ أجرى اللطخة الغربية والمناعة المناعية للتعبير عن ERCC1 و XPF ، وتحولات الفيروس البطيء ، والبقاء على قيد الحياة المستنسخة (UV ، MMC ، IR) ، تجارب Co-IP لتحليل اللطخة الغربية ، تجارب UDS ، تجارب IP المشتركة لـ MS ، وصبغات H2AX ؛ وكتب الورقة. أ. Kragten قام بأداء AUDS و RRS و immunostainings بعد الأشعة فوق البنفسجية المحلية. أنتجت جوهرة AP Wonder خلايا KO و KI وأجرت تجارب UDS و Western blot و Sanger لتأكيد الطفرة الخاطئة. قدم SM White المشورة للمرضى ، وقام بتحليل بيانات الإكسوم ، وإجراء الخزعات ، وتوليد الخلايا الليفية الأولية ، وكتب وصف المريض السريري. قام S.Lunke و BT Wilson بتوليد بيانات NGS. قام S. Pantaleo و D. Flanagan بإجراء qPCR للتحقق من صحة الحذف. كتب جيم كوينلان الوصف السريري للكلية. دبليو هارديكار كتب الوصف السريري للكبد. قام MA Rooimans andR.MF Wolthuis بتوليد خلايا ليفية 48BR و PV50LD خاملة hTERT وأجرى فحوصات تكسر الكروموسوم التي يسببها MMC. قام R. Gonzalez-Prieto و ACO Vertegaal بتحليل جميع تجارب MS. أجرى كل من WW Wiegant و H. vanadium عمليات البقاء على قيد الحياة المستنسخة في خلايا U2OS (IR). قام كل من J.-E.Yeo و HS Kim بتنقية البروتينات المؤتلفة وأجريا مقايسة نوكلياز ومقايسات NER في المختبر. أشرف OD Sch¨arers في المختبر على عمل NER وساهم في التفسير الهيكلي لأليل R156W وقام بتحرير الورقة. أشرف MS Luij sterburg على المشروع وكتب الورقة.

مراجع

عبد الغفار ، تي واي ، وفاق السبكي ، و إس إم السيد. 2011. ركود صفراوي في مرضى متلازمة كوكايين ومعايير معدلة مقترحة للتشخيص السريري. OrphanetJ. نادرة ديس. 6:13. -1172-6-13

عبد الله ، يو بي ، جي إف ماكجوران ، إس برولين ، دي بتشلكين ، إيه إتش الصغير ، تي براون ، بي جي ماكهيو. 2017. ينشط RPA نوكلياز XPF-ERCC1 لبدء معالجة الوصلات المتشابكة للحمض النووي. EMBO J. 36: 2047-2060.

Adair ، GM ، RL Rolig ، D. Moore-Faver ، M. Zabelshansky ، JH Wilson ، و RS Nairn. 2000. دور ERCC1 في إزالة ذيول طويلة غير متجانسة أثناء إعادة التركيب المتماثل المستهدف. EMBO J. 19: 5552–5561.

أحمد ، إيه ، إيه آر روبنسون ، إيه دوينسينج ، إي فان درونين ، إتش بي بيفرلو ، دي بي ويسبرج ، بي هيستي ، جيه إتش هويجيماكرز ، وإل جيه نيدرهوفر. 2008. ERCC 1- نوكلياز XPF يسهل عملية إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج. مول. خلية. بيول. 28: 5082-5092.

Ahmad، A.، JH Enzlin، NR Bhagwat، N. Wijgers، A. Raams، E. Appledoorn، AF Theil، JH J Hoeijmakers، W. Vermeulen، NG J Jaspers، et al. 2010. سوء تحديد موقع نوكلياز XPF-ERCC1 يساهم في تقليل إصلاح الحمض النووي في مرضى XP-F. بلوس جينيت. 6: e1000871.

Auerbach، AD 2009. فقر الدم فانكوني وتشخيصه. موتات. الدقة. 668: 4-10.

بن شهيدة ، أ. ، ن. غالي ، ر. بن عبد العزيز ، ف. بن موسى ، ون. طيب. 2017. التورط الكلوي في 2 من الأشقاء المصابين بمتلازمة كوكايين. إيران. J. الكلى ديس. 11: 253-255.

Biggerstaff و M. و DE Szymkowski و RD Wood. 1993. التصحيح المشترك لـ ERCC1 و ERCC4 وجفاف الجلد المصطبغ لمجموعة F DNA لإصلاح العيوب في المختبر. EMBO J. 12: 3685–3692.

-2075. 1993.tb06043.xBogliolo، M.، B. Schuster، C. Stoepker، B. Derkunt، Y. Su، A. Raams، JP Trujillo، J. Minguillón، MJ Ramı´rez، R. Pujol ، وآخرون. 2013. الطفرات في ERCC4 ، التي ترميز نوكلياز إكس بي إف لإصلاح الحمض النووي ، تسبب فقر الدم فانكوني. أكون. جيه هوم. جينيه. 92: 800-806.

Ceccaldi ، R. ، P. Sarangi ، و AD D'Andrea. 2016. مسار فانكوني لفقر الدم: لاعبون جدد ووظائف جديدة. نات. القس مول. خلية بيول. 17: 337-349.

دي لات ، و WL ، و E. Appeldoorn ، و NG Jaspers ، و JH Hoeijmakers. 1998 أ. العناصر الهيكلية للحمض النووي المطلوبة لنشاط نوكلياز XPF ERCC 1-. J. بيول. تشيم. 273: 7835-7842.

de Laat و WL و AM Sijbers و H. Odijk و NG Jaspers و JH Hoeijmakers. 1998 ب. رسم خرائط مجالات التفاعل بين بروتينات الإصلاح البشرية ERCC1 و XPF. الدقة الأحماض النووية. 26: 4146-4152.

nar / 26.18.4146.26

de Vries، A.، CT van Oostrom، FM Hofhuis، PM Dortant، RJ Berg، FR de Gruijl، PW Wester، CF van Kreijl، PJ Capel، H. van Steeg، and SJ Verbeek. 1995. زيادة القابلية للتأثر بالأشعة فوق البنفسجية- B والمواد المسرطنة للفئران التي تفتقر إلى جين XPA لإصلاح استئصال الحمض النووي. طبيعة سجية. 377: 169-173.

ديجيوفانا ، وجي جي ، وخي إتش كريمر. 2012. تسليط الضوء على جفاف الجلد المصطبغ. J. الاستثمار. ديرماتول. 132: 785-796.

Enzlin و JH و OD Schrer. 2002. الموقع النشط للنوكلياز الداخلي XPF-ERCC1 لإصلاح الحمض النووي يشكل نموذج نوكلياز محفوظ بدرجة عالية. EMBO J. 21: 2045-2053.

Funaki، S.، S. Takahashi، H. Murakami، K. Harada، and H. Kitamura. 2006. متلازمة كوكايين مع التهاب الكلية الخلالي النبيبي الحاد المتكرر. باتول. كثافة العمليات 56: 678-682.

.02029.x

جيليت ، إل سي ، جي ألزير ، وأودي شرير. 2005. التضمين الخاص بالموقع لـ N- (deoxyguanosine -8- yl) -2- acetylaminofluorene (dG-AAF) في أليغنوكليوتيدات باستخدام تخليق DNA معدل "خفيف للغاية". الدقة الأحماض النووية. 33: 1961-1969.

Gregg و SQ و AR Robinson و LJ Niedernhofer. 2011. العواقب الفسيولوجية للعيوب في نوكلياز إصلاح DNA XPF ERCC. إصلاح الحمض النووي (أمست). 10: 781-791.

Guo، C.، Y. Nakazawa، L. Woodbine، A. Bjorkman، M. Shimada، H. Fawcett، N. Jia، K. Ohyama، TS Li، Y. Nagayama، et al. 2015. يسبب نقص XRCC4 في البشر نمطًا ظاهريًا عصبيًا ملحوظًا ولكن لا يوجد نقص مناعي صريح. كلين الحساسية. إمونول. 136: 1007-1017.

Helfricht، A.، PE Thijssen، MB Rother، RG Shah، L. Du، S. Takada، M. Rogier، J. Moritz، H. IJspeert، C. Stoepker، et al. 2020. يضعف فقدان ZBTB24 الالتحام غير المتماثل وإعادة التركيب في مرضى متلازمة ICF. ياء إكسب. ميد. 217: e20191688.

Houtsmuller، AB، S. Rademakers، AL Nigg، D. Hoogstraten، JH Hoeij-akers، and W. Vermeulen. 1999. عمل نوكلياز إصلاح الحمض النووي ERCC1 / XPF في الخلايا الحية. علوم. 284: 958-961. ح

العلوم 284.5416.958.37

جاسبرز ، إن. 2007. كان أول مريض مصاب بنقص ERCC1 البشري مصابًا بمتلازمة الدماغ والعيون والهيكل العظمي مع خلل بسيط في إصلاح ختان النوكليوتيدات وفشل تنموي حاد. أكون. جيه هوم. جينيه. 80: 457–466.

Joenje و H. و AB Oostra و M. Wijker و FM di Summa و CG van Berkel و MA Rooimans و W. Ebell و M. van Weel و JC Pronk و M. Buchwald و F. Arwert. 1997. دليل لما لا يقل عن ثمانية جينات فقر الدم Fanconi. أكون. جيه هوم. جينيه. 61: 940-944.

جونز ، إم ، إف بورون ، إيه بورغ ، إيه نانز ، سي بي إيرل ، دي سي بريجز ، إيه بي سنيجرز ، إم باولز ، إي بي موريس ، إم لينش ، وإن كيو ماكدونالد. 2020. تكشف هياكل Cryo-EM للنوكلياز الداخلي XPF-ERCC1 كيف أن ارتباط الحمض النووي يؤدي إلى تعطيل التشكل المثبط تلقائيًا. نات. كومون. 11:11.

كاريكينيث ، إيه سي ، إم. شيبي كنودسن ، إي فيفينسون ، دي إل كروتو ، وفا بوهر. 2017. متلازمة كوكايين: السمات السريرية والنظم النموذجية والمسارات. شيخوخة الدقة. القس 33: 3-17.002

Kashiyama، K.، Y. Nakazawa، DT Pilz، C. Guo، M. Shimada، K. Sasaki، H. Fawcett، JF Wing، SO Lewin، L. Carr، et al. 2013. خلل في نوكلياز ERCC 1- XPF يؤدي إلى مظاهر سريرية متنوعة ويسبب متلازمة كوكايين وجفاف الجلد المصطبغ وفقر دم فانكوني. أكون. جيه هوم. جينيه. 92: 807-819.