الجزء: التكييف المسبق والتكييف اللاحق للميتفورمين لتقليل إصابة إعادة ضخ الدم في Lsolated Ex Vivo الفئران والخنازير الكلى نموذج نضح نموذجي
Mar 26, 2022
اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791
توبياس إم هوينك ، ليوني إتش فينيمال ، رينيه بوسما ، نينك جيه دي فريس ، أندري سي ويستيركامبل ، وآخرون.
المقدمة
زرع الكلى هو العلاج المفضل للمرضى الذين يعانون من مرض الكلى في نهاية المرحلة. لسوء الحظ ، فإن الطلب أعلى من توافر الأعضاء .2 وقد أدى هذا النقص إلى زيادة استخدام أعضاء ذات جودة دون المستوى الأمثل من التبرع بعد موت الدورة الدموية (DCD). والذي يرتبط بحدوث ارتفاع ملحوظ في تأخر وظيفة الكسب غير المشروع ، مما يؤثر على النتائج قصيرة الأجل وطويلة الأجل .45 IRI ناتج عن ضعف تدفق الدم وإعادة الأكسجة اللاحقة ، مما يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، بدء سلسلة من الاستجابات الخلوية الضارة .67 وترتبط شدة الإقفار ارتباطًا وثيقًا بفشل الكسب غير المشروع الكلوي المبكر بعد زرع الكلى ويساهم في زيادة معدلات الاعتلال. لذلك ، يجب الحفاظ على نقص التروية الدافئة (W) أثناء استرجاع الأعضاء وزرعها ، ووقت نقص تروية البرد أثناء الحفظ ، على التوالي ، عند الحد الأدنى. يمكن أن تلعب استراتيجيات نضح الآلة دورًا محوريًا في تقليل IRI من خلال توفير الأكسجين خلال مراحل نقص تروية الدم في التبرع بالأعضاء. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر منصة لإضافة عوامل وقائية محتملة قبل ضخه (شرط مسبق) أو أثناء ضخه (بعد التكييف) وهي طريقة مناسبة لتقييم وظيفة الكلى والإصابة على المدى القصير. 9-11
البيغوانيدميتفورمينهو أكثر الأدوية المضادة لفرط سكر الدم عن طريق الفم استخدامًا لعلاج مرضى السكري من النوع 2. آلية العمل والآثار متعددة الاتجاهاتميتفورمينينتج بشكل أساسي عن تثبيط المركب 1 داخل السلسلة التنفسية للميتوكوندريا. 12-14 لذلك ،ميتفورمينقد يخفف IRI بما يتجاوز إجراءات خفض الجلوكوز وقد تم اقتراحه كعامل وقائي للأعضاء أثناء الظروف التي يحدث فيها IRI ، مثل الزرع.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تقييم الآثار المفيدة المحتملة للتكييف المسبق وما بعد التكييفميتفورمينعلى IRI في نموذجين مختلفين مختلفين من نضح الجهاز الطبيعي الحراري المعزول خارج الجسم الحي (NMP) باستخدام كليتي الفئران والخنازير.
تغذية الكلى:عشب التنين التنين
طُرق
دراسة الفئران
الحيوانات.تم استخدام ذكور فئران لويس التي تزن 270-300 جم (Harlan Laboratories ، Boxmeer ، هولندا). وافقت لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها بجامعة جرونينجن على بروتوكول الدراسة (DEC6708C). تلقت الحيوانات الرعاية وفقًا للقانون الهولندي بشأن التجارب على الحيوانات ، وفقًا لمبادئ المعهد الوطني للصحة لرعاية حيوانات المختبر.
التصميم التجريبي واسترجاع الأعضاء والحفظ.تم تقسيم ما مجموعه 31 جرذًا إلى 6 مجموعات (ن =5-6 لكل مجموعة ؛ الشكل 1). في جميع المجموعات ، تم استخدام 15 دقيقة من W و 24 ساعة من الحفظ البارد للحث على الإصابة الدماغية. تم إجراء التكييف المسبق عن طريق إعطاء 300 مجم / كجمميتفورمين(1 ، 1- ثنائي ميثيل بيجوانيد هيدروكلوريد ؛ Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري) مذاب في محلول ملحي (0. 9 بالمائة كلوريد الصوديوم) أو محلول ملحي من خلال التزجيج الفموي قبل 12 و 2 ساعة من استئصال الكلية. محلول ملحي 30 مجم / لترميتفورمينأو 300 مجم / لترميتفورمينتمت إضافته إلى سائل الإرواء كعامل تكييف لاحق. تم اختيار تركيز 300 مجم / كجم من وزن الجسم حيث نتج عن هذه الجرعة مصل الدمميتفورمينالتركيزات التي تتوافق مع تلك الموجودة في البشر أثناء الصيانةميتفورمينالعلاج 17
تم إجراء شراء الكلى مع تغييرات طفيفة في إجراء DCD ، كما هو موضح سابقًا.18 باختصار ، تم تخدير الفئران بنسبة 2-5 بالمائة من الأيزوفلورين وتم إجراء شق البطن عن طريق شق خط الوسط. تم إعطاء مضادات التخثر ، باستخدام 500 وحدة دولية هيبارين (Leo Pharma ، Ballerup ، الدنمارك) ، عبر الوريد الظهري للقضيب. بعد 15 دقيقة من WI ، تم إجراء استئصال الكلية للكلية اليسرى. كان الشريان الكلوي والحالب مقنيا. تم غسل الكلى في الموقع باستخدام محلول التخزين البارد 10 مل (37 درجة) و 5 مل من محلول التخزين البارد بجامعة ويسكونسن (UW) (بريدج تو لايف ، كولومبيا ، ساوث كارولينا). بمجرد إزالتها ، تم غسل الكلى بـ 5 مل من UW مرة أخرى وتخزينها في UW لمدة 24 ساعة عند 4 درجات.
نضح آلة نورموثيرميك.تم وصف طريقة الجرذ NMP على نطاق واسع مسبقًا .18 باختصار ، تم إجراء NMP لمدة 90 دقيقة باستخدام مضخة أسطوانية (Ismatec ISM404 ، زيورخ ، سويسرا). تم ضبط ضغط التروية عند 102 مم زئبق ، ويتم التحكم فيه في الشريان الكلوي. في المجموعة الضابطة ، يتكون سائل التروية من 100 مل William's Medium E مكمل بـ 30 مليمول / لتر HEPES ، و 50 جم / لتر من الألبومين ، و 7 مليمول / لتر كرياتينين (جميع Sigma-Aldrich). في المجموعات التجريبية ، إما 30 أو 300 مجم / لترميتفورمينتمت إضافته إلى سائل الإرواء. تمت أكسجة سائل التروية بنسبة 95 بالمائة من الأكسجين و 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون بتدفق قدره 0. 5 لتر / دقيقة. تم الحفاظ على درجة حرارة سائل التروية عند 37 درجة باستخدام حمام مائي ومبادل حراري (Julabo ، Seelbach ، ألمانيا). تم تسجيل التدفق كل 10 دقائق ، باستخدام مستشعر تدفق معاير (ME1PXN Inline ، Transonic Systems ، Ithaca ، NY). بعد NMP ، تم غمر خزعات الكلى على الفور في 4 في المائة من الفورمالديهايد أو تم تجميدها في النيتروجين السائل ثم تخزينها في وقت لاحق عند -80 درجة.
شكل 1التمثيل التخطيطي للمجموعات التجريبية. تحتوي المجموعات على 5-7 كلى. HMP ، نضح آلة منخفضة الحرارة ؛ NMP ، نضح آلة حراري ؛ WIT ، دافئ وقت نقص التروية.
دراسة الخنازير
الحيوانات.تم جمع الكلى من أنثى الخنازير الهولندية Landrace من مسلخ. تم صعق الحيوانات واستنفادها وفقًا للإجراءات القياسية المحلية. أثناء الاستنزاف ، تم جمع ما يقرب من 1 لتر من الدم في حاوية تحتوي على 25 ، 000 وحدة دولية هيبارين غير مجزأ (Leo Pharma). نظرًا لاستخدام نفايات المسالخ ، لم تكن هناك حاجة إلى موافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات.
التصميم التجريبي واسترجاع الأعضاء والحفظ.للحث على الإصابة الدماغية ، تم استخدام 30 دقيقة من WI. بعد هذه الفترة ، تم غسل الكلى بـ 180 مل من محلول ملحي عند 4 درجات. مباشرة بعد الشطف ، تم أخذ خزعة قشرية (Invivo ، Best ، هولندا) وتخزينها في 4 في المائة من الفورمالديهايد المخزن. لاستيعاب النقل من المسلخ إلى المختبر وكتقنية للحفظ ، تم إدخال القنية على الشريان الكلوي وربط الكلى بجهاز نضح منخفض الحرارة يتم التحكم فيه بالضغط (HMP) (نقل مساعدة الكلى ؛ مساعدة الأعضاء ، جرونينجن ، هولندا ). تم ترطيب الكلى عند 4 درجات باستخدام 500 مل من محلول التروية في آلة UW لمدة 3 ساعات (بريدج تو لايف ، لندن ، المملكة المتحدة) مع أو بدون إضافة 2 مجمميتفورمين، بمتوسط ضغط شرياني 25 مم زئبق. تم توفير الأكسجين (1 0 0 بالمائة) إلى المؤكسج (Hilite LT1000 ؛ Medos Medizintechnik AG ، Stolberg ، ألمانيا) بمعدل تدفق ثابت قدره 0.1 لتر / دقيقة.
نضح آلة نورموثيرميك.تم إعادة استخدام الكلى باستخدام إعداد NMP خارج الجسم الحي لمدة 4 ساعات تم وصفها مسبقًا. في دراستنا ، جرعات متزايدة منميتفورمينأو محلول ملحي باستخدام مضخة التسريب. باختصار ، بعد HMP ، تم تفريغ الشريان الكلوي واحمراره. تم تعليب الحالب لجمع البول ، وبعد ذلك ، تم وزن الكلى ، وأخذت خزعة وتخزينها في 4٪ فورمالديهايد مخزنة لمزيد من التحليل ، وبعد ذلك ، تم وضع الكلى في دائرة NMP خارج الجسم المتحكم فيه بالضغط. تم إجراء NMP باستخدام 5 0 0 مل من الكريات البيضاء مستنفدة ، (BioR 02 plus ؛ Fresenius Kabi ، Bad Homburg ، ألمانيا) ذاتي ، مؤكسج (كاربوجين ، تدفق 0.5 لتر / دقيقة) لمدة 4 ساعات عند ضغط شرياني متوسط يبلغ 80 مم زئبق. يتم توفير المركبات الأخرى المضافة إلى سائل التروية في الجدول S1. في المجموعة التجريبية ،ميتفورمينتم حله في محلول اللاكتات الخاص بـ Ringer (20 مجم / مل ؛ باكستر ، أوترخت ، هولندا) باستخدام مضخة تسريب يتم التحكم فيها بواسطة برنامج مخصص يمكن من خلاله تحديد ملفات تعريف التسريب (Alaris ؛ CareFusion ، Rolle ، سويسرا) كل 30 دقيقة خلال NMP ، تمت زيادة سرعة التسريب وفقًا لجدول زمني محدد مسبقًا (الجدول S2) ، واستند هذا الجدول إلى بيانات الحرائك الدوائية البشرية التي تشير إلى أنميتفورمينالتصفية هي أربع مرات أعلى من تصفية الكرياتينين .19 في المجموعة الضابطة ، تم تروية الكلى دون إضافةميتفورمين. لكل تجربة ، تم تسجيل التدفق باستخدام مسبار تدفق clampon (ME7PXL ؛ أنظمة Transonic) ، والذي تم توصيله بالأنابيب القريبة من الشريان الكلوي. تمت معايرة مسبار التدفق هذا للأنبوب المستخدم ، كل 15 دقيقة خلال NMP ، تم جمع البول واستبداله بالحجم المقابل من محلول اللاكتات الخاص بـ Ringer ، والذي تم تسجيله أيضًا. تم الحفاظ على درجة حرارة سائل التروية عند 37 درجة باستخدام مبادل حراري متكامل متصل بحمام مائي (جولابو). تم أخذ عينات الدم والبول بعد 15 و 60 دقيقة وكل ساعة لاحقة للتحليل الكيميائي الحيوي. عندما تم الانتهاء من NMP ، تم أخذ الخزعات وتخزينها في 4 في المائة من الفورمالديهايد المخزن مؤقتًا ، أو التجميد المفاجئ وتخزينها في درجة -80 لمزيد من التحليل.
تحسين وظيفة الكلى من المكملات الغذائية
كلا الدراستين
التحليلات البيوكيميائية.تم طرد عينات المرواء والبول (1300 جم لمدة 10 دقائق في نموذج الفئران و 1 ، 000 جم لمدة 12 دقيقة في نموذج الخنازير ، على التوالي ، عند 4 درجات) وتم تخزين المادة الطافية في {{7} } الدرجة العلمية . تم تحديد اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) ، وأسبارتات أمينوترانسفيراز (ASAT) ، والكرياتينين في بيرفوسات ، والكرياتينين في البول ، على التوالي ، من قبل مركز المختبر التابع للمركز الطبي الجامعي جرونينجن باستخدام التحليلات الكيميائية الحيوية القياسية. تم قياس كمية البروتين التي تفرز في بول الفئران باستخدام مقايسة بروتين بيرس BCA (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA) ، بينما تم قياس تركيز البروتين الكلي في بول الخنازير باستخدام التحليلات الكيميائية الحيوية القياسية في مركز المختبر.
تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) وفقًا للإجراءات القياسية على نظام Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR ، كما هو موضح سابقًا. الترميز لـ ET -1) ؛ سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) ؛ والعامل الشبيه بكروبل 2 (KLF -2) ، التنشيط البطاني (عامل Von Willebrand (wWF) ؛ جزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM) -1) و IL -6) ، وبروتين الصدمة الحرارية 70 (HSP -70) باستخدام مجموعات التمهيدي المدرجة في الجدول S3. باختصار ، تم استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي من أقسام الكلى باستخدام TRlzol (Life Technologies، Gaithersburg، MD). تم استخدام cDNA التي تم الحصول عليها من الفئران كمرجع داخلي أثناء PCR لاختبار كفاءة التمهيدي. تم تطبيع التعبير الجيني بمتوسط محتوى mRNA -actin. تم التعبير عن النتائج على أنها 2- △ ACT ، حيث تمثل قيمة CT الفرق بين قيم عتبة الدورة.
الشكل 2تم تقييم معلمات التروية والوظائف الكلوية أثناء وبعد نضح الجهاز الحراري الطبيعي لكليتي الجرذان والخنازير. إجمالي تصفية الكرياتينين من الفئران (أ) والخنازير (ب) الكلى. إجمالي إنتاج البول (ج ، د) وإجمالي البروتين الذي يُفرز في البول (هـ ، و) من كليتي الجرذان والخنازير ، على التوالي. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± الخطأ المعياري للمتوسط. تحتوي المجموعات على 5-7 كلى. * P <0. 0="" 5="" و="" **="" p=""><>
التهديف الصرفي.تم تخزين الخزعات المخزنة في 4 في المائة من الفورمالديهايد في البارافين وتم تقطيعها إلى شرائح 4 ميكرومتر. تم تلطيخ الكوبس لاحقًا بحمض شيف الدوري وتم تسجيله على نخر الخلية الأنبوبي القريب (يتراوح من خفيف إلى شديد: 1-5) ، وذمة (تتراوح من خفيفة إلى شديدة: 1-4) ، وتفريغ الخلايا الأنبوبية القريبة ( تتراوح من خفيفة إلى شديدة: 1-4) 21 تم إجراء تقييم الأنسجة المرضية من قبل اثنين من الباحثين. قام اختصاصي علم الأمراض السريري المستقل ذو الخبرة الواسعة في تقييم العلامات النسيجية المرضية للإصابة بعد نضح الجهاز لأعضاء الفئران والخنازير بالتحقق من صحة الدرجات.
العمليات الحسابية.تم حساب المقاومة الوعائية داخل الكلى (IVR) عن طريق قسمة متوسط الضغط الشرياني على التدفق (معبرًا عنه بالملليمتر زئبقي / مل دقيقة). تم حساب تصفية الكرياتينين لتقدير معدل الترشيح الكبيبي باستخدام المعادلة التالية: [الكرياتينين في البول] * تدفق البول / [الكرياتينين في سائل الإرواء].
تحليل احصائي.يتم التعبير عن جميع البيانات على أنها متوسط الخطأ المعياري للمتوسط. عند مقارنة مجموعتين في نقطة زمنية واحدة ، تم تقييم الفروق باستخدام اختبار الطالب غير المقيد. تم اختبار الاختلافات في إجمالي إنتاج البول ، والدرجات المورفولوجية ، والتعبير الجيني باستخدام تحليل التباين. جميع الاختبارات الإحصائية ثنائية الطرف و P أقل من أو تساوي 0. 05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. تم استخدام الإصدار 23 من SPSS Statistics (IBM ، Armonk ، NY) لجميع التحليلات. تم حساب المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) وفقًا لقاعدة شبه منحرف ، وتم استخدامها لتقريب إجمالي تصفية الكرياتينين ، وإجمالي كمية البروتين التي تفرز في البول ، والمستويات الإجمالية لـ ASAT و LDH في سائل الإرواء.
ملاحظة: الأعشاب الطبية الصينية التقليدية (المعروفة أيضًا باسم "عشبة التنين" و "الجينسنغ الصحراوي") تنمو فقط في الصحاري القاحلة والدافئة. باعتبارها واحدة من تسعة أعشاب خالدة ، تحتوي Cistanche (cistanche tubulosa / cistanche deserticola / Desertliving cistanche / cistanche salsa) على مكونات غنية وفعالة مثل echinacoside و acteoside و phenylethanoid glycosides و flavonoids و polysaccharides وما إلى ذلك. تغذية عشب ومواد غذائية لمناعة الناس ، والأعضاء الداخلية ، وخلايا الدماغ والخلايا العصبية ، وما إلى ذلك. أكدت الدراسات الدوائية الحديثة الآثار التالية للتقيؤ (فوائد cistanche): تحسين المناعة ؛ تحسين الوظيفة الجنسية ووظيفة الكلى. مكافحة التعب؛ مكافحة الشيخوخة. تحسين الذاكرة؛ مكافحة مرض باركنسون. مرض الزهايمر. مضادات الأكسدة. سهولة الإمساك مضاد التهاب؛ تعزيز نمو العظام ، تبييض البشرة. حماية الكبد إلخ.
