خصائص الحماية من الصور ومضادة للميلانين من مستخلصات Kadsura Coccinea المختلفة

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

الأشعة فوق البنفسجية الشمسية (UV) ، التي تتميز بأشعة UVA (320-400 نانومتر) ، UVB (280-320 نانومتر) ، و UVC (100-280 نانومتر) ، هي العامل البيئي الأكثر أهمية الذي يسبب سرطان الجلد والتشيخ الضوئي الناتج عن السمية الخلوية والسمية الجينية ، والسمية الضوئية. على وجه التحديد ، تشكل أشعة UVA و UVB أكثر من 95 في المائة و 3 في المائة من الأشعة فوق البنفسجية اليومية ، على التوالي [8]. يمكن أن يؤدي تشعيع UVA و UVB إلى تحفيز أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بشكل غير مباشر أو مباشر عن طريق اختراق طبقات الجلد و / أو الجلد ، مما يؤدي إلى تلف الأكسدة وموت الخلايا. في العقود الأخيرة ، أصبحت الأشعة فوق البنفسجية مصدر قلق خطير على صحة الجلد ولا تزال تنتشر بشكل خطير في جميع أنحاء العالم [9-11]. الإشعاع فوق البنفسجي هو منبه مباشر ومتسق للخلايا الكيراتينية ، والتي تمثل ما يقرب من 95 في المائة من كتلة خلايا البشرة. تعمل الخلايا الكيراتينية كأول حاجز ضد المخاطر الميكروبية والكيميائية والفيزيائية ، وتساعد في الحماية من الأشعة فوق البنفسجية الطويلة والمتوسطة. عندما تتعرض الخلايا الكيراتينية للأشعة فوق البنفسجية الطويلة (أ) و (ب) ، تتولد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج [12-14].

الخلايا الصباغية هي المسؤولة عن إنتاج وكمية صبغات الميلانين ، والتي تلعب دورًا مهمًا في الدفاع البيولوجي لبشرة الجلد ؛ يمكن أن يسبب خلل التنظيم لديهم فرط تصبغ أو اضطرابات نقص التصبغ [15،16]. تتوزع الخلايا الصباغية في الطبقة القاعدية من البشرة ، والتي تتأثر أيضًا بالتعرض لأشعة الشمس وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وهرمونات تحفيز الخلايا الصباغية (-MSH) [17،18]. Tyrosinase ، وهو عضو في عائلة بروتين النحاس من النوع -3 ، هو بروتين معدني محفوظ تطوريًا يلعب دورًا مهمًا في تكوين الميلانين وفي أنشطة monooxygenase monooxygenase و catecholase و diphenols. إن تقليل تنظيم التيروزيناز والبروتين المرتبط بالتيروزيناز -1 (TRP -1) والبروتين المرتبط بالتيروزيناز -2 (TRP -2) لهما تأثيرات تحفيزية مميزة. TRP -1 عبارة عن 5 ، 6- ثنائي هيدروكسي إندول -2- أوكسيديز حمض الكربوكسيل ، و TRP -2 عبارة عن DOPAchrome tautomerase [19،20]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عامل النسخ المرتبط بداء المقلة العضلية (MITF) والبروتين المرتبط بالعنصر المستجيب لـ cAMP (CREB) هما من عوامل النسخ التي تنظم بشكل أساسي تكون الميلانيني وتشفير المعلومات حول وضع وشدة التحفيز [17 ، 21]. ذكرت دراسات متعددة أن مسارات MITF و CREB تنظم تكوين الميلانين. MITF هو عامل رئيسي في نسخ الإنزيمات المرتبطة بتكوين الميلانين والمنظم المركزي لتكوين الميلانين. يؤدي -MSH إلى التعبير عن MITF من خلال آلية إشارات تتضمن بروتين ربط مرتبط بـ cAMP (CREB). بعد ذلك ، يدخل MITF إلى النواة باستخدام تسلسل M-box (AGTCATGTGCT) لتعزيز نسخ جينات وإنزيمات صباغية معينة. ومن المعروف أيضًا أن مادة CREB المُفسفرة يتم تحفيزها بواسطة -MSH ، والتي ترتبط بعنصر توافق CREB في محفز Mitf لتنظيم نسخ Mitf [21-24].

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة مستخلصات جذر KC (KCR) والساق (KCS) والأوراق (KCL) والفاكهة (KCF) بشكل شامل وتم إجراء تقييمات متعددة لخصائصها الواقية من الضوء ومضادة لتكوين الميلانين.

2. المواد والأساليب

2.1. إعداد مستخلصات KC

تمت زراعة مصنع KC 15 البالغ من العمر ثلاث سنوات في وعاء بلاستيكي سعة 9 لترات في حرم Miryang بجامعة Pusan ​​الوطنية. تم التعرف على KC من قبل البروفيسور يونغ وان تشوي ، مؤلف هذه الدراسة. تم إيداع هذه العينات كعينات قسيمة (رقم الإدخال KC- PDRL -1) في المعشبة التابعة لقسم العلوم البيولوجية البستانية ، كلية الموارد الطبيعية وعلوم الحياة ، جامعة بوسان الوطنية. تم ري النباتات بشكل كافٍ باستخدام محلول مغذٍ كامل بمستوى توصيل 1. 0 مللي ثانية · سم 1 وتحتوي على العناصر التالية (في داخلي · L − 1): NO 3- N، 16؛ NH 4- N ، 1.34 ؛ ف ، 4 ؛ ك ، 8 ؛ كاليفورنيا ، 8 ؛ و S ، 4. تم قطع ثوب KC في الميناء في ديسمبر 2020 عن طريق تصنيف الجذور والسيقان والأوراق والفواكه (الشكل 1 أ). تم تجميد العينات المحصودة على الفور في مجفف التجميد وتخزينها في أكياس من الفينيل عند 20 درجة مئوية حتى التحليل. تم طحن الجذور والسيقان والأوراق والثمار المجففة لـ KC (20 جم) إلى مسحوق ناعم واستخلاصها في درجة حرارة الغرفة باستخدام الكحول الإيثيلي. باختصار ، تم إجراء الترشيح والتبخير لمستخلصات EtOH من KC تحت ضغط منخفض عند 45 درجة مئوية متبوعًا بالتجفيد. أخيرًا ، تمت إذابة المستخلص الصلب (50 مجم / مل) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمزيد من التجارب.

cistancheهربا epimedium sagittatumمقتطف

2.2. إجمالي محتويات البوليفينوليك والفلافونويد لمستخلصات KC

كما تم وصفه سابقًا [25] ، تم قياس إجمالي محتويات البوليفينول والفلافونويد لجذر KC والساق والأوراق ومستخلصات الفاكهة باستخدام طرق Folin-Ciocalteu (بوليفينول الكلي) وكلوريد الألومنيوم (الفلافونويد). تم قياس الامتصاصية عند 700 نانومتر (البوليفينول الكلي) باستخدام Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences ، Buck- inghamshire ، المملكة المتحدة) وعند 510 نانومتر (الفلافونويد) باستخدام VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) .

تم إنشاء المنحنيات القياسية باستخدام حمض الغال (بوليفينول كلي) وكيرسيتين (فلافونويد) كمعيارين ، وتم التعبير عن النتائج كمكافئات حمض الغاليك لكل جرام (GAE / g) من مستخلصات جذر KC والساق والأوراق والفاكهة ومكافئ كيرسيتين. لكل جرام (QE / g) من مستخلصات جذر وساق وأوراق وفاكهة KC ، على التوالي.

2.3 مقايسة DPPH و ABTS

تم قياس أنشطة الكسح الجذري لـ DPPH و ABTS لمستخلصات جذر وساق وأوراق وفاكهة KC ({0}. 5 مجم / مل) وفقًا لطريقة موصوفة سابقًا [25] مع تعديلات طفيفة. تم خلط مستخلصات جذر KC والساق والأوراق والفاكهة (0. 5 مجم / مل) مع محلول DPPH (6 0 ميكرومتر) في أطباق ميكروية. بعد رج العينات بقوة ، تم حفظها في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 0 .5 ساعات. تم تحضير محاليل مخزون من 7 ملي مولار ABTS و 2.6 بيرسلفات البوتاسيوم في ماء مقطر عند درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 18 ساعة. تم خلط مستخلصات جذر KC والساق والأوراق والفاكهة (0.5 مجم / مل) مع محلول العمل ثم تركت لمدة 0.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تمت مراقبة امتصاص مخاليط العينة عند 510 نانومتر (DPPH) أو 734 نانومتر (ABTS).

2.4 زراعة الخلايا

تم تلقيح الخلايا الكيراتينية الملتصقة (HaCaT) والخلايا الصباغية الملتصقة (B16F10) في محلول DMEM (Invitrogen Corporation ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) يحتوي على 10 بالمائة FBS (Invitrogen Corporation ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 بالمائة من البنسلين / الستربتومايسين (Invitrogen) ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تربيتها عند 37 درجة مئوية مع 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. لوحظ نمو خلايا HaCaT و B16F10 الملتصقة بانتظام ، وتم تغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام. تم استخدام الخلايا من مرحلة النمو اللوغاريتمي للتجارب اللاحقة.

2.5 إشعاع UVA و UVB

تعرضت الخلايا الكيراتينية لإشعاع UVA أو UVB (Bio-Link BLX -365 ، Villber- Lourmat ، Eberhardzell ، ألمانيا) 5 8 من أنابيب W التي تنبعث معظم طاقتها عند ذروة انبعاث إما 365 نانومتر ( UVA) أو 312 نانومتر (UVB). كانت جرعات إشعاع UVA 20 جول / سم 2 وجرعات إشعاع UVB كانت 50 مللي جول / سم 2.

2.6. قياس قابلية بقاء الخلية والسمية الخلوية من خلال تحليل CCK -8 وتحليل LDH

لتحليل صلاحية الخلية ، تمت إضافة حل مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) من CCK -8 Assay Kit (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) إلى HaCaT keratinocytes و B16F10 معلقات خلايا سرطان الجلد وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. باختصار ، تم زرع 2 104 من الخلايا في كل بئر من 24- صفيحة جيدة واحتضانها بنسبة 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. باختصار ، تم زرع الخلايا 2 104 في كل بئر من صفيحة البئر 24- وتم تحضينها باستخدام 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تمت إضافة كاشف CCK -8 إلى كل بئر ، وتم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعات. تم استخدام مجموعة أدوات الكشف عن السمية الخلوية (Roche Applied Science ، سويسرا) لتحديد إطلاق اللاكتات ديهيدروجينيز (LDH) خارج الخلية في وسط زراعة الخلايا الكيراتينية HaCaT. تم تحليل الامتصاصية عند 450 نانومتر (CCK -8) و 490 نانومتر (LDH) باستخدام قارئ اللوحة متعدد العلامات VICTOR.

2.7. تقييم إنتاج ROS داخل الخلايا في الخلايا الكيراتينية

تم تحليل مستويات ROS داخل الخلايا باستخدام {0} (و -6) - كلورو ميثيل -2 ′ ، 7′-ثنائي كلوريد- هيدروفلوريسين ثنائي أسيتيل إستر (CM-H2DCFDA ؛ Thermo Fisher Scientific، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، بعد علاج KC المستخلصات الجزئية الأخرى (0. 5 ملغ / مل) ، تم غسل الخلايا الكيراتينية (HaCaT) بمحلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS) وحضنت بـ CM-H2DCFDA (5 ميكرومتر) لمدة 0.5 ساعة في الظلام. بعد ذلك ، تم تصور توليد ROS داخل الخلايا باستخدام مجهر Carl Zeiss مضان ؛ تم قياس شدة التألق بناءً على صبغة الفلورسنت (CM-H2DCFDA) باستخدام مقياس التدفق الخلوي (Fit NXT Flow Cyto ، Thermo Fisher Scientific ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.8. تحليل موت الخلايا المبرمج

بعد التعرض والعلاج ، تم تجريب الخلايا الكيراتينية HaCaT والطرد المركزي. بعد ذلك ، تم تقييم موت الخلايا المبرمج للخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام fluorescein isothiocyanate (FITC) Annexin V / Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies ، Carls-bad ، CA ، USA) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. باختصار ، تم شطف الخلايا الكيراتينية مرتين باستخدام PBS ، وتم الحصول على الخلايا الكيراتينية في المخزن المؤقت للربط الملحق وخلطها مع محلول FITC / Annexin V (المكون A) و propidium iodide (PI). بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام ، تم قياس موت الخلايا المبرمج الكيراتيني وتم حساب النسبة المئوية للخلايا المبرمج باستخدام مقياس التدفق الخلوي (Fit NXT Flow Cyto ، Thermo Fisher Scientific ، باسادينا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الكشف عن إشارات لقنوات FL1 (FITC / Nexin V) و FL3 (PI) ، وتم إنشاء مخططات تلطيخ رباعي ونقاط للخلايا الملطخة.

2.9 تحليل محتوى الميلانين داخل الخلايا ونشاط التيروزينيز

تم قياس محتوى الميلانين داخل الخلايا ومقايسات نشاط التيروزيناز من خلال شرح مواضع اختلاف الإجراء المعدل قليلاً [24]. عولجت الخلايا الصباغية بتركيز نهائي قدره 0. 5 ميكرومتر - MSH و 0. 5 مجم / مل من خلاصات KC الجزئية الأخرى لمدة 48 ساعة. تم تحلل كريات الخلايا الصباغية بـ 1 N NaOH في 1 0 بالمائة من DMSO عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تم تحديد محتوى الميلانين النسبي عن طريق قياس الامتصاصية عند 475 نانومتر باستخدام قارئ لوحة VICTORMultilabel. تم تحديد نشاط التيروزيناز داخل الخلايا عن طريق قياس معدل إنتاج الدوباكروم باستخدام L-DOPA. تم غسل الخلايا الصباغية باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ومحلول في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 بالمائة (وزن / حجم) Triton X -100. تم تحضير ركيزة التيروزيناز L-DOPA (2 مجم / مل) في نفس محلول تحلل الفوسفات. تم وضع كل مستخلص في 96- لوحة بئر ، وبدأ تحليل الإنزيم بإضافة محلول L-DOPA. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، تم قياس الامتصاصية عند 475 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة متعدد العلامات VICTOR لتحليل إنتاج الدوباكروم. تم التعبير عن قيمة كل قياس كنسبة مئوية من عنصر التحكم. تم استخدام أربوتين (أ ، 0.5 مجم / مل) كعنصر تحكم إيجابي.

سيستانشإشنكوسايدهو مثبط للتيروزيناز.

2.10. الوقت الحقيقي الكمي PCR

تم عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من كل مجموعة من الخلايا الصباغية باستخدام مجموعة RNeasy Mini Kit (QIAGEN ، Hilden ، ألمانيا). تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة النسخ العكسي عالية السعة (كدنا) (Thermo Fisher Scientific ، Miami ، OK ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، للحصول على أول حبلا من cDNA. ثم تم استخدام الخيوط كقوالب للوقت الحقيقي الكمي PCR (qRT-PCR) باستخدام أداة Bio-Rad Chromo4TM ومزيج رئيسي SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific ، Miami ، OK ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء PCR تحت التمسخ المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والصلب عند 55-58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم استخدام GAPDH mRNA كمرجع داخلي لـ tyrosinase و TRP -1 و TRP -2 mRNA. القيمة النسبية للتعبير الجيني المستهدف=2 - ∆∆CT. كانت تسلسلات التمهيدي كما يلي: Tyrosinase-sense (5′-ggccagctttcaggcaggt -3 ′) ، Tyrosinase-anti-sense (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc -3 ′) ، TRP -1- sense (5) ′ -agccccaactctgtcttttc -3 ′) ، TRP -1- anti-sense (5′-ggtctccctacatttccagc -3 ′) ، TRP -2- sense (5′- tccagaagtttgacagccc -3 ′) و TRP -2- مضاد للحس (5′-ggaaggagtgagccaagttatg -3 ′) و GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctgacttc -3 ′) ، و GAPDH-antisense (5′-taccaggacatgagcttc -3 ′).

2.11. النشاف الغربي

تم حصاد الخلايا الصباغية وتحللها باستخدام كاشف استخراج البروتين في الثدييات (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تحديد جميع تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص بروتين Bio-Rad (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك ، تمت إضافة المخزن المؤقت للتحميل إلى طاف البروتين وخلطه. تم غلي الخليط لمدة 10 دقائق ، وتم فصل البروتينات باستخدام Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ونقلها إلى غشاء Hybond polyvinylidene difluoride (Amersham Biosciences ، Piscataway ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء الكشف المناعي باستخدام التيروزيناز (1: 1000) ، TRP -1 (1: 1000) ، TRP -2 (1: 1000) ، MITF (1: 1000) ، CREB الفسفوري (p-CREB 1: 1000) و CREB (1: 1000) و -tubulin (1: 1000) (تقنية تشوير الخلايا ، بيفرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام مجموعة مُحسِّن المناعة SignalBoost (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميسوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الغشاء طوال الليل باستخدام الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية. تمت إضافة الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للأرنب (IgG) (1: 5000 ، تقنية تشوير الخلية) إلى الغشاء وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لوحظت نطاقات البروتين باستخدام ركيزة النشاف الغربية المحسنة من بيرس ECL (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم قياسها كنسبة شدة نطاق البروتين المستهدف إلى شدة نطاق -tubulin.

2.12. تحليل احصائي

تم تكرار جميع المقايسات بشكل مستقل ثلاث مرات على الأقل. يتم تقديم جميع المعلمات الإحصائية على أنها متوسط ​​الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) ، متبوعًا باختبار Dunn اللاحق. تم اعتبار قيمة p <0. 0="" 1="" أو="" p=""><0.05>

اختبار الفلافونويد

3. النتائج

3.1. مقارنة بين خصائص مضادات الأكسدة للعديد من المستخلصات الجزئية من KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25.7 ± 2.1 بالمائة)> KCF (8.7 ± 1.1 بالمائة) (الشكل 1E).

3.2 مقارنة بين الخلايا الكيراتينية القابلة للحياة والتالفة المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود UVA أو UVB أو غير الإشعاعي

أجرينا التجارب التالية لاستكشاف تأثيرات الخلايا الكيراتينية KCR و KCS و KCL و KCF. أولاً ، تم تطبيق جميع المستخلصات على الخلايا الكيراتينية HaCaT في وجود UVA أو UVB أو عدم التشعيع. أظهر تحليل CCK -8 أن المستخلصات لم تغير بشكل ملحوظ قابلية بقاء الخلايا الكيراتينية بتركيزات 0. 5 مجم / مل. في وقت لاحق ، عولجت الخلايا الكيراتينية باستخدام KCR و KCS و KCL و KCF في وجود إشعاع UVA أو UVB. أدى تشعيع UVA و UVB إلى تثبيط جدوى الخلايا الكيراتينية بشكل كبير ، كما يتضح من تحليل CCK -8 في الشكل 2A. ومع ذلك ، وجدنا أن جدوى الخلايا الكيراتينية المشعة للأشعة فوق البنفسجية UVA و UVB زادت بالترتيب التالي: KCL و KCR و KCS و KCF (الشكل 2 أ). قمنا أيضًا بمراقبة الخلايا الكيراتينية التالفة عن طريق قياس إطلاق LDH خارج الخلية. أظهرت النتائج أن إشعاع UVA أو UVB سهل بشكل كبير إطلاق LDH ؛ ومع ذلك ، خففت KCL و KCR و KCS و KCF بشكل كبير من إطلاق LDH مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية UVA أو UVB بهذا الترتيب (الشكل 2B). أظهرت النتائج التجريبية أعلاه أن التأثيرات المضادة للتكاثر والسمية للخلايا لإشعاع UVA أو UVB على الخلايا الكيراتينية قد تم تخفيفها بترتيب KCL و KCR و KCS و KCF. والجدير بالذكر أن KCL يمكنه استعادة قابلية بقاء الخلية للتحكم في المستويات.

الشكل 2. جدوى الخلايا الكيراتينية وتأثيرات السمية الخلوية لمستخلص KCR و KCS و KCL و KCF في وجود UVA أو UVB أو غير الإشعاعي.

3.3 مقارنة بين إنتاج ROS داخل الخلايا في الخلايا الكيراتينية المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود أو عدم وجود إشعاع UVA و UVB

نظرًا لأن إنتاج ROS داخل الخلايا يسبب تلفًا شديدًا في الخلايا الكيراتينية ، فإنهم يعتبرون وسطاء محتملين للضرر الناجم عن الإشعاع UVA أو UVB. اقترحت العديد من الدراسات أن تشعيع UVA أو UVB يحفز إنتاج ROS الداخلي [12 ، 14]. لقد هدفنا إلى تحديد ما إذا كانت هناك زيادة في مستويات ROS الداخلية في الخلايا الكيراتينية المشععة UVA أو UVB. وفقًا لذلك ، قمنا بتحليل شدة التألق داخل الخلايا للمسبار CM-H2DCFDA باستخدام الفحص المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي. كنتيجة للفحص المجهري الفلوري ، أظهرت صور تلطيخ CM-H2DCFDA تلطيخًا طفيفًا في السيطرة ، وخلايا كيراتينية معالجة KCR و KCS و KCL و KCF وتلطيخ كبير في الخلايا الكيراتينية المشعة UVA أو UVB (الشكل 3A). وفقًا للنتائج الكمية لقياس التدفق الخلوي ، زاد إشعاع UVA و UVB من مستويات ROS داخل الخلايا في الخلايا الكيراتينية بنسبة 27.2 ± 4.5 بالمائة و 34.1 ± 4.2 بالمائة ، على التوالي ، مقارنةً بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة (5.7). ±0. 2 بالمائة). بالإضافة إلى ذلك ، على غرار نتائج الفحص المجهري الفلوري ، تم التأكيد على أن مستوى ROS داخل الخلايا تم تثبيته بواسطة مقتطفات KC بترتيب KCL> KCR> KCS> KCF في وجود إشعاع UVA أو UVB (الشكل 3 ب). تشير هذه النتائج إلى أن العديد من المستخلصات الجزئية من KC تثبط بشكل كبير تلف الخلايا الكيراتينية عن طريق تقليل مستويات ROS الذاتية.

الشكل 3. تأثير مستخلص KCR و KCS و KCL و KCF على إنتاج ROS داخل الخلايا في الخلايا الكيراتينية UVA أو UVB أو غير المشععة

3.4. مقارنة بين موت الخلايا المبرمج للخلايا الكيراتينية المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود أو غياب إشعاع UVA و UVB

للكشف عن موت الخلايا المبرمج ، وهو مؤشر موثوق به على تلف الخلايا الكيراتينية ، تم تلوين الخلايا الكيراتينية بـ Annexin V بالاشتراك مع يوديد البروبيديوم. تم استخدام الفلورسين أيزوثيوسيانات (FITC) أنكسين V / مجموعة موت الخلايا المبرمج للخلايا الميتة لاختبار معدل موت الخلايا المبرمج في الخلايا الكيراتينية. سهّل تشعيع UVA و UVB نشاط تلطيخ Annexin V ، بينما قلل KCR و KCS و KCL و KCF من معدل نشاط تلطيخ Annexin V في وجود إشعاع UVA و UVB. لم تحفز KCR و KCS و KCL و KCF وحدها (0. 5 مجم / مل) نشاط تلطيخ Annexin V. أظهرت البيانات الكمية من قياس التدفق الخلوي أن إشعاع UVA و UVB زاد من مستويات موت الخلايا المبرمج للخلايا الكيراتينية بمقدار 46.3± 1.5 في المئة و 48.7 ± 1. 0 بالمائة ، على التوالي ، مقارنةً بعنصر التحكم (5. 0 بالمائة ± 0. 7 بالمائة). الأهم من ذلك ، تم التأكيد على أن مستوى موت الخلايا المبرمج تم تثبيته بواسطة مستخلصات KC بترتيب KCL> KCR> KCS> KCF في وجود إشعاع UVA أو UVB (الشكل 4 أ ، ب). بشكل عام ، تسبب تشعيع UVA و UVB في تلف الخلايا الكيراتينية والعديد من المستخلصات الجزئية من تلف الخلايا الكيراتينية الموهن الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية.

الشكل 4. تأثير مستخلصات KCR و KCS و KCL و KCF على موت الخلايا المبرمج في الخلايا الكيراتينية UVA أو UVB أو غير المشعة.

3.5 مقارنة بين محتوى الميلانين داخل الخلايا ونشاط التيروزيناز للخلايا الصباغية المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود أو عدم وجود علاج MSH

قبل التحقيق في الإمكانات البيولوجية لـ KCR ، و KCS ، و KCL ، و KCF على تكوين الميلان الناجم عن MSH ، تم تقييم قابلية بقاء الخلية بعد علاج KCR و KCS و KCL و KCF (0. 5 مجم / مل) باستخدام فحص CCK -8 في الخلايا الصباغية B16F1 0 مع أو بدون -MSH. لم يغير KCR و KCS و KCL و KCF (0.5 مجم / مل) صلاحية الخلية في وجود أو عدم وجود -MSH (الشكل 5 أ). -MH هو عامل مهم في تكوين الميلانين يمكن أن يزيد من محتوى الميلانين داخل الخلايا عن طريق الارتباط بمستقبل الميلانوكورتين 1 وتنشيط إنزيم الأدينيلات. للتحقيق في تأثير KCR و KCS و KCL و KCF على تكوين الميلانين في الخلايا الصباغية ، تم تحديد محتوى الميلانين داخل الخلايا من خلال الملاحظة البصرية والقياسات البيوكيميائية. كما هو مبين في الشكل 5 ب ، تمت زيادة محتوى الميلانين داخل الخلايا بشكل ملحوظ بواسطة -MSH. ومع ذلك ، أظهر العلاج المشترك مع KCR و KCS و KCL و KCF انخفاضًا ملحوظًا في محتوى الميلانين داخل الخلايا مقارنةً بعلاج MSH. كان تسلسل القياسات البيوكيميائية التي تشير إلى تثبيط محتوى الميلانين داخل الخلايا على النحو التالي: KCL> KCR> KCS> KCF (الشكل 5 ب). تم إجراء فحص نشاط التيروزيناز داخل الخلايا وفقًا لمقايسة محتوى الميلانين داخل الخلايا. زاد نشاط التيروزيناز داخل الخلايا للخلايا الصباغية المحفزة بـ MSH ، بينما انخفض نشاط الخلايا الصباغية المحفزة بـ MSH والمعالجة بـ KCR و KCS و KCL و KCF. كان تسلسل القياسات البيوكيميائية التي تشير إلى تثبيط النشاط التيروزيني داخل الخلايا على النحو التالي: KCL> KCR> KCS> KCF (الشكل 5C). تشير هذه النتائج إلى أن العديد من المستخلصات الجزئية من KC قللت بشكل كبير من محتوى الميلانين داخل الخلايا وتثبيط نشاط التيروزيناز دون تغيير حيوية الخلية.

3.6 مقارنة بين مستويات النسخ والترجمة من Tyrosinase و TRP -1 و TRP -2 في الخلايا الصباغية المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود أو غياب-علاج MSH

لاستكشاف تأثير KCR و KCS و KCL و KCF على تقليل تنظيم مستويات تعبير البروتين و mRNA لعلامات تكوين الميلانين (التيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2) ، تمت معالجة الخلايا الصباغية باستخدام KCR و KCS و KCL و KCF في وجود أو عدم وجود -MSH. كما هو موضح في الشكل 6A-C ، زادت مستويات الرنا المرسال لكل من التيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2 بشكل ملحوظ بواسطة العلاج -MSH. في المقابل ، مقارنةً بعلاج -MSH ، قللت KCR ، و KCS ، و KCL ، و KCF من تنظيم تعبير mRNA للتيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن لـ KCR و KCS و KCL و KCF وحدها أي تأثير كبير على مستويات التيروزيناز و TRP -1 و TRP -2 mRNA. تم إجراء تحليل لطخة غربية بالتعاون مع PCR في الوقت الحقيقي. أظهرت النتائج أن علاج -MSH زاد من مستويات التعبير البروتيني للتيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2 وانخفضت هذه المستويات من خلال العلاج المشترك مع KCR و KCS و KCL و KCF (الشكل 6D ). كان تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي الكمي وتثبيط الإشارة الغربية للتيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2 mRNA وتعبير البروتين كما يلي: KCL> KCR=KCS> KCF (الشكل 6). تشير هذه النتائج إلى أن العديد من المستخلصات الجزئية من KC لديها القدرة على تعزيز مكافحة تكون الميلانين ، وهو ما ظهر من خلال تقليل تنظيم علامات تكون الميلانين.

3.7 مقارنة بين تعبير MITF وفسفرة الخلايا الصباغية CREB المعالجة بالعديد من المستخلصات الجزئية من KC في وجود أو عدم وجود علاج MSH

Tyrosinase و TRP -1 و TRP -2 ضرورية في تكوين الميلانين. يتم تنظيم التعبير عن طريق MITFexpression و CREB الفسفرة [17 ، 21]. أشار تحليل اللطخة الغربية إلى أن KCR و KCS و KCL و KCF يثبط بشكل فعال الزيادة في مستوى البروتين في MITF الناجم عن العلاج -MSH. بالإضافة إلى ذلك ، بالكاد اكتشف KCR و KCS و KCL و KCF تعبير بروتين MITF. كان تسلسل نتائج اللطخة الغربية الكمية التي تشير إلى تثبيط مستويات تعبير البروتين MITF كما يلي: KCL> KCR> KCS> KCF (الشكل 7A). علاوة على ذلك ، عكست KCR و KCS و KCL و KCF تأثيرات علاج -MSH على فسفرة CREB. كان لـ KCR و KCS و KCL و KCF وحدها تأثير ضئيل على فسفرة CREB. كان تسلسل نتائج اللطخة الغربية الكمية التي تشير إلى تثبيط مستويات الفسفرة CREB كما يلي: KCL> KCR> KCS> KCF (الشكل 7 ب). أشارت هذه النتائج إلى أن العديد من المستخلصات الجزئية من KC قمعت بتكوين الخلايا الصباغية ، جزئيًا على الأقل ، من خلال تعبير MITF و فسفرة CREB.

4. مناقشة

تزداد شعبية تبييض البشرة في جميع أنحاء العالم بسبب زيادة الإشعاع فوق البنفسجي ، ومن المرجح أن تصل إلى نسب عالية في العقود القادمة لأغراض التجميل [8]. تم استخدام أنواع عديدة من مواد التبييض ، مثل حمض الكوجيك والأربوتين ، في أسواق مستحضرات التجميل والأدوية. علاوة على ذلك ، تتلقى المستخلصات الطبيعية اهتمامًا متزايدًا نظرًا لاحتوائها على مضادات الأكسدة المحتملة ، ومضادة للالتهابات ، ومضادة للأورام ، ومضادة للبكتيريا ، وأنشطة أخرى [26 ، 27]. بناءً على خصائص مضادات الأكسدة والمضادة للضوء ومضادة لتكوين الميلانين ، تم تطوير العديد من مستحضرات التجميل والأدوية المرشحة. من المعروف أن خصائص التبييض هذه هي مساهمات لا غنى عنها في البحث والتطوير في مجال مستحضرات التجميل والأدوية [28]. يحتوي TDM على خصائص متعددة المكونات والأهداف ويحسن بشكل كبير الفعالية البيولوجية البشرية ونوعية الحياة [29]. تُظهر الأبحاث الكيميائية النباتية الحديثة أن KC يحتوي على مجموعة متنوعة من المكونات ، مع كون الليغنانات والتربينويدات هي المكونات الرئيسية [30]. تم التعرف على أكثر من 202 مركب ، بما في ذلك قشور ثنائي البنزين- كلوكتاديين ، قشور سبيروبنزوفورانويد ثنائي بنزو سيكلوكتادين ، قشور أريل نفتالين ، كادلونجيلاكتون ترايتيربينويدس ، وسيسكيتيربينويدس [31،32]. تمتلك الجذور الجافة والسيقان والأوراق في KC تقليدًا واسعًا للاستخدام في TDM لعلاج التهاب المفاصل الروماتويدي وقرحة الاثني عشر واضطرابات الجهاز الهضمي ومشاكل أمراض النساء. الجذور الجافة من KC ، مع إجراءات تطهير الحرارة والقضاء على السموم ، والحث على إدرار البول لإزالة الوذمة. تُستهلك ثمار KC في الغالب على شكل فواكه طازجة وعصائر ونبيذ فواكه ، مما يشير إلى أنها مفيدة لصحة الإنسان [7،33،34]. أظهرت الدراسات السابقة أيضًا أنها غنية بالمكونات النشطة بيولوجيًا مثل قشور ، ترايتيربينويدات ، الفلافونويد ، الأحماض الفينولية ، الستيرويدات ، والأحماض الأمينية ، والتي لها قيمة غذائية وطبية عالية [3،35]. في هذه الدراسة ، تم استخراج أجزاء مختلفة من KC. والجدير بالذكر أن إجمالي محتويات البوليفينول والفلافونويد لأوراق وجذور KC كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في السيقان والفواكه. تحتوي الأوراق والجذور على أكثر من ضعف عدد البوليفينول والفلافونيدات الموجودة في السيقان والفواكه. نتيجة لذلك ، فإننا نعتبر أن مجموع البوليفينول والفلافونويد يساهمان بشكل كبير في تأثيرات KC الواقية من الضوء والميلانين.

ترجع السمية الضوئية الجلدية الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية في المقام الأول إلى السمية الخلوية للخلايا ، وتراكم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج في الخلايا الكيراتينية. لذلك ، فمن المعقول أكثر التركيز على تثبيط السمية الخلوية ، وتراكم ROS داخل الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج في الخلايا الكيراتينية المشعة للأشعة فوق البنفسجية UVA و UVB [36 ، 37]. كما هو موضح في هذه الدراسة [10،38] ، أظهرت نتائج التدخل باستخدام مستخلصات KC على السمية الخلوية الضوئية (UVA: 20 J / cm2، UVB: 50 مللي جول / سم 2) أن مستخلصات KC قللت بشكل كبير من السمية الخلوية وتراكم ROS داخل الخلايا و موت الخلايا المبرمج. تمشيا مع النتائج السابقة ، كانت تأثيرات الحماية الضوئية لأوراق وجذور KC أعلى بكثير من تلك الموجودة في الساق والفاكهة. علاوة على ذلك ، أشارت نتائجنا إلى أن مستخلصات KC تظهر التأثيرات المذكورة أعلاه من خلال تعزيز نشاط مضادات الأكسدة. غالبًا ما يتم ملاحظة تكون الميلانين بعد التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية ويرتبط أساسًا بالتصبغ أو فرط التصبغ [39]. وفقًا للدراسات السابقة ، تم التعرف على طريقة إحداث تكون الميلانين باستخدام -MSH وتطبيقها على نطاق واسع. لذلك ، استندت هذه الدراسة إلى بناء نموذج الخلايا الصباغية المحفزة بـ -MSH [24،39]. وجدنا أن مستخلصات KC مكبوتة - تحفز MSH داخل الخلايا ونشاط التيروزيناز. بالإضافة إلى ذلك ، قللت مقتطفات KC من نسخ وترجمة علامات تكون الميلانين مثل التيروزيناز ، و TRP -1 ، و TRP -2 في الخلايا الصباغية المحفزة في MSH. علاوة على ذلك ، قمنا بفحص تعبير بروتين MITF و فسفرة CREB في الخلايا الصباغية المحفزة بـ MSH. وبالمثل ، في هذه الدراسة ، وجدنا أن مستخلصات KC قمعت التعبير عن بروتين MITF بوساطة MSH و فسفرة CREB في الخلايا الصباغية. تمشيا مع النتائج الواقية من الضوء ، كانت التأثيرات المضادة للميلانين لأوراق وجذور KC أعلى بكثير من تلك الموجودة في السيقان والفواكه.

شرائح cistanche

لمزيد من المعلومات، يرجى الضغط هنا.

5. الاستنتاجات

بشكل عام ، تم العثور على التأثيرات المحتملة للحماية من الضوء والمضادة للميلانين لمستخلص KC في هذه الدراسة. يمكن لمستخلص KC الذي يحتوي على نسبة عالية من البوليفينول والفلافونويد أن يمارس تأثيرات واقية من الضوء ومضادة للميلانين على الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية. توفر هذه الدراسة أساسًا منطقيًا واستراتيجية بحثية للتدخلات التجميلية والصيدلانية للتبييض الطبيعي والعوامل الواقية من الضوء.