جزء Ⅰ مخلب الحديد ، PBT434 ، ينظم الاتجار بالحديد عبر الخلايا في الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ

خلاصة

الحديد والمعادن الانتقالية الأخرى ، مثل النحاس والمنغنيز ، ضرورية لدعم وظائف المخ ، ولكن الإفراط في التراكم هو سام للخلايا. هذا التراكم المفرط للمعادن ، وخاصة الحديد ، شائع للعديد من الاضطرابات العصبية. وتشمل هذه مرض الزهايمر ، ومرض باركنسون ، وترنح فريدريك ، وغيرها من الاضطرابات التي تظهر مع التنكس العصبي وتراكم الحديد في الدماغ المرتبط به. توفر إدارة تدفق الحديد بواسطة الحاجز الدموي الدماغي خط الدفاع الأول ضد التراكم المفرط للحديد في الفسيولوجيا الطبيعية وهذه الحالات المرضية. في هذه الدراسة ، قررنا أن خالب الحديد PBT434 ، الذي يتم تطويره حاليًا لعلاج مرض باركنسون وضمور الأجهزة المتعددة ، ينظم امتصاص الحديد بواسطة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري (hBMVEC) عن طريق إزالة معدن ثقيل من الحديد خارج الخلية.^{2 زائد}. ينتج عن علاج hBMVEC باستخدام PBT434 زيادة في وفرة النصوص لمستقبلات الترانسفيرين (TfR) والسيرولوبلازمين (Cp). تكشف تحليلات اللطخة الغربية و ELISA عن زيادة مقابلة في البروتينات أيضًا. داخل الخلية ، يزيد PBT434 من مستوى Fe القابل للاكتشاف الخيري^{2 زائد}؛ تشير البيانات إلى أن هذا Fe^{2 زائد}من الفيريتين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن PBT434 يعزز تدفق الحديد على الأرجح بسبب الزيادة في الحديدوز العصاري الخلوي ، الركيزة لمصدر الحديد ، ferroportin. يوازن PBT434 بسرعة وثنائية الاتجاه عبر حاجز الدم في الدماغ hBMVEC. تشير هذه النتائج إلى أن مركب الحديد PBT 434- ليس ركيزة لامتصاص hBMVEC وبالتالي يدعم نموذجًا يمكن أن يخلب فيه PBT434 الحديد الخلالي ويمنع إعادة امتصاص الحديد بواسطة الخلايا البطانية للحاجز الدموي الدماغي ، مثل وكذلك تمنع امتصاصه من قبل الخلايا الأخرى للوحدة العصبية الوعائية. بشكل عام ، يقدم هذا آلية جديدة وواعدة لاستخلاب الحديد العلاجي.

انقر هنا للحصول علىما هي فوائد Cistanche

مقدمة

لطالما استخدم العلاج باستخلاب المعادن (MCT) كعلاج للتسمم المعدني الانتقالي وللاضطرابات الوراثية في استقلاب أيون معدني أساسي يؤدي إلى تراكم المعدن المفرط [1-3]. مثالان على هذا الأخير هما التراكم المفرط للنحاس في مرض ويلسون [4] والحديد في داء ترسب الأصبغة الدموية الوراثي [5]. يعتبر كل من النحاس والحديد من العوامل المحفزة للإجهاد التأكسدي وبالتالي فهي سامة للخلايا بتركيزات تتجاوز قدرة الخلية والكائن الحي على "الإشراف" على هذه المعادن الانتقالية النشطة للأكسدة [٦ ، ٧]. تراكم الحديد ، على وجه الخصوص ، مجهول السبب على نطاق واسع ؛ في الواقع ، زيادة الحديد هي السمة المميزة لشيخوخة الدماغ [8-10]. من الناحية المرضية ، يعتبر تراكم الحديد في الدماغ سمة من سمات الطفرات في الجينات التي لا علاقة لها باستقلاب الحديد [11-15] بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية الأخرى ، وبعضها يفتقر إلى ارتباط وراثي محدد مثل الشيخوخة [16] ، ومرض الزهايمر [ 17] ، ترنح فريدريك [18] ومرض باركنسون [19]. كمجموعة ، يمكن اعتبار هذه الاضطرابات على أنها تنكس عصبي مع تراكم الحديد في الدماغ (NBIA) على الرغم من أن هذا الاختصار عادةً ما يقتصر على تلك التي تم تحديد ارتباط جيني لها [11 ، 13 ، 14].

في حالة الحمل الزائد للحديد ، فإن الهدف هو "تطهير" الجسم من الحديد الزائد بسبب خلل في امتصاص الحديد الخلوي أو تدفقه. والهدف هنا هو التنافس مع المستخلبات الفسيولوجية للحديد مع العقار ؛ الدواء المستهدف هو المركب الذي يحتوي على حركية دوائية جيدة وقابلية عالية للحديد الحديدية. نظرًا لأن الجسم مليء بالمعدن الأساسي ، فلا داعي للقلق بشأن إحداث نقص في مسار العلاج. يتطلب علاج أمراض المخ باستخدام العلاج باستخلاب الحديد استراتيجية مختلفة. هذه ليست مشكلة الحمل الزائد النظامي للحديد ، ولكن مشكلة تراكم الحديد في مناطق علم الأمراض مع الأضرار الناتجة عن مجرى النهر. تراكم الحديد المرتبط بالعمر في مرض باركنسون (PD) ، على سبيل المثال ، يحتمل أن يساهم في الضرر الخلوي المرتبط بالإجهاد التأكسدي [20]. يعزز الحديد المتغير المفرط اختلال السينوكلين في الخلايا العصبية السوداء. قد يؤدي استخدام خالب عالي التقارب إلى بعض الانخفاض في حمل الحديد في الدماغ ، ولكنه سيؤدي بالتأكيد إلى نقص الحديد الذي يكون بطلانًا عند كبار السن ، على الأقل ، نظرًا لنقص الحديد الجهازي الشائع في تلك الفئة العمرية [21] . يتمتع المخلب ذو التقارب الأمثل بالقدرة على تقليل تراكم الحديد بالإضافة إلى الإجهاد التأكسدي المصاحب بسبب زيادة الحديد المتقطع والعمليات المرضية الكامنة.

Cistanche tubulosaوآثار Cistanche

أحد المخالب المعتمد للاستخدام في علاج الحمل الزائد للحديد الناجم عن نقل الدم في مرضى الثلاسيميا هو ديفيريبرون (DFP ، الاسم التجاري فيريبروكس) [5 ، 22]. كما تم استخدام DFP في علاج ترنح فريدريك [23] ومرض باركنسون [24 ، 25]. في التحليل التلوي ، ثبت أن DFP يوفر تخفيضات كبيرة في محتوى الحديد في عضلة القلب بالإضافة إلى حماية قلب أكبر في مرضى الثلاسيميا من ديفيروكسامين ، عامل مخلب الحديد الكلاسيكي [5]. من ناحية أخرى ، يتم استقلاب DFP سريعًا عن طريق الكبد [26] وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أنه يخلب Fe2 plus في الموقع النشط لنسب ميثيلاز هيستون ليسين المعتمد على الحديد ، وهو نشاط يرتبط بسمية خلوية غير معروفة سابقًا [27]. تؤكد هذه النتيجة وجود قيود رئيسية في استخدام العلاج باستخلاب الحديد ، أي التنافس من قبل الدواء على الحديد الضروري من الناحية الفسيولوجية ، سواء في مخزن الحديد أو البروتين الذي يؤوي نوعًا من الحديد الاصطناعي. ومع ذلك ، فقد أظهر DFP ، على سبيل المثال ، فعالية في المرحلة الثانية من العلاج التجريبي لمرض باركنسون كما هو مبين في كل من المؤشرات التحليلية (انخفاض حمل الحديد في الدماغ بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي T 2-) والمؤشرات السلوكية (وظيفة الخلايا العصبية الإدراكية والحركية) [ 24 ، 25].

ومع ذلك ، يظل تقارب DFP مع Fe3 plus مصدر قلق. أنواع الحديد DFP المستقرة هي مركب tris ، [Fe (DFP) 3] 0 [28]. في حين أن حيادية هذا المركب مثالية لتعبئة الحديد خارج الخلية ، فإن ثابت الاستقرار لها ، ~ 1037 ، يجعل DFP زبالًا حقيقيًا للحديد ؛ في هذا السياق ، يمكن التنبؤ بتثبيطه لإنزيم الحديد مثل ليسين ديميثيلاز [27]. يعكس هذا القلق الحاجة إلى تطوير مخلبات الحديد التي لها نفاذية غشاء DFP ولكن تقارب أضعف بكثير لكل من Fe2 plus و Fe3 plus. تحد هذه الميزة الأخيرة من مسح العقاقير للمعدن الاصطناعي والإمكانات الديناميكية الحرارية للعامل المخلب لتحفيز الأكسدة التلقائية للحديد الحديدية التي تؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. في الأساس ، تحفز مخالب الحديد القوي الخاصية المؤيدة للأكسدة لـ Fe2 plus [29]. في هذه الدراسة ، قمنا بالإبلاغ عن كيف أن مثل هذا المخلب الحديدي مع تقاربات معتدلة من الحديد والحديد الحديدية يعدل تدفق الحديد في الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة التي تشكل الحاجز الدموي الدماغي (BBB).

حبوب Cistanche

هذا الدواء ، PBT434 [5 ، 7- dichloro -2- ((methylamino) methyl) -8- hydroxy -3- methylquinazolin -4 (3H) -one ، Fig 1A] ، يشكل معقدًا مكررًا من الحديد مع ثوابت استقرار اللوغاريتمات ~ 11 و ~ 15 للحديد^{2 زائد}و Fe^{3 زائد}، على التوالي [30]. منع PBT434 فقدان الخلايا العصبية المكونة من nigra pars Compacta (SNPC) ، وخفض تراكم السينوكلين ، وخفض محتوى الحديد المرتبط بنموذج مرض PD في الدماغ المتوسط ​​، وإنقاذ الأداء الحركي في نموذجين من الفئران لمرض باركنسون دون أي استنفاد واضح لمخازن الحديد النظامية [30]. يعتبر PBT434 فعالًا أيضًا في النماذج الفأرية لضمور الجهاز المتعدد (MSA) [30 ، 31] ، وهو اضطراب حركي مشابه في العرض لمرض باركنسون ولكنه يتميز بخلل في تكوين السينوكلين والتراكم اللاحق مما يتسبب في تكوين شوائب السيتوبلازم الدبقية التي هي السمة المميزة علم أمراض المرض [32]. بشكل ملحوظ ، قلل PBT434 علامات الإجهاد التأكسدي في نماذج PD للفأر [30] مما يشير إلى أن 1) PBT434 يستهدف مخازن الحديد التي كانت مهيأة لتعمل كمواد مؤكسدة و 2) PBT434 لم تحفز هذه السمية الخلوية الناشئة القائمة على الأكسدة. أكمل PBT434 دراسة المرحلة الأولى بشكل مرضٍ [33].

تم تصميم العمل المقدم هنا لاستجواب تأثير PBT434 على تهريب الحديد في الخلايا الحاجزة للدماغ ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة التي تشكل مع الخلايا الدبقية الكامنة الحاجز الدموي الدماغي. استخدمت هذه الدراسات خطًا خلويًا بطانيًا تم التحقق من صحته جيدًا في كلٍ من تنسيقات الثقافة أحادية الطبقة والمتحولة [34-37]. كان الهدف الأساسي من هذه الدراسات هو تحديد حركية امتصاص الحديد وتدفقه من هذه الخلايا وتعديلها بواسطة PBT434. تم استخدام نموذج transwell BBB أيضًا لإثبات التدفق عبر الخلايا PBT434 ثنائي الاتجاه عبر حاجز الخلايا البطانية. أظهر النموذج من الناحية الجزيئية أن PBT434 يثبط امتصاص الحديد عن طريق عملية إزالة معدن ثقيل بينما يحفز تدفق الحديد. تشير دراسات التصوير الخلوي إلى أن PBT434 يصل إلى نفس مجموعة الحديد القابلة للتغير التي يتم فحصها بواسطة Fe الكلاسيكي^{2 زائد}عامل مخلب ، 2،2'-bipyridine أو bipyridyl ، ومسبار فلورسنت للحديد الحديدية. تشير النتائج إلى آلية عمل محتملة لـ PBT434 تتضمن تثبيط امتصاص الحديد النظامي في BBB ، وعزل الحديد في الدماغ لاحقًا في الفراغ الخلالي.

نتائج

1. ليس لـ PBT434 تأثيرات سامة للخلايا على خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ

لتحديد نطاق مناسب من تركيزات العمل لـ PBT434 في ثقافة الخلايا المختبرية لدينا ، استخدمنا اختبار MTT لمراقبة وظيفة الميتوكوندريا hBMVEC استجابة لـ PBT434. بناءً على التقارير السابقة [30] ، تم علاجها بمدى من تركيزات PBT434 تصل إلى 100 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. لم نلاحظ أي تغييرات كبيرة في قابلية hBMVEC مع أي تركيز تم اختباره (الشكل 2).

2. يتم تناول PBT434 بسرعة وتداوله عبر حاجز hBMVEC

PBT434 هو دواء متوفر بيولوجيًا عن طريق الفم يمكنه اختراق BBB بسهولة ، كما يتضح من الدراسات التي أجريت على الفئران والبشر [30 ، 38 ، 39]. راقبنا تراكم PBT434 في hBMVEC المزروع في طبقات أحادية باستخدام PBT434 المسمى 14C كجهاز تعقب إشعاعي. أشارت البيانات إلى أنه في المرحلة الأولى ، تمت معايرة 14C-PBT434 بسرعة بين وسط الامتصاص والخلية. أعقب هذا الامتصاص الأولي تراكم بطيء إضافي على مدى 3 ساعات أظهر معدل 30.1 ± 9.8 pmol / mg / h (الشكل 3 أ). في بروتوكول الامتصاص ، يتم إخماد الامتصاص وغسل الخلايا عند 4 درجات مئوية قبل المعالجة لتراكم 14C-PBT434 (طرق). في تجربة منفصلة ، قمنا بفحص تدفق 14C-PBT434 من hBMVEC بعد فترة تحميل تبلغ 30 دقيقة. في بروتوكول التدفق ، يتم غسل الخلايا عند 25 درجة مئوية. تشير البيانات الواردة في الشكل 3 ب إلى أنه في غسيل 25 درجة مئوية ، فقد ما يقرب من 92 في المائة من 14C-PBT434 المتراكم بالخلايا (cf 550 pmol 14C-PBT434 / mg بروتين في 3A عند 30 دقيقة إلى 43 pmol 14C-PBT434 / mg بروتين في تي=0 في 3B). كان هناك مزيد من الخسارة البطيئة لما تبقى من 14C-PBT434 (الشكل 3 ب). تشير البيانات إلى جانبين من جوانب تراكم وتدفق PBT434 بواسطة hBMVEC. يصل التدفق عبر غشاء البلازما بسرعة إلى ما يبدو أنه توازن سواء أثناء الامتصاص أو التدفق. ومع ذلك ، في كلتا العمليتين ، تظهر عملية أخرى أبطأ. يشير هذا إلى أنه داخل الخلية ، يكون جزء من الخلية PBT434 في موقع / حالة في علاقة حالة ثابتة حركية مع الكسر في حالة توازن مع البيئة خارج الخلية. قدّر التحليل الحركي الموضح في الشكل 3 ب أن مجموعة PBT434 هذه تم تمثيلها بـ 27 ± 4 pmol / mg بروتين في محللة الخلية عندما عولجت الخلايا بكاشف 20 ميكرومتر.

لفحص التدفق عبر الخلايا لـ PBT434 ، استخدمنا نموذج BBB في المختبر تم التحقق من صحته جيدًا باستخدام نمت على الجانب القمي من غشاء transwell [35 ، 36 ، 40 ، 41]. تم التحقق من خصائص الحاجز لهذه الثقافات transwell عن طريق القياس الكمي لمقاومتها الكهربائية عبر البطانة (TEER) وعدم نفاذية ديكستران المسمى FITC (S1 الشكل). قارنا امتصاص 14C-PBT434 في الجانب اللمعي (أو القمي ، الدم) (الشكل 4 أ) لامتصاص الغشاء اللمعي (أو الجانب السفلي من الدماغ) (الشكل 4 ج). في نفس التجربة ، تم قياس التدفق المقابل (التدفق عبر الخلايا) من خلال ظهور 14C-PBT434 في غرفة التدفق (الشكل 4 ألواح B و D). يتم توفير معدلات هذه العمليات في الجدول 1. توضح بيانات الكتلة الموضحة في الشكل 4 (اللوحات B و D) أن التدفق الصافي لـ PBT434 عبر هذا الحاجز الدموي الدماغي النموذجي كان هو نفسه في الاتجاهين. كان هناك 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 المتراكمة في الغرفة القاعدية (الشكل 4B) و 1033 ± 210 pmol كميًا في الغرفة القاعدية (الشكل 4D). انعكس هذا التكافؤ القريب أيضًا في المعدلات المتشابهة جدًا لتدفق PBT434 في أغشية الحاجزين (الجدول 1). ومع ذلك ، كان هناك امتصاص أكبر بكثير لـ PBT434 في الغشاء الجانبي في نموذج الحاجز هذا كما هو موضح في خسارة المركب بنسبة 50 بالمائة تقريبًا من الغرفة القاعدية (الشكل 4 ج) والتي تتوافق مع معدل أكبر بنسبة 40 بالمائة تقريبًا من امتصاص الخلية الظاهر (الجدول 1). من المتوقع أن يؤدي امتصاص أكثر قوة إلى تراكم أكبر. أظهر تحليل الخلايا عند 3 ساعات أنها احتفظت بـ 6 ميكرومتر من PBT434 بغض النظر عن اتجاه التدفق. كانت القيم 8.1 ± 1.3 ميكرومتر (قمي إلى القاعدية) و 4.7 ± 1.2 ميكرومتر (القاعدية إلى القمية). كما هو مذكور أعلاه ، يتبع هذا التحليل غسل الخلايا قبل التحلل وتحديد كمية بروتين الخلية الكلي و 14C-PBT434. بالإضافة إلى ذلك ، احتوى الوسط الموجود في الحجرة القمية على RPMI بالإضافة إلى 10 بالمائة FBS و 10 بالمائة NuSerum بينما احتوت غرفة "الدماغ" القاعدية على RPMI (الطرق) فقط. كان الاستدلال المنطقي هو أن `` الامتصاص '' الأكبر في الغشاء القاعدي يعكس امتزاز سطح الخلية لـ PBT434 الذي كان محدودًا في الغرفة القمية بسبب وجود مكونات البروتين في المصل. عند غسل الخلايا لتراكم PBT434 ، تمت إزالة هذه المادة الممتصة (التي تم تسجيلها على أنها "امتصاص"). أظهر تكرار تجربة التدفق هذه ولكن مع المصل في الغرفة القاعدية أن المصل قد كبح بالفعل امتصاص سطح الخلية المحتمل PBT434 (الشكل S2).

3. PBT434 ، على عكس bipyridyl ، لا يحد من التوافر داخل الخلايا للحديد القابل للشفاء

نظرًا لأن PBT434 له تقارب أكثر اعتدالًا للحديد مقارنة بمخالب الحديد الكلاسيكي مثل deferiprone أو bipyridyl ، فقد درسنا كيف انعكس هذا الاختلاف في تأثير PBT434 على تجمع الحديد الخلوي (LIP) لـ hBMVEC. للقيام بذلك ، استفدنا من نفاذية Fe^{2 زائد}- صبغة فلورية محددة FerroOrange ، والتي تتفاعل مع الحديد السيتوبلازمي الخيري. لقد رأينا استئصالًا كبيرًا للفلورة في الخلايا عند معالجتها باستخدام bipyridyl ، بما يتوافق مع عملية إزالة معدن ثقيل من LIP بواسطة مخلب الحديد الحديدي عالي التقارب وبالتالي منع عمل مؤشر الحديد الفلوري (الشكل 5 أ). في المقابل ، لم يتنافس PBT434 مع FerroOrange للحديد^{2 زائد}، وهو سلوك يتفق مع تقاربها الأكثر اعتدالًا [30]. أظهرت النتائج أن PBT434 ، ولكن ليس PBT 434- قابل مشتقًا غير نشط ، تسبب في زيادة بنسبة 34 ± 9 في المائة في FeroOrange الذي يمكن الوصول إليه.^{2 زائد}مما يشير إلى أن هذا العامل المخلب يعبئ الحديد داخل الخلية دون سمية متزامنة. تشير البيانات الواردة أدناه إلى أن هذا الحديد جاء من الفيريتين.

تم عرض PBT434 سابقًا لاستعادة تعبير بروتين ferroportin المستنفد في الفئران المعالجة بـ MPTP إلى مستوى مشابه لمستوى الفئران غير المتحدثة [30]. هذه النتيجة ، جنبًا إلى جنب مع الزيادة في تلطيخ الحديدوز داخل الخلايا استجابةً لـ PBT434 ، اقترحت تأثيرًا محتملاً على نظام استجابة الحديد الخلوي ووظيفة البروتينات المرتبطة بالحديد في مجرى النهر. لتقييم ذلك ، أجرينا أولاً تحليلًا كميًا لـ PCR (qPCR) لتأثير PBT434 على وفرة النصوص للعديد من بروتينات معالجة الحديد (الشكل 6). بينما لم تتأثر النصوص الخاصة ببروتين تدفق الحديد ، ferroportin (Fpn) ، ومرافقي الحديد السيتوبلازمي ، PCBP1 و 2 ، فإن وفرة mRNAs لمستقبلات الترانسفيرين (TfR) ، و ferroxidase ، سيرولوبلازمين (Cp) ، لم تتأثر يتغير. زادت نصوص TfR و Cp بمقدار 2.8 و 3. 6- ضعفًا ، على التوالي. يرتبط تعبير مستقبل الترانسفيرين (TfR) بالعنصر المستجيب للحديد (IRE) / نظام البروتين التنظيمي للحديد (IRP) [42-44]. تشير الزيادة في TfR mRNA إلى أن PBT434 يتنافس مع PCBP 1- التسليم المعتمد للحديد لتجميع مجموعة Fe، S الذي يحول IREBP التنظيمي من بروتين رابط RNA إلى aconitase عصاري خلوي [45]. وبالتالي ، يحول PBT434 هذا التعديل التنظيمي نحو ربط RNA والتثبيط المقابل لتدهور TfR mRNA. في نقص الحديد الخلوي ، يتم تنظيم تعبير Cp جزئيًا بواسطة HIF -1 [46]. تأتي الزيادة في وظيفة HIF -1 نتيجة هدم عملية التحلل بالهيدروكسيل بواسطة نشاط هيدروكسيلاز البرولايل في تفاعل يعتمد على الحديد [47]. كما في حالة IREBP ، يبدو أن PBT434 يقلل من تجمع الحديد الذي يعمل كعامل مساعد في HIF -1 هيدروكسيل وتدهور. في هذا النموذج ، تؤدي الزيادة في مستوى الحالة المستقرة لمنشط النسخ هذا إلى زيادة نسخ Cp.

باستخدام مزيج من تحليل ELISA والنشاف الغربي ، قمنا بفحص التعبير عن بروتينات معالجة الحديد في PBT434 أو PBT 434- مع hBMVEC المعالج ؛ ترد أمثلة لتحليلات WB في الشكل 7 أ. أظهرت البيانات زيادة كبيرة في وفرة مونومر TfR و dimer بمقدار 24 ساعة كما كان Cp (الشكل 7B و 7C). تزامنت الزيادتان مع الزيادة المعتمدة على PBT 434- في النصوص المعنية (الشكل 6) ، في المقابل ، كان التعبير عن بروتين تدفق الحديد ، Fpn ، غير حساس لمعاملة PBT434 (الشكل 7 د).

استخدمنا ELISA كطريقة إضافية لتحديد تغييرات الطيات المشار إليها بواسطة بيانات اللطخة الغربية. وهكذا ، عولجت hBMVEC بـ PBT434 لمدة 24 ساعة وتم اختبار محللات الخلية بواسطة ELISA لـ TfR (الشكل 8 أ). كانت زيادة أضعاف في TfR استجابةً لعلاج PBT434 التي تم تحديدها بواسطة ELISA مكافئة لتلك المقدمة من خلال تحليل البقع الغربية (الشكل 7 ب). تم استخدام ELISA أيضًا لتقييم وفرة بروتين Cp المرتبط بـ GPI ، باستخدام خلايا HepG2 كعنصر تحكم إيجابي. فيما يتعلق بـ Cp الذي تم إفرازه في وسائط النمو ، كان هذا النهج محدودًا في وفرة sCp في كل من الوسائط المكيفة HepG2 و hBMVEC كانت عند أو أقل من الحد الأدنى للحساسية لهذا الفحص (S3 الشكل). ومع ذلك ، فقد مكنت من تقييم وفرة GPI-Cp. في هذه الطريقة ، عولجت الخلايا باستخدام فسفوليباز سي الخاص بالفوسفاتيديلينوسيتول (PI-PLC) ، والذي يشق مرساة GPI ؛ تم تركيز الوسائط التي تم تكييفها وتحليلها بواسطة Cp-ELISA. بينما أظهر هذا النهج أن PBT434 زاد من كمية GPI-Cp في خلايا HepG2 ، إلا أنه فشل مرة أخرى في اكتشاف أي Cp تم إصداره بواسطة PI-PLC (الشكل 8 ب). أتاحت ELISA أيضًا طريقة مباشرة لتقدير كمية الفيريتين. للقيام بذلك ، تم تحميل hBMVEC بـ 1 ميكرومتر Fe-citrate لمدة 24 ساعة ، متبوعًا بالمعالجة في غياب أو وجود PBT434 لمدة ساعة إضافية. خضعت محللات الخلايا الناتجة لتحليل ELISA للفيريتين (الشكل 8C). على عكس الزيادة في TfR ، فقد أدى العلاج بـ PBT434 إلى تدمير بروتين الفيريتين (Ft) بنسبة 18 في المائة تقريبًا. في الواقع ، كان فقدان بروتين Ft واضحًا بعد ساعة واحدة فقط من العلاج بالكاشف. يمكن ربط الطبيعة الزمنية لهذه النتيجة بالزيادة في الأعمال الخيرية Fe2 زائد المذكورة أعلاه بعد 30 دقيقة من العلاج باستخدام PBT434. كما تمت مناقشته لاحقًا ، فقد تم إثبات ضربة قاضية للفيريتين بعد العلاج باستخدام Fe2 المنفصل للخلايا بالإضافة إلى عوامل مخلبية [48].

4. ⁵⁵الحديد^{2 زائد}يتم منع الامتصاص عن طريق التعقيد باستخدام PBT434

بالنظر إلى الموازنة السريعة لـ PBT434 في hBMVEC في غضون 30 دقيقة ، مقارنةً بالامتصاص البطيء ثنائي الطور والموازنة لـ Fe2 بالإضافة إلى 24 ساعة [49] ، افترضنا أن PBT434 و Fe2 plus لا يشتركان في نفس آلية الامتصاص. لاختبار ذلك ، تم تحضين الطبقات الأحادية بعلامة إشعاعية 55Fe2 plus في غياب أو وجود PBT434 أو PBT 434- ، وتمت مراقبة 55Fe2 بالإضافة إلى امتصاص أكثر من 3 ساعات (الشكل 9 أ). قلل PBT434 بشكل كبير من معدل امتصاص 55Fe2 بالإضافة إلى تقليل التراكم الكلي لـ 55Fe2 plus في محللات الخلية (الشكل 9C). لم يتم رؤية هذا التأثير مع تحقيق PBT 434-. تشير مقارنة معدلات PBT434 إلى 55Fe-uptake إلى أن PBT434 و Fe2 plus يتم تناولهما بواسطة مسارات نقل منفصلة. علاوة على ذلك ، فإن تثبيط امتصاص 55Fe في وجود PBT434 ولكن ليس PBT 434- التقى يشير إلى أن مركب الحديد PBT 434- خارج الخلية ليس رابطًا لناقلات الحديد الحديدية في hBMVEC ، وبالتحديد ZIP8 ، و ZIP14.

مكملات Cistanche

لمزيد من فحص دور PBT434 في تراكم الحديد ، اختبرنا تأثير تعرضه المسبق على امتصاص 55Fe2 plus. أظهرت الخلايا المعالجة مسبقًا بـ PBT434 والتي تعرضت ، بعد الغسيل ، لـ 55Fe2 بالإضافة إلى زيادة في معدل الامتصاص والتراكم لـ 55Fe2 plus بعد 3 ساعات (الشكل 9 ، اللوحات B و D). تم الحفاظ على هذا التراكم المتزايد لمدة 24 ساعة على الأقل. تشير هذه البيانات إلى أن التعرض المسبق للخلايا لـ PBT434 يزيد بشكل عابر من امتصاص الحديد. بشكل غير متوقع ، أظهرت PBT 434- التي تمت معالجتها مسبقًا أيضًا زيادة في كل من الامتصاص والتراكم (الشكل 9 ب) ، ولكن هذا التأثير لم يكن كبيرًا أو ثابتًا كما هو موضح بواسطة PBT434.

لقد أظهرنا أن امتصاص الحديد من 59Fe-transferrin مدعوم باختزال ferri والتخلل الحديدي في غشاء البلازما لـ have [50 ، 51]. كانت إحدى النتائج التجريبية لدعم نموذج امتصاص الحديد TBI هي ضربة قاضية لهذا الامتصاص عن طريق تثبيط نشاط ferrireductase خارج السيتوبلازم. وكانت النتيجة الأخرى هي تثبيط 60٪ من امتصاص الحديد TBI بواسطة ferrozine ، وهو عامل مخلب قوي للحديد الحديدية [50]. تم استخدام هذه الاستراتيجية الأخيرة لإثبات أن PBT434 ، ولكن ليس PBT 434- قد استوفى ، كما منع امتصاص الحديد TBI (الشكل 10).

5. PBT434 يحفز 55Fe2 المعتمد على Fpn بالإضافة إلى التدفق

يمتلك PBT434 ما يقرب من 20 بالمائة من قدرة ديفيريبرون على إنتاج تحفيز واضح لـ Fe2 بالإضافة إلى تدفق من الخلايا العصبية [30]. قمنا بتقييم تدفق 55Fe2 plus من hBMVEC في غياب أو وجود PBT434 في خلايا التحكم أو الخلايا المعالجة بـ mini-hepcidin ، PR73. Hepcidin هو هرمون ببتيد موجود بشكل منهجي وفي النسيج الخلالي في الدماغ والذي يرتبط بـ Fpn ويستهدف الناقل للتحلل. تمت دراسة تأثيرات الهيبسيدين على وظيفة تصدير الحديد لـ Fpn على نطاق واسع [52-54]. لقد أظهرنا سابقًا أن تدفق Fe2 plus من hBMVEC يعتمد على Fpn [35 ، 49]. PR73 لديه EC50 ~ 4 نانومتر لتدهور Fpn في مقايسة مراسل GFP [55]. تم تحميل hBMVEC في الطبقات الأحادية بـ 55Fe2 plus لمدة 24 ساعة في غياب أو وجود PR73. تم بعد ذلك قياس كمية التدفق 55Fe-flow خلال فترة 5 ساعات في ظل استمرار غياب أو وجود PR73 بالاقتران مع غياب ووجود PBT434 (الشكل 11). في حين أنهى PR73 تدفق 55Fe من كل من الثقافات المعالجة و PBT 434- ، قام PBT434 بقمع التثبيط جزئيًا بسبب الهيبسيدين المصغر. في غياب PBT434 ، انخفض تدفق الحديد من الثقافات المعالجة بالـ PR 73- بنسبة 75٪ تقريبًا بينما كانت الضربة القاضية في الثقافات المعالجة بـ PBT 434- تقريبًا ~ 50٪ (الشكل 11 والجدول 2). يمكن استنتاج اثنين من هذه النتائج. أولاً ، تؤدي ضربة قاضية لـ Fpn بواسطة PR73 إلى تنظيم تدفق 55Fe في وجود وغياب PBT434. ثانيًا ، في كلتا الحالتين ، يدعم PBT434 تحفيزًا كبيرًا وإن كان صغيرًا لتدفق الحديد.

مراجع

1. Hatcher HC، Singh RN، Torti FM، Torti SV. مخلبات الحديد الاصطناعية والطبيعية: الإمكانات العلاجية والاستخدام السريري. المستقبل ميد كيم. 2009 ؛ 1 (9): 1643–70.

2. Nuñez MT، Chana-Cuevas P. وجهات نظر جديدة في العلاج باستخلاب الحديد لعلاج الأمراض العصبية التنكسية. الأدوية (بازل). 2018 ؛ 11 (4): 109.

3. Tosato M ، Di Marco V. العلاج باستخلاب المعادن ومرض باركنسون: مراجعة نقدية للديناميكا الحرارية للتكوين المعقد بين أيونات المعادن ذات الصلة والأدوية الواعدة أو الراسخة. الجزيئات الحيوية. 2019 ؛ 9 (7).

4. Hedera P. تحديث على الإدارة السريرية لمرض ويلسون. أبل كلين جينيت. 2017 ؛ 10: 9-19.

5. شيا إس ، تشانغ دبليو ، هوانغ إل ، جيانغ هـ. الفعالية المقارنة ومأمونية الديفيروكسامين ، ديفيريبرون وديفيراسيروكس على الثلاسيميا الوخيمة: تحليل تلوي لـ 16 تجربة معشاة ذات شواهد. بلوس واحد. 2013 ؛ 8 (12): e82662.

6. Buettner GR ، Jurkiewicz BA. المعادن المحفزة ، الأسكوربات ، والجذور الحرة: تركيبات يجب تجنبها. رديات ريس. 1996 ؛ 145 (5): 532–41. PMID: 8619018

7. سينغ أ ، كوكريتي آر ، ساسو إل ، كوكريتي إس الإجهاد التأكسدي: عامل رئيسي في الأمراض العصبية التنكسية. جزيئات. 2019 ؛ 24 (8).

8. أشرف أ ، كلارك إم ، إذن بي دبليو. شيخوخة الرجل الحديدي. الشيخوخة الأمامية العصبية. 2018 ؛ 10:65.

9. غادري سي ، بيربامير إل ، هوفر إي ، لانجكامر سي ، بتروفيتش ك ، لويتفيلدر إم ، وآخرون. R2 * رسم خرائط لحديد الدماغ: الارتباط بالإدراك في الشيخوخة الطبيعية. الشيخوخة نيوروبيول. 2015 ؛ 36 (2): 925-32.

10. Zecca L، Youdim MBH، Riederer P، Connor JR، Crichton RR. الحديد وشيخوخة الدماغ واضطرابات التنكس العصبي. نات ريف نيوروسسي. 2004 ؛ 5 (11): 863 - 73.

11. Di Meo I، Tiranti V. التصنيف والتسبب الجزيئي لمتلازمات NBIA. Eur J بيدياتر نيورول. 2018 ؛ 22 (2): 272–84.

12. Levi S، Finazzi D. التنكس العصبي مع تراكم الحديد في الدماغ: تحديث الآليات المسببة للأمراض. فارماكول الجبهة. 2014 ؛ 5: 99–.

13. ليفي إس ، تيرانتي ف.التنكس العصبي مع اضطرابات تراكم الحديد في الدماغ: نماذج قيّمة تهدف إلى فهم التسبب في ترسب الحديد. الأدوية (بازل). 2019 ؛ 12 (1).

14. ماير إي ، كوريان إم إيه ، هايفليك إس جيه. التنكس العصبي مع تراكم الحديد في الدماغ: التنوع الجيني وآليات الفيزيولوجيا المرضية. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015 ؛ 16: 257-79.

15. Tonekaboni SH ، Mollamohammadi M. التنكس العصبي مع تراكم الحديد في الدماغ: نظرة عامة. إيران ي طفل نيورول. 2014 ؛ 8 (4): 1-8. PMID: 25657764

16. Cozzi A و Orellana DI و Santambrogio P و Rubio A و Cancellieri C و Giannelli S et al. نمذجة الخلايا الجذعية لاعتلال الأعصاب تكشف عن الحديد كعامل محدد للشيخوخة والتهاب الخلايا الجذعية أثناء الشيخوخة العصبية. تقارير الخلايا الجذعية. 2019 ؛ 13 (5): 832–46.

17. ليو جيه إل ، فان واي جي ، يانج زد إس ، وانج زي واي ، جو سي. مرض الحديد والزهايمر: من التسبب إلى الآثار العلاجية. الجبهة العصبية. 2018 ؛ 12: 632.

18. Llorens JV، Soriano S، Calap-Quintana P، Gonzalez-Cabo P، Molto MD. دور الحديد في ترنح فريدريك: رؤى من الدراسات في الأنسجة البشرية والنماذج الخلوية والحيوانية. الجبهة العصبية. 2019 ؛ 13:75.

19. بوشمان أ. الجينات الجديدة التي تسبب مرض باركنسون الوراثي أو مرض باركنسون. مندوب Neurol Neurosci بالعملة .2017 ؛ 17 (9): 66.

20. Crielaard BJ ، Lammers T ، Rivella S. استهداف استقلاب الحديد في اكتشاف الأدوية وتسليمها. نات ريف ديسكوف المخدرات. 2017 ؛ 16 (6): 400-23.

21. Guralnik JM ، Eisenstaedt RS ، Ferrucci L ، Klein HG ، Woodman RC. انتشار فقر الدم لدى الأشخاص الذين تبلغ أعمارهم 65 عامًا أو أكبر في الولايات المتحدة: دليل على ارتفاع معدل فقر الدم غير المبرر. دم. 2004 ؛ 104 (8): 2263-8.

22. Pepe A ، Meloni A ، Capra M ، Cianciulli P ، Prossomariti L ، Malaventura C ، et al. علاج Deferasirox و deferiprone و desferrioxamine في مرضى الثلاسيميا الرئيسيين: مقارنة بين الحديد القلبي والوظائف التي تحددها التصوير بالرنين المغناطيسي الكمي. الدم. 2011 ؛ 96 (1): 41-7.

23. Pandolfo M ، Arpa J ، Delatycki MB ، Le Quan Sang KH ، Mariotti C ، Munnich A ، et al. Deferiprone في فريدريك ترنح: تجربة عشوائية محكومة لمدة {{1} شهر. آن نيورول. 2014 ؛ 76 (4): 509–21.

24. Martin-Bastida A و Ward RJ و Newbould R و Piccini P و Sharp D و Kabba C وآخرون. استخلاب الحديد في الدماغ بواسطة ديفيريبرون في المرحلة 2 من التجارب السريرية العشوائية مزدوجة التعمية التي تسيطر عليها وهمي في مرض باركنسون. مندوب علوم .2017 ؛ 7 (1): 1398.

25. Devos D، Moreau C، Devedjian JC، Kluza J، Petrault M، Laloux C، et al. استهداف الحديد المخلّب كطريقة علاجية لمرض باركنسون. إشارة الأكسدة والاختزال المضادة للأكسدة. 2014 ؛ 21 (2): 195-210. https: // دوى. org / 10.1089 / ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S ، Epemolu RO ، Dobbin PS ، Tilbrook GS ، Ellis BL ، Damani LA ، et al. ملامح التمثيل الغذائي البولي في البشر والجرذان من 1 ، 2- ثنائي ميثيل و 1 ، 2- ثنائي إيثيل بديل 3- هيدروكسي بيريدين -4-. استقلاب الدواء والتخلص منه. 1992 ؛ 20 (2): 256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V، Tapadar S، MacDonald IA، Xu Y، Ho PY، Bridges A، et al. Deferiprone: عموم انتقائي هيستون ليسين ديميثيلاز دراسة نشاط التثبيط والهيكل النشاط. ممثل العلوم .2019 ؛ 9 (1): 4802.

28. Hider R. التطورات الأخيرة تركز على خالب الحديد النشط عن طريق الفم. تقارير الثلاسيميا. 2014 ؛ 4 (2).

29. Kosman DJ. استقلاب الحديد في الهوائيات: إدارة التحلل المائي للحديد والأكسدة التلقائية للحديد. المنسق Chem Rev. 2013 ؛ 257 (1): 210-7.

30. Finkelstein DI ، Billings JL ، Adlard PA ، Ayton S ، Sedjahtera A ، Masters CL ، et al. يمنع المركب الجديد PBT434 التنكس العصبي بوساطة الحديد وسمية ألفا سينوكلين في نماذج متعددة لمرض باركنسون. اكتا نيوروباتول كومون. 2017 ؛ 5 (1): 53.

31. هيراس-غارفين أ ، ريفولو الخامس ، شميدت سي ، برادبري إم ، ستاملر دي ، ستيفانوفا إن ، محررون. يحافظ PBT434 على الخلايا العصبية الدوبامينية ، ويقلل من قلة قلة الدم ألفا سينوكلين ، ويحسن الوظيفة الحركية في نموذج ضمور الجينات متعدد الأنظمة المعدلة وراثيًا. حوليات علم الأعصاب. 2020: شارع نهر وايلي 111 ، هوبوكين 07030-5774 ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية.

32. Heras-Garvin A، Stefanova N. MSA: من الآليات الأساسية إلى العلاجات التجريبية. مرض باركنسون ريلات ديسورد. 2020 ؛ 73: 94-104.

33. Dawson VL، Dawson TM. علاجات واعدة لتعديل المرض لمرض باركنسون. علوم الطب الانتقالي. 2019 ؛ 11 (520): eaba1659.

34. Eigenmann DE، Xue G، Kim KS، Moses AV، Hamburger M، Oufir M. دراسة مقارنة لأربعة خطوط الخلايا البطانية الشعيرية في الدماغ البشري الخالد ، hCMEC / D3 ، hBMEC ، TY10 ، و BB19 ، وتحسين ظروف الاستزراع ، من أجل نموذج الحاجز الدموي الدماغي في المختبر لدراسات نفاذية الدواء. سوائل وحواجز الجهاز العصبي المركزي. 2013 ؛ 10 (1): 33.

35. مكارثي RC ، Kosman DJ. ينظم سيرولوبلازمين الخلايا الدبقية والهيبسيدين بشكل مختلف تدفق الحديد من الخلايا البطانية الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. بلوس واحد. 2014 ؛ 9 (2): e89003.

36. Steimle BL، Smith FM، Kosman DJ. تنظم ناقلات المواد المذابة ZIP8 و ZIP14 تراكم المنجنيز في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ وتتحكم في مستويات المنغنيز في الدماغ. J بيول كيم. 2019 ؛ 294 (50): 19197–208.

37. Stins MF ، Badger J ، Sik Kim K. الغزو البكتيري و transcytosis في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري المنقولة. ميكروب الممرض. 2001 ؛ 30 (1): 19-28.

38. Stamler D، Bradbury M، Wong C، Offman E. أول دراسة بشرية لـ PBT434 ، مثبط جديد لجزيء صغير لتجمع السينوكلين (S4.001). علم الأعصاب. 2019 ؛ 92 (15 ملحق): S4.001.

39. Stamler D ، Bradbury M ، Wong C ، Offman E. A Phase 1 Study of PBT434 ، مثبط جزيء صغير جديد لتجمع السينوكلين ، لدى المتطوعين البالغين وكبار السن (4871). علم الأعصاب. 2020 ؛ 94 (15 ملحق): 4871.

40. مكارثي RC ، Kosman DJ. تفعيل تعبير سيرولوبلازمين لخلية الورم الأرومي الدبقي C6 عن طريق الإنترلوكينات المشتقة من بطانة الدماغ البشري المجاورة في نظام نموذج حاجز الدم في الدماغ في المختبر. الاتصالات الخلوية والتشوير: CCS. 2014 ؛ 12:65.

41. مكارثي RC، Park YH، Kosman DJ. ينظم SAPP تدفق الحديد من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ عن طريق تثبيت مصدر الحديد الحديدية فيروبورتين. تقارير EMBO. 2014 ؛ 15 (7): 809-15. https: // دوى. org / 10.15252 / embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW ، Muckenthaler MU ، Galy B ، Camaschella C. Two to Tango: تنظيم استقلاب الحديد في الثدييات. خلية. 2010 ؛ 142 (1): 24-38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD، Tan EK. مسار إشارات البروتين التنظيمي للحديد (IRP) - عنصر مستجيب للحديد (IRE) في الأمراض التنكسية العصبية البشرية. التنكس العصبي الجزيئي. 2017 ؛ 12 (1): 75. https://doi.org/10. 1186 / ثانية 13024-017-0218-4 PMID: 29061112

44. Crichton RR، Dexter DT، Ward RJ. استقلاب الحديد في الدماغ واضطراباته في الأمراض العصبية. J العصبية ترانسم. 2011 ؛ 118 (3): 301-14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ ، Frey AG ، Palenchar DJ ، Achar S ، Bullough KZ ، Vashisht A ، et al. يقوم PCBP 1- مجمع BolA2 chaperone بتوصيل الحديد لتجميع مجموعة العصارة الخلوية [2Fe -2 S]. نات تشيم بيول. 2019 ؛ 15 (9): 872-81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​موخوبادهياي CK، Mazumder B، Fox PL. دور العامل المحرض بنقص الأكسجة -1 في التنشيط النسخي للسيرولوبلازمين بسبب نقص الحديد. J بيول كيم. 2000 ؛ 275 (28): 21048–54.

47. سترويتسكي إم جي ، كامينز إي بي ، تايلور سي تي. هيدروكسيل البروتين بواسطة هيدروكسيلاز عامل نقص الأكسجة (HIF): فريد أم موجود في كل مكان؟ الخلايا. 2019 ؛ 8 (5).

48. De Domenico I ، و Vaughn MB ، و Li L ، و Bagley D ، و Musci G ، و Ward DM ، وآخرون. يسبق التعبئة بوساطة Ferroportin للحديد الفيريتين تحلل الفيريتين بواسطة البروتيازوم. إمبو ج. 2006 ؛ 25 (22): 5396-404.

49. مكارثي RC ، Kosman DJ. نشاط Ferroportin و ferroxidase exocytoplasmic مطلوبان لتدفق حديد خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. مجلة الكيمياء البيولوجية. 2013 ؛ 288 (24): 17932-40.

50. مكارثي RC ، Kosman DJ. التحليل الميكانيكي لتراكم الحديد بواسطة الخلايا البطانية في BBB. المعادن الحيوية. 2012 ؛ 25 (4): 665-75.

51. Kosman DJ. تيلوس اختزال المعادن وأكسدة الفلزات في تجارة الحديد والنحاس حقيقية النواة. علم المعادن. 2018 ؛ 10 (3): 370-7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S و Qiao B و Stefanova D و Valore EV و Sek AC و Ruwe TA وآخرون. يحدد تحليل بنية ووظيفة ferroportin موقع الارتباط وآلية بديلة لعمل الهيبسيدين. دم. 2018 ؛ 131 (8): 899-910.

53. Ganz T ، Nemeth E. Hepcidin واستتباب الحديد. Biochim Biophys Acta. 2012 ؛ 1823 (9): 1434-1443.

54. كياو ب ، سوجيانتو ب ، فونج إي ، ديل كاستيلو-رويدا أ ، موران جيمينيز إم جيه ، جانز تي ، وآخرون. يعتمد الالتقام الخلوي الناجم عن الهيبسيدين في فيروبورتين على انتشار الفيروبورتين. ميتاب الخلية. 2012 ؛ 15 (6): 918-24.

55. Fung E ، Chua K ، Ganz T ، Nemeth E ، Ruchala P. minihepcidins المشتقة من Thiol تحتفظ بالنشاط البيولوجي. بيورج ميد كيم ليت. 2015 ؛ 25 (4): 763-6.

دانييل ك.بايلي ، ويتني كلارك ، دانييل ج.كوسمان

قسم الكيمياء الحيوية ، كلية جاكوبس للطب والعلوم الطبية الحيوية ، جامعة ولاية نيويورك في بوفالو ، بوفالو ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية