الجزء: دور SIK1 في انتقال إصابة الكلى الحادة إلى مرض الكلى المزمن

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

Jinxiu Hul و JiaoQiaot و Qun Yul و Bing Liu1 وآخرون.

خلفية

إصابة الكلى الحاد(AKI) ، وهو مرض شائع يتميز بانخفاض معدل الترشيح الكبيبي (GFR) وزيادة الكرياتينين في الدم [1] ، يعتبر عامل خطر لتطور وتطور مرض الكلى المزمن [2،3]. في الآونة الأخيرة ، AKI-CKD (اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن) أصبح الانتقال من النقاط الساخنة في دراسة أمراض الكلى. على الرغم من الإبلاغ عن أن الالتهاب و EMT والتليف يلعبان دورًا حيويًا في تقدم AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال [4،5] ، الآلية الجزيئية الدقيقة لـ AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال لا يزال غير واضح.

وقف علاج أمراض الكلى والوقاية من الفشل الكلوي

كيناز المحرض بالملح 1(SIK1) هو عضو في عائلة كينازات البروتين المنشط AMP (AMPKs) ، والتي تلعب أدوارًا محورية في تنظيم التمثيل الغذائي ، وبقاء الخلية ، والنمو [6 ، 7]. أثبتت الدراسات أن تثبيط SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)يروج EMT ، مما يؤدي إلى انتقال ورم خبيث للأورام [8-10]. الى جانب ذلك ، أفيد أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)ينظم سلبًا التنشيط المستحث TLR 4- لـ NF-kB والتعبيرات المخففة للسيتوكينات المنشطة للالتهابات [11]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الأدلة الناشئة وجود صلة بين SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)وأمراض الكلى [6،12]. على سبيل المثال ، تنظيم SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)عكس التكاثر المرتفع لخلايا المسراق الناجم عن الجلوكوز وتراكم المصفوفة خارج الخلية (ECM) عن طريق تثبيط التعبير عن FN و PAI -1 ، وكلاهما له دور في الاضطرابات التليفية ، مثل تصلب الكبيبات [6،13]. وبالتالي ، فإننا نتوقع أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)قد تشارك في تطور AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال ، والذي يتميز بـ EMT والالتهاب والتليف الكلوي.

مسار WNT / الكاتينين هو مسار إشارات معقد ومحفوظ للغاية ينظم العمليات البيولوجية المختلفة ، مثل تطور الأعضاء ، واستتباب الأنسجة ، والتسرطن [14 ، 15]. على الرغم من صمتها في الكلية العادية للبالغين ، فقد وجد أنها تنشط في مجموعة متنوعة من أمراض الكلى ، بما في ذلك إصابة الكلى الحادة ، واعتلال الكلية السكري ، والتليف الخلالي ، وأمراض الكلى الكيسية [16]. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن إسكات مسار WNT / الكاتينين يحسن التليف الكلوي ، مما يؤخر تطور AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)في الإصابة التي يسببها I / R [17]. ولكن ما إذا كان SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)يمكن أن تشارك في AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)لا يزال الانتقال من خلال تعديل مسار WNT / -catenin بحاجة إلى مزيد من التوضيح.

أظهرت الأدلة الناشئة أن Snail و Twistl ، عوامل النسخ EMT ، تلعب دورًا مهمًا في التسبب في التليف الكلوي [18-20]. تم الإبلاغ عن أن الحذف الشرطي لـ Twistl أو Snail في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة يمنع EMT ، مما يخفف من التليف الخلالي في التليف الكلوي المستحث تجريبياً في الفئران [21]. بالنظر إلى أن Snail و Twist1 جزيئات مهمة تقع في اتجاه مجرى WNT / -catenin ، فقد توقعنا أنها قد تلعب أيضًا دورًا حيويًا في SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)بوساطة AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال.

وبالتالي ، في هذه الدراسة ، هدفنا إلى توضيح دور وآلية SIK1 (كيناز المحرض بالملح 1) في AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال ، والذي سيوفر هدفًا علاجيًا جديدًا للوقاية والعلاج السريري من التليف الكلوي وسيوفر طريقة جديدة لتأخير تقدم AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال.

وقف علاج أمراض الكلى

المواد والأساليب

المرضى وعينات الأنسجة

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري في مستشفى مقاطعة شاندونغ التابع لجامعة شاندونغ. تم جمع عينات الكلى البشرية من مرضى القصور الكلوي الحاد (AKI).إصابة الكلى الحاد) تم تشخيصه بناءً على خزعة الكلى ، وتم الحصول على عينات الكلى في المجموعات الضابطة من الأنسجة السرطانية لمرضى أورام الكلى الذين خضعوا لعملية استئصال جراحي. تم حفظ عينات الأنسجة في نيتروجين سائل وتم توقيع الموافقة المستنيرة من قبل جميع المرضى وفقًا لإعلان هلسنكي.

بناء AAV 9- Sik1(كيناز المحرض بالملح 1)

تم إنشاء الفيروس المرتبط بالغدة المؤتلف (AAV 9- Sik1) والتحكم السلبي للفيروس المرتبط بالغدة (AAV 9- NC) بواسطة GENECHEM (شنغهاي ، الصين). يشتمل Recombinant AAV 9- ناقل الفيروس المرتبط بالغشاء Sik1 GV467 على محفز ومنطقة ترميز الجسم المضاد ومنطقة ترميز البروتين الفلوري الأخضر EGFP ومنطقة 3FLAG لتشفير البروتين. تم التحقق من قدرة ناقل AAV9 على نقل الكلى (ملف إضافي 1).

الحيوانات وطرق النمذجة

تمت الموافقة على البرامج التجريبية للنمذجة والمتابعة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة شاندونغ. تم توفير C57BL / 6 الفئران التي يبلغ عمرها 4-6 أسبوعًا وتزن 15-20 جرامًا بواسطة مركز الحيوانات التجريبية بجامعة شاندونغ وتم تخصيصها عشوائيًا إلى 4 مجموعات: المجموعة الضابطة (المجموعة الضابطة) ، الفئران العادية التي عولجت بمجموعة AA ( AA) ، الفئران AA المعالجة بمجموعة AAV 9- Sik1 (AAV 9- Sik1 plus AA) ، الفئران AA المعالجة بـ AAV 9- مجموعة NC (AAV 9- NC plus AA) . تم حقن الفئران في مجموعة AA بـ AA (10 مجم / كجم) داخل الصفاق ، بينما تم حقن الفئران في المجموعة الضابطة بـ PBS. في اليوم الثالث والسابع والرابع عشر والثامن والعشرين بعد حقن AA ، تم جمع بول 24 ساعة من الفئران في قفص أيضي وتم تخزين المادة الطافية عند -20 درجة مئوية بعد الطرد المركزي. تم طرد الدم عند 3000r لمدة 10 دقائق ، وتم تخزين المادة الطافية عند درجة -20. 24 ساعة من البروتين البولي ، والكرياتينين في الدم (Scr) ، ونتروجين اليوريا في الدم (BUN) تم قياسها بواسطة محلل الكيمياء الحيوية الأوتوماتيكي. تم اكتشاف مصل IL -1 و TNF- بواسطة ELSA. ثم تم التضحية بالفئران ووزنها. بعد ذلك تم استئصال الكلى ووزنها. تم تقسيم جميع عينات الكلى إلى جزأين ، تم تثبيت أحدهما في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة للتلطيخ النسيجي ، بينما تم تخزين الآخر تحت درجة -80 من أجل اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الفعلي واكتشاف اللطخة الغربية.

علم الأنسجة والكيمياء المناعية

بعد التثبيت في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة ، كانت عينات الكلى مجففة وشفافة ومضمنة في البارافين ومقسمة إلى شرائح بسماكة 4 ميكرومتر. بعد ذلك ، تم إزالة الشمع من الشرائح وترطيبها وتلطيخها. للتحليل النسيجي الكلوي ، تم استخدام تلطيخ HE وتلطيخ PAS وتلطيخ Masson ثلاثي الألوان وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. للتحليل الكيميائي المناعي ، تم تحضين المقاطع بالأجسام المضادة الأولية ضد SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)(51045-1- AP ، Proteintech ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، E-cadherin (20874-1- AP ، Proteintech ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، -SMA (ab32575 ، Abcam ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، COL1 (bs -10423 R ، Bioss ، بكين ، الصين) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي ، تمت إضافة DAB ، متبوعًا بالتلوين النووي مع الهيماتوكسيلين. أخيرًا ، لوحظت الصور تحت المجهر (لايكا ، ألمانيا). النسبة المئوية للتلوين الإيجابي لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تم قياس E-cadherin و -SMA و COLl باستخدام برنامج Image-Pro plus 6. 0 (Media Cybernetics، Silver Spring، MD) [22].

زراعة الخلايا وعلاجها

تمت زراعة الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة البشرية (HK2) في وسط DMEM (Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS) (Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 بالمائة بنسلين ستربتومايسين (سيغما ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة مئوية في a. جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم إذابة حمض الأرستولوكيك (AA) (سيغما ، الولايات المتحدة الأمريكية) في DMSO إلى 1 مجم / مل وعولجت الخلايا بالتركيز النهائي عند 10 ميكرولتر / لتر ، و 20 ميكرولتر / لتر ، و 40 ميكرو مول / لتر ، و 60 ميكرولتر / لتر ، و عولجت المجموعة الضابطة بنفس الكمية من DMSO.

نقل ناقلات الفيروسة البطيئة وترنسفكأيشن siRNA يبني shRNA lentiviral هدف SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)، -كاتينين و shRNA مخلوط ، بالإضافة إلى ناقل فرط التعبير البطيء لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)وناقل التحكم الفارغ تم إنشاؤه بواسطة Cyagen (قوانغتشو ، الصين). يتم سرد التسلسلات المستهدفة على النحو التالي: SIKI shRNA: 5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC -3 '؛

فوائد القسط الصحراوي: علاج أمراض الكلى المزمنة

نتائج

SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)كان خاضعًا للتنظيم في AKI(إصابة الكلى الحاد)

بالنظر إلى أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)يلعب دورًا مهمًا في إصابة الكلى ، اكتشفنا أولاً تعبير SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)في أنسجة الكلى من AKI(إصابة الكلى الحاد)المرضى و AKI(إصابة الكلى الحاد)الفئران. كشف تلطيخ الكيمياء المناعية أن SIK1 ليس فقط في المرضى ولكن في الفئران(كيناز المحرض بالملح 1)التعبير عن الأنابيب الكلوية المسيطرة أعلى من ذلك في القصور الكلوي الحاد(إصابة الكلى الحاد)المجموعة ، والتي أشارت إلى أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)كان خاضعًا للتنظيم خلال AKI(إصابة الكلى الحاد)(الشكل ، ب). إلى جانب ذلك ، أجرينا تلطيخ HE و Masson ثلاثي الألوان لتحليل التغيرات النسيجية المرضية في عينات الكلى من AKI(إصابة الكلى الحاد)المرضى (الشكل 1 ج). بالمقارنة مع السيطرة ، لوحظ تورم الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية ، والتنكس الفجوي ، والوذمة الخلالية في مجموعة AKI بواسطة تلطيخ HE. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة التحكم ، لوحظت الخلايا الأنبوبية المسطحة ، وحدود الفرشاة المنفصلة ، والبياضات الأنبوبية الموسعة في مجموعة AKI بواسطة تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان. مجتمعة ، أشارت كل هذه النتائج إلى أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)قد تلعب دورًا في الإصابة الأنبوبية.

كان الشكل 1 SIK1 خاضعًا للتنظيم في AKI(إصابة الكلى الحاد).صور تلطيخ كيميائي مناعي ممثل لـ SIK1 في Control و AKI(إصابة الكلى الحاد)المرضى. شريط المقياس =50 ميكرومتر. أظهر الرسم البياني التحليل الكمي لـ SIK1 في الأقسام الملطخة المناعية. ب صور تلطيخ كيميائي مناعي تمثيلي لـ SIK1 في Control و AKI(إصابة الكلى الحاد)الفئران. شريط المقياس =50 ميكرومتر. أظهر الرسم البياني التحليل الكمي لـ SIK1 في الأقسام الملطخة المناعية. ج صور تمثيلية لتلطيخ HE و Masson ثلاثي الألوان في أنسجة الكلى من AKI(إصابة الكلى الحاد)المرضى. شريط المقياس =10 ميكرومتر. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)كان خاضعًا للتنظيم في AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الفئران الانتقالية

للحصول على نموذج الفئران من AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال ، قمنا بحقن AA داخل الصفاق في الفئران. بالمقارنة مع التحكم ، أظهرت الفئران التي عولجت بـ AA زيادة في إنتاج العوامل الالتهابية ، EMT ، والتليف الكلوي (الشكل 2 أ-د). بالإضافة إلى ذلك ، فإن مؤشر الكلى ، ومصل Scr ، و BUN ، و 24 ساعة محسّن من البروتين البولي عند علاج AA (الشكل 2 هـ). علاوة على ذلك ، ضعف البنية الكلوية AA ، مما يؤدي إلى ضمور الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية ، وتضخم الجير ، ومدى مختلف لترسب ألياف الكولاجين في tubulointerstitium (الشكل 2f). كل ما سبق يشير إلى أن AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)تم إنشاء نموذج الانتقال بنجاح. لاستكشاف دور SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)في AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن) الانتقال ، قمنا بتقييم تعبيرها في عينات من الفئران حقنت مع AA. وجدنا SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)و p-SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)(Thr182) بطريقة تعتمد على الوقت بعد حقن AA (الشكل 2g) ، مما يشير إلى دور محتمل لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)في تنظيم AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال.

تم تنظيم الشكل 2 SIK1 في AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الفئران الانتقالية.تحليل ELISA لتعبير IL -1 و TNF- في مجموعات مختلفة من الفئران. (ب) لطخة غربية وتحليل PCR في الوقت الحقيقي لعلامات الالتهاب والتليف (Caspase1 / p20 / p10 و FN و COL1) ؛ ج لطخة غربية وتحليل PCR في الوقت الحقيقي لعلامات EMT (E-cadherin و Vimentin و -SMA). د صور تلطيخ كيميائي مناعي تمثيلي لـ E-cadherin في مجموعات مختلفة من الفئران. شريط المقياس =50 ميكرومتر. أظهر الرسم البياني التحليل الكمي لـ E-cadherin في الأقسام الملطخة المناعية. e مؤشر الكلى ، Scr ، BUN ، ومستويات البروتين البولي على مدار 24 ساعة في مجموعات مختلفة من الفئران. و التلوين النسيجي التمثيلي (HE ، PAS ، وتلوين ثلاثي الألوان Masson) صور لأنسجة الكلى في مجموعات مختلفة من الفئران. شريط المقياس =50 ميكرومتر. g تحليل لطخة غربية لمستويات البروتين SIK1 و p-SIK (Thr182) في C57BL / 6 الفئران. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

الإفراط في التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)التخفيف من حدة AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال

لتحديد وظيفة SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)في AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال ، حقننا AAV 9- SikI في الوريد الذيل للفئران لإفراط في التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1). وجدنا بعد الحقن بـ AAV 9- Sik1 ، تحسن الخلل الكلوي الناجم عن AA بشكل ملحوظ ، كما يتضح من انخفاض مستويات مؤشر kid-ney و Scr و BUN و 24 ساعة من البروتين البولي (الشكل 3 أ). كشف PCR في الوقت الفعلي أن AAV 9- Sik1(كيناز المحرض بالملح 1)يخفف الاستجابة الالتهابية التي يسببها AA (الشكل 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، AAV 9- Sik1(كيناز المحرض بالملح 1)تحسن بشكل كبير الضرر النسيجي الناجم عن AA (الشكل 3 ج). علاوة على ذلك ، أشارت نتائج التلوين الكيميائي المناعي إلى أن AAV 9- Sik1(كيناز المحرض بالملح 1)تخفيف التليف الخلالي و EMT في عملية AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال (الشكل ثلاثي الأبعاد). بشكل عام ، أشارت هذه النتائج إلى أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)لعبت دورًا وقائيًا في AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال.

الفوائد الصحية cistanche: تحسين وظائف الكلى

SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تم تنظيمه بشكل منخفض في خلايا HK2 المعالجة بـ AA وقد أظهر عدد كبير من الدراسات أن النبيبات القريبة من الكلى هي أحد الأهداف الرئيسية للإصابة في AKI(إصابة الكلى الحاد)، وإصابة النبيبات القريبة قد تلعب دورًا فسيولوجيًا مرضيًا مهمًا في تطوير AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال. لتقييم ما إذا كان SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تم تنظيمه في المختبر ، وركزنا على خلايا HK2 في هذه الدراسة. من خلال إجراء فحوصات CCK8 ، نختار 10 ميكرو مول / لتر AA كتركيز مثالي للتجارب اللاحقة (ملف إضافي 2). باستمرار ، أظهر علاج AA زيادة في الالتهاب ، و EMT ، والتليف في خلايا HK2 (الشكل 4 أ-ج) ، مما يشير إلى إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA في المختبر. بعد ذلك ، قمنا بفحص مستويات البروتين في SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)ولاحظت انخفاض SIK1 بشكل ملحوظ(كيناز المحرض بالملح 1)و p-SIK1 (Thr182) في خلايا HK2 في وجود AA (الشكل 4 د). علاوة على ذلك ، اكتشفنا موقع SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)البروتين في خلايا HK2 قبل وبعد التعرض لـ AA عن طريق تلطيخ التألق المناعي. في الخلايا غير المحفزة ، SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)لوحظ في كل من النواة والسيتوبلازم. عندما تعامل مع AA ، فإن التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تم تخفيضه و SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تم اكتشافه تدريجيًا في النواة (ملف إضافي 3). بشكل جماعي ، أوضحت هذه النتائج أن SIK1 كان متورطًا في إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA.

الشكل 3: فرط التعبير عن SIK1 يخفف AKI-CKD الناجم عن AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)انتقال.أ. مؤشر الكلى ، سكر ، بن ، ومستويات البروتين البولي 24 ساعة في مجموعات مختلفة من الفئران. (ب) تحليل PCR في الوقت الفعلي لمستويات Caspase 1 و IL -1 mRNA في مجموعات مختلفة من الفئران. تم استخدام التلوين ثلاثي الألوان HE و PAS و Masson لتقييم التغيرات النسيجية ومدى التليف الأنبوبي الخلالي. شريط المقياس =50 ميكرومتر. د صور تلطيخ كيميائي مناعي تمثيلي لبروتين E-cadherin و -SMA و COLI في مجموعات مختلفة من الفئران. شريط المقياس =50 ميكرومتر. أظهرت الرسوم البيانية التحليل الكمي لـ E-cadherin و -SMA و COL1 في أقسام ملطخة بالنسج المناعي. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

مستخلص cistanche: تحسين وظائف الكلى

الإفراط في التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تحسين إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA

لتوضيح دور SIK1 بشكل أكبر(كيناز المحرض بالملح 1)في إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA ، قمنا ببناء خطوط خلوية تعمل على تنظيم SIK1 بشكل ثابت(كيناز المحرض بالملح 1)بواسطة عدوى الفيروس البطيء لخلايا HK2 (ملف إضافي 4). أدى الإفراط في التعبير عن SIK1 إلى زيادة كبيرة في E-cadherin وقمع Caspasel / p20 / p10 و Vimentin و COLI و Fspl عند مقارنته بخلايا التحكم المحفزة باستخدام AA وحده (الشكل 4 هـ ، و). الى جانب ذلك ، الإفراط في التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)يثبط قدرة هجرة خلايا HK2 التي يسببها AA (الشكل 4g). أظهرت هذه النتائج معًا أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)كان وقائيًا من الإصابة التي يسببها AA في خلايا HK2.

تم تنظيم الشكل 4 SIK1 في خلايا HK2 المعالجة بـ AA والإفراط في التعبير عن SIK1 أدى إلى تحسين إصابة خلايا HK2 الناتجة عن AA.أ. اكتشاف ELISA لمستويات IL {0} و TNF- في المادة الطافية لخلايا HK2 المعالجة بـ 1 0 ميكرو مول / لتر AA لمدة 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة ب تحليل البقعة الغربية لـ Caspase 1 / p20 / p10 و E-cadherin و ZO -1 و Vimentin و -SMA في خلايا HK2 المعالجة بـ 10 ميكرو مول / لتر AA لمدة 0 ساعة ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، و 72 ساعة بأكبر تأثير بعد 72 ساعة من العلاج. -الاكتين كان يستخدم كعنصر تحكم. ج تحليل PCR في الوقت الحقيقي لمؤشرات التليف المبكرة (COLI ، PAI -1 ، و MMP9) مستويات mRNA في خلايا HK2 المعالجة بـ 10 ميكرو مول / لتر AA لمدة 72 ساعة. د تحليل اللطخة الغربية لمستويات p-SIK1 (Thr182) و SIK1 في خلايا HK2 المعالجة بـ 10 ميكرو مول / لتر AA لمدة 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة. تحليل لطخة غربية لـ Caspase1 / p20 / p10 و E-cadherin و Vimentin و Fsp1 و COL1 في خلايا HK2 التي يتم علاجها بموجه SIK1 (ناقل SIK1 lentiviral overexpression) في وجود 10 ميكرو مول / لتر AA أو معالجتها بـ 10 ميكرو مول / L AA وحده لمدة 72 ساعة. و صور التألق المناعي التمثيلية لـ E-cadherin و Vimentin في خلايا HK2. شريط المقياس =50 ميكرومتر. ز نتائج الهجرة التمثيلية لخلايا HK2. شريط المقياس =50 ميكرومتر. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

مستخلص الصحراوية cistanche: علاج أمراض الكلى

SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)مسار إشارات WNT / -catenin المنظم في الجسم الحي وفي المختبر

النظر في الدور الحاسم لمسار WNT / الكاتينين في AKI-CKD(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الانتقال ، اكتشفنا ما إذا كان SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تنظم مسار WNT / -catenin. في تجارب الجسم الحي ، لاحظنا أن الإفراط في التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)يثبط مستويات البروتين لكل من WNT1 و p {1}} catenin (Y654) وكاتينين نووي في AKI-CKD المستحث AA(اصابة الكلى الحادة الى مرض الكلى المزمن)الفئران (الشكل 5 أ). لمزيد من استكشاف ما إذا كان SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)نظمنا مسار WNT / -catenin في المختبر ، وقمنا بإسكات التعبير عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)بواسطة shRNA في خلايا HK2 (ملف إضافي 5). تمشيا مع النتائج في الجسم الحي ، أدى إسكات SIK1 إلى زيادة مستويات -catenin و TCF4 و LEF1 mRNA (الشكل 5 ب). الى جانب ذلك ، ضربة قاضية من SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)زادت مستويات البروتين في -catenin و p - - catenin (Y654) (الشكل 5 ج). بالإضافة إلى ذلك ، ضربة قاضية لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)روجت للانتقال النووي للكاتينين (الشكل 5 د). بشكل جماعي ، اقترحت هذه البيانات أن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)تنظم مسار WNT / -catenin في الجسم الحي وفي المختبر.

الشكل 5 SIK1 ينظم مسار WNT / -catenin في الجسم الحي وفي المختبر.أ. تحليل اللطخة الغربية لمستويات بروتين SIK1 و WNT1 و p - - catenin (Y654) ومستويات بروتين الكاتينين النووي في مجموعات مختلفة من الفئران. (ب) تحليل PCR في الوقت الحقيقي لـ -catenin و TCF4 وLEF1 في خلايا HK2 المعالجة بـ SIK1 shRNA أو Scramble shRNA. ج تحليل اللطخة الغربية - الكاتينين ، و - - كاتينين (Y654) في خلايا HK2 المعالجة بـ SIK1 shRNA أو Scramble shRNA. صور مناعية تمثيلية لـ -catenin في خلايا HK2. شريط المقياس =50 أم. تظهر البيانات على أنها متوسطة ± sd * P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

مسار إشارات WNT / -catenin متورط في إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA

لاستكشاف ما إذا كان مسار WNT / -catenin قد لعب دورًا في إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA ، اختبرنا مستويات التعبير عن WNT1 ، والكاتينين النووي ، و p - - catenin (Y654) بعد علاج AA. أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن WNT1 وكاتينين نووي و p - - كاتينين (Y654) زاد بشكل ملحوظ بعد تحفيز AA (ملف إضافي 6 أ). إلى جانب ذلك ، كشف تلطيخ التألق المناعي عن الانتقال النووي لـ -catenin (ملف إضافي 6 ب) ، مما يشير إلى أن تحفيز AA يمكن أن ينشط مسار إشارات WNT / -catenin. بالنظر إلى أن الكاتينين هو المكون المركزي لمسار WNT / -catenin ، نتساءل عما إذا كان تنظيم -catenin ينظم إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA. وهكذا ، قمنا بإسقاط الكاتينين بثبات بواسطة shRNA lentivirus في خلايا HK2 (ملف إضافي 6 ج). وقد لاحظنا أن ضربة قاضية -catenin أضعفت تعبير Caspasel و IL {25}} و Vimentin و PAI -1 و MMP9 الناجم عن AA وعززت تعبير E-cadherin (الشكل 6 أ ، ب). علاوة على ذلك ، أظهرت خلايا -catenin shRNA التي تم تحفيزها باستخدام AA انخفاضًا ملحوظًا في الهجرة مقارنة بخلايا التحكم -catenin التي تم تحفيزها باستخدام AA وحده (الشكل 6 ج). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن مسار WNT / -catenin كان متورطًا في إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA.

يشارك مسار إشارات WNT / B-catenin في إصابة خلايا HK2 المستحثة بـ AA.عولجت خلايا HK2 باستخدام B-catenin shRNA أو Scramble shRNA في وجود تحليل PCR في الوقت الفعلي 10 umol / LAA لـ Caspase1.L -1 BE-cadherin.Vimentin، PA / -1. مستويات MMP9 mRNA في خلايا HK2. (ب) صور مناعية تمثيلية لـ E-cadherin و Vimentin في خلايا HK2. شريط المقياس =50 نتائج الترحيل التمثيلي لخلايا HK2. شريط المقياس =50 أم. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

مطلوب مسار إشارات WNT / -catenin لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)بوساطة إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA

لدراسة ما إذا كان SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)إصابة خلايا HK2 الخاضعة للرقابة الناتجة عن AA من خلال مسار إشارات WNT / الكاتينين ، انخفض الكاتينين بشكل أكبر في SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)ضربة قاضية خلايا HK2. مقارنة بخلايا الضربة القاضية SIK1 ، أدت الضربة القاضية الإضافية للكاتينين إلى خفض مستويات الرنا المرسال في Caspasel و COLl و Vimentin ، مع زيادة مستويات الرنا المرسال لـ E-cadherin (الشكل 7 أ). كانت نتائج لطخة West-ern متوافقة مع PCR في الوقت الفعلي ، حيث أظهر إسكات -catenin و SIK1 عكس تنظيم E-cadherin ، وتنظيم Caspasel / p20 / p10 و Vimentin الناجم عن SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)ضربة قاضية (الشكل 7 ب).

بشكل جماعي ، أشارت هذه النتائج إلى أن تثبيط -catenin عكس الاستجابة الالتهابية ، EMT ، وتطور التليف بوساطة SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)ضربة قاضية ، والتي تكشف بقوة أن مسار WNT / -catenin كان مطلوبًا لـ SIK1(كيناز المحرض بالملح 1)بوساطة إصابة خلايا HK2 الناجم عن AA.

مطلوب مسار WNT / -catenin الشكل 7 لإصابة خلايا HK2 بوساطة SIK1 الناتجة عن AA.تم نقل خلايا HK -2 بشكل مشترك مع SIK1 و B-catenin shRNA أو تم نقلها باستخدام SIK1 أو -catenin shRNA وحدها ، ثم تمت معالجتها بـ 10 umol / L AA مقابل 72 هكتارًا من تحليل PCR في الوقت الفعلي لـ Caspase1 ، COL1. تعبير E-cadherin و Vimentin. ب. تحليل لطخة غربية لـ Caspase1 / p20 / p10 و E-cadherin و Vimentin. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

دور Twist1 في إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA

بصفتها EMT-TFs ، يمكن لـ Twistl تعزيز EMT وتليف الكلى. في هذه الدراسة ، وجدنا أن AA عززت التعبير البروتيني و mRNA لـ Snail و Twist1 بينما تمنع ضربة قاضية -catenin التعبير عن Snail و Twist1 الناجم عن AA (الشكل 8 أ) ، مما يشير إلى Snail و Twist1 الموجود في المصب من -catenin واللعب دور في إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA. للتحقق من فرضيتنا ، قمنا بضرب Twist1 بواسطة siRNA (ملف إضافي 7) وقمنا بإجراء تحليل PCR في الوقت الفعلي وتحليل لطخة ويسترن. كما هو متوقع ، عند المقارنة بخلايا التحكم التي تم تحفيزها باستخدام AA وحده ، تم تقليل تعبير Vimentin و COLI بينما تمت زيادة ZO -1 في خلايا Twist1 siRNA في وجود AA ، مما يشير إلى أن صمت Twist1 خفف من حدوث EMT وتطور التليف الكلوي الناجم عن AA (الشكل 8 ب و ج).

الشكل 8 دور تويست في إصابة خلايا HK2 التي يسببها AA.لطخة غربية وتحليل PCR في الوقت الحقيقي لمستويات الحلزون والتويست 1 في خلايا HK2. (ب) تحليل PCR في الوقت الحقيقي لمستويات Twist1 و COL1 و ZO -1 و Vimentin في خلايا HK2 المعالجة بـ Twist1 siRNA أو NC siRNA.c. تحليل اللطخة الغربية لمستويات Twist1 و ZO -1 وفيمنتين في خلايا HK2 المعالجة بـ Twist1 siRNA أو NC siRNA. تظهر البيانات على أنها تعني ± sd * P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

انقر هنا للجزء Ⅱ