الجزء 1: آثار Isorhamnetin على مرض السكري والمضاعفات المرتبطة به: مراجعة للدراسات في المختبر وفي الجسم الحي وتحليل ما بعد النسخ المخصص للمسار الجزيئي المتضمن

لمزيد من المعلومات. اتصلtina.xiang@wecistanche.com

الملخص: داء السكريmellitus ، وخاصة النوع 2 (T2DM) ، هو مشكلة صحية عامة رئيسية على مستوى العالم. يتميز مرض السكري بمستويات عالية من السكر في الدم وأنسولين الدم بسبب ضعف إفراز الأنسولين وحساسية الخلايا للأنسولين ، والمعروفة باسم مقاومة الأنسولين. يسبب T2DM مضاعفات متعددة وشديدة مثل اعتلال الكلية ، واعتلال الأعصاب ، واعتلال الشبكية مما يتسبب في تلف الخلايا المؤكسدة في الأنسجة الداخلية المختلفة ، وخاصة البنكرياس والقلب والأنسجة الدهنية والكبد والكلى. تكتسب المستخلصات النباتية والمواد الكيميائية النباتية النشطة بيولوجيًا اهتمامًا كبدائل علاجية ووقائية جديدة لـ T2DM والمضاعفات المرتبطة به. في هذا الصدد ، isorhamnetin ، وهو نباتالفلافونويد، تمت دراسته منذ فترة طويلة لآثاره المحتملة المضادة لمرض السكري. تصف هذه المراجعة تأثيرها على الحد من الاضطرابات المرتبطة بمرض السكري عن طريق خفض مستويات الجلوكوز ، وتحسين حالة الأكسدة ، وتخفيف الالتهاب ، وتعديل استقلاب الدهون وتمايز الخلايا الشحمية من خلال تنظيم مسارات الإشارات المتضمنة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات المختبرية والحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بتضمين تحليل نصي كامل للجينوم بعد ذلك للأنشطة البيولوجية لـ isorhamnetin باستخدام أداة تعتمد على الخلايا الجذعية.

الكلمات الدالة: isorhamnetin؛ كيرسيتين. أنشطة بيولوجية؛ داء السكري؛ المسارات الجزيئية ميكروأري

انقر هنا لمعرفة المزيد من جهات الاتصال

1 المقدمة

تم استخدام النباتات كأدوية تقليدية في جميع قارات العالم تقريبًا منذ العصور القديمة. أدى البحث العلمي في أسباب استخداماتها الطبية إلى استكشاف الجزيئات النشطة بيولوجيًا. تعتبر النباتات المتطرفة التي تنمو في ظروف بيئية قاسية مصدرًا محتملاً جيدًا للجزيئات النشطة بيولوجيًا ذات الأهمية. في الواقع ، هذه القيود البيئية هي أصل خلل التمثيل الغذائي للأكسجين ، مما يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي عن طريق زيادة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) [1،2]. بعض النباتات ، مثل النباتات الملحية ، لها تأثير قويمضادات الأكسدةنظام للقضاء على هذه المركبات الضارة. من بين الجزيئات النشطة بيولوجيًا ذات الأهمية ، هناك مركبات فينولية. قيمت العديد من الدراسات النباتات الغنية بالبوليفينول مع أو بدون شروط مقيدة في المختبر [3-10]. تُعزى العديد من التأثيرات البيولوجية إلى المستخلصات الغنية بالبوليفينول ، مثل الأنشطة المضادة للالتهابات والسرطان [11-13]. أظهرت دراسات أخرى أن مضادات الأكسدة ومضادات الميكروبات [8 ، 14-16] وكذلك مضادات السمنة ومضادات السكري ومضادة للكبد الدهني [17-19] تأثيرات isorhamnetin. من بين هذه البوليفينول ،مركبات الفلافونويديتميزون. تتضمن هذه المجموعة عدة مجموعات فرعية ، مثل الفلافونول. Isorhamnetin هو أحد المركبات الرئيسية للفلافونول. Isorhamnetin هو أحادي ميثوكسي فلافون أو فلافونول O- ميثيل من فئة الفلافونويد. إنهاكيرسيتينحيث تحل مجموعة الميثوكسي محل مجموعة الهيدروكسي في الموضع 3 '. توجد بعض مشتقات isorhamnetin في الطبيعة ، مثل isorhamnetin 3- O - - d-glucopyranoside و isorhamnetin 3- O-neohesperidoside و isorhamnetin 3- O-rutinoside من Calendula officinalis L [20]. يقدم Isorhamnetin خصائص بيولوجية مهمة مثل مضادات الأكسدة [21] ، مضاد للسرطان [22] ، مضاد للميكروبات [23] ، مضاد للفيروسات [24] ، تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للسكري [21 ، 25-33].

في هذه المراجعة ، ينصب التركيز الأول على الأصل ، والتركيب الكيميائي ، والعزل ، وطرق الاستخراج ، بالإضافة إلى الجانب الكيميائي النباتي لإيزورهامنتين. بعد ذلك ، في الجزء الثاني ، نركز على وصف التأثيرات المحتملة المضادة لمرض السكري لهذا الفلافونول من خلال الحد من الاضطرابات المرتبطة بمرض السكري عن طريق خفض مستويات الجلوكوز ، وتخفيف حالة الأكسدة ، وتخفيف الالتهاب ، وتعديل التمثيل الغذائي للدهون وتمايز الخلايا الشحمية. أخيرًا ، أجرينا تحليلًا ثانويًا لبيانات المصفوفة الدقيقة للجينوم الكاملة المنشورة سابقًا لاستكشاف الأنشطة الحيوية المرتبطة بمرض السكري من isorhamnetin في أداة تعتمد على الخلايا الجذعية. نهدف أيضًا إلى تسليط الضوء على تأثير هذا الجزيء على تنظيم مسارات الإشارات المعنية من خلال الإبلاغ عن الدراسات المختبرية والحيوية المستخدمة في هذا المجال من البحث. في هذه المراجعة ، كشفنا عن خصائص النشاط المضاد للسكري لأيزورهامنتين بالمقارنة معكيرسيتينالذي يعتبر مستقلبًا من isorhamnetin ومرجع مهم في العلاج الطبيعي لمرض السكري.

2. نظرة عامة على الجزيئات النشطة بيولوجيًا في بوليفينول وفلافونيدات معينة

2.1. الإجهاد التأكسدي كأصل للجزيئات النشطة بيولوجيا في النباتات

يمكن أن تتعرض العديد من النباتات لظروف بيئية مختلفة (الملوحة والجفاف والأشعة فوق البنفسجية والمعادن الثقيلة ودرجات الحرارة القصوى ونقص المغذيات وتلوث الهواء وهجمات مسببات الأمراض). هذه القيود هي أصل الاختلالات في استقلاب الأكسجين ، والتي تولد الإجهاد التأكسدي عن طريق زيادة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يلعب جزيء الأكسجين (O2) دورًا مهمًا في كائنات التمثيل الضوئي. في الأصل ، في النباتات والطحالب العليا ، يحدث تبادل الغازات الذي يتضمن الإلكترونات في البلاستيدات الخضراء عن طريق التقاط ثاني أكسيد الكربون أثناء النهار وإنتاج الأكسجين. يتضمن تبادل الغازات هذا الإلكترونات. في الواقع ، في حالة القيود البيئية الشديدة ، لا يتم تقليل جزء كبير من الأكسجين وبالتالي يمكن أن يولد ROS في بعض العضيات من الخلايا النباتية [1،2] بسبب عدم التوازن في الأداء السليم للبلاستيدات الخضراء ونقل الإلكترونات [ 1]. علاوة على ذلك ، في ظل القيود البيئية المذكورة أعلاه ، يتم إنتاج العديد من أنواع ROS ، مثل جذور الهيدروكسيل (OH) ، وجذر الأنيون الفائق (O ، -) ، جذور ألكوكسيل وبيروكسيل (RO: و RO2 ، على التوالي) ، بيروكسيد الهيدروجين (H2O2 ، ) ، جذور هيبوكلوريت (-OCl) ، أكسجين القميص (O2) ، جذور أكسيد النيتريك (NO) وبيروكسيدات الدهون الأخرى (مثل malondialdehyde و 4- hydroxynonenal) [2،34،35]. في بعض الأحيان ، قد يكون لـ ROS دور في إرسال الإشارات الخلوية في السلوك الفسيولوجي للنباتات ، على سبيل المثال في عملية نمو البذور وتطورها ، وتطور الأنسجة ، والانتقال من التكاثر الخلوي إلى استطالة الخلية خلال المراحل المبكرة من التمايز [36]. . على مستوى عالٍ ، تسبب هذه الجزيئات ضررًا جزيئيًا مثل أكسدة الدهون في الأغشية ، وتغيير البروتينات والحمض النووي ، وموت الخلايا [1،35،37]. بعض النباتات ، مثل النباتات الملحية ، لديها القدرة على التكيف بشكل جيد مع هذه الظروف من خلال نظام قوي مضاد للأكسدة. من المعروف أن النباتات الملحية مصدر للأيضات الثانوية مثل البوليفينول [3-10]. يوضح هؤلاء المؤلفون أنه في ظل الظروف القاسية ، يتم تصنيع مادة البوليفينول لتلعب دورًا مهمًا في الحماية من الضرر التأكسدي الناجم عن الإجهاد. إن التركيب الحيوي والمحتوى وأنشطة هذه المركبات الفينولية هي دالة للعديد من المعلمات الخارجية (الضوء ودرجة الحرارة والملوحة والجفاف) والجوهرية (التركيب الوراثي والعضو ومرحلة التطور) التي تؤثر على محتواها وتوزيعها في النباتات [ 8،38،39]. على سبيل المثال ، في Pyracantha coccinea ، توجد بعض مركبات الفلافونويد مثل الفلافونونات والفلافون والفلافونول في البراعم أثناء المرحلة الخضرية وفي الجذور حصريًا أثناء الإنجاب 40]. من ناحية أخرى ، أظهر العديد من المؤلفين أن هذه المركبات الفينولية لها خصائص بيولوجية أخرى مثل الأنشطة المضادة للالتهابات ومضادة للسرطان [11-13]. أظهرت دراسات أخرى تأثيرات مضادات الأكسدة ومضادات الميكروبات [8 ، 14-16] وكذلك مضادات السكر [18،41،42] من المستخلصات الفينولية.

2.2. تصنيف مضادات الأكسدة الطبيعية

يمكن تصنيف نظام مضادات الأكسدة وفقًا لطبيعة هذه المكونات إلى مركبات إنزيمية أو غير إنزيمية. الأول يتضمن ديسموتاز الفائق (SOD) ، الكاتلاز (CAT) ، بيروكسيديز أسكوربات ، واختزال الجلوتاثيون [1 ، 3542-44]. كشفت الجينات المتعلقة بهذه الإنزيمات أهميتها أثناء التدهور الفسيولوجي بعد الحصاد لجذر التخزين واستجابة للإجهاد التناضحي وحمض الأبسيسيك وكذلك عدوى Xanthomonas axonopodis [44]. المجموعة الثانية تحتوي بشكل رئيسي على المركبات الفينولية والكاروتينات والفيتامينات والأسموليت [1]. تتميز المركبات الفينولية بوجود حلقة بنزين واحدة أو أكثر وتختلف في تعقيد الجزيء الأساسي وعدد وموقع الهيدروكسيل ودرجة البلمرة. هذه المركبات عبارة عن مستقلبات ثانوية تنقسم إلى ثلاث مجموعات عريضة: الأحماض الفينولية (مشتقات أحماض البنزويك والسيناميك) ، الفلافونويدات (الفلافونول ، الفلافونول ، الفلافونونات ، الفلافون ، الأنثوسيانين) ، والعفص (العفص المتحلل بالماء والبروانثوسيانيدين). بالإضافة إلى هذه الجزيئات ، يتم تمييز الستيلبين والقشور والكومارين أيضًا [45].

2.3 الأصول والتركيب الكيميائي الحيوي لمركبات الفلافونويد ، على وجه الخصوص ، Isorhamnetin

المركبات الفينولية هي مستقلبات ثانوية منتشرة في النباتات. هذه المركبات ذات حلقة عطرية بها مجموعة هيدروكسيل واحدة أو أكثر (OH) وتحتوي على جزيئات تتراوح من الأحماض الفينولية البسيطة إلى المركبات المبلمرة مثل العفص. يعتبر تخليق المركبات الفينولية عملية معقدة تمر بعدة مراحل. المركبات الفينولية عبارة عن جزيئات نشطة بيولوجيًا ذات مسارين نشطين: على جانب واحد حمض الشيكيميك وعلى الجانب الآخر ، جزيئات فينيل بروبانويد. يعتمد التخليق الحيوي للفلافونويد مثل isorhamnetin على هذه المسارات. في الواقع ، من ناحية ، يعطي shikimate الهيكل الأساسي للبوليفينول الذي يحتوي على واحدة أو أكثر من حلقات البنزين (C6) التي تحمل وظيفة هيدروكسيل واحدة أو أكثر. من ناحية أخرى ، هناك تخليق لقاعدة C 6- C3 المتكونة من تكثيف فينيل ألانين إلى حمض سيناميك (الشكل 1) [46].

بتعبير أدق ، يكون حمض الشيكيميك أساسًا للعديد من التفاعلات ، ويمثل الهيكل العظمي للأحماض الأمينية العطرية ، والتي تعد من بادئ المركبات الفينولية. تتكون الخطوة الأولى من مزيج من جزيئين: فوسفوينول بيروفات وإريثروز 4- فوسفات ، والذي يؤدي بعد أربعة تفاعلات إلى تكوين أول هيكل عظمي للفينولات: حمض شيكيمات أو حمض شيكيميك (CHoOs). يقدم هذا لاحقًا الحلقة الأولى التي تميز الفينولات بمجموعتين من الهيدروكسيل. يخضع شيكيمات لست تفاعلات تنتهي بالحمض الأميني الأول: فينيل ألانين. بفضل اثنين من الإنزيمات الرئيسية ، فينيل ألانين أمونيا- لياز (PAL) وسينامات -4- هيدروكسيلاز (C4H) ، يشكل فينيل ألانين سينامات وب- كومارات على التوالي .. في هذه الخطوة ، يمكن أن ينظم مستوى نشاط PAL تراكمًا كميًا مركبات فينوليه. جزيء p-coumarate هو أصل مشتقات الكومارين. يتميز مسار تخليق جزيئات فينيل بروبانويد بوجود إنزيم رئيسي يسمى 4- الكومارات CoA ligase (4CL) ، والذي يحفز في وجود وظيفة ثيول للأنزيم المساعد A (CoA) في الكوماريك p حمض إلى 4- coumaroyl CoA (C30Ha2N-O18P، S). توفر الحلقة A العطرية من مركبات الفلافونويد من تكثيف ثلاثة جزيئات من malonyl-CoA (-C6).

في وقت لاحق ، أنتجت شركة {{0} coumaroyl CoA الكالكون النارينجين ، موضحًا الارتباط بين الحلقة B العطرية والحلقة 3C من الشالكون (C 6- C 3-). يعد Chalcone عنصرًا رئيسيًا في هذا الموضوع لأنه مقدمة لجميع مركبات الفلافونويد القائمة على هيكل عظمي مكون من خمسة عشر كربونًا يتكون من حلقتين بنزين. بعد ذلك ، يتم تحويل الكالكون إلى Naringenin (ويسمى أيضًا flavanone أو trihydroxy flavone) عن طريق عمل chalcone isomerase (CHI) ، ومن ناحية أخرى ، يتم تصنيع الفلافونات مثل Apigenin أو acacetin أو chrysin أو luteolin من Naringenin في وجود الفلافون سينثيز (FNS). من ناحية أخرى ، يتم إنتاج مركبات مختلفة من الفلافونول وحمض السكسينيك من النارينجين في وجود إنزيمين ؛ فلافانون 3- ديوكسجيناز (F3D) وفلافونول سينثيز (FS). بصرف النظر عن مشتقات الفلافونول ، يتم أيضًا إنتاج مركبات أخرى ، مثل kaempferol و myricetin و quercetin. عن طريق نقل مجموعة الميثيل من S-adenosyl-L-methionine ، يتم إنتاج isorhamnetin في وجود flavone 3'-O-methyltransferase (FMT) [47،48]. ثم ، isorhamnetin هو monomethoxy flavone أو O-methylated flavonol من فئة الفلافونويد. إنه كيرسيتين (السلائف) حيث يتم استبدال مجموعة الهيدروكسي في الموضع 3 بمجموعة ميثوكسي. توجد بعض مشتقات isorhamnetin في الطبيعة ، مثل isorhamnetin 3- O - - d-glucopyranoside و isorhamnetin 3- O-neohesperidoside و isorhamnetin 3- O-rutinoside من Calendula officinalis L [20].

في الواقع ، تعتبر مركبات الفلافونويد واحدة من أهم مجموعات عائلة البوليفينول. لديهم هيكل يعتمد على نوع البروبان ثنائي الفينيل مع حلقتين بنزين (الحلقة A و B ، انظر الشكل 2) مرتبطة بسلسلة من ثلاثة كربون تشكل حلقة بيران مغلقة (حلقة C). لذلك ، يشار إلى هيكلها باسم C 6- C 3- C6. مواضع O-glycosylation هي C7 في الفلافون ، الايزوفلافون ، الفلافانون ، والفلافونول ، و C3 في الفلافونول والأنثوسيانيدين. مواقع الارتباط بالجليكوزيل C هي C6 و C8 في الفلافون [49]. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط أهمية الدور المضاد للأكسدة للمركبات الفينولية بدرجة الهيدروكسيل في الجزيء. تشتمل مركبات الفلافونويد على الايسوفلافون والفلافون والفلافونونات والجليكوزيدات والفلافونول مثل isorhamnetin ، والذي يُسمى أيضًا 3'-methoxy quercetin و 3- methyl quercetin [50]. في النباتات ، يكون الإنزيم ، Glycosyltransferases المعتمد على UDP ، مسؤولاً عن شكل الجليكوزيد من isorhamnetin (isorhamnetin 3- O-glucoside). يستخدم هذا الإنزيم سكريات نيوكليوتيد ثنائي الفوسفات ، عادةً سكر يوريدين ثنائي الفوسفات (UDP) ، لنقل مجموعة الميثيل إلى الدورة وربط وظيفة الجليكوسيد مع أيزورهامنتين [51].

2.4. عزل وتحليلات Ilsorhamnetin المنشأ من النباتات الطبية

إن توزيع isorhamnetin في النباتات الطبية واسع جدًا وطرق الاستخراج والتحليل متنوعة. مشتقات Isorhamnetin مطلوبة بشكل خاص. تساعد مجموعات الهيدروكسيل والميثيل في توصيفها. تُستخدم بعض الطرق لاستخراج isorhamnetin ، من بينها على أساس التجزئة ، باستخدام أساليب القياس الكيميائي ، والإنزيم ، واستخراج السوائل فوق الحرج (SFE-CO2). أولاً ، يمكن استخدام التجزئة لتبسيط الاستخراج عن طريق إزالة جميع أصباغ الزيت والدهون من العينات المحتوية على دهون. يتم أيضًا صوتنة العينة المنزوعة الدهن قبل النقع في خليط من الميثانول والماء. يمكن بعد ذلك استخدام الكروماتوغرافيا لتحليل المركبات الفينولية ، وخاصة مركبات الفلافونويد [49]. بالنسبة لهذه المركبات الأخيرة ، يتم استخدام LC-MS ويتم تطبيق كل من التأين بالرش الكهربائي (ESI) والتأين الكيميائي للضغط الجوي بشكل متكرر ، ويتم تحقيق أفضل حساسية للفلافونويدات بشكل عام في وضع الأيونات السالبة [49]. على سبيل المثال ، تم تقييم الكيمياء النباتية لأجزاء نبات Calligonum Azel Maire ، التي تم جمعها من الصحراء التونسية ، وتم استخدام كروماتوجرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بأربعة أضعاف قياس الطيف الكتلي UHPLC-ESI-QTOF لتحديد الفينولات فيما بينها. والفلافانول ، وهي المركبات الفينولية الأكثر وفرة التي تم تحديدها [52]. وبشكل أكثر تحديدًا ، تم تأكيد وجود غلوكوزيد isorhamnetin و isorhamnetin glucosyl-rhamnoside كمركبات رئيسية في أوراق نبات الملحي الصالحة للأكل Mesembryanthemum edule باستخدام تقنية LC / ESI-MS / MS [3]. تبع هذا العمل آخرون ممن استخدموا LC-ESI-TOF-MS لتوصيف العديد من البوليفينول. من بينها ، تم التعرف على مركبات الفلافونويد من الأجزاء الهوائية من مرحلة الإزهار الكامل للنباتات الملحية مثل Arthrocnemum indicum [5] ، Tamarix gallica [16] ، Glaucium flavum [13] ، و Salsola kali [8]. على غرار الأعمال الأخيرة ، تم إجراء التنميط LC-ESI-TOF-MS و GC-MS لأعشاب الأرطماسيا لتحديد الفينولات ، مثل الفلافون ، والفلافونول ، وقلويدات الفلافونويد [7]. تم إجراء عمل آخر على Pancratium maritimum وكشف التحليل بواسطة HPLC-DAD-ESI / MS عن وجود مركبات الفلافونويد بما في ذلك الفلافونول مثل isorhamnetin مع اقتران خماسي أكسيد وهيكسوسيد مثل isorhamnetin di-hexoside [53].

كمركب غير دهني ، يمكن عزل الفلافونول بواسطة الهكسان. بعد ذلك ، يمكن استخدام مذيب قطبي مثل الإيثانول. أظهرت دراسة أجريت على Limoniastrum guyonianum باستخدام HPLC وجود العديد من الفينولات ، من بينها isorhamnetin -3- O-rutinoside [54].

بعيدًا عن المستخلصات الفينولية ، توجد المركبات الفينولية أيضًا في الزيوت مثل زيت الزيتون [55]. هذه المركبات لها القدرة على حماية الزيوت من الأكسدة وتحسين القيمة الغذائية للزيت. تم اكتشاف Isorhamnetin ، كمركب فينولي ، أيضًا في مستخلص زيت من بذور الكمون الأسود التونسي (Nigella sativa L.) التي تم الحصول عليها باستخدام مذيب أخضر مثل 2- methyl tetrahydrofuran (MeTHF) كبديل للبترول أو الهكسان - مذيب أساسه لاستخلاص المركبات الفينولية المخصبة بالزيت [1 0]. تمت الموافقة على وجود isorhamnetin من خلال تحليل HPLC. كشفت التحليلات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة مع كاشف مصفوفة الصمام الثنائي (LC-DAD) عن وجود كمية عالية من isorhamnetin تتراوح بين 6.3 و 6.6 ميكروغرام / غرام زيت） بعد استخلاص الزيت من الكمون الأسود بواسطة MeTHF والهكسان ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام الرنين المغناطيسي النووي H (HNMR) والرنين المغناطيسي النووي C (CNMR) ، بعض جليكوسيدات الفلافونول مثل kaempferol -3- O-rutinoside (nicotiflorin) و isorhamnetin -3- O-rutinoside (النرجسية) تم تمييزها من الأجزاء الجوية لبيوسيدانوم أوشيري بويس التي تم جمعها في مدينة ماريفان ، إقليم كردستان ، إيران [56]. تكتشف طريقة الرنين المغناطيسي النووي خاصية تفاعل نوى ذرية معينة للمركب مع مجال مغناطيسي. توفر هذه الخاصية ، وهي إنتاج الرنين المغناطيسي بتردد معين ، معلومات عن بنية الجزيء. ثانيًا ، يتم اختيار النماذج الرياضية لتقييم كفاءة استخراج الفلافونول ، وخاصة لفهم أفضل طريقة للحصول على isorhamnetin -3- O-rutinoside [20]. تم إجراء تحليل عاملي متعدد المتغيرات باستخدام أزهار Calendula officinalis. تم تحليل النماذج الخطية والتربيعية والمكعبية الكاملة والمكعبية الخاصة. كان المكعب الكامل النهائي هو الأنسب ، مما أتاح قدرًا أكبر من الكفاءة في استخراج isorhamnetin -3- O-rutinoside بنسبة 60 بالمائة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الإنزيمات ، Rapides Maxi Fruit و Viscozyme تحت بعض العوامل المهمة التي تؤثر على نشاط الإنزيم في ظل ظروف CO2 فوق الحرجة مثل الضغط ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة والوقت ومحلول الإيثانول المائي. أخيرًا ، تم استخدام طريقة استخراج السوائل فوق الحرجة لاستخراج المركبات الفينولية مثل مركبات الفلافونول. منذ عدة سنوات ، تم استخدام إجراء استخلاص السوائل فوق الحرج على لحاء الكينا الكروي لأول مرة ، باستخدام ثاني أكسيد الكربون النقي والمعدل مع الماء ، وخلات الإيثيل ، والإيثانول [57]. أظهر المؤلفون أن ثاني أكسيد الكربون فوق الحرج جنبًا إلى جنب مع الإيثانول يمكن أن يستخلص كميات كبيرة من المركبات الفينولية ، بما في ذلك isorhamnetin. حدد التقدير الكمي لـ HPLC-MS بعض مركبات الفلافونول ، مثل isorhamnetin-hexoside (0.26 gg-I من ex-tract) و isorhamnetin البسيط (14.29 mg: gI من المستخلص). تم استخدام الإيثانول كمذيب مشترك. تم إجراء القياس الكمي باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الضغط ومجهزة بكاشف صفيف ثنائي ضوئي. Isorhamnetin 3- O-glucosyl-rhamnosyl-rhamnoside و isorhamnetin 3- O-glucosyl-rhamnosyl-pentoxide و isorhamnetin 3- O-glucosyl-rhamnoside و isorhamnetin 3- O-glucosyl -بنتوكسيد كانت أكثر مركبات الفلافونول وفرة المستخلصة من مستخلص O. ficus-indica فوق الحرج. كما ذكرنا من قبل ، يعتبر التحليل اللوني للسائل عالي الضغط أو HPLC طريقة شائعة الاستخدام لتحليل المركبات الفينولية. في عصير التفاح وعصير الكمثرى ، تم اكتشاف إيزورهامنتين 3- O-glucoside. في الواقع ، كشف فصل جليكوسيدات الفلافونول في مستخلص تفاح "بريتاتشر" بواسطة HPLC وقياس الطيف الكتلي عن وجود شكلين من أشكال الجليكوسيد مثل isorhamnetin 3- O-glucose و isorhamnetin 3- O-galactoside [ 58].