تطوير كريم تجميلي متعدد الوظائف باستخدام مواد نشطة بيولوجيا من Streptomyces

رام هاري دحل1 ، توان مانه نجوين1,2، دونغ سيوب شيم3جون يونغ كيم4، جانغيول لي4 وجايسو كيم1,*

الملخص:يتم استخدام مستحضرات التجميل المختلفة التي لها وظيفة واحدة بشكل متزايد ، لكن مستحضرات التجميل ذات الأنشطة المتعددة الوظائف لا تزال محدودة. نحن نهدف إلى تطوير كريم تجميلي متعدد الوظائفمضادات الأكسدة، وأنشطة مكافحة التيروزيناز ، ومكافحة الشيخوخة ومضادات الميكروبات. تم تنفيذ الأنشطة المضادة للميكروبات عن طريق طريقة نشر القرص. تم تقييم سمية الخلية وتكاثر الخلايا في 96- لوحة بئر بخطوط خلوية مختلفة مثل HaCaT و RAW264.7 و CCD -986 Sk و B16F1 و B16F1 0. تم تقييم تثبيط تيروزيناز الفطر ، وتثبيط الإيلاستاز ، و 1 ، 1- ثنائي فينيل -2- أنشطة الكسح الجذري (DPPH) وتم حساب IC50. تم تصنيع جسيم السيليكا ميسوبوروس باستخدام Pluronic P123 و tetraethyl ortho-silicate (TEOS). تم التقاط صور الوجه بواسطة VISIA-CR (نظام تصوير الوجه للأبحاث السريرية). تم تحليل خشونة الصورة بواسطة برنامج PRIMOS وتم تحليل سطوع الصورة بواسطة Chromameter CR -400. المنتج الخام من سلالة T65 يثبط البكتيريا المسببة للأمراض البشرية المختلفة مثل العصوية الرقيقة ، الإشريكية القولونية ، بروبيونيباكتيريوم أكنس ، المكورات العنقودية الذهبية ، الزائفة الزنجارية ، والمكورات العنقودية البشروية. كان IC50 من T65 المنتج الخام لأنشطة الكسح الجذري للفطر التيروزينيز والإيلاستاز و DPPH 58.73 و 14.68 و 6.31 ميكروغرام / مل على التوالي. تكاثر المنتج الخام T65 من النوع الأول من الكولاجين من النوع الأول في CCD -986 خلية Sk حتى 145.91 بالمائة ± 9.11 بالمائة (متوسط ​​± SD ؛ متوسط ​​24 و 48 و 72 ساعة) عند 250 بيكوغرام / مل. أكدت الجسيمات المتوسطة المسامية (SBA -15) الأداء المستدام من خلال التحكم في الإطلاق لمدة ثلاثة أيام. كريم تجميلي وظيفي مركب يحتوي على T65 المدمج في SBA -15 ، قلل بشكل ملحوظ من خشونة الجلد بنسبة 4.670 في المائة وزاد من سطوع البشرة بنسبة 0.472 في المائة بعد الاستخدام لمدة 4 أسابيع. المنتج الخام T65 يمنع مسببات الأمراض موجبة الجرام وسالبة الجرام. أكد الجسيم متوسط ​​المسام المركب ، SBA -15 ، أن المادة الفعالة من الناحية الفسيولوجية قد تم إطلاقها في حالة إطلاق مستدامة. أظهر المنتج الخام T65 مضادًا للميكروبات لا تشوبه شائبة ،مضادات الأكسدة، ومكافحة الشيخوخة ، والتبييض مع تأثيرات غير سامة للخلايا لخطوط الخلايا المختلفة المتعلقة بجلد الإنسان.

الكلمات الدالة: مضادات الأكسدة. السمية الخلوية. مضاد للتيروزيناز. مكافحة الشيخوخة. مضادات الميكروبات. جزيئات السيليكا المسامية. تركيبات مستحضرات التجميل تطبيق جمالي

فقدت cistanche الإمبراطورية الأعشابلديه أيضاتأثير تبييض البشرة.

1 المقدمة

الجلد هو أكبر عضو وغطاء خارجي لجسم الإنسان. يسمح المظهر المرئي للجلد بتقدير العمر والجنس والصحة والجاذبية والجمال [1،2]. تستخدم مستحضرات التجميل على نطاق واسع لتحسين مظهر الجلد وتقليل شيخوخة الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح التطبيق الموضعي لمستحضرات التجميل كيفية زيادة الجاذبية من خلال التلاعب بعوامل الجمال المرتبطة بتباين الوجه [3،4]. تبحث صناعات مستحضرات التجميل باستمرار عن مواد جديدة وطبيعية نشطة بيولوجيًا مع خصائص مضادة للشيخوخة ومضادة للأكسدة ومضادة للتيروزيناز ومضادة للميكروبات لتركيبات مستحضرات التجميل لتحسين أساليب العناية بالبشرة [5،6].

شيخوخة الجلد هي عملية بيولوجية معقدة ناتجة عن عوامل داخلية وخارجية مختلفة تؤدي إلى خلل وظيفي فيزيولوجي وفقدان السلامة الهيكلية للجلد. الشيخوخة الجوهرية ، المعروفة عمومًا بالشيخوخة الطبيعية (الشيخوخة الزمنية) للجلد ، ترتبط بالتغيرات الهرمونية على أساس العمر ، في حين ترتبط الشيخوخة الخارجية بحركة العضلات ، والتلوث ، والنيكوتين ، والتعرض للإشعاع الشمسي ، والكافيين ، ودرجة الحرارة ، وأنماط الحياة مثل كغذاء (تغذية) ، قلة النوم ، الإجهاد ، وظروف صحية أخرى [7-9]. يساعد الإيلاستين البشرة على العودة إلى وضعها الأصلي بعد الحركة ، في حين أن الإيلاستاز المنتج في خلايا أسينار يحلل الإيلاستين ويؤدي إلى شيخوخة الجلد [9]. يمنع مضاد الإيلاستاز الإيلاستاز ويحتفظ بالإيلاستين في حالته الأولية ، مما يمنع الجلد من الشيخوخة. مستحضرات التجميل أو منتجات العناية بالبشرة ذات الخصائص المضادة للشيخوخة تؤثر بشكل إيجابي على شيخوخة الجلد [10-13].

عادة ما يتم إنشاء الجذور الحرة أثناء التمثيل الغذائي الخلوي. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وأنواع النيتروجين التفاعلي (RNS) ، مثل جذور الأنيون ، والأكسيد الفائق ، والبيروكسيد ، وجذر الهيدروكسيل ، وأكسيد النيتريك (NO) ، والبيروكسينيتريت ، وحمض هيبوكلوروس مسؤولة عن الأضرار التأكسدية للخلايا والدهون والبروتينات ، والحمض النووي ، مما يؤدي إلى تصلب الشرايين ، والسرطان ، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، والشيخوخة الخلوية ، والالتهابات المزمنة ، ومرض السكري ، وارتفاع ضغط الدم ، والطفرات ، والتنكسات العصبية ، والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والسكتة الدماغية ، والصدمة الإنتانية ، وأمراض تنكسية أخرى [7 ، 14 - 17]. تمنع مضادات الأكسدة أكسدة البروتينات وتوليد ROS و RNS التي قد تقلل ضرر الجذور الحرة للأنسجة الطبيعية عن طريق مكافحة الإجهاد التأكسدي [17-19].

ينتج الجلد صبغة داكنة تعرف باسم الميلانين. يمنع إنتاج الميلانين الجلد من التلف الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية [9]. ومع ذلك ، فإن الإفراط في إنتاج وتراكم الميلانين يسبب فرط تصبغ جلدي ، مما يؤدي إلى مضاعفات جمالية مثل الكلف والنمش ونباتات الشيخوخة ، وحمة ، و ephelis [9،20]. Tyrosinase هو بروتين سكري موجود في أغشية الميلانوسومات المسؤولة عن التخليق الحيوي للميلانين عن طريق التحلل المائي لـ L-tyrosinase إلى 3 ، 4- dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) والأكسدة اللاحقة لـ L-DOPA إلى dopaquinone [21]. بسبب البلمرة العفوية ، يتحول الدوباكوينون أخيرًا إلى الميلانين [22]. يجب التحكم في إفراز الميلانين للحفاظ على سلامة الجلد. هذا هو السبب في أن اكتشاف مثبطات التيروزيناز الجديدة لتطوير تركيبات مستحضرات التجميل قد حظي باهتمام كبير [23-25].

تُضاف المواد الحافظة المضادة للميكروبات إلى مستحضرات التجميل للحفاظ على نقاء الميكروبات خلال فترة استخدامها بأكملها [26]. بدلاً من استخدام مواد حافظة لمستحضرات التجميل مثل ميثيل بارابين ، فإن المركبات الطبيعية المضادة للميكروبات التي لها وظائف أخرى أفضل وأكثر فائدة لصحة الإنسان [27-29]. قد تحتوي المستقلبات الثانوية المعزولة من الموارد البكتيرية على خصائص حافظة ومضادة للميكروبات تمنع استعمار مسببات الأمراض البكتيرية (Propionibacterium acnes و Staphylococcus epidermidis و Staphylococcus aureus) في الجلد [9،26،28].

المركبات النشطة بيولوجيًا التي تنتجها التربة أو البكتيريا البحرية ، وخاصة البكتيريا الشعاعية ، غير مستغلة ولا تزال غير مستكشفة [23،30]. المركبات النشطة بيولوجيًا المختلفة القابلة للتطبيق في صناعة مستحضرات التجميل ومستحضرات التجميل ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على خصائص مضادة للشيخوخة ومضادات الأكسدة ومضادات التيروزيناز ومضادات الميكروبات وغير السامة للخلايا ، لديها إمكانات كبيرة لاستخدامات جديدة.

هناك العديد من الدراسات حول المواد النشطة بيولوجيًا المعزولة من النباتات التي تُستخدم حاليًا في تركيبات مستحضرات التجميل ، ولكن يتوفر عدد قليل جدًا من الدراسات حول المواد النشطة بيولوجيًا من البكتيريا [9 ، 21 ، 24 ، 27 ، 31]. هدفت هذه الدراسة إلى تقييم الإمكانات التجميلية لمستخلصات أسيتات الإيثيل من السلالة البكتيرية Streptomyces sp. T65 للأنشطة المضادة للأكسدة ، ومكافحة الشيخوخة ، والتيروزيناز ، والمضادة للبكتيريا وأي تأثيرات سامة للخلايا على سلالات مختلفة من خلايا الفئران والبشر. بالإضافة إلى ذلك ، كنا نهدف إلى تصنيع جزيئات السيليكا المسامية. أخيرًا ، كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير المنتج التجميلي النهائي للتطبيق الموضعي باستخدام المواد النشطة بيولوجيًا المستخرجة من الكائنات الحية الدقيقة في التربة.

2. المواد والأساليب

2.1. الكواشف وخطوط الخلايا والمعدات

جميع المذيبات المستخدمة كانت من الدرجة التحليلية. تم شراء خط خلايا الورم الميلاني B 16- F10 ، وخط خلايا الورم الميلانيني للفأر 16- وخط خلايا الخلايا الكيراتينية البشرية (HaCaT) من American Type Culture Collection (ATCC ، Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء وسيط Dulbecco المعدل (DMEM) والبنسلين الستربتومايسين ومصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة (HI FBS) من Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd. ، سيول ، كوريا الجنوبية). تم شراء مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) من Dojindo (كوماموتو ، اليابان). تم شراء خط خلية بلعم الفأر RAW264.7 و CCD -986 Sk human fibroblasts من Korean Cell Line Bank (سيول ، كوريا الجنوبية). عديد السكاريد الدهني (LPS ، الإشريكية القولونية ، النمط المصلي O11: B4) ، السلفانيلاميد ، ثنائي هيدروكلوريد النفتيل إيثيلين ديامين ، تيروسيناز الفطر ، الإيلاستاز البنكرياس الخنازير ، التيروزين ، حمض الأسكوربيك ، أربوتين ، N-Succ- (Ala) {16} ، 3- (4 ، 5- ثنائي ميثيلثيازول -2- يل) -2 ، 5- ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، كولاجين من النوع الأول ، توين 20 ، رباعي ميثيل بنزيدين (TMB ) ، رباعي إيثيل أورثو سيليكات (TEOS) ، بلورونيك P -123 (بولي (إيثيلين جلايكول) - بلوك بولي (بروبيلين جليكول) - بلوك بولي (إيثيلين جليكول) ؛ PEG-PPG-PEG) و -خلية ميلانية - تم شراء هرمون التحفيز (-MSH) من سيجما الدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء 1 ، 1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) وحمض الأولينوليك من Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء الأجسام المضادة الأولية COL1A1 (الكولاجين ، النوع الأول ، ألفا 1) والجسم المضاد الثانوي المقترن بـ HRP (Horseradish peroxidase) من Santa Cruz Biotechnology (سانتا كروز ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام قارئ الألواح الدقيقة SpectraMax 340PC384 (الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) 96- لقراءة لوحة الآبار.

2.2. السلالات البكتيرية الممرضة

تم شراء Staphylococcus epidermidis KACC 13234 و Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 من مجموعة الثقافة الزراعية الكورية (KACC ، جيونجو ، كوريا الجنوبية) ؛ تم الحصول على Bacillus subtilis KEMB 51201-001 و Escherichia coli KEMB 212-234 و Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 من بنك كوريا للكائنات الدقيقة البيئية (KEMB ، سوون كوريا الجنوبية) ؛ و Propionibacterium acnes تم شراء KCTC 3314 من المجموعة الكورية للثقافات النوعية (KCTC ، Jeongeup ، كوريا الجنوبية).

2.3 العزلة والحفظ

تم جمع عينات مختلفة من التربة من الأراضي العشبية المستصلحة في هواسونغ (37◦16′10 "شمالاً 126◦45′43" شرقًا) وغابة جامعة كيونج جي (37◦18′1 "شمالًا 127◦2′20" شرقًا) في كوريا. تم عزل البكتيريا باستخدام طريقة سبق وصفها [9]. تم وضع خطوط على المستعمرات على ألواح R2A كل أسبوع للحفظ على المدى القصير وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية كتعليق في مرق R2A مكمل بنسبة 20 في المائة (حجم / حجم) جلسرين للحفظ على المدى الطويل.

2.4 الفحص والتعرف والموقف النشئي للسلالات المعزولة

تم الانتهاء من فحص مستحضرات التجميل والأنشطة المضادة للميكروبات من السلالات المعزولة كما هو موصوف سابقًا [9]. تم تحديد البكتيريا التي لها وظائف باستخدام تسلسل الجينات 16S rRNA. تم استخراج الحمض النووي الجيني للسلالات باستخدام مجموعة InstaGene Matrix (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تضخيم جين 16S rRNA بواسطة PCR باستخدام البادئة البكتيرية العالمية 27F و 1492R [32]. تمت تنقية منتج PCR باستخدام لوحة مرشح متعدد الشاشات (Millipore Corp. ، Bedford ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتم تسلسله باستخدام محلل DNA Biosystems 3770XL التطبيقي باستخدام مجموعة أدوات تسلسل دورة BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems ، Foster City ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت مطابقة تسلسل كامل تقريبًا مع برنامج SeqMan (DNASTAR Inc. ، Madison ، WI ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم التعرف على أقرب سلالة من السلالات الوظيفية المعزولة باستخدام EzBioCloud [33] وقاعدة بيانات NCBI GenBank [34]. تم الحصول على متواليات الرنا الريباسي 16S ذات الصلة من GenBank ، وتم إجراء تحليل النشوء والتطور باستخدام MEGA7 [35].

2.5 ثقافة البكتيريا

تم استزراع P. acnes عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام بشكل لاهوائي في مرق Schaedler اللاهوائي (Oxoid). للثقافة اللاهوائية ، تم استخدام جرة BBL اللاهوائية مع نظام حاوية توليد الغاز GasPak EZ (Becton Dickinson ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت زراعة S. epidermidis و S. aureus في وسط TSB (مرق الصويا التربتي) (Oxoid) عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الهواء. تمت تربية E. coli و P. aeruginosa و B. subtilis في وسط LB (Luria-Bertani) (Oxoid). زرعت سلالات بكتيرية معزولة في R2A عند 28 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام.

2.6. التخمير

بالنسبة لعملية التخمير ، تم تحضير اللقاح في مرق R2A عند 28 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام في الساعة 150 مساءً. تم تخمير السلالة T65 باستخدام لقاح بنسبة 1-2 في المائة في وسط ISP2 (مشروع Streptomyces الدولي 2) عند 28 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد عند 140 مساءً.

2.7. اِستِخلاص

تم الطرد المركزي لمرق الاستزراع المحصود عند 11305 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع جهاز طرد مركزي كبير السعة 1736R (لابوجين ، سيول ، كوريا). تم ترشيح المادة الطافية للثقافة باستخدام ورق ترشيح بحجم 150 مم (Whatman 1001-150 ، GE Healthcare ، Maidstone ، المملكة المتحدة) للتخلص من حطام الخلية وتركيزها باستخدام مبخر دوار عند 40 درجة مئوية. تم بعد ذلك استخلاص المنتج الخام المركز مرتين بحجم متساوٍ باستخدام خمسة مذيبات مختلفة (n-hexane ، di-ethyl ether ، dichloromethane ، chloroform ، و ethyl acetate). وجد أن أسيتات الإيثيل هي أفضل مذيب ، وأجريت تحليلات أخرى باستخدام مستخلص أسيتات الإيثيل. تم فصل الطبقة العضوية بواسطة قمع فصل وتبخرت حتى تجف. أخيرًا ، تمت إذابة المنتج الخام المجفف في ميثانول لمزيد من التقييم.

استخراج cistanche

2.8. مجموعة الكسور النشطة بواسطة HPLC التحضيري (Prep-HPLC)

تم جمع الأجزاء النشطة من مستخلص المستنبت الخام لـ T65 باستخدام HPLC التحضيري (سلسلة Agilent 12 0 0). تم استخدام عمود عكسي Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 (30 مم معرف × 25 سم) بحجم جسيم 15 ميكرومتر كمرحلة ثابتة. بالنسبة للمرحلة المتنقلة ، تم استخدام 0.1 في المائة من ماء HCHOOH (المذيب A) والأسيتونيتريل (المذيب B). كان تركيز المذيب ب 10 بالمائة إلى 100 بالمائة من 0 دقيقة إلى 60 دقيقة و 100 بالمائة من 60 دقيقة إلى 75 دقيقة. كان معدل التدفق 15 مل / دقيقة. تم استخدام كاشف متعدد الموجات (MWD) مع 208 و 230 و 254 و 280 نانومتر. تم تبخير الأجزاء المجمعة من 14 دقيقة إلى 21 دقيقة حتى تجف وتم إذابتها في ميثانول (منتج خام T65) لمزيد من التقييم.

2.9 صلاحية الخلية لخلية HaCaT

تم تحديد صلاحية الخلية لخلايا HaCaT بمقايسة CCK -8 (مجموعة عد الخلايا -8) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم زرع خلايا HaCaT في 96- أطباق بئر عند 104 خلايا لكل بئر ثم تم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في وسط Dulbecco المعدل لـ Eagles (DMEM) الذي يحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (FBS). عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من T65 المنتج الخام (10 مجم / مل ، 1 مجم / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 100 نانوغرام / مل ، و 1 نانوغرام / مل) ، وحضنت. في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون مع إضافة 10 ميكرولتر من كاشف CCK -8. تم قياس امتصاص خليط التفاعل باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الصفيحة الدقيقة عند 450 نانومتر وتم حساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية.

2.10. تقييم الأنشطة المضادة للأكسدة

2.10.1. تقييم السمية في خلايا RAW264.7

تم الحفاظ على خلايا RAW264.7 في DMEM تحتوي على 1 0 بالمائة من FBS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 بالمائة. تم زرع خلايا RAW264.7 في 96- صفيحة ميكروترية مسطحة جيدًا بكثافة 104 خلية لكل بئر بتركيزات مختلفة (0-1 مجم / مل) من المنتج الخام T65 وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ح في حاضنة 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، تم غسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي مخزّن من الفوسفات (PBS) ، وتمت إضافة 190 ميكرولتر من الوسط الطازج و 10 ميكرولتر من محلول MTT العامل (5 مجم / مل) إلى كل بئر ، ثم تم تحضين اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في حاضنة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، تمت إزالة المادة الطافية ، وتم إذابة بلورات فورمازان المتكونة بإضافة 150 ميكرولتر من DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) في كل بئر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم قياس شدة بلورات فورمازان الذائبة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 570 نانومتر.

2.10.2. تحديد أكسيد النيتريك

تمت المعالجة المسبقة لخلايا RAW264.7 (105 خلية / مل) بتركيزات مختلفة من المنتج الخام T65 (15.5-125 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة ، يليها التحفيز بـ 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 24 ساعة. تم تحديد تركيز NO المنطلق من الخلايا بواسطة كاشف Griess باستخدام المنحنى القياسي NO2– [36]. تم تحضين مائة ميكرولتر من المادة الطافية المستنبتة بـ 100 ميكرولتر من كاشف Griess (خليط من ثنائي هيدروكلوريد N – 1 – naphthyl ethylenediamine (NEDHC) والسلفانيلاميد) عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام. تم قياس الامتصاصية عند 540 نانومتر.

2.10.3. مقايسة الكسح الجذور الحرة DPPH

تم إجراء أنشطة إزالة الجذور الحرة DPPH وفقًا لطريقة موصوفة مسبقًا [9]. تم تخفيف المنتج الخام لمستخلص مزرعة T65 إلى تركيزات 6 0 0 و 200 و 100 و 20 و 4 ميكروغرام / مل في ميثانول. تم صنع خليط التفاعل بمقدار 180 ميكرولتر باستخدام 90 ميكرولتر من 0.1 ملي DPPH (مذاب في MeOH) و 90 ميكرولتر من محاليل العينات بتركيزات مختلفة (الجدول S1). تم خلط تفاعلات الاختبار تمامًا في 96- ألواح بئر ، وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وتم قياس الامتصاص عند 516 نانومتر باستخدام مقياس طيف ضوئي. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط DPPH على النحو التالي:

التثبيط (النسبة المئوية)=[1 - (ODexp - ODcon) / (ODstd - ODbln)] × 100 (1)

حيث ODexp هو امتصاص العينة التجريبية ؛ ODcon هو امتصاص التحكم ؛ ODstd ، امتصاص المعيار ؛ و ODbln ، امتصاص الفراغ.

2.11. تقييم أنشطة مكافحة الشيخوخة

2.11.1. تقييم السمية الخلوية في خلايا Sk CCD -986

تم تحديد سمية الخلايا بتركيزات مختلفة (0 - 1 مجم / مل) من المنتج الخام T65 في خلايا الخلايا الليفية لجلد الإنسان (CCD -986 Sk) بواسطة مقايسة MTT كما هو موضح سابقًا لمقايسة MTT لـ RAW264.7 الخلايا.

2.11.2. انتشار الخلايا الليفية البشرية باستخدام خلايا Sk CCD -986

تم تحديد تكاثر خلايا الأرومات الليفية الجلدية البشرية (HDF) في خلايا Sk CCD {0}} باستخدام مقايسة CCK -8. تم زرع خلايا CCD -986 في أطباق جيدة 96- عند 5 × 103 خلية / بئر ثم حضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في DMEM الذي يحتوي على 10 بالمائة من FBS. عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من T65 الناتج الخام (0-1 مجم / مل) وتم تحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في جو رطب يحتوي على 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون مع إضافة 10 ميكرولتر من كاشف CCK -8. تم قياس امتصاص خليط التفاعل باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية عند 450 نانومتر وتم تحديد النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة مقارنة بامتصاص الخلايا غير المعالجة.

Cistanche هو مضاد للشيخوخة.

2.11.3. فحص توليف الكولاجين من النوع الأول

تم تقييم توليف الكولاجين من النوع الأول بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). تم زرع خلايا CCD -986 في لوحات بئر 96- بكثافة 5 × 1 0 3 خلايا / بئر في DMEM تحتوي على 1 0 بالمائة من FBS وحضنت عند 37 درجة مئوية C لمدة 24 ساعة. تمت إضافة تركيزات مختلفة من T65 المنتج الخام (31.25-25 {{3 0} بيكوغرام / مل) في وسط خالٍ من FBS لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت إضافة 1 0 0 ميكرولتر من وسط الاستزراع ونوع الكولاجين الأول إلى أطباق البئر 96- المطلية بالكولاجين وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 و 48 و 72 ساعة. تم غسل كل بئر باستخدام محلول ملحي مخزّن بالفوسفات بنسبة 0.05 بالمائة مع 0.1 بالمائة من Tween 20 (PBST) وتم إضافة الجسم المضاد الأولي COL1A1 واحتضانه لمدة ساعة واحدة. مرة أخرى ، تم غسل الآبار بنسبة 0.05 بالمائة من PBST ، وتم إضافة جسم مضاد ثانوي مترافق مع HRP (بيروكسيداز الفجل) واحتضانه لمدة ساعة واحدة. تم غسل كل بئر باستخدام 0.05 بالمائة من PBST ، وإضافة TMB (رباعي ميثيل بنزيدين). بعد الحصول على كثافة اللون المطلوبة (الأزرق) ، يتم إنهاء التفاعل بإضافة 0.5N H2SO4 ، مما يجعل لون المحلول أصفر. تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة ، وتم تحديد إنتاج الكولاجين من النوع الأول.

2.11.4. مقايسة تثبيط Elastase

تم تقييم أنشطة تثبيط الإيلاستاز البنكرياس الخنازير (PPE) وفقًا للإجراء الموصوف سابقًا [9]. تم تخفيف المنتج الخام T65 إلى تركيزات من 3 0 {{1 0} 0 و 1 0 00 و 500 و 100 ميكروغرام / مل في ميثانول. تم تحضير خليط التفاعل باستخدام محلول 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0) ، 0.5 ملي مولار N-Succ- (Ala) 3- ρ-nitroanilide (SANA) كركيزة ، من الإيلاستاز البنكرياس الخنازير (3.5 وحدة / مل في 0.2 M Tris-HCl عازلة ؛ درجة الحموضة 8.0) والمثبط (عينة). تم تحضين كل عينة مسبقًا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم تحضين خليط التفاعل الكلي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم قياس الامتصاص عند 400 نانومتر. تم تحضير خليط التفاعل الكلي بمقدار 150 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول S2. كانت التركيزات النهائية للعينة في خليط التفاعل 300 ، 100 ، 50 ، 10 ميكروغرام / مل. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط معدات الوقاية الشخصية باستخدام الصيغة (1).

2.12. تقييم أنشطة التبييض

2.12.1. تقييم السمية الخلوية في خلايا B16F1

تم تحديد السمية الخلوية للمنتج الخام T65 لخلايا سرطان الجلد B16F1 عن طريق مقايسة MTT. تم زرع خلايا B16F1 في 96- أطباق جيدة عند 1 0 4 خلايا لكل بئر ثم حضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في DMEM الذي يحتوي على 10 بالمائة من FBS. عولجت الخلايا بتركيزات مختلفة من T65 الناتج الخام (0-1 مجم / مل) وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في جو رطب يحتوي على 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. تم قياس امتصاص خليط التفاعل باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو الصفيحة الدقيقة عند 450 نانومتر وتم حساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية.

2.12.2. تثبيط تخليق الميلانين في خلايا B16F10

تمت معالجة خلايا B16F10 مسبقًا بـ -MSH في 6- لوحات جيدة عند 105 خلايا لكل بئر وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في DMEM الذي يحتوي على 10 بالمائة FBS لتعزيز تخليق الميلانين. تم تحضين الخلايا بتركيزات مختلفة من المنتج الخام T65 (31.25 - 125 ميكروغرام / مل) و 100 ميكروغرام / مل من أربوتين كعنصر تحكم إيجابي في وجود أو عدم وجود -MSH لمدة 48 ساعة. لوحظ تثبيط تخليق الميلانين في خلايا سرطان الجلد B16F10.

يمنع Cistanche تكوين الميلانين.

2.12.3. مقايسة تثبيط الفطر التيروزينيز

تم تحديد أنشطة تثبيط التيروزيناز في الفطر كما هو موضح سابقًا [9]. تم تخفيف المنتج الخام T65 إلى تركيزات من 3 0 0 0 و 1000 و 500 و 100 ميكروغرام / مل في ميثانول. تم تحضير خليط التفاعل باستخدام محلول 0.1 مولار من فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6.8) ، 3 ملي مولار من محلول التيروزين [مذاب في DW (ماء مقطر)] ، وتيروزيناز فطر 2000 وحدة / مل (مذاب في محلول فوسفات بوتاسيوم 0.05 مولار ، الرقم الهيدروجيني 6.8 ؛ سيجما) في 96- لوحات جيدة. تم تحضين خليط الاختبار الكلي من 150 ميكرولتر (120 ميكرولتر من محلول فوسفات ، 10 ميكرولتر لتيروزين ، 15 ميكرولتر من محلول عينة ، و 5 ميكرولتر من فطر التيروزيناز ؛ الجدول S3) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتم قياس الامتصاص عند 475 نانومتر. كانت التركيزات النهائية للعينة في خليط التفاعل 300 ، 100 ، 50 ، 10 ميكروغرام / مل. كان المعيار بدون محلول العينة ، وكان التحكم بدون l-tyrosine ، وكان الفراغ بدون L-tyrosine ومحلول العينة. تم حساب النسبة المئوية لتثبيط التيروزيناز بتطبيق الصيغة (1).

2.13. تحليل الأحماض الأمينية

تم تحديد الأحماض الأمينية الحرة للمنتج الخام T65 بواسطة طريقة GC-FID (كروماتوغرافيا الغاز - كاشف تأين اللهب) في المعهد الكوري لأبحاث وأبحاث البوليمر (Koptri). بالنسبة لطريقة GC-FID ، كانت الآلة المستخدمة عبارة عن Agilent 689 0 N GC-FID ؛ العمود ZB-AAA (10 م × 0.25 مم) ؛ درجة حرارة جزء الحقن ، 250 درجة مئوية ؛ عمود الحقن ، 2 ميكرولتر ؛ نسبة الانقسام ، 5: 1 ؛ حالة درجة الحرارة ، 110 درجة مئوية → 32 درجة مئوية / دقيقة → 320 درجة مئوية ؛ كاشف ، FID @ 320 درجة مئوية ؛ الناقل ، غاز النيتروجين ، 1.5 مل / دقيقة ؛ صانع ظاهرة. معيار الأحماض الأمينية والتركيز 200 ميكرولتر / لتر.

تم تحديد الأحماض الأمينية المركبة لمنتج خام T65 بواسطة طريقة GC-FID (كروماتوغرافيا الغاز - كاشف تأين اللهب) في المعهد الكوري لأبحاث وأبحاث البوليمرات (Koptri). بالنسبة إلى GC-FID ، كانت الآلة المستخدمة عبارة عن Agilent 689 0 N GC-FID ؛ العمود ZB-AAA (10 م × 0.25 مم) ؛ درجة حرارة جزء الحقن ، 250 درجة مئوية ؛ عمود الحقن ، 2 ميكرولتر ؛ نسبة الانقسام ، 5: 1 ؛ حالة درجة الحرارة ، 110 درجة مئوية → 32 درجة مئوية / دقيقة → 320 درجة مئوية ؛ كاشف ، FID @ 320 درجة مئوية ؛ الناقل ، غاز النيتروجين ، 1.5 مل / دقيقة ؛ صانع ظاهرة. معيار الأحماض الأمينية والتركيز 200 ميكرولتر / لتر.

2.14. حمض دهني

تم تحديد الأحماض الدهنية للمنتج الخام T65 بواسطة طريقة GC-FID (كروماتوغرافيا الغاز - كاشف تأين اللهب) في المعهد الكوري لأبحاث وأبحاث البوليمر (Koptri). بالنسبة إلى GC-FID ، كانت الآلة المستخدمة هي Agilent 689 0 N GC-FID ؛ العمود ، Supelco SP – 25 0 0 (1 0 0 م × 0.25 مم × 0.20 ميكرومتر) ؛ درجة حرارة جزء الحقن ، 250 درجة مئوية ؛ عمود الحقن ، 1 ميكرولتر ؛ نسبة الانقسام ، 50: 1 ؛ حالة درجة الحرارة ، 100 درجة مئوية (4 دقائق) → 3 درجات مئوية / دقيقة → 240 درجة مئوية (15 دقيقة) ؛ كاشف ، FID @ 285 درجة مئوية ؛ الناقل ، غاز النيتروجين ، 0.8 مل / دقيقة ؛ صانع ، SUPELCO 37 Component FAME Mix ؛ والتركيز 0.5 مجم / مل.

2.15. أنشطة مضادات الميكروبات

تم إجراء تثبيط البكتيريا المسببة للأمراض عن طريق طريقة انتشار القرص. تم نشر مائة ميكرولتر من مستنبت P. acnes عند 108 CFU (وحدة تشكيل مستعمرة) / مل واحتضانها عند 35 درجة مئوية بشكل لاهوائي لمدة 2-3 أيام على ألواح أجار Schaedler جنبًا إلى جنب مع قرص 6 مم (Whatman) يحتوي على 15 ميكروغرام من المستخلص الخام المذاب في الميثانول وتم قياس مناطق التثبيط. وبالمثل ، تم نشر 100 ميكرولتر من S. epidermidis ، و S. aureus ، و B. subtilis ، و E. coli ، و P. aeruginosa عند 108 CFU / mL وحضنت عند 35 درجة مئوية هوائيًا على أطباق R2A أو LBA لـ 1-2 تم قياس أيام ومناطق التثبيط.

2.16. توليف جسيمات السيليكا ميسوبوروس

تمت إذابة البوليمر المحفز للهيكل في ماء منزوع الأيونات لتحضير محلول ميسيل. تم تصنيع مواد السيليكا ميسوبوروس وفقًا للطرق الموضحة في الأدبيات [37]. لتخليق جزيئات السيليكا متوسطة المسام (SBA -15) ، تم إذابة 10 جم من Pluronic P123 (EO20PO70EO20 ، BASF Corporation ، Florham Park ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، في 55 مل من 2 M HCl ، متبوعًا بالتقليب في الغرفة درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. علاوة على ذلك ، تمت إضافة 22 جم من رباعي إيثيل أورثوسيليكات (TEOS) إلى المحلول وتقليبها مرة أخرى لمدة 30 دقيقة ووضعها عند 36 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ثم وضعها في الفرن ، حيث تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 100 درجة مئوية ، وتم تركها من أجل 4 أيام في حالة السكون. بعد 4 أيام ، تغير المحلول إلى محلول غائم في الزجاجة. تم ترشيح المحلول المعكر باستخدام طبقتين من ورق ترشيح السليلوز وغسله باستخدام EtOH (مرتين) وماء DI (منزوع الأيونات) (مرتين). تم تجفيف المسحوق المرشح الناتج في فرن حراري 120 درجة مئوية ووضعه في فرن مفل (Hanyang Scientific Equipment Co.، Ltd. ، سيول ، كوريا الجنوبية). تم تصنيع ست عينات بنفس الشروط ولكن في دفعة مختلفة. تم التقاط الصور المجهرية الإلكترونية للإرسال (TEM) لـ SBA المركب -15 في جامعة سيول الوطنية عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (Talos L120C ؛ FEI).

2.17. BET تحليل مساحة السطح

تم قياس حجم جزيئات السيليكا بواسطة Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt. ، Malvern ، المملكة المتحدة). لتحضير عينة تحليل BET (Brunauer-Emmett-Teller) ، تمت إضافة 5 جم من P -123 إلى 76 جم من 2M HCl وتم التقليب عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، عندما تم إذابة P -123 تمامًا ، تمت إضافة 160 مل من ماء DI (منزوع الأيونات) و TEOS بشكل موحد (15 مل / دقيقة) وتقليبها عند 750 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم فصل المسحوق المتشكل بالترشيح ووضع المسحوق المفصول في كشتبان وغسله باستخدام Soxhlet لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تم غسلها بماء DI وحرقها في فرن مفل (Hanyang Scientific Equipment Co.، Ltd. ، كوريا الجنوبية). تم إجراء تحليلات مساحة سطح BET لتأكيد أداء المسحوق المنتج بواسطة تصنيع SBA -15. تم الانتهاء من تحليلات BET من قبل جامعة Inha وجامعة Changwon الوطنية.

تم استخدام محلل امتصاص الغاز (Autosorb iQ ، Quantachrome Instruments ، آشلاند ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية) لفحص توزيعات مساحة السطح وحجم المسام لمواد السيليكا المسامية المحضرة. تم حساب توزيعات مساحة السطح وحجم المسام باستخدام برنامج ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc. ، Boynton Beach ، FL ، الولايات المتحدة الأمريكية) استنادًا إلى متساوي درجة حرارة الامتصاص والامتصاص. تم تفريغ الجسيمات المصنعة الأصلية عند 300 درجة مئوية / 3 ساعات ، ثم تم قياس متساوي درجة حرارة الامتزاز والامتصاص N2 عند درجة حرارة -196 درجة مئوية. تم تطبيق تحليل BET متعدد النقاط لحساب مساحة السطح الإجمالية.

2.18 تقييم الاستدامة

لتأكيد وجود T65 في SBA المضمن -15 ، تم إجراء الأداء التالي على النحو التالي: تم خلط 12 جم من SBA -15 و 1.2 جم من المنتج الخام T65 في 500 مل أسيتونتريل. تم تقليب المحلول لمدة 18 ساعة تحت 30 ْم. بعد الترشيح ، يرشح الخليط ويجفف الجسيمات المرشحة في فرن حراري 100 درجة مئوية. للعثور على جسيم T65 نفسه في SBA -15 ، تمت إذابة 1 جم من T65 المجفف المضمّن في SBA -15 في أسيتونيتريل وأضيف 25 مل من حمض الفلوريك 3 مولار. تم تقليب الخليط عند درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة حتى يصبح المحلول صافياً. بعد ذلك ، يرشح المحلول ، ويستخدم محلول الترشيح كعينة. تم تحليل العينات التي تم الحصول عليها من التجارب المذكورة أعلاه بواسطة HPLC.

لتحديد خاصية الإطلاق الخاضع للرقابة ، تم صب 35 مل من SBA -15 في 50 مل من الزيت المعدني (M3516 ؛ Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) وخلط جيدًا. بعد ذلك ، تمت إضافة 50 مل من ماء DI إلى الخليط ورجها تحت درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات ، ثم تُترك على المنضدة لمدة 12 ساعة. عندما تم فصل الطبقة السائلة ، تم التخلص من طبقة الماء ، وتم جمع 1 مل من طبقة الزيت كعينة لتحليل HPLC. تم تكرار نفس التجربة في اليوم الثاني والثالث وتم تحليل العينة مرة أخرى باستخدام HPLC.

2.19 صياغة مستحضرات التجميل والتطبيق

2.19.1. اختبار الصياغة والثبات

صُنع منتج مستحضرات التجميل من كريم من نوع المستحلب. تم تحديد ثبات المستحضر التجميلي عن طريق الحفاظ على مستحضرات التجميل في درجات حرارة مختلفة (37 ، 45 ، 60 درجة مئوية) بما في ذلك الثلاجة ، الثلاجة ، وفي درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 28 يومًا. لوحظ ثبات الكريم التجميلي في الأسابيع الأول والثاني والثالث والرابع.

2.19.2. التجارب السريرية والمتطوعين وطرق التطبيق

تم تطبيق كريم تجميلي وظيفي يحتوي على منتج خام T65 على 21 متطوعة لتحديد مدى تحسن التجاعيد وفعالية التبييض من خلال خشونة البشرة وإشراقها. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية للمشاركة البشرية لهذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) (EL-P -7400). تم الحصول على الموافقة المسبقة من جميع المشاركين الأفراد. أجريت الاختبارات قبل تطبيق المنتج ، بعد أسبوعين وبعد 4 أسابيع. تم وضع ما يقرب من 5 ملغ من مستحضرات التجميل مرتين في اليوم (صباحًا ومساءً) على الوجه بعد تنظيف الوجه ، وتم دهنه بنعومة حسب قوام الجلد. لم يُسمح للمتطوعين باستخدام أي كريمات أو منتجات أخرى قبل أسبوع من التجربة وأثناء التجربة.

2.19.3. طرق التقاط الصور ومعالجتها

تم التقاط الصور بواسطة VISIA-CR. تم تحليل خشونة الصور بواسطة برنامج PRIMOS (الإصدار 5.8E من PRIMOS ، Canfield Scientific ، Inc. ، Parsippany-Troy Hills ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب متوسط ​​الخشونة (Ra) وأقصى عمق للخشونة (Rmax) باستخدام الصيغة التالية:

معدل Ra أو Rmax (النسبة المئوية)=(القيمة قبل العلاج - القيمة بعد العلاج) / القيمة قبل العلاج × 100 (2)

تم تحليل سطوع الصور بواسطة Chromameter CR -400. L * هي معلمة السطوع ويتم قياسها بالصيغة التالية:

L * معدل متزايد (بالمائة)=(القيمة قبل العلاج - القيمة بعد العلاج) / القيمة قبل العلاج × 100 (3)

2.20. تحليل احصائي

تم إجراء الحسابات الإحصائية لقيمة IC5 0 بواسطة البرنامج الإحصائي OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation ، Northampton ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية). أجريت جميع التجارب في ثلاث نسخ ، وتم تقديم جميع النتائج على أنها متوسط ​​± SD لثلاث تجارب منفصلة. تم تحليل البيانات من خلال تحليل عينة مستقلة من اختبار t أحادي الاتجاه (ANOVA أحادي الاتجاه) ، متبوعًا باختبار Tukey اللاحق باستخدام OriginPro 8.5. اعتبرت الاختلافات كبيرة عند p <>

3. النتائج والمناقشات

3.1. عزل وانتقاء وتطور سلالات مختارة من السلالات النشطة

تم عزل 2285 سلالة بكتيرية من عينات التربة التي تم جمعها. أظهرت نتائج الفحص أن 102 سلالة من البكتيريا لها وظائف قابلة للتطبيق على مستحضرات التجميل (الجدول S4). على أساس الفحص الأولي ، Streptomyces sp. وجد أن T65 له أنشطة أعلى لجميع التطبيقات التجميلية ، مثل مضادات الأكسدة ومضادات الإيلاستاز ومضادات التيروزيناز والأنشطة المضادة للميكروبات. أخيرًا ، تم اختيار السلالة T65 لمزيد من التقييم لتحديد تطبيقها المحتمل في مستحضرات التجميل. أظهر التحليل الوراثي أن السلالة T65 شكلت كليدًا مع Streptomyces bungoensis DSM 41781T (أقرب سلالة على أساس تسلسل الجينات الرنا الريباسي 16S) بقيمة تمهيد قوية (الشكل S1).

3.2 كشف وجمع المواد النشطة بيولوجيا

تم جمع المواد النشطة بيولوجيًا المختلطة من مستخلص مزرعة أسيتات الإيثيل T65 من Prep-HPLC. تم قياس المواد النشطة بيولوجيًا عند 208 و 230 و 254 و 280 نانومتر بواسطة أجهزة الكشف. تم جمع الكسور على أساس الوقت (من 14 دقيقة إلى 21 دقيقة). تم تبخير الأجزاء التي تم جمعها حتى تجف وتم إذابتها في ميثانول (منتج خام T65) واستخدمت في جميع التقييمات ، بما في ذلك الأنشطة المضادة للميكروبات.

3.3 السمية الخلوية في خلية هاكات

ظلت صلاحية الخلية في خط الخلايا الكيراتينية البشرية (خلية HaCaT) غير متأثرة بالمنتج الخام T65 حتى 10 مجم / مل. من ناحية أخرى ، زادت صلاحية الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة عندما تم تطبيق تركيزات من 10 نانوغرام / مل إلى 10 ملغ / مل من المنتج الخام T65 (الشكل S2). نتج عن نطاق التركيز هذا أكثر من 100 في المائة من صلاحية الخلية ، مما يشير إلى أنه عزز تكاثر خلايا HaCaT وكان ، بالتالي ، غير سام لخط خلية HaCaT.

3.4. الأنشطة المضادة للأكسدة

3.4.1. السمية الخلوية في خلية RAW264.7

تم تقييم السمية الخلوية للمنتج الخام T65 من خلال صلاحية الخلية في RAW264.7 الضامة بواسطة طريقة اختبار MTT. لم يظهر المنتج الخام T65 أي تأثير سام للخلايا على خطوط الخلايا RAW264.7.

على العكس من ذلك ، ساعد المنتج الخام T65 على تكاثر خلايا RAW264.7 بطريقة تعتمد على الجرعة عند معالجتها بـ 13.5 إلى 1 0 00 ميكروغرام / مل. عندما تم استخدام 1000 ميكروغرام / مل من المنتج الخام T65 ، كانت صلاحية الخلية لخلايا RAW264.7 هي 118.7 بالمائة (p <0.05). أظهرت="" هذه="" النتائج="" أن="" مركب="" t65="" الخام="" كان="" غير="" سام="" حتى="" 1="" مجم="" مل="" ويمكن="" استخدامه="" في="" تركيبات="" مستحضرات="">

3.4.2. تثبيط إنتاج أكسيد النيتريك (NO)

تم استخدام كاشف Griess لتحديد مستويات NO. لتحديد تثبيط NO ، RAW264.7عولجت الخلايا بـ 1 ميكروغرام / مل LPS (عديد السكاريد الدهني) مع تركيزات مختلفة من المنتج الخام T65. تم تنشيط خلايا RAW264.7 بواسطة LPS ، ولم يتم قياس أي إنتاج كتركيز نتريت في وسط الثقافة. مقارنةً بـ LPS وحده ، فإن المنتج الخام T65 بشكل كبير (p <0. 001)="" يثبط="" تركيز="" النتريت="" في="" خلايا="" raw264.7="" المحفزة="" بـ="" lps="" بطريقة="" تعتمد="" على="" التركيز="" عند="" استخدامه="" من="" 15.5="" إلى="" 125="" ميكروغرام="" مل="" (الشكل="" 2).="" كانت="" الضامة="" عبارة="" عن="" تعبير="" شبيه="" بـ="" lps-toll="" لـ="" no="" synthase="" (inos)="" المحرض="" عن="" طريق="" الإشارة="" إلى="" تنشيط="" الخلية="" عبر="" المستقبلات="" [38].="" lps="" هو="" منشط="" للبلاعم="" ويلعب="" دورًا="" مهمًا="" في="" إنتاج="" no="" في="" خلايا="" الثدييات="" [39].="" no="" هو="" جذر="" حر="" تنتجه="" الخلايا="" ذات="" الكفاءة="" المناعية="" مثل="" البلاعم="" [40].="" إنتاج="" أكسيد="" النيتروجين="" له="" تأثير="" بلعمي="" على="" الضامة.="" وهكذا="" ،="" تم="" اختيار="" خط="" خلايا="" البلاعم="" raw264.7="" لفحص="" مضادات="" الأكسدة.="" لفترة="" طويلة="" ،="" تم="" إيلاء="" اهتمام="" كبير="" للبحث="" عن="" مضادات="" الأكسدة="" الطبيعية="" لمنع="" إنتاج="" no="" [41].="" عند="" 125="" ميكروغرام="" مل="" ،="" انخفض="" المنتج="" الخام="" t65="" بشكل="" كافٍ="" مستويات="" أكسيد="" النيتروجين="" بنسبة="" 57.4="" في="" المائة="" مقارنةً="" بأكسيد="" النيتروجين="" الناتج="" عن="" 1="" ميكروغرام="" مل="" lps.="" على="" أساس="" تثبيط="" أكسيد="" النيتروجين="" الناتج="" في="" خط="" خلايا="" البلاعم="" raw264.7="" الناجم="" عن="" lps="" ،="" يمكن="" اعتبار="" مستخلص="" ثقافة="" t65="" أحد="" مضادات="" الأكسدة="">

يتم إعطاء DPPPHrRaaddiciacal lsScacvaveennggininggpAerccteivnitayges بتركيزات مختلفة وقيمة IC50 للمنتج الخام T65 في الجدول S5. تم استخدام حمض الأسكوربيك (فيتامين ج) كمعيار لأنه يستخدم في المستحضرات ، والكريمات ، والأمصال ، والبقع ، والتي من المعروف أن لها أنشطة قوية مضادة للأكسدة للتطبيقات الموضعية [42]. تم العثور على IC50 لأنشطة الكسح الجذري DPPH للمنتجات الثانوية لفيتامين C و T65 لتكون 5.01 و 6.31 ميكروغرام / مل ، على التوالي (الشكل 3).

لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات حول الأنشطة المضادة للأكسدة من العزلات البكتيرية مقارنة بتلك الموجودة في المواد النباتية وقد ركزت معظم الدراسات على المنتجات النباتية الراسخة [43-49]. كان تركيز 10 ميكروغرام / مل من المنتج قادرًا على تنظيف 68.66 ± 2.83 بالمائة من الجذور الخالية من DPPH. كان المنتج الخام IC50 من T65 مشابهًا تقريبًا لتلك الموجودة في أقوى مضادات الأكسدة فيتامين C ، مما أظهر أنه يمكن استخدامه كعامل مضاد للأكسدة في صياغة مستحضرات التجميل.

3.5.1. السمية الخلوية في خلايا Sk CCD -986

تم تقييم السمية الخلوية للمركبات الخام لـ T65 في خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية (HDF) في خط خلايا Sk CCD -986 باستخدام مقايسة MTT. عندما تم توفير تركيز T65 المنتج الخام من 0 إلى 1 مجم / مل ، تكاثرت خلايا HDF بطريقة تعتمد على الجرعة حتى تركيز 500 ميكروغرام / مل. أظهرت هذه النتيجة أن المركبات الخام من T65 كانت غير سامة للخلايا لخلايا HDF. ومع ذلك ، وجد أن تركيزًا يزيد عن 1 مجم / مل سام للخلايا ، ونجا 81.34 في المائة فقط من الخلايا مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 4).

3.5.2. انتشار HDF

تم تحديد تكاثر خلايا HDF باستخدام خط خلية CCD {0} Sk. انتشر المنتج الخام T65 خلايا HDF بطريقة تعتمد على التركيز من 0 إلى 500 ميكروغرام / مل (الشكل 5). ومع ذلك ، كانت سامة للخلايا بتركيز 1 مجم / مل. أكد نمو الخلايا الظهارية الجلدية للإنسان القدرة على تحسين التجاعيد من خلال التغيير في الخلايا المستنبتة الأولية المعزولة من خلايا الجلد البشرية وإفراز الكولاجين [50،51].

3.5.3. الكولاجين من النوع الأول

تم اكتشاف تخليق نوع الكولاجين الأول بواسطة ELISA. زاد الناتج الخام لـ T65 عند 250 بيكوغرام / مل من تركيز الكولاجين من النوع الأول بطريقة تعتمد على الجرعة حتى 145.91 بالمائة ± 9.11 بالمائة (متوسط ​​± SD ؛ متوسط ​​24 و 48 و 72 ساعة). أظهرت نتيجة ثلاث تجارب في 24 و 48 و 72 ساعة تخليق النوع الأول من الكولاجين (الشكل 6) .. وهكذا ، أكد إفراز الخلايا الجلدية للكولاجين المصحوب بنمو الخلايا الظهارية الجلدية البشرية قدرة مركبات T65 على تحسين التجاعيد.

3.6 أنشطة التبييض

3.6.1. السمية الخلوية في خلايا B16F1

نتيجة السمية الخلوية لمنتج خام T65 على خلايا سرطان الجلد B16F1 بواسطة مقايسة MTT موضحة في الشكل 8. نتائج حضانة المنتج الخام T65 في خلايا B16F1 أظهرت تأثيرات غير سامة تصل إلى تركيز 1 مجم / مل. تكاثرت خلايا B16F1 بطريقة تعتمد على الجرعة حتى تركيز 62.5 ميكروغرام / مل ، ولكن تم تقييم انخفاض معنوي (p <{14}}. 05)="" يعتمد="" على="" الجرعة="" في="" قابلية="" الخلية="" للحياة="" من="" 125="" إلى="" 1000="" ميكروغرام="" مل.="" ومع="" ذلك="" ،="" بتركيز="" 1="" مجم="" مل="" ،="" لوحظ="" 99.12="" بالمائة="" ±="" 4.16="" بالمائة="" من="" الخلايا="" القابلة="" للحياة="" (الشكل="" 8).="" أظهرت="" النتائج="" التجريبية="" أن="" مستخلص="" أسيتات="" الإيثيل="" من="" سلالة="" t65="" كان="" غير="" سام="" للخلايا="" لخط="" خلايا="" سرطان="" الجلد="" b16f1="" ويمكن="" استخدامه="" في="" صياغة="" مستحضرات="" التجميل="" لتبييض="" بشرة="">

3.6.2. تثبيط تخليق الميلانين في خلايا B16F10

لتأكيد تأثير التبييض ، خلايا B16F10 ، خط خلوي يفرز وينتجتم استخدام الميلانين في الخلايا. لتعزيز تخليق الميلانين ، تم استكمال B16F10 بـ 1 ميكروغرام من -MSH. تم استخدام Arbutin (100 ميكروغرام / مل ؛ عامل تبييض تجاري) كعنصر تحكم إيجابي. أظهرت الملاحظة المجهرية لهذه التجربة تثبيطًا شبه كامل للميلانين عن طريق تطبيق 125 ميكروغرام / مل من مستخلص ثقافة T65 في 48 ساعة (الشكل 9 أ ، ب). أثبتت هذه التجربة أن مستخلص مستنبت T65 لديه القدرة على تثبيط تخليق الميلانين بطريقة تعتمد على الجرعة ويمكن استخدامه كعامل مبيض لصياغة مستحضرات التجميل للتطبيقات الموضعية.

3.7 مواد السيليكا ميسوبوروس

مادة مسامية هي مادة تحتوي على مسام يبلغ قطرها من 2 إلى 50 نانومتر وفقًا لتسمية IUPAC (الاتحاد الدولي للكيمياء البحتة والتطبيقية) ، وبالتالي فإن مادة السيليكا المسامية عبارة عن مادة سيليكا لها مسام يتراوح قطرها بين 2 و 50 نانومتر. تم الإبلاغ عن هذه المادة في السبعينيات أولاً في براءات الاختراع الأمريكية ، ولكن لم يتم ملاحظتها جيدًا في المجالات ذات الصلة ، وبالتالي تم البحث عن مادة مماثلة وتوليفها بشكل مستقل من قبل اليابان مرة أخرى في عام 1990 [69]. تبعت شركة Mobil Corporation المزيد من الأبحاث التفصيلية ، وقاموا بتسمية هذه المادة MCM (مادة موبيل البلورية) ، مع أمثلة مثل MCM -41 أو MCM -48 ، والتي يتراوح قطرها من 2 إلى 6 نانومتر [70،71]. نجحت مجموعة بحثية أخرى في جامعة كاليفورنيا ، سانتا باربرا ، في تصنيع مسام أكبر حجمًا (5-30 نانومتر) من السيليكا المسامية بعد 6 سنوات ، وأطلقوا عليها اسم SBA (مادة سانتا باربرا غير المتبلورة) -15 [72] . تم تصميم مادة Mesopore silica في البداية لاستخدامها كمنخل جزيئي نظرًا لطابعها الهيكلي الخاص ، ولكنها وجدت مؤخرًا مجموعة واسعة من التطبيقات في توصيل الأدوية والمحفزات والمستشعرات الحيوية وتخزين الطاقة وما إلى ذلك.

هناك اختلافات مختلفة في المواد المسامية SBA -15 و MCM -41. ومع ذلك ، فإن أبسط طريقة للتمييز بين هذين النوعين هي سماكة جدار السيليكا. يتميز جدار SBA -15 بجدار السيليكا السميك بهيكل أكثر ثباتًا وصلابة مقارنةً بهيكل MCM -41 ، الذي يتميز بسمك جدار أرق. علاوة على ذلك ، فإن الطريقة التركيبية لـ SBA -15 أبسط من طريقة MCM -41. بسبب هذه الاختلافات ، تم اختيار SBA -15 لحمل المنتج الخام T65 النشط بيولوجيًا داخل السطح المتوسط ​​لمادة السيليكا.

3.8 تخليق جزيئات السيليكا ميسوبوروس

بعد إجراء عملية التكليس تحت 200 درجة مئوية لمدة ساعتين و 600 درجة مئوية لمدة 3 ساعات متواصلة ، تم الحصول على مسحوق السيليكا الأبيض ميسوبوروس الناتج. تم تصنيع SBA -15 من 8 نانومتر من المسام في هذه العملية. تم العثور على أحجام جسيمات SBA -15 بقطر 11.539-13.630 ملم (الشكل S4) وتم تحديدها بواسطة منشأتين مختلفتين: مختبر جامعة Inha ومختبر جامعة تشانغوون الوطنية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيع جميع العينات الست في الشكل S4 بنفس الطريقة ولكن بدفعة مختلفة.

عندما تم الحفاظ على الخليط عند 60 درجة مئوية وتركه لمدة 4 أيام في ظل ظروف ثابتة باتباع الطريقة المذكورة أعلاه ، تم التعرف على SBA -15 من مسام 5 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تم التحكم في درجة الحرارة عند 120 درجة مئوية ، تم تصنيع SBA -15 بمقدار 10 نانومتر. وفقًا للنتائج ، يمكن التحكم في حجم الميزوبور اعتمادًا على عملية الشيخوخة [73]. تم استخدام SBA -15 من مسام 10 نانومتر (الشكل 11) لمزيد من المعالجة لأن المواد النانوية السيليكا المسامية الكبيرة لها إجراءات توصيل أفضل للجزيئات الحيوية من المسام الضيقة [74].

3.9 تقييم الأداء المستدام

لتحديد ما إذا كانت SBA المسامية -15 تتمتع بقدرة على الإطلاق الخاضع للرقابة ، تم دمج SBA -15 والمنتج الخام T65 معًا في ماء DI ، أو ميثانول ، أو أسيتونيتريل ، أو مذيب إيثيلين جلايكول. عندما تم خلط SBA -15 والماء ، أصبح المحلول ملاطًا بسبب التخثر بين سطح السيليكا والماء. كان الميثانول مذيبًا جيدًا لكل من منتج خام السيليكا و T65. ومع ذلك ، بسبب السمية ، تم استبدال الميثانول بالأسيتونيتريل. تم تحديد جزيئات نسبة الغمر T65 بقيمة PV (الجدول S13). كما هو موضح في الجدول S13 ، انخفضت قيمة PV لـ SBA -15 بعد الانغماس في المنتج الخام T65. أظهر هذا أن مواد T65 كانت مغمورة جيدًا داخل جزيئات السيليكا متوسطة المسام.

لتحديد ما إذا كان هناك T65 داخل الجسيم ، تم فحص T65 نفسه بواسطة HPLC (الشكل S5). كما هو موضح في البيانات ، كان هناك قمتان محددتان (داخل المربع الأحمر) كانا مرئيين دائمًا في حالة مقتطفات ثقافة T65 ، على الرغم من تغيير مجموعة التحضير T65. كان لدى هاتين القمتين أوقات استبقاء 10 دقائق و 12 دقيقة عند 230 نانومتر. تم فحص عينة الترشيح في HPLC لتحديد ما إذا كان T65 موجودًا داخل SBA المضمن -15. كما هو مبين في الشكل S6 ، لوحظت قمتان محددتان بالقرب من 10 دقائق و 12 دقيقة. علاوة على ذلك ، لوحظت ذروة صغيرة بالقرب من 18 دقيقة من وقت الاحتفاظ ، وهو أمر مهم للغاية لتتبع منتجات T65 التي تم إصدارها بمرور الوقت.

يمثل الشكل 12 الإصدار الخاضع للرقابة للاختبار المستدام لـ SBA المضمن لـ T65 -15 من 0 إلى 3 أيام. كانت الذروة المحددة لـ T65 مرئية بالقرب من 15 و 2 0 دقيقة من الأيام 0 إلى 3. تم غمر المنتجات الخام T65 بشكل صحيح وتم إفرازها تدريجياً بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لمواد السيليكا ميسوبوروس (SBA {11}}) المقترحة في هذه الدراسة أن تحمل مواد نشطة فسيولوجيًا في المنتج الخام T65 وتؤكد أن المواد النشطة فسيولوجيًا تم إطلاقها بطريقة إطلاق مستدامة بعد التحميل. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مادة السيليكا ميسوبوروس المقترحة في هذه الدراسة ، في المستقبل ، كحامل جيد لتلقيح مختلف المواد الوظيفية وكمواد مستدامة الإطلاق من خلال دعم العديد من المواد النشطة من الناحية الفسيولوجية.

4 - نتائج

المواد الثانوية النشطة بيولوجيًا المستخرجة من الكائنات الحية الدقيقة في التربة ذات أهمية للتطبيقات التجميلية نظرًا لأنشطتها المضادة للميكروبات ومضادات الأكسدة ومضادة للتجاعيد وتبييض البشرة ومضادات الميكروبات. تصف هذه الدراسة النشاط الجديد لمستخلص أسيتات الإيثيل من سلالة الثقافة T65 للمكونات الوظيفية في تركيبات مستحضرات التجميل. كان المنتج الخام T65 غير سام لخطوط الخلايا المختلفة ، مثل HaCaT (خلية كيراتينية بشرية) و RAW264.7 (خلية بلعم) و CCD -986 Sk (خلية خلايا ليفية لجلد الإنسان) وخلايا سرطان الجلد B16F1 و B16F10 . بالإضافة إلى ذلك ، أظهر منتج T65 الخام تنظيمًا لتخليق الكولاجين من النوع الأول ، وهو أمر مهم جدًا لتقليل التجاعيد على الجلد. علاوة على ذلك ، فإن المنتج الخام T65 يثبط بشكل كاف البكتيريا المسببة للأمراض البشرية مثل B.subtilis و E. coli و P. acnes و S. aureus و S. epidermidis ، مما قد يساعد في منع تلف مستحضرات التجميل واستعمار البكتيريا المسببة للأمراض. تشكيل حب الشباب الشائع على جلد الإنسان. علاوة على ذلك ، فإن المنتج الخام T65 يثبط تيروزيناز الفطر لتأثير التبييض وإيلاستاز البنكرياس الخنازير للأنشطة المضادة للشيخوخة ، ويمنع أكسيد النيتروجين وكسح جذور DPPH للأنشطة المضادة للأكسدة. أثبت تخليق جسيمات السيليكا متوسطة المسام ، SBA -15 ، أن المنتج الخام T65 سيكون فعالًا في تركيبات مستحضرات التجميل مع خصائص إطلاق محكومة فعالة. أخيرًا ، أثبت التطبيق في الجسم الحي لمنتج مستحضرات التجميل المركب جنبًا إلى جنب مع المنتج الخام T65 على وجوه المتطوعين تأثير التبييض والمضاد للتجاعيد لـ T65. ومع ذلك ، لا يزال يتعين اكتشاف كيمياء المركبات النشطة بيولوجيًا المختلفة والآليات الجزيئية المتعلقة بأنشطة تثبيط الإنزيم المختلفة وتثبيط مسببات الأمراض. في الختام ، دعمت دراستنا بقوة فكرة أنه يمكن إضافة الموارد البكتيرية إلى مستحضرات التجميل الموضعية لتأثير التبييض ، والتكوين المضاد للتجاعيد ، والتأثير المضاد للأكسدة ، والأنشطة المضادة للميكروبات.

cistanche pharma special

لمزيد من التفاصيل، الرجاء الضغط هنا.