Tetrandrine يخفف من إصابة Podocyte عن طريق Calpain المعتمد على الكالسيوم -1

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

يين دينغ ، وشوانلي تانغ ، ويوهوي وانغ ، ودونغ رونغ يو ، وكايفنغ تشو ، وجين يو *

الملخص

خلفية:أصبحت Podocytes هدفًا حاسمًا للتدخلات في بروتينيةالكلىالأمراض. أفادت العديد من الدراسات أن الإفراط في التعبير عن بروتين قناة الكاتيون 6 المحتمل لمستقبلات عابرة (TRPC6) في إصابة خلية البودوسيت ينظم تدفق Ca2 بالإضافة إلى تدفق الكالسيوم داخل الخلايا ويحفز Ca2 plus المعتمد على البروتياز calpain -1. يستخدم الدواء الصيني التقليدي ، tetrandrine ، وهو مانع قناة غير انتقائي Ca2 plus ، منذ فترة طويلة لعلاج المزمنالكلىمرض. يهدف هذا البحث إلى استكشاف الآليات المحتملة الكامنة وراء الخصائص المضادة للبروتين في التيتراندرين.

طُرق:لقد بحثنا في تورط التيتراندرين في إشارات Ca2 بالإضافة إلى calpain المعتمد -1 في خلايا الفئران الجرثومية وفئران اعتلال الكلية الناجم عن الأدرياميسين. تم استخدام السيكلوسبورين A (CsA) و U73122 كعناصر تحكم إيجابية. تم فحص قابلية بقاء الخلية ، والسمية الخلوية ، و Ca2 بالإضافة إلى التركيز ، ونشاط calpain ، ومستويات التعبير mRNA والبروتين لمسارات إشارات calpain -1. تم قياس التغيرات السريرية والمرضية.

نتائج:خفض التيتراندرين Ca2 داخل الخلايا بالإضافة إلى التدفق في TRPC المستنبت 6- المفرط في التعبير عن الخلايا البودوسية. في كل من الدراسات التي أجريت في المختبر وفي الجسم الحي ، أدى إعطاء نشاط الكالبيين الخافض للتنظيم التيتراندرين والتعبير عن الكالبين -1 إلى استعادة التعبير عن تالين -1 ونيفرين. مقارنةً بـ CsA ، أظهر العلاج بالتيتراندرين تأثيرات مثبطة فائقة على نشاط الكالبين وتعبير الكالبين -1.

الاستنتاجات:للتيتراندرين إمكانات علاجية في تلف خلية البودوسيت عن طريق منع Ca2 بالإضافة إلى التنشيط المعتمد لمسار إشارات calpain -1. يقلل التيتراندرين من بروتينية ، ويحسن وظائف الكلى ، ويخفف الضرر المرضي الكلوي.

الكلمات الدالة:Tetrandrine ، إصابة Podocyte ، بروتين 6 لقناة الكاتيون الموجبة لمستقبلات عابرة ، Calpain -1

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

خلفية

تعتبر Podocytes شرطًا أساسيًا للحفاظ على النفاذية الانتقائية لحاجز الترشيح الكبيبي والسلامة الهيكلية الكبيبية. عادةً ما ترتبط إصابة Podocyte بأمراض الكلى البروتينية ، بما في ذلك تصلب الكبيبات القطاعي البؤري (FSGS) ، واعتلال الكلية الغشائي ، ومرض التغيير الأدنى ، ومرض السكري.الكلىمرض [1-4]. تشكل حماية خلايا الأقدام واستعادتها من العوامل الضارة تحديًا كبيرًا في العلاج الناجح لأمراض الكلى.

Podocytes هي خلايا عالية التخصص ومتباينة نهائيًا تقع خارج الغشاء القاعدي الكبيبي وتتميز بعمليات القدم. يؤدي الخلل في تنظيم إشارات الكالسيوم في الخلايا البادئة إلى خلل في الهيكل الخلوي لخلايا البودوسيت ، وتشوه عملية القدم ، وتعطل الحجاب الحاجز الشق ، والبيلة البروتينية. تم التعرف على بروتين 6 قناة كاتيون محتمل لمستقبلات عابرة (TRPC6) ، وهو بروتين جديد مرتبط بحجاب الحاجز الشق في الخلايا podocytes ، على أنه قناة أيون غير محددة Ca2 بالإضافة إلى موصل أيون [5-8]. يتم زيادة التعبير الكبيبي TRPC6 في العديد من الأمراض البروتينية الوراثية والمكتسبة. أفادت الدراسات السابقة أن الإفراط في التعبير عن TRPC6 في الخلايا البودوسية يؤدي إلى زيادة كبيرة في تدفق Ca2 بالإضافة إلى التدفق داخل الخلايا ، والذي يُعتقد أنه مسؤول عن إصابة خلايا البودوسيت. تؤدي زيادة تحميل الكالسيوم داخل خلايا الأقدام إلى تنشيط مسارات الإشارات النهائية ، بما في ذلك calpain -1 ، و Talin -1 ، و nephrin ، و calcineurin ، لتعديل نشاط أو تعبير الجينات المستهدفة [9-12]. Fangji Huangqi Tang هو دواء صيني تقليدي كلاسيكي (TCM) لعلاج المتلازمة الكلوية [13]. وهو يتألف من ستة أعشاب: Radix Stephania Tetrandra (جذور Stephania tetrandra) ، Radix Astragali (جذور Astragalus Membranaceus) ، Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (جذور Atractylodes macrocephaly) ، Radix Glycyrrhizuralis (جذور الجلسرينغريزا) (جذور Zingiber Officinale) و Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus Jujubae) [1]. تم اختبار التيتراندرين ، وهو أحد المكونات النشطة الرئيسية لـ Radix Stephania Tetrandra ، وهو مانع قناة غير انتقائي Ca2 plus ، في التجارب السريرية وأشير إلى أنه يخفف من البيلة البروتينية ويحسن وظائف الكلى [14 ، 15]. أظهرت دراسة سابقة تأثيرات الحجب للتيتراندرين على Ca2 بالإضافة إلى إشارات RhoA المعتمدة في الخلايا البودوسية [16] ، ولكن لم يتم توضيح الآليات الكامنة وراء ذلك. هنا ، تم تطوير نماذج التعبير المفرط TRPC 6- في المختبر وفي الجسم الحي. بعد إعطاء tetrandrine ، تم تقييم التغييرات في TRPC 6- المعتمد على Ca2 بالإضافة إلى الإشارات ، بما في ذلك أهداف المصب ، calpain -1 ، Talin -1 ، nephrin ، و calcineurin. تم استخدام السيكلوسبورين A (CsA) ، وهو مثبط للكالسينورين ، يستخدم على نطاق واسع في علاج أمراض البيلة البروتينية) [17] و U73122 ، وهو مثبط لفتح قناة TRPC6 [18] كعناصر تحكم إيجابية.

طُرق

ثقافة الخلية وبناء البلازميد

تم الحفاظ على خلايا خط خلية خلية بودوسيت (MPC5) ، التي تم الحصول عليها من البروفيسور بيتر مونديل (مدرسة Mount Sinai للطب ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، التي تم تخليدها بشكل مشروط عند 33 درجة للتكاثر ، ثم تحولت إلى 37 درجة للتمايز. تم بناء بلازميد التعبير Te TRPC6 عن طريق استنساخ الطول الكامل لتسلسل الحمض النووي الترميز لجين TRPC6 في مواقع EcoRI / BamHI لمتجه pCDH-GFP-PURO وتعبئته في الفيروس البطيء. عند التمايز والنمو إلى ما يقرب من 80 في المائة من التقاء ، تم زرع البذرة في كثافة خلية تبلغ 4 × 104 لكل سم 2 واحتضانها مع TRPC 6- overexpressing lentivirus. تم استخدام خط الخلايا المستقرة Te TRPC6 ، الذي تم التحقق منه باستخدام بروتين TRPC6 وتعبير mRNA ، لإجراء مزيد من التجارب. تم تقسيم خلايا Tus و MPC5 إلى ثلاث مجموعات ، مجموعة التحكم العادية (NC) ومجموعة الفيروسات البطيئة الفارغة (Lv-NC) ومجموعة TRPC 6- overexpressing (OverTRP).

العلاج بالعقاقير بالخلايا المختبرية وفحص السمية الخلوية

تم الوصول إلى صلاحية الخلية باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا {0} (CCK -8) ، وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة. تمت زراعة ما مجموعه 5 0 00 MPC5 خلية بئر في ثلاث نسخ في 96- لوحات جيدة. عولجت الخلايا بسلسلة من CsA (0–2μmol / L ؛ Sigma-Aldrich، St. تمت إضافة CCK -8 بعد ذلك إلى الأطباق (10 ميكرولتر / بئر) ، والتي تم تحضينها بعد ذلك في الظلام لمدة ساعتين. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (BioTek Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم السمية الخلوية عن طريق تحديد كمية نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) باستخدام مجموعة اختبار LDH للسمية الخلوية- WST (مختبرات Dojindo ، اليابان). كعنصر تحكم إيجابي ، تم علاج الخلايا بـ 10μmol / LU73122 (Cal biochem ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة لمدة 10 دقائق.

استخراج الحمض النووي الريبي والتفاعل الكمي العكسي للبوليميراز المتسلسل (qRT ‑ PCR)

تم تحضير مجموع الحمض النووي الريبي من الخلايا المستنبتة والكلىالأنسجة باستخدام كاشف RNAiso Plus (تاكارا ، اليابان) ونسخها عكسيًا إلى مجموعة cDNA PrimeScript ™ RT Master Mix (تاكارا) وفقًا لبروتوكول المصنّعين. تم إجراء qRT-PCR باستخدام Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific ، ألمانيا). يتم سرد تسلسل التمهيدي للجينات المستهدفة والجينات المرجعية في الجدول التكميلي S1. تم جمع البيانات باستخدام نظام ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR. تم تطبيع القياس الكمي النسبي للتعبير الجيني المستهدف باستخدام طريقة المقارنة 2- ΔΔCt. تم استخدام Glyceraldehyde 3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH) كعنصر تحكم داخلي.

النشاف الغربي

تم استخراج عينات البروتين الكلي من الخلايا المستنبتة والكلىمناديل. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (Thermo Fisher Scientific). تم فصل العينات على 10 في المائة من هلام دوديسيل كبريتات - بولي أكريلاميد الصوديوم ونقلها إلى غشاء ثنائي فلوريد متعدد الفينيل. تم بعد ذلك سد الغشاء طوال الليل عند 4 درجات بالأجسام المضادة الأولية ، وهي مضادات TRPC6 (سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، والألم المضاد للكالسيوم -1 (Abcam ، المملكة المتحدة) ، ومكافحة Talin -1 (Abcam) ، ومضاد النيفرين (سانتا كروز) ، ومضاد الكالسينورين (أبكام). بعد الغسيل ، تم تحضين الغشاء بمضاد أرنب الماعز IgG (H plus L ، Jackson ImmunoResearch Laboratories ، USA). تمت معالجة الغشاء أيضًا للكشف عن GAPDH (Abcam) من أجل التحميل المتساوي. تم تصور نطاقات Te التي تم التعرف عليها بواسطة الجسم المضاد الأولي ، وتم تحليل الكثافة البصرية لنطاقات البروتين باستخدام برنامج TanonImage (تانون ، الصين).

تحديد Ca2 زائد عصاري خلوي في خلايا podocytes المستنبت MPC5 تم بذرها ومعالجتها باستخدام tetrandrine و CsA و U73122 لمدة 48 ساعة و 48 ساعة و 10 دقيقة على التوالي. ثم تم تحضين بودوسيتيس مع RPMI -1640 مكمل بـ 10 ميكرومتر Fluo -3 AM (Dojindo Laboratories) لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد ذلك ، تم غسلها على الفور بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات ، حيث تم الحفاظ عليها وإثارة حماستها عند 488 نانومتر. تم تقييم التركيز النسبي لعصارة الخلية Ca2 بالإضافة إلى أيون عن طريق قياس شدة التألق باستخدام نظام التصوير متحد البؤر بالليزر زايس (زايس ، الولايات المتحدة الأمريكية).

قياس نشاط الكالبي

تم تحديد نشاط Calpain باستخدام Calpain Activity Assay Kit من Abcam Inc. ، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. المادة الطافية (150 ميكرولتر) للخلايا البودوسية أوالكلىتم أخذ الأنسجة في محلول منظم مناسب (145 مليمول / لتر Nacl ، 1 0 0 mmol / L Tris-HCL ، pH 7.3) و 0.15mLN-Succinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol / L). بعد حضانة 1- ساعة عند 37 درجة في الظلام ، تمت قراءة العينات باستخدام مقياس التألق المجهز بفلتر إثارة 360 نانومتر ومرشح انبعاث 440 نانومتر.

نموذج الفئران للاعتلال الكلوي الناجم عن Adriamycin (ADRN) استنادًا إلى تقريب Fermi لحجم العينة [19] وفرق بروتينية بين مجموعة التحكم ومجموعات النموذج في تجاربنا الأولية ، تم تحديد العدد الإجمالي للفئران المطلوبة في دراستنا. تم تقسيم ما مجموعه 56 من فئران سبراغ داولي الصحية ، التي تزن حوالي 200 جرام وتبلغ من العمر 8 أسابيع تقريبًا (معهد تشجيانغ للطب الصيني التقليدي) ، بشكل عشوائي إلى سبع مجموعات (ن =8 جرذان / مجموعة) ، وهي مجموعة ADR ، ADR plus مجموعة جرعة منخفضة من التيتراندرين (4 مجم / كجم / يوم) ، ADR بالإضافة إلى مجموعة جرعة متوسطة من التيتراندرين (8 مجم / كجم / يوم) ، ADR بالإضافة إلى مجموعة جرعة عالية من التيتراندرين (16 مجم / كجم / يوم) ، ADR بالإضافة إلى مجموعة معالجة CsA (30 مجم / كجم / د) ، ADR بالإضافة إلى الجرعة المتوسطة من التيتراندرين (8 مجم / كجم / يوم) بالاشتراك مع مجموعة CsA (30 مجم / كجم / يوم) ومجموعة NC. تم تخدير الفئران في المجموعة النموذجية ومجموعات العلاج بالعقاقير بحقن داخل الصفاق من هيدروكلوريد الكيتامين (50 مجم / كجم) ، وتم حقن جرعتين من ADR (4 مجم / كجم) في الوريد الذيلية لتطوير نموذج FSGS الفئران. بعد 12 أسبوعًا ، تم جمع عينات بول من الفئران لمدة 24 ساعة باستخدام أقفاص استقلابية ، يليها جمع الدم وحصادالكلى. لوحظت الفعالية الإكلينيكية ، وتم قياس التغييرات في 24- مستويات بروتين البول وألبومين البلازما وكرياتينين المصل (Scr) ونيتروجين بول الدم (BUN) باستخدام مجموعات التشخيص المتاحة تجاريًا مع محلل كيميائي آلي (HITACHI 7180 ).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات بشأن التجارب على الحيوانات في معهد تشجيانغ للطب الصيني التقليدي (طريق تيانموشان رقم 132) وتم تنفيذها بدقة وفقًا للمبادئ الموضحة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام حيوانات المختبر .

التلوين النسيجي والفحص المجهري الإلكتروني والتحليل

فأرالكلىتم إصلاحها في بارافورمالدهيد ، وتجفيفها باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول ، ومضمنة في البارافين. المقاطع ({0}} ميكرومتر) ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) وثلاثي الكروم ماسون وتم فحصها تحت المجهر الضوئي. تم ترطيب الكلى وتثبيتها باستخدام الجلوتارالدهيد ثم تم تقطيعها إلى كتل نسيجية بحجم 1- مم 3 لتضمين الإيبوكسي. تم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني باستخدام الإجراءات القياسية. تم الحصول على خمسة صور مجهرية فائقة بشكل عشوائي من كل عينة. تم حساب معدل اندماج عمليات قدم بودوسيت (PFR) باستخدام الصيغة التالية: PFR (النسبة المئوية)=∑LFP / ∑LBM × 100 بالمائة ، حيث ∑LFP هو الطول الإجمالي لعملية القدم المنصهرة و LBM هو الطول الكلي للغشاء القاعدي الشعري المحيطي (BM).

تحليل احصائي

يتم التعبير عن البيانات على أنها ± خطأ معياري للقياس ويتم تحليلها باستخدام SPSS 2 0. 0 (IBM Statistics SPSS ، الولايات المتحدة) و GraphPad Prism 6 لنظام التشغيل Windows (GraphPad Software Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تقييم التوزيع الطبيعي من خلال قطع الأرض qq واختبار SW. أظهرت البيانات توزيعًا طبيعيًا. عند مقارنة مجموعتين من البيانات ، تم تطبيق اختبار t للعينات المستقلة. تمت مقارنة الاختلافات بين ثلاث مجموعات مستقلة أو أكثر باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار Tukey اللاحق. تم تعيين الدلالة الإحصائية عند p<>

نتائج

اختيار التركيزات المثلى والسمية الخلوية للتيتراندرين و CsA و U73122

تم استخدام اختبار CCK {0}} للكشف عن صلاحية الخلية. كما هو مبين في الشكل 1 أ و ب ، فإن أقصى تركيز قدره 1 0 ميكرولتر / لتر من التيتراندرين و 0. لم يؤثر 1 ميكرو مول / لتر من CsA على صلاحية خلايا MPC5. أكد اختبار إطلاق LDH أيضًا أن 10μmol / L tetrandrine و 0.1μmol / L CsA لمدة 48 ساعة لم تظهر أي سمية ، في حين أظهر 10μmol / LU73122 لمدة 10 دقائق السمية المتوقعة (الشكل 1 ج). لذلك ، استخدمت التجارب الخلوية اللاحقة التيتراندرين و CsA عند 10 ميكرولتر / لتر و 0.1 ميكرولتر / لتر ، على التوالي.

قلل التيتراندرين من تدفق الكالسيوم داخل الخلايا بالإضافة إلى التدفق في خلايا MPC5 المستزرعة التي تزيد من التعبير عن TRPC6

باستخدام تعداء البلازميد ، تم بنجاح إنشاء نموذج خلوي للتعبير الزائد عن التعبير TRPC6 في خلايا podocytes MPC5. أظهر تحليل qRT-PCR وتحليل اللطخة الغربية أن مستويات التعبير عن TRPC6 في مجموعة Over-TRP زادت بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في مجموعات NC و Lv-NC (ص.<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

أشار التصوير الفلوري (الشكل 2 ج) والتحليل شبه الكمي (الشكل 2 د) إلى أن الإفراط في التعبير عن TRPC6 عزز التدفق داخل الخلايا Ca2 بالإضافة إلى التدفق ، بينما لم تكن هناك اختلافات واضحة بين مجموعات NC و Lv-NC. ثم عولجت عشر خلايا مجموعة OverTRP بالعقاقير التجريبية. كان لمجموعات العلاج المسبق للأدوية (التيتراندرين ، CsA ، و U73122) تأثيرات مثبطة على تدفق الكالسيوم داخل الخلايا بالإضافة إلى (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

آثار التيتراندرين على النشاط والتعبير عن كالباين ‑ 1 ، الكالسينورين ، تالين 1 ، والنيفرين في خلايا MPC5

لقد ثبت أن Ca2 plus داخل الخلايا ينشط calpain ، و Ca2 plus- بروتين سيستين المعتمد ، و calcineurin ، وهو بروتين فوسفاتيز Ca2 plus / calodulin المعتمد. تماشياً مع الملاحظات السابقة ، كانت مستويات النشاط والتعبير لـ calpain و calcineurin في مجموعة Over TRP أعلى من تلك الموجودة في مجموعات NC و Lv-NC (ص.<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0. 05) ونفرين (ص<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0 .5 ؛ الشكل 3f و g و j و k).

تم تضمين المواد الهلامية والبقع كاملة الطول في الشكل التكميلي S1.

في التجارب المجراة باستخدام نموذج الفئران من ADRN لتوصيف الاستجابة لتثبيط التتراندرين بوساطة إشارات TRPC6 / calpain -1 في الجسم الحي ، تم تطوير نموذج ADRN في الفئران. تمت زيادة ملفات تعريف mRNA والبروتين لـ TRPC6 بشكل كبير في مجموعة ADRN مقارنة بتلك الموجودة في الفئران التي تتغذى بالطعام العادي (مجموعة NC ؛ ص.<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

لم يمنع العلاج باستخدام CsA تنشيط الكالئين الناجم عن الإفراط في التعبير عن TRPC6 (الشكل 4 ج) ، ولم يكن التأثير قويًا مثل تأثير التيتراندرين على ألم الكال -1 تعبير البروتين (ص<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

لم يمنع العلاج باستخدام CsA تنشيط الكالبي الناجم عن الإفراط في التعبير عن TRPC6 (الشكل 4 ج) ، ولم يكن التأثير قويًا مثل تأثير التيتراندرين على التعبير البروتيني لـ calpain -1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

علاوة على ذلك ، تم تقييم تعبير Talin -1 و nephrin (الشكل 4h و i و l و m). تم خفض مستويات تالين -1 ونيفرين في جرذان ADRN مقارنةً بتلك الموجودة في مجموعة NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

تم تضمين المواد الهلامية والبقع كاملة الطول في الشكل التكميلي S2.

قام التيتراندرين بقمع تقدم ADRN وإنقاذ التشريح المرضي من تأثير التيتراندرين علىالكلىتم تقييم الوظيفة في جرذان Sprague-Dawley التي عولجت بـ ADRN لاحقًا (الشكل 5 أ-د). لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية أولية في مستويات 24- البيلة البروتينية و Scr و BUN بين المجموعات. بعد اثني عشر أسبوعًا ، تم زيادة مستويات البيلة البروتينية لمدة 24 ساعة ، و Scr ، و BUN في مجموعة ADRN إحصائيًا ، في حين انخفض مستوى ألبومين البلازما بشكل ملحوظ ، مقارنةً بتلك الموجودة في مجموعة NC (P).<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0 .5 ؛ البيانات غير ظاهرة).

تظهر التغييرات في التركيب النسيجي في الشكل 6. في الفئران ADRN ، أظهر تلطيخ H&E و Masson FSGS ، تليف نبيبي خلالي ، وتسلل الخلايا الالتهابية الخلالي الكلوية. بالإضافة إلى ذلك ، كشف التصوير المجهري الإلكتروني للكبيبات عن عمليات قدم متحللة ومُسمنة ومندمجة بدرجة عالية مع 80-100 بالمائة من خلايا بودوسيت PFR. أظهرت الجرذان في المجموعات الفرعية التيتراندرين (الجرعات المتوسطة والجرعة العالية) آفات أقل من مجموعة ADR بنطاقات مختلفة ، وكان التحسن في مجموعة الجرعات العالية متفوقًا على مجموعة الجرعة المتوسطة. في الجرعات المنخفضة والمتوسطة والعالية من المجموعات المعالجة بالتيتراندرين ، كانت Podocyte PFRs 70-80٪ ، 50-60٪ ، 30-40٪ على التوالي. تشير هذه البيانات إلى أن التيتراندرين محمي ضد التلف البنيوي للكبيبات الكلوية الناجم عن إدارة ADR. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في التغيرات المرضية تحت المجهر الضوئي بين المجموعات (جرعة عالية من التيتراندرين ، CsA ، و tetrandrine بالاشتراك مع CsA). بالإضافة إلى ذلك ، كانت Podocyte PFR في مجموعة ADRN المعالجة بـ CsA هي نفسها الموجودة في الجرعات العالية من المجموعات المعالجة بالتيتراندرين.

مناقشة

أصبحت Podocytes حاسمة بشكل متزايد كهدف للتدخلات في FSGS والأمراض الكلوية ذات الصلة [20 ، 21]. هنا ، بناءً على البيانات المختبرية والحيوية ، كان

أظهر أن حماية الخلايا القرنية والتأثير المضاد للبروتينات لتيتراندرين ، وهو مانع قناة غير انتقائي Ca2 زائد ، تم التوسط من خلال تثبيط Ca2 بالإضافة إلى التدفق داخل الخلايا و Ca2 بالإضافة إلى calpain المعتمد -1 سلسلة إشارات ، بما في ذلك Talin -1 والنيفرين والكالسينيورين. كان Tetrandrine أكثر فعالية من تثبيط -1 calpain.

وفقًا للنتائج السابقة ، فإن خلية البودوسيت TRPC6 هي القناة التي تساهم بشكل أساسي في التغيرات في تدفق الكالسيوم بالإضافة إلى تدفق في ظل الظروف العادية والمرضية [7 ، 22]. من المعروف على نطاق واسع أن نشاط الكالباين يعتمد على مستويات الكالسيوم ويرتبط بهالكلىإصابة ، وخاصة إصابة الكلى المضادة للكبيبات BM [10 ، 23]. من بين 15 شكلًا من أشكال الكالبيين التي تم تحديدها ، ظهر مؤخرًا أن calpain -1 يربط نشاط TRPC6 بإصابة خلية القدم [24]. تم الإبلاغ عن أن Calpain -1 يشق بروتين تالين المرتبط بالهيكل الخلوي المرتبط بالهيكل الخلوي -1 وبروتين الحجاب الحاجز الشق ، nephrin ، الذي يزعج سلامة الخلايا البودوسية ويؤدي إلى بيلة بروتينية شديدة [8-12 ، 16]. Calcineurin هو الكالسيوم المعتمد على الفوسفاتيز الذي سبق أن ثبت أنه يلعب دورًا في الخلايا البودوسية والكلىوظيفة. تشير الأدلة المتراكمة على نحو متزايد إلى أن الكالبيين يمكن أن يشق وينشط الكالسينورين بطريقة تحلل البروتين [25 ، 26]. خلقت هذه الدراسة نماذج التعبير المفرط TRPC6 عن طريق الإصابة بالفيروس في خلايا podocytes المستزرعة وحقن الأدرياميسين في جرذان SD. وفقًا لذلك ، أظهرنا أن TRPC 6- بوساطة Ca2 بالإضافة إلى تدفق ينشط نشاط calpain ، وتعبير calpain عضو عائلة calpain -1. زيادة الكالبين -1 أدى لاحقًا إلى شق تالين -1 ونيفرين.

التيتراندرين هو قلويد مستخرج من مصنع الطب الصيني التقليدي وهو مانع قناة Ca2 plus غير انتقائي. هنا ، تم التأكيد مجددًا على أن التيتراندرين تثبط الإفراط في التعبير عن TRPC6 وتقليل تدفق Ca2 plus في كل من الخلايا والفئران المفرطة في التعبير عن TRPC6 ، كما هو موثق سابقًا [16]. الأهم من ذلك ، تركز هذه الدراسة على التأثير المتداخل للتيتراندرين على مسار إشارات المصب المعتمد على الكالسيوم. لوحظ أنه ، على عكس CsA ، قلل التيتراندرين من نشاط البروتياز المحايد المنشط بالكالسيوم (calpain). علاوة على ذلك ، قلل التيتراندرين من التعبير عن عائلة البروتياز المنشط بالكالسيوم ، calpain -1 ، وأعاد التعبير المنظم عن تالين -1 ونيفرين. بالمقارنة مع CsA ، أظهرت إدارة التيتراندرين تأثيرات متفوقة على تثبيط الكالبيين والتعبير الخاضع للتنظيم عن الكالبين -1. أظهرت هذه النتائج أن للتيتراندرين إمكانات علاجية في تلف خلايا القدم عن طريق منع التنشيط المعتمد على TRPC 6- لمسار إشارات calpain -1.

تم تحديد Phospholipase C (PLC) ليكون شريكًا ملزمًا لـ TRPC 6- [27]. يثبط U73122 PLC بحيث يتم إنشاء كمية أقل من ثنائي أيسيل جلسرين ويتم تقليل فتحة قناة TRPC6 [18 ، 24]. وبالتالي ، تم استخدام U73122 بالتوازي كعنصر تحكم إيجابي ، وقد أظهر تأثيرًا ملحوظًا في تقليل تدفق Ca2 زائد داخل الخلايا ، وتثبيط نشاط الكالابين ، وتعبير calpain -1 في خلايا podocytes التي تفرط في التعبير عن TRPC6. ومع ذلك ، أظهرت فحوصات السمية الخلوية في المختبر سمية واضحة لخلايا القرنية.

في هذه الدراسة ، بعد 12 أسبوعًا من حقن ADR ، ظهرت بيلة بروتينية خطيرة ، ونقص ألبومين الدم ، ومستويات مرتفعة من BUN و Scr في الفئران المعالجة بـ ADR --. كشف الفحص المجهري الضوئي عن FSGS ، والتليف الخلالي الأنبوبي ، وتسلل الخلايا الالتهابية الخلالي الكلوية في الفئران ADRN. أظهر الفحص المجهري الإلكتروني محوًا واسع النطاق لعمليات القدم. أظهرت البيانات في الجسم الحي كذلك أن العلاج التيتراندرين يمكن أن يقلل من بروتينية ، ويحسن وظائف الكلى ، ويقلل من تطور تصلب الكبيبات. بعد العلاج بالتيتراندرين ، تم تحسين التغيرات المرضية تحت المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني ، 24- البيلة البروتينية ، وألبومين البلازما ، و Scr ، و BUN في فئران ADRN بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الموجودة في مجموعة NC.

يستخدم مثبط الكالسينيورين CsA منذ فترة طويلة لعلاج بروتينيةالكلىالأمراض [28]. Calcineurin مهم سريريا كهدف مباشر للعقار المثبط للمناعة CsA [17 ، 29]. يقلل CSA من التعبير عن الكالسينيورين ويقلل من العامل النووي بوساطة الكالسينيورين للخلايا التائية المنشطة [30-32]. تدعم الأدلة الحديثة تأثير استقرار CsA على الهيكل الخلوي الأكتيني podocyte ، مثل سينابتوبودين عن طريق منع نزع الفسفرة بوساطة الكالسينيورين من سينابتوبودين [17]. وقد ثبت أيضًا أن الكالبين يمكن أن يشق وينشط الكالسينورين بطريقة تحلل البروتين [25 ، 26]. أكدت بيانات هذه الدراسة أن CsA تثبط نشاط وتعبير الكالسينيورين بقوة أكبر من التيتراندرين. كما ورد سابقًا ، لا يبدو أن CsA تؤثر بشكل مباشر على نشاط الكالبين.

كان أحد القيود الرئيسية للدراسة هو الفشل في إظهار التأثير المعتمد على الجرعة بين المجموعات الفرعية التيتراندرين (جرعة منخفضة ، جرعة متوسطة ، جرعة عالية). قد يكون أحد التفسيرات المحتملة هو أن نطاق الجرعات الذي استخدمناه كان مرتفعًا جدًا بالنسبة للفئران. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون الفروق الفردية في التجربة الحيوانية أكبر بكثير من الاختلافات في الجرعة. قد يقلل حجم العينة الصغير نسبيًا من القوة الإحصائية. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات بما في ذلك جرعات أصغر بكثير وحجم العينة المناسب للتأكد من مدى الجرعة الدقيقة وتأثير التيتراندرين في الفئران ARDN.

باختصار ، في تنظيم مسارات إشارات الكالسيوم ، أظهر التيتراندرين تأثيرًا مثبطًا واضحًا على الكالبين -1 ، بينما أثر CsA بشكل مباشر على تثبيط الكالسينيورين. تشير هذه النتائج إلى أن العلاج المشترك بـ tetrandrine و CsA قد يؤثر على أهداف متعددة لشبكة إشارات الكالسيوم لتحسين النتائج السريرية. الدراسات التوكيدية ضرورية للتحقق من صحة هذه الملاحظات وكذلك لتوضيح آليات التأثيرات التآزرية.

الاختصارات

FSGS: التصلب الكبيبي البؤري القطعي. MCD: مرض التغيير الأدنى ؛ MN: اعتلال الكلية الغشائي. DKD: مصاب بمرض السكريالكلىمرض؛ TRPC6: البروتين 6 لقناة الكاتيون المحتملة لمستقبلات عابرة ؛ Ca2 plus: الكالسيوم ؛ الطب الصيني التقليدي: الطب الصيني التقليدي الكلاسيكي ؛ تيت: التيتراندرين. CsA: السيكلوسبورين أ ؛ Scr: مصل الكرياتينين. BUN: نيتروجين البول في الدم. PFR: معدل اندماج العمليات ؛ BM: الغشاء القاعدي. ADRN: اعتلال الكلية الناجم عن Adriamycin. PLC: فسفوليباز سي.

حكمnces

1. Garg P. مراجعة لبيولوجيا الخلية. أنا J نفرول. 2018 ؛ 47 (ملحق 1): 3-13.

2. Khalilpourfarshbaf M، Hajiaghaalipour F، Selvarajan KK، et al. العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية الوسيطة ضد تلف خلايا القدم في اعتلال الكلية السكري. الأنسجة المهندس ريجين ميد. 2017 ؛ 14: 201-10.

3. إصابة Nagata M. Podocyte وعواقبها. الكلى Int. 2016 ؛ 89: 1221-30.

4. Pavenstädt H ، Kriz W ، Kretzler M. بيولوجيا الخلية في الخلية الكبيبية. فيسيول القس .2003 ؛ 83: 253-307.

5. Riehle M ، Büscher AK ، Gohlke BO ، وآخرون. ترتبط طفرة فقدان الوظيفة TRPC6 G757D بـ FSGS. J آم سوك نفرول. 2016 ؛ 27: 2771–83.

6. Ilatovskaya DV ، Blass G ، Palygin O ، وآخرون. مسار NOX4 / TRPC6 في تنظيم الكالسيوم في خلايا القدم والضرر الكلوي في مرض الكلى السكري. J آم سوك نفرول. 2018 ؛ 29: 1917–27.

7. Reiser J ، Polu KR ، Möller CC ، وآخرون. TRPC6 هي قناة مرتبطة بالحجاب الحاجز الكبيبي مطلوبة لوظيفة الكلى الطبيعية. نات جينيه. 2005 ؛ 37: 739-44.

8. هوانغ ح ، أنت واي ، لين إكس ، وآخرون. يحد تثبيط مسار إشارة TRPC6 من إصابة خلايا القدم التي يسببها TGF - 1. خلية Physiol Biochem. 2017 ؛ 41: 163-72.

9. Verheijden KAT، Sonneveld R، Bakker-van Bebber M، et al. يربط البروتيز المعتمد على الكالسيوم -1 نشاط TRPC6 بإصابة خلية البودوسيت. J آم سوك نفرول. 2018 ؛ 29: 2099-109.

10. Peltier J ، Bellocq A ، Perez J ، وآخرون. تنشيط وإفراز الكالب يعزز إصابة الكبيبات في التهاب كبيبات الكلى التجريبي: دليل من الفئران المعدلة وراثيا كالباستاتين. J آم سوك نفرول. 2006 ؛ 17: 3415-23.

11. تيان إكس ، كيم جي جي ، مونكلي إس إم وآخرون. يعتبر talin1 المرتبط بخلايا بودوسيت أمرًا بالغ الأهمية لصيانة حاجز الترشيح الكبيبي. ياء نوتر إنستيج. 2014 ؛ 124: 1098-113.

12. جيانغ إل ، دينغ جي ، تساي إتش ، وآخرون. تحفز القناة الكاتيونية المحتملة لمستقبلات عابرة 6 في خلايا podocytes الإفراط في التعبير عن إعادة ترتيب الهيكل الخلوي من خلال زيادة تنشيط Ca2 plus و RhoA داخل الخلايا. إكسب بيول ميد (مايوود). 2011 ؛ 236: 184-93.

13. Liu X و Zhou QG و Zhu XC وآخرون. فحص المكونات النشطة المحتملة لـ Fangji Huangqi tang على علاج المتلازمة الكلوية باستخدام عمليات التمثيل الغذائي المتكاملة بناءً على "الارتباطات بين الملامح الكيميائية والاستقلابية". فارماكول الجبهة. 2019 ؛ 10: 1261.

14. ليو كيه سي ، لين واي جي ، هسياو واي تي ، وآخرون. يستحث التيتراندرين موت الخلايا المبرمج في خلايا سرطان البلعوم الأنفي البشري NPC-TW 039 عن طريق إجهاد الشبكة الإندوبلازمية ومسارات Ca2 plus / Calpain. الدقة المضادة للسرطان. 2017 ؛ 37: 6107–18.

15. Wang YJ ، He LQ ، Sun W ، وآخرون. مشروع محسن للطب الصيني التقليدي في علاج المرحلة الثالثة من مرض الكلى المزمن: تجربة معشاة ذات شواهد مزدوجة التعمية متعددة المراكز. ي إثنوفارماكول. 2012 ؛ 139: 757-64.

16. Yu J ، Zhu C ، Yin J ، وآخرون. يقوم التيتراندرين بقمع مستقبلات قناة الكاتيون 6 المحتملة لمستقبلات عابرة - تلف خلية البودوسيت الناجم عن الإفراط في التعبير عن طريق انسداد إشارات RhoA / ROCK1. المخدرات Des Devel Ther. 2020 ؛ 14: 361-70.