arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

يحسن عوز Part Ⅰ Smad3 العلاج القائم على الجزر لمرض السكري وإصابات الكلى السكرية من خلال تعزيز تكاثر الخلايا عبر آلية E2F 3- المعتمدة

May 25, 2023

خلاصة

1. الأساس المنطقي

يعد تكاثر الخلايا الضعيف أحد العوامل الضارة التي تعيق العلاج باستبدال الخلايا الجزيرية لمرضى السكري. Smad3 هو عامل نسخ مهم لإشارات TGF وقد ثبت أنه يعزز مرض السكري عن طريق منع تكاثر الخلايا. لذلك ، نفترض أن الجزر الصغيرة الناقصة Smad 3- قد تكون علاجًا جديدًا لاستبدال الخلايا لمرض السكري.

2. الطرق

لقد فحصنا هذه الفرضية في الفئران المصابة بداء السكري من النوع -1 الناجم عن الستربتوزوسين ونوع -2 الفئران المصابة بالسكري ديسيبل / ديسيبل عن طريق زرع Smad3 بالضربة القاضية (KO) والجزيرة من النوع البري (WT) تحت الكبسولة الكلوية ، على التوالي. تم فحص آثار Smad3KO مقابل العلاج ببدائل WT على مرض السكري وإصابة الكلى السكري. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق RNA-seq لتحديد الجين المستهدف المصب الكامن وراء تكاثر الخلايا المنظم Smad 3- في Smad3KO-db / db مقابل جزر الماوس Smad3WT-db / db.

3. النتائج

مقارنةً بعلاج جزيرة Smad3WT ، فإن العلاج بجزر Smad3KO أنتج تأثيرًا علاجيًا أفضل بكثير على كلا النوعين -1 والنوع -2 من مرض السكري عن طريق خفض مستويات الجلوكوز في الدم و HbA1c في الدم بشكل كبير والحماية من إصابات الكلى السكري عن طريق الوقاية زيادة في الكرياتينين في الدم وتطور البيلة البروتينية وتوسع مصفوفة ميسانجيل والتليف. ارتبطت هذه بزيادة كبيرة في تكاثر الخلايا المطعمة ومستويات الأنسولين في الدم ، مما أدى إلى تحسين عدم تحمل الجلوكوز. ميكانيكيًا ، كشف RNA-seq أنه مقارنة بجزر الماوس Smad3WT-db / db ، حذف Smad3 من جزر الماوس ديسيبل / ديسيبل بشكل ملحوظ E2F3 ، وهو منظم محوري لدخول دورة الخلية G1 / S. وجدت دراسات أخرى أن Smad3 يمكن أن يرتبط بمحفز E2F3 ، وبالتالي يمنع تكاثر الخلايا عبر آلية تعتمد على E2F 3- حيث أن إسكات E2F3 أبطل التأثير التكاثري على خلايا Smad3KO.

4. الخلاصة

يمكن أن يؤدي العلاج ببدائل الجزر الناقص في Smad -1 والنوع -2 إلى تحسن كبير في مرض السكري والوقاية من إصابة الكلى السكري ، والتي تتوسطها آلية جديدة تعتمد على E2F 3- تكاثر خلوي.

الكلمات الدالة

Smad3 ، زرع الجزر ، السكري ، E2F3 ، دورة الخلية.

Cistanche benefits

انقر هنا للحصول علىفوائد Cistanche

مقدمة

اكتب -1 وداء السكري 2 (T1DM و T2DM). يعتبر زرع الخلايا أو الجزر علاجًا جذابًا وقد تم تطبيقه بنجاح في المرضى الذين يعانون من T1DM. عادة ما تكون الجزر أو الخلايا المستخدمة للزرع من المتبرع الجثث أو الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (iPSC) [1 ، 2]. تم الانتهاء من أكثر من 1500 حالة من عمليات زرع الجزر السريرية في المرضى الذين يعانون من T1DM وفقًا لبروتوكول إدمونتون الراسخ [1]. على الرغم من أن حوالي 50 في المائة من المرضى يتمتعون باستقلال الأنسولين لمدة 5 سنوات بعد الزرع ، إلا أن فشل التطعيم هو مصدر قلق شائع سريريًا. أحد العوامل التي تعيق زرع الجزر هو معدل التكاثر المنخفض للغاية لخلايا الجزيرة المطعمة [3]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المحفزات الخطرة من البيئة المكروية للتطعيم مثل الالتهاب ورفض الطعم المناعي والإجهاد الأيضي قد تتسبب في خضوع الخلايا المزروعة للاستماتة والنخر ، مما يؤدي إلى فقدان الكسب غير المشروع التدريجي [1]. لذلك ، يعد تحسين تكاثر الخلايا المزروعة أمرًا محوريًا لنجاح العلاج القائم على زرع الجزر لمرض السكري.

يلعب تحويل إشارات عامل النمو بيتا (TGF-) أدوارًا متعددة الاتجاهات في العديد من العمليات البيولوجية. يبدأ تحويل الإشارة بربط TGF- يجند بمستقبله من النوع 2 TGFBR2. يقوم الأخير بتجنيد وتنشيط مستقبل النوع الأول TGFBR1 عن طريق الفسفرة. المنشط TGFBR1 يزيد من فسفرة بروتينات Smad التي تنظم المستقبلات (R-Smads) و Smad2 و Smad3. تشكل R-Smads معقدًا مع Smad4 ، والذي ينتقل إلى النواة لتنظيم الجينات المستهدفة نسبيًا [4 ، 5]. يُذكر أن جزيرة البنكرياس تحافظ على إشارات TGF المنشط عالميًا كما يتضح من مستوى عالٍ نسبيًا من Smad2 / 3 الفسفوري في الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك ، استجابةً لطلب الأنسولين ، انخفض نشاط إشارات TGF ، مصحوبًا بزيادة تكاثر الخلايا [6]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التثبيط الدوائي لإشارات TGF- يعزز تكاثر الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي [7 ، 8]. الأهم من ذلك ، أن حذف Smad3 يؤدي إلى تكاثر خلايا أكثر قوة مقارنة بحذف Smad2 في الفئران مع استئصال البنكرياس الجزئي ، مما يشير إلى أن Smad3 وليس Smad2 هو المستجيب الأساسي في اتجاه مجرى TGF- لتنظيم تكاثر الخلايا [6]. تظهر الدراسات اللاحقة أن Smad3 يمنع تكاثر الخلايا عن طريق تحفيز التعبير عن مثبطات كيناز المعتمدة على السيكلين (CDKIs) ، بما في ذلك p16 و p21 و p57 [7 ، 8].

وجد عملنا الأخير أيضًا أن حذف Smad3 في الفئران ديسيبل / ديسيبل (Smad3KO-db / db) يمنع ظهور مرض السكري الصريح دون السمنة وارتفاع السكر في الدم ومقاومة الأنسولين وعدم تحمل الجلوكوز. ومن المثير للاهتمام ، أن الفئران Smad3KO-db / db تظهر تضخم جزيرة مع زيادة تكاثر الخلايا بشكل ملحوظ وفرط أنسولين الدم المستمر [9]. هذا يعني أن Smad3 هو أحد مسببات الأمراض في مرض السكري وأن استهداف Smad3 في الخلايا قد يمثل خلية جديدة أو علاجًا بديلاً للجزيرة لمرض السكري. تم فحص هذا في الدراسة الحالية باستخدام زرع جزيرة Smad3 بالضربة القاضية (Smad3KO) في الفئران المصابة بداء السكري من النوع -1 الناجم عن الستربتوزوسين (STZ) وفي الفئران المصابة بداء السكري من النوع -2 ديسيبل / ديسيبل.

Cistanche benefits

مكملات Cistanche

نتائج

1. أنتج زرع جزيرة Smad3KO تأثيرًا علاجيًا أفضل على مرض السكري من النوع -1 الناجم عن STZ

لمقارنة الفعالية العلاجية لـ Smad3KO مقابل جزيرة Smad3WT على مرض السكري ، أجرينا أولاً زرع جزيرة اصطناعية تحت الكبسولة الكلوية للفئران المصابة بداء السكري التي يسببها STZ حيث يحدث ارتفاع السكر في الدم بسبب نقص الخلايا. تم زرع الفئران المصابة بمرض السكر في اليوم السابع بعد حقن STZ بثلاث جرعات من الجزر (50 و 100 و 200 جزيرة لكل فأر) تم عزلها حديثًا من الفئران Smad3WT أو Smad3KO. تمت مراقبة كل من مستويات الجلوكوز العشوائي في الدم (RBG) وجلوكوز الدم الصائم (FBG) أسبوعياً لمدة 16 أسبوعًا. تم اختيار جرعات الزرع بناءً على النتائج السابقة التي تفيد بأن زرع 300 جزيرة كافية لاستعادة سكر الدم في الفئران المستنفدة للخلايا بسرعة [10]. كما هو مبين في الأشكال من 1 أ إلى د ، أصيبت الفئران المصابة بداء السكري مع العملية الوهمية بفرط سكر الدم المستمر على مدى 16 أسبوعًا. فشل الزرع بجرعة منخفضة (50 جزيرة) من Smad3KO أو جزر WT في تقليل مستويات RBG و FBG. ومع ذلك ، فإن الفئران المصابة بداء السكري التي تلقت 100 جزيرة Smad3KO ، ولكن ليس نفس جرعة جزر Smad3WT ، استعادت تدريجيًا RBG و FBG الطبيعي على غرار تلك التي تلقت 200 Smad3KO أو جزر WT. وجدنا أيضًا أن تأثير خفض الجلوكوز في الدم يُعزى فقط إلى الجزر المزروعة حيث تكرر ارتفاع السكر في الدم فورًا بمجرد إزالة الكلية الحاملة للجزيرة من 16 أسبوعًا فصاعدًا (السهم ، الشكل 1 أ).

Figure 1

كما تم تطوير اختلال تحمل الجلوكوز في الفئران المصابة بداء السكري التي تم تشغيلها بطريقة وهمية ، والتي تم تخفيفها بشكل كبير عن طريق زرع جرعة عالية (200) من جزر Smad3KO أو WT و 100 جزيرة Smad3KO ، ولكن ليس بجرعة منخفضة من 50 Smad3KO أو جزر WT و 100. جزر Smad3WT (الشكل 1E و G). كما هو متوقع ، لم تطور الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها STZ مقاومة للأنسولين.

في المقابل ، لوحظ استجابة مطولة للأنسولين في الفئران التي تعاني من ارتفاع السكر في الدم مع العملية الصورية أو العلاج غير الفعال مع 50 جزر Smad3WT أو KO و 100 جزيرة Smad3WT (الشكل 1F و H). تماشياً مع نسبة السكر في الدم المستعادة وتحسين عدم تحمل الجلوكوز ، أظهرت الفئران المصابة بداء السكري التي تم إعطاؤها 200 Smad3KO أو WT و 100 جزيرة Smad3KO ، ولكن ليس 50 Smad3KO أو WT و 100 Smad3WT ، انخفاضًا في مستوى HbA1c في الدم مصحوبًا بزيادة مستوى الأنسولين (الشكل 1 I و ي). علاوة على ذلك ، تسبب مرض السكري الناجم عن STZ في تأخر النمو ، والذي تم شفاؤه جزئيًا في الفئران المزروعة بـ 200 Smad3KO أو جزر WT و 100 جزيرة Smad3KO (الشكل S1). بالإضافة إلى ذلك ، أصيبت الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها STZ أيضًا باعتلال الكلية السكري عند 16 أسبوعًا كما يتضح من التوسع في الميزانجي والتليف الخلالي والبروتين وزيادة الكرياتينين في الدم (الشكل 2). من المثير للاهتمام أن العلاج باستخدام 100 جزيرة من Smad3KO ، ولكن ليس 100 جزيرة Smad3WT ، أدى إلى حماية ضد تطور مرض الكلى السكري ، على الرغم من أن هذا كان ملحوظًا أيضًا في الفئران المصابة بداء السكري التي عولجت بجرعة عالية من 200 Smad3KO أو جزر WT (الشكل 2). تُظهر هذه النتائج فعالية علاجية أفضل لجزر Smad3KO في مرض السكري الناجم عن STZ وتقترح انخفاض بنسبة 50 في المائة في الجزر اللازمة لتحقيق السيطرة المختصة على نسبة السكر في الدم والحماية من إصابة الكلى السكري باستخدام علاج Smad3KO الناقص للجزيرة السكري.

Figure 2

2. أنتج زرع جزيرة Smad3KO تأثيرًا علاجيًا أفضل على النوع -2 من مرض السكري في الفئران ديسيبل / ديسيبل

تم الإبلاغ عن أن زرع الجزر يحسن T2DM في نموذج فأر غني بالدهون يتغذى على نظام غذائي يتم تحديه بجرعة منخفضة من STZ [11]. درسنا بعد ذلك ما إذا كانت زراعة جزر Smad3KO تنتج أيضًا تأثيرًا علاجيًا أفضل على T2DM من خلال علاج الفئران db / db مع 250 Smad3KO أو جزر WT من عمر ما قبل السكري من الأسبوع 4 إلى الأسبوع 12. وجدنا أن الزرع إما باستخدام Smad3KO أو WT لم تؤثر الجزر على نمو الفئران المتلقية ديسيبل / ديسيبل (الشكل S2). على الرغم من أن الفئران ديسيبل / ديسيبل التي تلقت زرع جزيرة Smad3WT أظهرت انخفاضًا في اتجاه RBG و FBG مقارنةً بالفئران التي تعمل بالديسيبل / ديسيبل ، فإن الفئران ديسيبل / ديسيبل المزروعة بالجرعة المكافئة من جزر Smad3KO أظهرت انخفاضًا كبيرًا في RBG و FBG (الشكل 3 أ و ب). تم تحسين عدم تحمل الجلوكوز الذي تم تطويره في الفئران ديسيبل / ديسيبل بشكل ملحوظ عن طريق Smad3KO ولكن ليس زرع جزيرة Smad3WT ، على الرغم من أن مقاومة الأنسولين لم تتغير (الشكل 3C-F). بشكل ثابت ، مقارنةً بزرع جزيرة Smad3WT أو العملية الوهمية ، قدمت الفئران ديسيبل / ديسيبل التي عولجت بزرع جزيرة Smad3KO أيضًا انخفاضًا كبيرًا في مستويات HbA1c في الدم ، والتي صاحبت زيادة ملحوظة في مستويات الأنسولين في الدم (الشكل 3G و H). علاوة على ذلك ، فإن العلاج باستخدام 250 جزيرة Smad3KO خفف بشكل كبير من التوسع الكبيبي الكبيبي (الشكل 4). ومع ذلك ، نظرًا لعدم وجود تغييرات كبيرة في الكرياتينين في الدم والبروتينية والتليف الكلوي في الفئران ديسيبل / ديسيبل في عمر 12 أسبوعًا ، لم يتم العثور على تغييرات واضحة في هذه المعلمات في الفئران ديسيبل / ديسيبل التي عولجت بجزر Smad3KO أو WT (الشكل 4). بشكل إجمالي ، تشير هذه البيانات مرة أخرى إلى أن زرع جزر Smad3KO ينتج علاجًا أفضل على جزر Smad3WT في الفئران المصابة بداء السكري من النوع -2 ديسيبل / ديسيبل.

figure 3

3. نقص Smad3 يعزز تكاثر الخلايا في الجزر المطعمة في كل من الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها STZ والفئران ديسيبل / ديسيبل.

قمنا بعد ذلك بالتحقيق في الآليات المحتملة التي ينتج عنها زرع جزر Smad3KO تأثير علاجي أفضل على كل من T1DM و T2DM. قمنا أولاً بفحص كتلة الخلايا في الجزر المطعمة عن طريق التحصين المناعي بالأنسولين. في مرض السكري الناجم عن STZ ، فشلنا في الكشف عن وجود خلايا إيجابية للأنسولين تحت الكبسولة الكلوية في الفئران المحصنة بـ 50 Smad3KO أو WT في الأسبوع 16 بعد الزرع ، مما يشير إلى فقدان الخلايا. بشكل غير متوقع ، أظهرت الفئران المصابة بداء السكري التي تلقت 100 جزيرة Smad3WT عددًا قليلاً من مجموعات الخلايا المشتتة المنتجة للأنسولين ، ولكن هذه الزيادة زادت بشكل كبير في الفئران المصابة بداء السكري التي عولجت بـ 100 جزيرة من جزر Smad3KO ، مما أدى إلى زيادة 17- ضعف في كتلة الخلية (الشكل 5 أ و ب). ومن المثير للاهتمام ، أن الفئران المصابة بداء السكري التي أعطيت جرعة عالية من 200 Smad3KO أو جزر WT أظهرت كتلة خلوية مماثلة (الشكلان 5 أ و ب). كانت هذه النتائج متوافقة مع التأثير المعتمد على الجرعة لزرع الجزر على ارتفاع السكر في الدم كما هو موضح في الشكلين 1 أ و ب.

figure 4

درسنا بعد ذلك ما إذا كانت كتلة الخلية المتزايدة في طعوم جزيرة Smad3KO مرتبطة بتكاثر الخلايا المحسن. أظهر التألق المناعي ثنائي اللون أنه في الأسبوع السادس عشر من زرع ما بعد الجزيرة ، أظهرت الفئران التي عولجت بـ 100 جزيرة Smad3WT خلايا PCNA غير قابلة للكشف أو نادرة بالإضافة إلى الأنسولين بالإضافة إلى الخلايا ، والتي زادت بشكل أساسي في أولئك الذين يتلقون 100 جزيرة Smad3KO أو جرعة عالية من 200 Smad3KO أو WT الجزر (الشكل 5C و D). قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كان Smad3 يتحكم في تكاثر الخلايا المبكر في الجزر المطعمة تحت ظروف مرض السكري التدريجي عن طريق وضع العلامات BrdU في اليوم السابع بعد زرع الجزر عندما ظلت مستويات الجلوكوز في الدم مرتفعة. كشفت تسمية BrdU عن 3- زيادة أضعاف في BrdU بالإضافة إلى الأنسولين بالإضافة إلى الخلايا في 100 طعوم جزيرة Smad3KO مقارنة بالجرعة نفسها من طعوم جزيرة Smad3WT (الشكل 5E و F). تشير هذه النتيجة إلى أن نقص Smad3 يعزز إلى حد كبير تكاثر الخلايا من خلال دورة خلية المرحلة S في ظل ظروف ارتفاع السكر في الدم ، مما يساهم في زيادة 17- أضعاف في كتلة الخلية كما رأينا في الأسبوع 16 من عملية زرع ما بعد الجزيرة (الشكل 5 أ و ب) . مجتمعة ، تشير جميع هذه النتائج إلى أن نقص Smad3 يعزز إلى حد كبير تكاثر الخلايا ، وبالتالي استعادة نسبة السكر في الدم في مرض السكري من النوع -1 الناجم عن STZ.

Figure 5

وبالمثل ، تم اكتشاف الأنشطة التكاثرية عالية الخلايا أيضًا في ترقيع جزيرة Smad3KO في الفئران المصابة بداء السكري من النوع -2 ديسيبل / ديسيبل كما يتضح من زيادة 5- أضعاف في كتلة الخلية مقارنة بتلك التي تحتوي على ترقيع جزيرة Smad3WT في عمر الأسبوع 12 بعد زرع جزيرة (الشكل 6A و B) ، والذي ارتبط بزيادة 2. 5- أضعاف في الأنسولين بالإضافة إلى خلايا PCNA plus (الشكل 6C و D). باستخدام تصنيف BrdU ، اكتشفنا أيضًا 3- زيادة أضعاف في الأنسولين بالإضافة إلى خلايا BrdU plus في طعوم جزيرة Smad3KO في اليوم السابع بعد الزرع في 12- فئران ديسيبل / ديسيبل عمرها أسبوع (الشكل 6E و F). تؤكد هذه النتيجة مرة أخرى أن الخلايا التي تفتقر إلى Smad3 تقاوم ارتفاع السكر في الدم وتبقى عالية التكاثر للحفاظ على كتلة الخلايا لتحسين T2DM.

Figure 6

4. نقص Smad3 يعزز تكاثر الخلايا في المختبر

تم الإبلاغ عن أن التثبيط الدوائي لـ TGFBR1 يعزز تكاثر الخلايا في المختبر [7 ، 8]. لذلك ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان الحذف الجيني لـ Smad3 يعزز أيضًا تكاثر الخلايا عن طريق زراعة خلايا جزيرة Smad3KO و WT متبوعة بعلامة BrdU. أظهر التألق المناعي المزدوج أن خلايا الجزيرة التي تفتقر إلى Smad3 أظهرت مستوى أعلى بكثير من الخلايا الإيجابية لـ BrdU (5.7 بالمائة) مقارنة بخلايا جزيرة Smad3WT (2.4 بالمائة) (الشكل 7 أ و ب). تم توضيح الانتشار المعزز لخلايا Smad3KO أيضًا من خلال زيادة التعبير عن PCNA كما كشف تحليل اللطخة الغربية (الشكل 7C) ، مما يؤكد الدور التنظيمي الرئيسي لـ Smad3 في تكاثر الخلايا.

Figure 7

5. يحدد RNA-seq E2F3 باعتباره جينًا مستهدفًا من نوع Smad3 ينظم تكاثر الخلايا

للكشف عن آلية المصب لـ Smad3 في تنظيم تكاثر الخلايا ، أجرينا RNA-seq في جزر معزولة عن الفئران db / m أو db / db مع أو بدون حذف جين Smad3 بما في ذلك Smad3WT-db / db و Smad3KO-db / db و Smad3WT -db / m ، و Smad3KO-db / m الفئران كما هو موصوف سابقًا [9]. تم إجراء تحليل إثراء المسار بين الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) بين جزر Smad3WT و Smad3KO في خلفية db / m أو db / db. في الخلفية الجينية لـ db / db ، أدى Smad3KO إلى تغييرات كبيرة في الجينات أو المسارات المرتبطة بدورة الخلية كما كشف عنها تحليل GO و KEGG (الشكل 8 أ والشكل S3). بالنظر إلى الجينات الفردية ، كشف تحليل RNA-seq عن زيادة في التعبير عن الجينات التي تنطوي على عائلة بروتين cyclin ، و kinases المعتمدة على cyclin (CDKs) ، ودورة الانقسام الخلوي (CDC) في جزر Smad3KO-db / db مقارنة مع Smad3WT-db / ديسيبل الجزر ، والتي تم التحقق من صحتها في خلايا جزيرة Smad3KO المستزرعة بواسطة RT-PCR (الشكل S4 A و C). في المقابل ، في الخلفية الجينية لـ db / m ، لم يتسبب Smad3KO في أي تأثير ملحوظ على الجينات أو المسارات المتعلقة بدورة الخلية (الشكل S3B و C). يُذكر أن إشارات TGF- / Smad3 تنظم بشكل سلبي دورة الخلية عن طريق تحفيز جينات مثبطات كيناز المعتمدة على السيكلين (CDKIs) [7 ، 8 ، 12]. من المثير للدهشة أنه لم يتم قمع أي من تعبيرات جينات CDKI هذه في جزر Smad3KO-db / db في الجسم الحي وخلايا جزيرة Smad3KO المستزرعة كما تم الكشف عنها بواسطة RNA-seq و RT-PCR ، على التوالي (الشكل S4B و C). في المقابل ، تم تنظيم مستويات التعبير للعديد من جينات CDKI مثل p16 و p18 و p57 في خلايا جزيرة Smad3KO المستزرعة (الشكل S4C). هذا يعني أن هناك آلية بديلة موجودة في تكاثر الخلايا المنظم Smad 3-.

Figure 8

وبالتالي قمنا بتحليل إمكانية ربط Smad3 لتسلسل المروج لـ 224 DEGs في مصطلح GO لدورة الخلية باستخدام برنامج مستعرض ECR (الشكل 8 أ). من بينها ، جذب جين واحد اسمه E2F3 انتباهنا لأنه منفذ رئيسي ومنفذ طرفي ينظم دخول G1 / S لدورة الخلية [13 ، 14]. وجدنا موقع ربط Smad3 محتمل في مروج موضع الماوس E2F3 المحفوظ أيضًا في البشر (الشكل 8 ب).

Cistanche benefits

سيستانش توبولوسا

للتحقق مما إذا كان E2F3 ضروريًا لتكاثر الخلايا المنظم لـ Smad 3- ، قمنا بفحص الارتباط بين E2F3 و Smad3 في الجزر. تمشيا مع RNA-seq ، اكتشفت الكيمياء المناعية أن التعبير عن E2F3 قد انخفض إلى حد كبير في جزر الفئران Smad3WT-db / db ولكنه زاد بشكل كبير في الفئران Smad3KO-db / db (الشكل 8C). علاوة على ذلك ، لوحظ أيضًا زيادة تعبير E2F3 في خلايا جزيرة Smad3KO المستزرعة في كل من مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين (الشكل 8 DF). في المقابل ، ألغى صمت E2F3 بوساطة الفيروس الغدي النشاط التكاثري للخلايا (الأنسولينزائدBrdUزائد) في خلايا جزيرة Smad3KO (الشكل 9) ، مما يكشف عن دور أساسي لـ E2F3 في تكاثر الخلايا المنظم Smad3KO 3-.

figure 9

لتأكيد الارتباط المتوقع لـ Smad3 في مروج E2F3 ، أجرينا الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) في جزر الماوس المعزولة (الشكل 10 أ). تم التحقق من صحة خصوصية الجسم المضاد Smad3 المستخدم في رقاقة في البداية عن طريق الترسيب المناعي في جزر الماوس (الشكل 10 ب). أكد ChIP PCR ارتباط Smad3 بالمروج E2F3 باعتباره الجسم المضاد لـ Smad3 ، ولكن لم ينجح أي نمط مماثل IgG غير محدد في تعجيل جزء الكروماتين المقابل لمروج E2F3 (الشكل 10C). كشفت RT-PCR الكمي عن إثراء 6- أضعاف لتسلسل مروج E2F3 في اختبار ChIP مع الجسم المضاد Smad3 مقارنة بالنمط النظري IgG (الشكل 10 د) ، مما يدل على أن Smad3 يمكن أن يرتبط بمنطقة المروج للموضع الجيني E2F3 .

figure 10

للتحقق من الأهمية الوظيفية لربط Smad3 على مروج E2F3 ، قمنا ببناء متجه مراسل لوسيفيراز مدفوعًا بمروج E2F3 بالماوس الذي يؤوي موقع ربط Smad3 أو شكله المتحور (الشكل 10E). كشف اختبار ثنائي لوسيفيراز في خلايا HEK293T عن نسخ قوي للوسيفيراز مدفوعًا بمحفز E2F3 المستنسخ ، والذي تم تثبيته بشكل كبير عن طريق الإفراط في التعبير عن Smad3. ومع ذلك ، فإن طفرة موقع ربط Smad3 أبطلت التأثير المثبط لـ Smad3 (الشكل 10F). قدمت هذه النتائج دليلًا مباشرًا على الدور القمعي لـ Smad3 في نسخ E2F3 من خلال الارتباط بمروجها.

في هذه الدراسة ، أوضحنا أن زرع 3- الجزر الصغيرة التي تعاني من نقص في Smad أنتجت تأثيرًا علاجيًا أفضل على مرض السكري وإصابة الكلى المصابة بداء السكري في الفئران المصابة بداء السكري التي يسببها STZ وفئران ديسيبل / ديسيبل. في مرض السكري الناجم عن STZ ، أدت زراعة 100 Smad3KO ولكن ليس 100 Smad3WT إلى زيادة 17- أضعاف في كتلة الخلايا ، والتي ارتبطت بزيادة كبيرة في مستويات الأنسولين في الدم وبالتالي تحسين عدم تحمل الجلوكوز وتعافي نسبة السكر في الدم ، مما أدى إلى في الحماية من إصابة الكلى السكري.

تم العثور على نتائج مماثلة أيضًا في T2DM في الفئران التي تحتوي على ديسيبل / ديسيبل ، حيث أدى الزرع مع 250 جزيرة Smad3KO ولكن ليس نفس الجرعة من جزر Smad3WT إلى زيادة 5- من كتلة الخلايا وأنتج تحكمًا أفضل في نسبة السكر في الدم. تشير هذه النتائج إلى أن نقص Smad3 مقاوم للبيئات الدقيقة لمرضى السكري ويعزز إلى حد كبير توسع خلايا الجزر المطعمة وإنتاج الأنسولين لإظهار تحكم أفضل في نسبة السكر في الدم. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أيضًا أن العلاج باستخدام 100 جزيرة من Smad3KO يمكن أن ينتج تحكمًا مساويًا في نسبة السكر في الدم مثل استخدام 200 Smad3WT أو جزر KO في مرض السكري الذي يسببه STZ. تشير هذه الملاحظة إلى أن نقص Smad3 قد يكون قادرًا على تقليل (على الأقل 50 بالمائة) عدد الجزر المطلوبة للتأسيس الناجح لاستقلال الأنسولين في العلاج باستبدال خلايا الجزيرة من أجل T1DM. تتوافق هذه النتائج مع التقرير السابق بأن المعالجة المسبقة للجزر باستخدام SB -431542 ، وهو مثبط لـ TGFBR1 ، يعزز تكاثر الخلايا ووظيفتها بعد الزرع [15]. ومع ذلك ، نظرًا لأن Smad2 يلعب أيضًا دورًا أساسيًا في إطلاق الأنسولين المحفز بالجلوكوز في الخلايا [16] ، فإن استهداف Smad3 ولكن ليس TGFBR1 في الجزر (الخلايا) قد يكون أكثر ملاءمة لعلاج استبدال الخلايا لمرض السكري. وبالتالي ، قد يمثل زرع الجزير الصغير Smad 3- علاجًا جديدًا لكل من T1DM و T2DM إكلينيكيًا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يحمي العلاج بجزر Smad3KO أيضًا من إصابة الكلى السكري عند 16 أسبوعًا من T1DM ، على الرغم من أن هذا ليس عميقًا في T2DM بسبب الحد الأدنى من إصابة الكلى السكري التي تحدث في الفئران db / db في عمر الأسبوع 12.

ميكانيكيًا ، وجدنا أن Smad3 يعمل عن طريق قمع E2F3 لمنع تكاثر الخلايا. هذا مدعوم بالدليل على أن مروج E2F3 يحتوي على موقع ربط Smad3 وظيفي كما أكده اختبار مراسل ChIP و luciferase. أظهرت خلايا الجزيرة التي تفتقر إلى Smad3 انتشارًا محسنًا في آلية تعتمد على E2F 3- حيث ألغت ضربة قاضية لـ E2F3 هذا النشاط المؤيد للتكاثر. ينتمي E2F3 إلى عائلة E2F وهو عنصر حاسم في آلية Rb-E2F التي تحكم إدخال دورة الخلية G1 / S [13]. E2Fs هي عوامل النسخ والمنفذين النهائيين لتنظيم الجينات التي تنظم تقدم دورة الخلية [14]. لقد ثبت أن الإفراط في التعبير عن E2F3 يعزز تكاثر الخلايا في الجزر الصغيرة من القوارض والبشر [17]. توفر النتائج التي تفيد بأن Smad3 يستهدف نسختًا E2F3 لقمع دورة الخلية في الخلايا آلية تنظيمية جديدة لتكاثر الخلايا. وبالتالي ، فإن اضطراب Smad3 في خلايا الجزيرة يعزز تكاثر الخلايا المعتمد على E2F 3- كما يتضح من الزيادة الملحوظة في خلايا PCNA plus أو BrdU plus المنتجة للأنسولين ، مما يشير إلى أن العلاج بجرعة فرعية من Smad3KO كافٍ لتوسيع الخلية الكتلة ويمنع كلا من T1DM في الفئران التي يسببها STZ و T2DM في الفئران ديسيبل / ديسيبل.

Cistanche benefits

هيربا سيستانشومستخلص سيستانش

يُذكر أن إشارات TGF- تلعب دورًا مهمًا في تطوير خلايا جزيرة البنكرياس ووظيفتها ، وتوقف دورة الخلية ، وتسبب موت الخلايا المبرمج عن طريق تحفيز CDKIs [7 ، 8 ، 18]. لدهشتنا ، كشفت التجارب في الجسم الحي وفي المختبر أن نسخ CDKI لم يتغير أو حتى تنظيمه في جزر Smad3KO (الشكل S4). قد يعزى هذا التناقض إلى الظروف التجريبية المختلفة. النتائج في الدراسة الحالية مستمدة من الفئران Smad3KO (الجزر). ومع ذلك ، فإن الدراسات السابقة تستند إلى التثبيط الدوائي لـ TGFBR1 ، والذي يجب أن يؤثر على إشارات TGF بالكامل [7 ، 8]. علاوة على ذلك ، استخدمنا عينات جزيرة من الفئران الصغيرة البالغة (عمرها 8-10 أسبوعًا) ، بينما تم استخدام جزر صغيرة من حيوانات قديمة نسبيًا أو متبرعين جثامين لكبار السن في الدراسات السابقة [7 ، 8]. نظرًا لأن خلايا الجزيرة تظهر تراكمًا مرتبطًا بالعمر لـ CDKIs [19] ، فقد تكون CDKIs في الخلايا المسنة أكثر حساسية لتثبيط إشارات TGF.

كانت هناك العديد من القيود في هذه الدراسة. أولاً ، يتم التحقق من فعالية زرع الجزر في نموذج الماوس السكري الناجم عن STZ دون تفاعل المناعة الذاتية. لذلك ، يجب أيضًا التحقق من ميزة Smad3KO على علاج جزيرة Smad3WT لمرض السكري في نموذج T1DM أصلي في المستقبل. ثانيًا ، تستند نتائج هذه الدراسة إلى العلاج بخلايا Smad3KO للجزيرة بأكملها ولكن ليس بالخلية المحددة. من غير الواضح ما إذا كانت أنواع الخلايا بخلاف الخلايا الموجودة في الجزيرة ستنفذ دورًا يعتمد على Smad 3- لتعديل تكاثر الخلايا عن طريق مسارات الحديث المتبادل بين الخلايا. وبالتالي ، هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات مع Smad3KO الخاص بالخلايا. علاوة على ذلك ، يجب التحقق من نتائج هذه الدراسة في عينات الجزر البشرية لإثبات أهميتها السريرية.

مراجع

1 Shapiro AM ، Pokrywczynska M ، Ricordi C. الزرع السريري لجزيرة البنكرياس. نات ريف إندوكرينول. 2017 ؛ 13: 268-77.

2. جاكوبسون إي أف ، تزاناكيس إس. تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا البنكرياس الوظيفية لعلاجات مرض السكري: الابتكارات والتحديات والتوجهات المستقبلية. جي بيول م. 2017 ؛ 11:21.

3. Toso C و Isse K و Demetris AJ و Dinyari P و Koh A و Imes S et al. تقييم الكسب غير المشروع النسيجي بعد الزرع السريري للجزيرة. الزرع. 2009 ؛ 88: 1286-93.

4. لان HY. الأدوار المتنوعة لـ TGF-beta / Smads في التليف الكلوي والالتهابات. Int J Biol Sci. 2011 ؛ 7: 1056-67.

5. Meng XM، Tang PM، Li J، Lan HY. إشارات TGF-beta / Smad في التليف الكلوي. الجبهة فيسيول. 2015 ؛ 6:82.

6. El-Gohary Y، Tulachan S، Wiersch J، Guo P، Welsh C، Prasadan K، et al. تنظم شبكة إشارات smad تكاثر خلايا الجزيرة. السكري. 2014 ؛ 63: 224-36.

7. Dhawan S ، Dirice E ، Kulkarni RN ، Bhushan A. تثبيط إشارات TGF-beta يعزز استنساخ خلايا بيتا البشرية. السكري. 2016 ؛ 65: 1208-18.

8. Wang P ، Karakose E ، Liu H ، Swartz E ، Ackeifi C ، Zlatanic V ، et al. يتآزر التثبيط المشترك لمسارات DYRK1A و SMAD و Trithorax للحث على تكرار قوي في خلايا بيتا البشرية البالغة. ميتاب الخلية. 2019 ؛ 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY ، Wang L ، Tang PM-K ، Wang HL ، Li JC ، Xu BH ، et al. يعزز نقص Smad3 تكاثر خلايا بيتا ووظيفتها في الفئران ديسيبل / ديسيبل من خلال استعادة تعبير Pax6. ثيرانوستيكس. 2021 ؛ 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ، Powell CA، Hai T. طريقة لعزل جزيرة الفئران وزرع الكلى تحت المحفظة. J فيس إكسب. 2011.

11. Choi MY و Lim SJ و Kim MJ و Wee YM و Kwon H و Jung CH et al. يحسن زرع Isograft Isograft من حساسية الأنسولين في نموذج الفئران المصابة بداء السكري من النوع 2. الغدد الصماء. 2021 ؛ 72: 660-71.

12. Vijayachandra K ، Higgins W ، Lee J ، Glick A. تحريض p16ink4a و p19ARF بواسطة TGFbeta1 يساهم في توقف النمو واستجابة الشيخوخة في الخلايا الكيراتينية في الفئران. مول مسرطن. 2009 ؛ 48: 181-6.

13. داير إم إيه ، سيبكو سي إل. تنظيم الانتشار أثناء تطور الشبكية. نات ريف نيوروسسي. 2001 ؛ 2: 333-42.

14. Dyson N. تنظيم E2F بواسطة بروتينات عائلة pRB. تطوير الجينات. 1998 ؛ 12: 2245-62.

15. Xiao X ، Fischbach S ، Song Z ، Gaffar I ، Zimmerman R ، Wiersch J ، et al. قمع عابر لإشارات مستقبلات TGFbeta يسهل زرع الجزر البشرية. طب الغدد الصماء. 2016 ؛ 157: 1348-56.

16. Nomura M ، Zhu HL ، Wang L ، Morinaga H ، Takayanagi R ، Teramoto N. يؤدي اضطراب SMAD2 في خلايا بيتا البنكرياس في الفأر إلى تضخم الجزر وضعف إفراز الأنسولين بسبب توهين نشاط قناة K زائد الحساس لـ ATP. السكري. 2014 ؛ 57: 157-66.

17. Rady B ، Chen Y ، Vaca P ، Wang Q ، Wang Y ، Salmon P ، et al. يعزز الإفراط في التعبير عن E2F3 تكاثر خلايا بيتا البشرية الوظيفية دون تحريض موت الخلايا المبرمج. دورة الخلية. 2013 ؛ 12: 2691-702.

18. Zhang Y، Alexander PB، Wang XF. إشارات عائلة TGF-beta في التحكم في تكاثر الخلايا والبقاء على قيد الحياة. كولد سبرينغ هارب بيرسبكت بيول. 2017 ؛ 9.

19. وانج بي ، فياشي-تايسش إن إم ، فاسافادا آر سي ، سكوت دي كيه ، جارسيا أوكانا إيه ، ستيوارت إيه إف. داء السكري -- من التطورات والتحديات في انتشار خلايا بيتا البشرية. نات ريف إندوكرينول. 2015 ؛ 11: 201-12.

20. Yang X و Letterio JJ و Lechleider RJ و Chen L و Hayman R و Gu H وآخرون. يؤدي الاضطراب المستهدف لـ SMAD3 إلى ضعف مناعة الغشاء المخاطي وتقلص استجابة الخلايا التائية لـ TGF-beta. EMBO J. 1999 ؛ 18: 1280-91.

21. لي دس ، يوان يه ، تو هج ، ليانج كيو إل ، داي إل جيه. بروتوكول لعزل جزيرة صغيرة من البنكرياس الماوس. نات بروتوك. 2009 ؛ 4: 1649-52.

22. Szot GL، Koudria P، Bluestone JA. زرع جزر البنكرياس في كبسولة الكلى للفئران المصابة بداء السكري. J فيس إكسب. 2007: 404.

23. Xu BH، Sheng J، You YK، Huang XR، Ma RCW، Wang Q، et al. يمنع حذف Smad3 التليف الكلوي والالتهاب في اعتلال الكلية السكري من النوع 2. الاسْتِقْلاب. 2020 ؛ 103: 154013.

Hong-Lian Wang1،2، Biao Wei2، Hui-Jun He2، Xiao-Ru Huang2،3، Jing-Yi Sheng2،4، Xiao-Cui Chen2،5، Li Wang1، Rui-Zhi Tan1، Jian-Chun Li1، Jian Liu1 و Si-Jin Yang6 و Ronald CW Ma2 و Hui-Yao Lan2.7

1 مركز أبحاث للطب المتكامل وقسم أمراض الكلى ، مستشفى الطب الصيني التقليدي التابع لجامعة جنوب غرب الطبية ، لوتشو ، سيتشوان ، 646000 ، الصين.

2. قسم الطب والعلاج ، ومعهد لي كا شينج للعلوم الصحية ، الجامعة الصينية بهونج كونج ، هونج كونج ، 999077 ، الصين.

3. مختبر جوانجدونج - هونج كونج المشترك لأمراض الكلى المناعية والوراثية ، مستشفى مقاطعة جوانجدونج الشعبي ، أكاديمية جوانجدونج للعلوم الطبية ، جوانجدونج ، جوانجدونج ، 510080 ، الصين.

4. مختبر مفتاح الدولة للإلكترونيات الحيوية ، مختبر جيانغسو الرئيسي للمواد الحيوية والأجهزة ، كلية العلوم البيولوجية والهندسة الطبية ، جامعة الجنوب الشرقي ، نانجينغ ، الصين.

5. المختبر الرئيسي للوقاية من مرض الكلى المزمن وإدارته في مدينة Zhanjiang ، معهد أمراض الكلى ، المستشفى التابع لجامعة Guangdong الطبية ، Zhanjiang ، Guangdong ، 524001 ، الصين.

6. قاعدة البحوث السريرية الوطنية للطب الصيني التقليدي ، مستشفى الطب الصيني التقليدي التابع لجامعة جنوب غرب الطبية ، لوتشو ، سيتشوان ، 646000 ، الصين.

7. مختبر البحوث المشتركة لمستشفى CUHK-Guangdong People's Hospital on Immunological and Genetic Kidney Diseases ، الجامعة الصينية بهونغ كونغ ، هونغ كونغ ، 999077 ، الصين.

قد يعجبك ايضا