الجزء Ⅰ: العملية الالتهابية تعدل التعبير عن WT1 وتوطينه في خلايا بودوسيت مما يؤدي إلى تلف الكلى

جهة الاتصال: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 البريد الإلكتروني:audrey.hu@wecistanche.com

مارييلا أريلانو - رودريغيز ، بابلو زاباتا بينافيدس وآخرون.

مقدمة

جين ورم ويلم -1(WTI) هو أحد الجينات الرئيسية المشاركة في بقاء الخلايا البودوسية والترشيح الكلوي غير الفعال. تؤدي العمليات الالتهابية إلىالكلىخزيوقد يحدث هذا من خلال تعديل WT1 (جين ورم ويلم -1). WT1 (جين ورم ويلم -1) عامل النسخ ، وهو بروتين إصبع الزنك يحتوي على أربعة أشكال إسوية رئيسية عن طريق التضفير البديل في exon 5 (17AA ±) و exon 9 (KTS ±) (1). يحتوي KTS-isoform على تقارب أعلى للحمض النووي ، KTS plus يتشارك مع بروتينات spliceosome في السيتوبلازم (2 ، 3).جين ورم ويلم -1) دورًا حاسمًا في التطور الجنيني ، في المقام الأول في الغدد التناسلية والكلىتطوير؛ في البالغين ، يقتصر تعبيره على الخلايا الحشوية المتخصصة فيالكلى(podocytes) وهي ضرورية لصيانة وتعديل العديد من الجينات ، مثل podocalyxin و nephrin (NPHS1) وعامل النسخ المزدوج الصندوق (4-6). قد تؤدي الطفرات أو تقليل تعبير WTl إلى تقليل التعبير عن nephrin و podocalyxin ويرتبط باعتلال الكلية مثل تصلب الكبيبات (5 ، 7-10).

المتلازمة الكلوية هي المتلازمة الكلوية الأكثر شيوعًا في مرحلة الطفولة ، وتصنيفها النسيجي هو الحد الأدنى من التغير الكلوي ، وتصلب الكبيبات القطاعي البؤري ، والتصلب المسراق المنتشر ، ووفقًا لمدى استجابتها للستيرويدات تصنف على أنها متلازمة كلوية حساسة ومقاومة (11) .

آثار cistanche: مضاد للالتهابات

طفرة WT1 (جين ورم ويلم -1) بشكل شائع عند الأطفال المصابين بالمتلازمة الكلوية المقاومة للستيرويد ، وهو مرض نادر يصيب 10-15 في المائة من المرضى المصابين بالمتلازمة الكلوية (12،13). يستجيب حوالي 80 بالمائة من جميع الأطفال المصابين بالمتلازمة الكلوية المتفرقة للعلاج بالستيرويد ، ومع ذلك ، لم يتم العثور على طفرات في WT1 (جين ورم ويلم -1) في دراسة جماعية كبيرة (14). الحد من التعبير عن المتلازمة الكلوية المقاومة للستيرويد وإلى حد أقل في المرضى الذين يعانون من المتلازمة الكلوية الحساسة للستيرويد (15). في نموذج الفئران للالتهاب الجهازي الناجم عن عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، 24 ساعة بعد إدارة LPS ، WT1 (جين ورم ويلم -1) إلى السيتوبلازم وكان مرتبطًا بانخفاض في التعبير عن النيفرين ، وهو مكون رئيسي للحفاظ على الحجاب الحاجز الشق في الخلايا البادئة وهو ضروري للترشيح الكبيبي الصحيح ، وبالتالي يظهر WT1 (جين ورم ويلم -1) يعمل كعامل نسخي لتنظيم جين النيفرين (16).

في خلايا سرطان الرئة A459 المعالجة بعامل نخر الورم ألفا (TNFa) ، إزفاء WT1 (جين ورم ويلم -1) البروتين إلى السيتوبلازم ، مما يشير إلى أن المنبه الالتهابي يمكن أن يغير موقعه داخل الخلايا ووظيفة النسخ (17). قد تلعب الفسفرة دورًا في تعديل النشاط التنظيمي النسخي لـ WT1 (جين ورم ويلم -1) من خلال التداخل مع النقل النووي ، وكذلك عن طريق تثبيط WT1 (جين ورم ويلم -1) ربط الحمض النووي (18) عن طريق فسفرة بروتين كيناز المعتمد على cAMP لـ Ser -365 و Ser -393 في مجال إصبع الزنك (19).

ينتج الإنتان عن الاستجابة الالتهابية الجهازية ويتميز بإفراز السيتوكينات المؤيدة والمضادة للالتهابات الناتجة عن العدوى. الإصابة الكلوية الحادة شائعة في المرضى المصابين بأمراض خطيرة في وجود التهاب حاد ولها صلة قوية بتطور التلف الكلوي المزمن (20 ، 21). هناك أدلة على أن الالتهاب يلعب دورًا مهمًا في تلف الأعضاء المختلفة ، بما في ذلكالكلى(22) في هذا العمل ، قمنا بتقييم تأثير السيتوكينات المؤيدة للالتهابات على تعديل WT1 (جين ورم ويلم -1) التعبير وانتقاله إلى السيتوبلازم.

فائدة cistanche tubulosa: antit-cncer and anti-ورم

المواد والأساليب

نموذج حيواني. تم الحصول على إناث فئران BALB / c (عمرها 8-10 أسبوع) من Harland Mexico (مكسيكو سيتي ، المكسيك). تم وضع الفئران في أقفاص تحت درجة حرارة الغرفة والرطوبة والضوء (دورة مظلمة 12/12 ساعة) مع الماء والغذاء بالشهرة. تم إعطاء حقن LPS بجرعة 8 مغ / كغ داخل الصفاق (16) ؛ تم استخدام المحلول الملحي للتحكم والفئران غير المعالجة. تم التضحية بالفئران بحقنة داخل الصفاق بمقدار 200 مجم / كجم من محلول بنتوباربيتال الصوديوم عند 12،24،36،48 و 72 ساعة ، مع n =5 في كل نقطة زمنية ، ثمالكلىتم جمع الأنسجة والدم. تم جمع البول قبل التضحية بالحيوانات.

اثنين من الفئران لالكلىتم حقن إإكسبلنتس بـ 1 مجم / كجم من LPS كل يومين للحث المزمنالكلى إصابةكعنصر تحكم إيجابي (21). تم إجراء جميع التجارب وفقًا لموافقة مسبقة من لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها بكلية العلوم البيولوجية (CEIBA -2016-034).

الكلىإإكسبلنتس. منالكلىمن فئران BALB / c ، تم تحضير شرائح الأنسجة بسماكة {0} أم باستخدام قطاعة أنسجة Krumdieck (أبحاث وتطوير ألاباما ، Munford ، AL ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 4 درجات مع التدفق المستمر لمخزن كربونات Krebs Henseleit (KB) تم تهويته بنسبة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم حصاد الشرائح في مخزن KB عند 4 درجات.الكلىتم طلاء إإكسبلنتس في 12- أطباق جيدة مع وسط Dulbecco's Eagle's Medium / F12 المكمّل بمصل بقري جنيني بنسبة 10 بالمائة وعامل مضاد حيوي مضاد للفطريات بنسبة 5 بالمائة ، وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية ، مع 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، مع التقليب عند 25 دورة في الدقيقة. تمت معالجة الإكسبلنتس بـ 10 نانوغرام / مل من TNFa (R & D Systems ، Minneapolis ، MN ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 20 نانوغرام / مل من إنترلوكين 1 (IL1 ؛ أنظمة R & D) و 100 نانوغرام / مل من LPS وتحليلها عند 6 ، 12 وبعد 24 ساعة.

البروتين البولي. تم جمع عينات البول في كل نقطة زمنية أعلاه. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين DC (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تقييم بيلة الألبومين باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد وبناءً على حجم نطاق ألبومين المصل البقري (16).

السيتوكينات المؤيدة للالتهابات. تم قياس مستويات IL6 و IL1 و TNFa باستخدام مجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبطة بإنزيم السندويتش (PeproTech ، مكسيكو سيتي ، المكسيك).

تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR). تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة الكلى باستخدام كاشف Trizolw (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تصنيع (كدنا) أحادي السلسلة عن طريق النسخ العكسي باستخدام مجموعة النسخ العكسي (كدنا) عالية السعة (النظم البيولوجية التطبيقية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام 7500 Real-Time PCR System (النظم البيولوجية التطبيقية) مع مقايسات التعبير الجيني TaqMan. تم إجراء فحوصات PCR في الوقت الحقيقي لكل عينة في ثلاث نسخ. البادئات لـ WT1 (جين ورم ويلم -1) تم توجيهها إلى الأمام: 5- TCTGCGG AGCCCAATACAG -3 '؛ عكس: 5- CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA -3 '؛ ومسبار FAM: 5- CACCGTGCGTGTGTATT -3' NFQ ؛ تم تنفيذ البروتوكول لمدة 95 درجة لمدة 10 دقائق و 40 دورة عند 94 درجة لمدة 30 ثانية و 64 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. التعبير النسبي لـ WT1 (جين ورم ويلم -1) تم حساب الجين باستخدام المعادلة 2- AACT (23) مع جين الفوسفات ديهيدروجينيز (GAPDH) المستخدم للتطبيع.

علاج مقتطفات أمراض الكلى

تم تحديد التعبير عن nephrin mRNA باستخدام 3 ميكروغرام من cDNA والأشعال التالية: Forward: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT -3 'والعكس: 5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG -3' عند 94 درجة لمدة 30 ثانية ، 60 درجة لمدة 30 ثانية و 72 درجة لمدة 30 ثانية لمدة 30 دورة (372 نقطة أساس) (16). للتعبير عن GAPDH ، كانت البادئات المستخدمة هي: Forward: 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3 '، عكس: 5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA -3 '، مع ظروف التفاعل التالية: 94 درجة لمدة 40 ثانية ، 60 درجة لمدة 30 ثانية و 72 درجة لمدة 40 ثانية لمدة 35 دورة (452 ​​نقطة أساس).جين ورم ويلم -1): إعادة توجيه 5'-CACATGAGAAACGCCCCTTCATGTG -3 '، عكس 5'-TTTGAGCTGTCTGAACGAGAAA -3' عند 94 درجة لمدة 40 ثانية ، و 64 درجة لمدة 30 ثانية و 72 درجة لمدة 30 ثانية لمدة 35 دورة (160 نقطة أساس). التعبير عن WT1 (جين ورم ويلم -1) الأشكال الإسوية KTS ± و 17 AA ± (F 2- R2 بادئات لاكتشاف 17 AA plus / - و F 3- R3 لاكتشاف KTS plus /-splicing isoforms) تم إجراؤها بواسطة PCR التقليدي وفقًا لـ Oji et .ال (24) تم إجراء تحديد تعبير -actin وفقًا لـ Lauxet al. (25). وقد لوحظت المنتجات باستخدام 10 في المائة من البولي أكريلاميد الكهربائي للهلام من أجل الشكل الإسوي KTS ± و 2 في المائة من هلام الاغاروز للشكل الإسوي 17AA ±.

تألق مناعي. الالكلىمن الفئران والضوابط المعالجة بـ LPS في 10 في المائة من الفورمالين ومعالجتها لتلوين الهيماتوكسيلين والأيوزين والكيمياء المناعية والتألق المناعي.

لتحديد موقع WT1 (جين ورم ويلم -1) في الفئران التي عولجت بـ LPS ، {0} تم استخدام أقسام سميكة من نسيج كلوي مثبتة على شرائح مجهرية. تم إزالة الشمع من العينات ، وتم تفريغها باستخدام Triton X -100 [0.1 بالمائة Triton مع 1 بالمائة من سترات الصوديوم في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS)] ، وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. تم حظر الأنسجة باستخدام مصل بقري جنيني بنسبة 20 في المائة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة وحضنت عند 4 درجات طوال الليل بجسم مضاد أحادي النسيلة لـ WT1 (جين ورم ويلم -1) sc {0} (F -6) (Santa Cruz Biotechnology ، سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) المخفف بنسبة 1: 100 في مصل أبقار جنيني بنسبة 10 بالمائة في برنامج تلفزيوني. بعد الغسل باستخدام PBS ، تم التعرف على وجود الجسم المضاد المرتبط عن طريق التلوين باستخدام IgG Texas Red sc {6}} (التكنولوجيا الحيوية في سانتا كروز). تمت مواجهة الشرائح بـ 4 '، 6- diamidino -2- phenylindole. أخيرًا ، تم تركيب الشرائح وفحصها نوعيًا باستخدام مجهر أوليمبوس BX61W1 متحد البؤر مع هدف غمر بالماء 40 × وبرنامج Fluoview 4.0a (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).

المناعية. لتحديد الفسفرة (ع) -WT1 (جين ورم ويلم -1) في خلايا podocytes من الفئران المعالجة بـ LPS ، الأجسام المضادة متعددة النسيلة إلى p-WT1 (جين ورم ويلم -1) تم استخدام سيرين 393 ، sc -12933 و 363 ، sc -12934- R (سانتا كروز Biotechnology ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية）. تم إزالة الشمع من الشرائح التي تحتوي على 4- أقسام ميكرومتر من الأنسجة الكلوية ونفاذها تم إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام Universal Quick Kit (Vector Laboratories ، Burlingame ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم فحص الشرائح باستخدام مجهر ضوئي مع هدف غمر بالزيت 100 × (Primo Star ، Carl Zeiss ، GmbH ، ألمانيا) .

لطخة غربية. تم عزل البروتين الكلي باستخدام 200 مايكرولتر من محلول التحلل (1 بالمائة تريتون ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 25 ملي مولار Tris-HCl pH 7.6) ، وتم قياس التركيز باستخدام مجموعة فحص بروتين DC (Bio-Rad). تم فصل البروتين (50 ميكروغرام) باستخدام 12 في المائة من الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد هلام الكهربائي وتم تحليله بواسطة النشاف الغربي باستخدام WT1 (جين ورم ويلم -1) [F6] الجسم المضاد sc -7585 (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية). تم تطبيع العينات باستخدام مضاد GAPDH (AB2302 ؛ سيجما ، سان لويس ، مو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصور البروتينات باستخدام Lumi-Light Western Blotting system sc -2048 (سانتا كروز Biotechnology).

فائدة cistanche: حماية الكلى

نتائج

تحريضالكلىتلففي فئران BALB / c بواسطة LPS. ثبت جيدًا أن إصابة خلايا البودوسيت مرتبطة بزيادة البيلة البروتينية. تم تحديد الألبومين والبروتين الكلي في البول بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد ومجموعة فحص البروتين DC (Bio-Rad). لوحظت زيادة ملحوظة (p {2}}. 0 01) في الألبومين البولي بعد 12 ساعة من علاج LPS ، مع زيادة قصوى عند 24 ساعة (215.87 ± 1.41 ميكروغرام / مل） مقارنة بمجموعة التحكم （15.53 ± 5.0 ميكروغرام / مل） （الشكل 1 أ. لوحظ أن تركيز إجمالي البروتين البولي يصل إلى ذروته عند 36 ساعة (26.02 ± 2.43 مجم / مل) وكان أعلى بشكل ملحوظ مقارنةً بالتحكم (ص =0. 01) كما هو مبين في الشكل 1. تم تحليل التلف الكلوي الناجم عن LPS بواسطة الأنسجة. في 24 ساعة بعد العلاج ، لوحظ التهاب كبيبات الكلى البؤري في أنسجة الكلى ، مع وجود أكبر ضرر عند 36 ساعة ، مما أدى إلى زيادة حجم الكبيبة ، مع مسراق تكاثر الخلايا في 48 ساعة بعد الانتعاش التدريجي للكبيبة لوحظ حتى 72 ساعة ، كما هو مبين في الشكل 1C.

الشكل 1. تأثير الالتهاب الجهازي على الكلى.تركيزات الألبومين البولي (أ) والبروتين البولي (ب) كعلامات لتلف الكلى في الفئران المعالجة بعديد السكاريد الدهني. C: صورة تمثيلية عن الأنسجة الكلوية للفأر (تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين) في أوقات مختلفة (12 ، 24 ، 36 ، 48 ، 72 ساعة) بعد حقن عديدات السكاريد الدهنية ، مع مقارنة نموذج التهاب مزمن ، تكبير 100 ×. تختلف اختلافًا كبيرًا في: * n<><0,0]><0.00>

إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات TNFa و IL1 في المصل من الفئران المعالجة بـ LPS. لتأكيد حدوث تلف الكلى بواسطة LPS ، تم قياس مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. لوحظت زيادة في TNFa و I1 بعد 12 ساعة (3.6 ± 0. 9 نانوغرام / مل ، 11.9 ± 5 نانوغرام / مل) وحتى 36 ساعة (4.44 ± 0. 1 نانوغرام / مل ، 18 ± 0 .9 نانوغرام / مل على التوالي) من العلاج باستخدام LPS ، يبدأ في الانخفاض بعد ذلك (الشكل 2 أ و ب). تمت زيادة تعبير IL6 عند 12 ساعة (49.5 نانوغرام / مل) و 36 ساعة (23.5 نانوغرام / مل) بعد العلاج ، حيث كان أعلى بكثير من عنصر التحكم (الشكل 2C).

الشكل 2. الدورة الزمنية لمستويات عامل نخر الورم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ألفا (TNFa).(A) ، والإنترلوكين 1 (LL1) (B) ، و IL6 (C) في مصل الفئران بعد الإعطاء داخل الصفاق لعديد السكاريد الدهني. تختلف بشكل ملحوظ في: * p أقل من أو يساوي 0. 0 5 ، ** p أقل من أو يساوي 0. 01 و *** p أقل من أو يساوي 0.001 .

التعبير الجيني WTI في أنسجة الكلى من الفئران المعالجة بـ LPS. للإجابة على سؤالنا المركزي حول ما إذا كان WT1 (جين ورم ويلم -1) من خلال العملية الالتهابية ، وكان لهذا آثار كلوية ، التعبير الكلي عن WT1 (جين ورم ويلم -1) تم تحديد الجين في عينات كلوية من الفئران المصابة بالتهاب جهازي في أوقات مختلفة أثناء الالتهاب. WT1 (جين ورم ويلم -1) كان mRNA أقل في جميع الأوقات التي تم تحليلها فيما يتعلق بالسيطرة ، مع أدنى تعبير نسبي عند 36 ساعة وأعلى عند 12 ساعة بعد تحريض الالتهاب الجهازي كما هو موضح في الشكل 3 أ ، بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد ما إذا كان العلاج باستخدام LPs التعديل المستحث للتعبير عن exon5 الإسوي (17 AA ±) و KTS ± من WTI بواسطة PCR. أظهرت البيانات أنه لم يكن هناك أي تحرير للتعبير عن هذه الأشكال الإسوية حيث لوحظ نفس السلوك كمجموعة التحكم دون علاج طوال عملية الالتهاب الجهازية التي يسببها LPS (الشكل 3 ب). أظهر بروتين WT1 عن طريق النشاف الغربي انخفاضًا طوال العملية الالتهابية ، مع انتعاش طفيف عند 36 ساعة بعد العلاج ، ومع ذلك ، كانت كمية WT1 أقل من كمية التحكم غير المعالجة (الشكل 3C و D).

الشكل 3. تأثير عديدات السكاريد الدهنية (LPS) على التعبير الجيني Wilms'tumor I (WT1) في أنسجة الكلى من الفئران المصابة بالتهاب جهازي.A: التعبير النسبي عن WTI mRNA.B: التعبير النسبي للأشكال الإسوية KTS ± و 17IAA ± من WT1.C: مستويات البروتين WTI عن طريق التكتل المناعي بعد علاج LPS و D: كثافة التكتل المناعي لـ WT1. تختلف بشكل ملحوظ في: ** p أقل من أو يساوي 0. 0 1 و *** p أقل من أو يساوي 0.001 ،

الفسفرة وتوطين خام غرب تكساس الوسيط في خزعات الكلى للفئران المعالجة بـ LPS. حدث مهم في التعديل اللاحق لبروتين غرب تكساس الوسيط هو فسفرة الحمض الأميني 393 ، مما يؤدي إلى إزاحة البروتين إلى السيتوبلازم. تم تحديد الفسفرة وتوطين WT1 في عينات الكلى من الفئران المعالجة بـ LPS. تم تحليل الفسفرة لـ WT1 عن طريق الكيمياء النسيجية ، مما يشير إلى وجود WT1 الفسفوري في سيتوبلازم الخلايا في أقسام الأنسجة الكلوية بدءًا من 12 ساعة بعد تحريض الالتهاب الجهازي واستمر حتى 72 ساعة. تمت فسفرة WT1 في الأحماض الأمينية 393 و 363 كما هو مبين في الشكل 4 أ. تم تحليل موقع بروتين WT1 عن طريق التألق المناعي. كان موقع WT1 في خلايا podocytes في عينات الكلى من الفئران المعالجة بـ LPS هو السيتوبلازم بشكل أساسي ، بينما في الخلايا البودوسية من عينات التحكم ، كان الموقع غير واضح (الشكل 4 ب).

الشكل 4. الفسفرة وتوطين Wilms'tumor I (WTI) في عينات الكلى المأخوذة من الفئران المعالجة بالسكريات الدهنية.ج: تلطيخ كيميائي مناعي للفوسفور (p) - WTI يظهر زيادة في الفسفرة في سيرين 393 و 363 ابتداءً من 12 ساعة بعد إعطاء LPS (التكبير 100 × على المجهر الضوئي). ب: توطين WTI عن طريق التألق المناعي في الكلى. أمثلة توضح توطين نووي ثانوي لـ WT1 (مربعات) 36 ساعة بعد إعطاء عديدات السكاريد الدهنية (التكبير 40 × على المجهر متحد البؤر). DAP1: 4 ، 6- Diamidino -2- فينيليندول.

تعديل التعبير عن WTI و nephrin في الكلى من الفئران المعالجة بـ LPS. يؤثر موقع WT1 في الخلية على نشاطها البيولوجي. تم الإبلاغ عن أن WT1 السيتوبلازمي لا يمارس نشاط النسخ ؛ لهذا السبب ، تم تحليل التعبير عن WT1 و nephrin mRNA بواسطة PCR في عينات الكلى من الفئران المعالجة بـ LPS (الشكل 5A). أشار PCR إلى انخفاض في nephrin mRNA من 24 إلى 48 ساعة ، مع زيادة 72 ساعة (الشكل 5B) ) ، بينما زاد التعبير عن WTI mRNA في 12 ساعة ثم انخفض بعد ذلك خلال الساعات الحرجة من الالتهاب وتلف الكلى (24 و 36 ساعة) و (الشكل 5 ب).

الشكل 5. تحليل nephrin (NPHS1) و Wilms'tumor 1 (WT1) تعبير مرنا.ج: في تحليل تعبير mRNA ، انخفض NPHSI و WTI في 24 و 36 و 48 ساعة بعد تحريض الالتهاب الجهازي باستخدام عديد السكاريد الدهني. ب: القياس الكمي للنطاقات الموضحة في A عن طريق قياس الكثافة وتوحيدها بالتعبير عن glyceraldehyde 3- نازعة هيدروجين الفوسفات.

إإكسبلنتس الكلى المعالجة بـ TNFa و IL1 يعدل التعبير عن WTI و nephrin. لتحديد ما إذا كانت السيتوكينات تعدل التعبير عن WT1 ، تمت زراعة النباتات المستأصلة الكلوية ومعالجتها باستخدام السيتوكينات TNFa و IL1 لمدة 6،12 و 24 ساعة لتحليل التعبير عن WT1 و nephrin بواسطة PCR. انخفض تعبير Nephrin mRNA وزاد تعبير WTI mRNA في 24 ساعة في إإكسبلنتس الكلوية المعالجة بـ TNFa و ILlb (الشكل 6).

الشكل 6 تحليل التعبير عن nephrin (NPHS1) و Wilms'tumor 1 (WT1) مرنا في إإكسبلنتس الكلى.ج: مستويات تعبير mRNA لـ NPHSi و WTI في أوقات مختلفة في إإكسبلنتس كلوي تتعرض لـ 10 نانوغرام / مل من عامل نخر الورم ألفا (TNF) ، و 20 nglml من إنترلوكين 16 (IL16) ب: التعبير النسبي الذي تم الحصول عليه باستخدام تحليل قياس الكثافة منتج إشارة. تم قياس كمية العصابات بالتطبيع مع 3- نازعة هيدروجين الفوسفات.

توطين WTI في إإكسبلنتس الكلى عن طريق التألق المناعي. لتحديد ما إذا كان TNFa و IL مسئولين عن التغيير في توطين بروتين WT1 ، تم علاج إإكسبلنتس الكلى للفأر باستخدام TNFa و L1 و LPS لمدة 24 ساعة. في إإكسبلنتس تعامل مع ILlb و LPS ، كان توطين النواة / السيتوبلازم لبروتين WTl واضحًا ، وفي النباتات المستأصلة المعالجة بـ TNFa ، لوحظ توطين السيتوبلازم لبروتين WT1 ؛ وفي الوقت نفسه ، في الضوابط غير المعالجة ، لوحظ توطين نووي بشكل أساسي لـ WT1 (الشكل 7).

الشكل 7. توطين بروتين Wilms'tumor 1 (WTI) عن طريق التألق المناعي باستخدام Red TX (WT1) و 4 '، 6- ديميدينو -2- فينيل إندول (DAPI) (نواة) في خلايا بودوسيت من إكتشافات الكلى المعالجة باستخدام l 0 نانوغرام / مل من عامل نخر الورم ألفا (TNFa) ، و 20 نانوغرام / مل من إنترلوكين 16 (L1B) ، وعديد السكاريد الدهني (LPS).تم تقليل التوطين النووي لـ WTas الموضح في النباتات المستأصلة المعالجة بـ TNFa مقارنة بالتوطين النووي / السيتوبلازمي لـ WTI تحت علاجات IL1 و LPS. التكبير ، 40 ×.

انقر هنا للجزء Ⅱ