يخفف Pinocembrin من فشل القلب التالي للاحتشاء من خلال تنشيط Nrf2 / HO -1 مسار الإشارة الجزء 1

الرجاء التواصلoscar.xiao@wecistanche.comللمزيد من المعلومات

الملخص

خلفية:الإجهاد التأكسدي هو عامل مهم يشارك في تقدم قصور القلب. تم إجراء الدراسة الحالية للتحقق مما إذا كان البينوسيمبرين قادرًا على تحسين فشل القلب بعد احتشاء (PIHF) والآليات الأساسية.

الرجاء الضغط هنا لمعرفة المزيد

طُرق:تم إجراء الجرذان لربط الشريان الأمامي النازل الأيسر للحث على احتشاء عضلة القلب ثم تم تربيتها لمدة 6 أسابيع لإنتاج قصور القلب المزمن. ثم تم إعطاء بينوسيمبرين كل يومين لمدة أسبوعين. تم تقييم التأثيرات بواسطة تخطيط صدى القلب ، لطخة غربية ، تلطيخ ماسون ، فحوصات كيميائية حيوية ، كيمياء مناعية ، ومضان. في المختبر ، قمنا أيضًا بتربية الخلايا العضلية القلبية H9c2 والخلايا الليفية العضلية القلبية لمزيد من الشهادة على الآليات.

نتائج:وجدنا أن التدهور الناجم عن PIHF لوظائف القلب قد تم تحسينه بشكل كبير عن طريق إعطاء البينوسيمبرين. بالإضافة إلى ذلك ، خفف علاج البينوسيمبرين أيضًا ترسب الكولاجين وزيادة مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية 2 في منطقة حدود الاحتشاء جنبًا إلى جنب مع موت الخلايا المبرمج الموهن ، والذي كان مرتبطًا بتحسين الإجهاد التأكسدي الذي يتضح من خلال تقليل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في أنسجة القلب و malondialdehyde (MDA) في مصل الدم ، وزيادة ديسموتاز الفائق (SOD). وقد ترافق ذلك مع تنظيم مسار العامل النووي 2- المرتبط بالعامل 2 (Nrf2) / الهيم أوكسيجيناز -1 (HO -1). وجدنا في التجارب المختبرية أن مثبط Nrf2 المحدد عكس التأثيرات الناتجة عن البينوسيمبرين بشكل ملحوظ بما في ذلك مضادات الأكسدة ، ومضادات موت الخلايا المبرمج ، ومضاد التليف ، وتكوين الأوعية الدموية الجديدة ، مما يشير أيضًا إلى تحسين PIHF بواسطة pinocembrin كان في Nrf2 / HO -1 بطريقة تعتمد على المسار.

يمكن أن يحسن القدر من المناعة

استنتاج:قام Pinocembrin بتحسين وظائف القلب وإعادة التشكيل الناتجة عن PIHF عن طريق مسح ROS وتنشيط مسار Nrf2 / HO -1 مما أدى إلى زيادة ترسب ألياف الكولاجين وموت الخلايا المبرمج ، ويسهل تكوين الأوعية.

الكلمات الدالة:بينوسيمبرين ، قصور القلب ، الإجهاد التأكسدي ، Nrf2 / HO -1

مقدمة

لا يزال قصور القلب (HF) ، الذي يتميز بمجموعة من المتلازمات السريرية النهائية الناتجة عن ضعف هيكلي و / أو وظيفي للقلب ، عبئًا صحيًا عالميًا ، مع احتشاء عضلة القلب (MI) باعتباره السبب الرئيسي (Ziaeian and Fonarow 2016؛ Galli and لومباردي 2016 ؛ Rengo وآخرون 2013). على الرغم من التقدم الكبير الذي تم إحرازه في العلاجات وجودة الرعاية في HF ، هناك معدل انتشار يقدر بـ 37.7 مليون شخص كل عام في جميع أنحاء العالم ، إلى جانب معدل وفيات بنسبة 50 في المائة عند 5 سنوات بعد تشخيص HF (Go et al. . 2014). قد تُعزى المعضلة الحالية جزئيًا إلى أن HF (PIHF) بعد احتشاء يتكون من مجموعة متنوعة من الآليات الفيزيولوجية المرضية التي لا يمكن للطرق العلاجية الحالية الرجوع إليها تمامًا.

أظهرت الدراسات المتراكمة أن الإجهاد التأكسدي (OS) متورط في الغالب في التقدم المرضي لـ PIHF (Dubois-Deruy et al.2020؛ Ma et al. 2019؛ Bubb et al.2017؛ Habtemariam 2019). تم إثبات التراكم المفرط للجذور الحرة / أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تحتوي على جذور الهيدروكسيل ، والأكسيد الفائق ، وأكسيد النيتريك ، وما إلى ذلك (Dubois-Deruy et al. 2020 ؛ Habtemariam 2019) ، ليكون قادرًا على إثارة التعديل التأكسدي أو تلف الدهون. والبروتينات والحمض النووي ، مع اضطرابات العضية ، والالتهابات ، وموت الخلايا المبرمج في الخلايا العضلية والتليف الخلالي الذي يشرف (Dubois-Deruy et al.2020 ؛ Bubb et al.2017 ؛ Hermida et al. 2018). نظرًا للتأثيرات الضارة المتعددة لـ ROS ، تم أخذ مضادات الأكسدة في الاعتبار في علاجات PIHF التي تتكون آلياتها من المسح المباشر لـ ROS و / أو تحفيز الدفاع المضاد للأكسدة الذي يحتوي على الجلوتاثيون ، ديسموتاز الفائق (SOD) ، الكاتلاز ، إلخ ( Habtemar-iam 2019). ومع ذلك ، كان من المؤسف أن تطبيق بعض مضادات الأكسدة ، لا فيتامين E (لي وآخرون 2005) ولا ريسفيراترول (Made et al. 2015 ؛ Olesen et al. 2014) ، فشل في تلبية الرضا في علاج أمراض القلب والأوعية الدموية ، يتضح من خلال فشل في تحسين وظائف القلب. لذلك ، هناك حاجة لمضادات الأكسدة الأكثر كفاءة في علاج PIHF.

Pinocembrin (Pino) ​​(يظهر التركيب الكيميائي في الشكل 1 أ) هو مركب فلافونويد طبيعي يمكن استخلاصه من العسل والبروبوليس والعديد من النباتات الأخرى (لان وآخرون 2015 ؛ رسول وآخرون 2013) بالإضافة إلى توليف اصطناعي (Costa and Leitao 2011) ، يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات ومضادة للجراثيم ومضادة للسرطان (Rasul وآخرون 2013 ؛ Ye وآخرون 2019) ، جنبًا إلى جنب مع التأثير المضاد للأكسدة المؤكد (Kim et al.2020 ؛ Sangweni et al. .2020). كما تم توضيحه سابقًا ، فإن التركيب الفينولي لـ Pino المسؤول عن التخلص المباشر من ROS وكذلك الهياكل الفينولية وغير الفينولية التي تكثف الدفاع المضاد للأكسدة (Habtemariam 2019) تفسر التأثير المضاد للأكسدة لـ Pino ، والذي تم من خلاله دراسة Pino وتطبيقه على نطاق واسع مجموعة متنوعة من الأمراض ، مثل الأمراض التنكسية العصبية ، وتصلب الشرايين ، وتسمم خلايا عضلة القلب التي يسببها دوكسوروبيسين (Sangweni et al. 2020 ؛ Sang et al. 2012 ؛ Liu et al. 2014). ومع ذلك ، نظرًا لأن العديد من مضادات الأكسدة لاحتشاء عضلة القلب و HF غير صالحة أو غير كافية للتحول إلى الاستخدام السريري ، فإن ما إذا كان يمكن تحقيق تأثير مضادات الأكسدة لـ Pino في علاج PIHF يظل غير مفهوم جيدًا. وبالتالي تم إجراء هذا البحث للتحقيق فيما إذا كان إعطاء Pino يمكن أن يكون له تأثيرات مفيدة على PIHE ، أو يعد علاجًا جديدًا ، أو إن لم يكن علاجًا مهيمنًا ولكنه على الأقل مساعد.

الطرق والمواد

نموذج الحيوان وبروتوكول التجربة

56 ذكرًا من جرذان Sprague-Dawley ، تم شراؤها من مركز التجارب على الحيوانات بجامعة China Three Gorges ،

أثيرت في إدارة الحيوانات بمستشفى ووهان رقم 3. تم السماح رسميًا بجميع التجارب وأجريت في مختبر Hubei Key لأمراض القلب ، مع الامتثال لدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة بالولايات المتحدة (NIH Publication No. 82-23 ، المنقحة في عام 1996).

تلقت الفئران في البداية ربط الشريان التاجي الأمامي الأيسر النازل (LAD) أو الجراحة الصورية. باختصار ، تم تخدير الفئران بنسبة 3٪ بنتوباربيتال (2 مل / كجم ؛ سيجما الدريدج ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية ، داخل الصفاق) ، متبوعًا بالتنبيب الرغامي والدعم التنفسي (حجم المد والجزر: 5-10 مل ، المعدل: 70 مرة / دقيقة). تم إجراء التعرض للقلب اللاحق وتم ربط LAD بواسطة خيوط النايلون الأحادية 7-0. يشير حدوث شحوب قمة الرأس أو ارتفاع الجزء ST على الرصاص الأول لمخطط القلب الكهربائي إلى تحريض MI. خضعت العملية الصورية لإجراءات متطابقة باستثناء ربط LAD. تم حقن البنسلين (200 ، 000 وحدة دولية) في العضل مرة واحدة يوميًا لمدة أسبوع بعد العملية.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 في المائة Sigma-Aldridge) أو نفس الحجم من المحلول الملحي عن طريق الوريد من خلال وريد الذيل كل يوم لمدة أسبوعين. أشارت الجرعة إلى دراسة سابقة (لان وآخرون 2017). تم توضيح البروتوكول في الشكل 1 ب.

احتوت الجرذان الضابطة الإيجابية على 3 مجموعات: الشام بالإضافة إلى المحلول الملحي (مجموعة الشام) ؛ ربط LAD بالإضافة إلى المحلول الملحي (مجموعة HF) ؛ ربط LAD بالإضافة إلى إنالابريل (HF plus ACEI group). خضعت الفئران للعمليات المناظرة باستثناء أن الفئران من مجموعة HF زائد ACEI تم إطعامها عن طريق الفم بمقدار 20 مجم / كجم من إنالابريل.

قياسات تخطيط صدى القلب

تم تقييم وظائف القلب عن طريق تخطيط صدى القلب عبر الصدر باستخدام نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية (Vevo 2100 ، Visual Sonics Inc. ، تورنتو ، كندا) ، كما ورد سابقًا في مجموعتنا (Fo وآخرون 2020). تم تسجيل البعد الداخلي للبطين الأيسر في مرحلة نهاية الانبساطي (LVIDd) ومرحلة نهاية الانقباض (LVIDs) ، وحجم انقباض نهاية البطين الأيسر ونهاية الانبساطي (LVESV و LVEDV) بواسطة تخطيط صدى القلب ثنائي الأبعاد لمدة 3 على الأقل دورات متتالية لكل فأر. تم حساب جزء طرد البطين الأيسر (LVEF) والتقصير الجزئي (FS) ، اللذين يعكسان الوظيفة الانقباضية ، لاحقًا.

إعداد عينة

بعد إجراء اختبارات بينو وتخطيط صدى القلب ، تم تخدير الفئران مرة أخرى. تم التقاط أكثر من 2 مل من الدم الوريدي من وريد الذيل إلى حمض إيثيلين ديامينيتتراسيتيك (EDTA) - الذي يحتوي على أنابيب تجميع دم مفرغة مع الطرد المركزي المتتالي بسرعة 3000 دورة / دقيقة لمدة 15 دقيقة وعند درجة حرارة 4 درجات مئوية ، متبوعًا بعزل طاف المصل والمحافظة عليه في -80 "C. ثم تم حصاد القلوب بسرعة. تم قطع جزء من منطقة حدود الاحتشاء لكل قلب وتجميده في النيتروجين السائل لتحليل اللطخة الغربية ، مع تثبيت أنسجة القلب الأخرى في 4 في المئة لامتصاص العرق لأكثر من 24 ساعة.

تلطيخ ماسون

أجرينا تلطيخ ماسون للكشف عن ترسب الكولاجين في منطقة حدود الاحتشاء. تم تضمين البطينات المثبتة لبارافورمالدهيد بواسطة البارافين ثم تم تقطيعها إلى أقسام 5- ميكرومتر. تم تلطيخ الأقسام فيما بعد بثلاث ألوان ماسون حيث تم صبغ الكولاجين باللون الأزرق ، وعضلة القلب باللون الوردي ، والنواة باللون الأسود. تم حساب نسبة ترسيب الكولاجين بواسطة برنامج Image J (NIH ، Bethesda ، MD) عند تكبير × 200.

التحليل المناعي

تم إجراء تحليل كيميائي مناعي لتقييم كثافة مستقبل عامل النمو البطاني الوعائي 2 (VEGFR2) الذي أدى تنظيمه إلى تعزيز تكوين الأوعية الذي كان مفيدًا ومهمًا في التخفيف من إعادة التشكيل (Rengo et al. 2 0 13). تم تصنيع المقاطع البطينية مثل تلك التي أجريت في تلطيخ ماسون ، تليها منزوعة الكافيين وترطيبها. ثم تلقت الأقسام استرجاع الجينات المضادة بوساطة الحرارة وعولجت بنسبة 3 في المائة H ، O ، لمنع بيروكسيداز داخلي المنشأ ، مع تحضين 1 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد VEGFR2 (Abcam ، ab9530) لمدة 12 ساعة عند 4 درجات تم الوفاء بها. بعد ذلك ، تم تحضين الأقسام بواسطة بيروكسيداز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المسمى (1: 200 ، الخدمة ، G1213) لمدة 50 دقيقة عند 37 درجة. يظهر في بني مصفر. أخيرًا ، تم تحليل متوسط ​​الكثافة البصرية لـ VEGFR2 وحسابها بواسطة برنامج Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics ، الولايات المتحدة الأمريكية).

مقايسة وضع العلامات على النهايات الطرفية (TUNEL) بوساطة ترانسفيراز-ديوكسينوكليوتيد

تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج لاحقًا بواسطة اختبار TUNEL. تم قطع كتل البارافين المصنعة سابقًا والتي تضمنت الأنسجة البطينية إلى شرائح أخرى لمقايسة TUNEL ، متبوعة بتلطيخ TUNEL وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لمجموعة الفحص التجارية (Roche ، سويسرا ؛ 11684817910). باختصار ، تم تعريض المقاطع البطينية لكاشف TUNEL ، حيث تم خلط TdT و dUTP بنسبة 1: 9 ، لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة ، بعد حضانة بروتيناز K وتمزق غشاء الخلية. أخيرًا ، لوحظت الصور الفلورية بطول موجة يبلغ 530 نانومتر والذي تم تشغيله بواسطة طول موجة انبعاث يبلغ 450 نانومتر (تكبير × 400). تم تحليل معدل موت الخلايا المبرمج لأنسجة البطين في كل مجموعة وحسابه بواسطة Image Software.

لطخة غربية

نقوم بتنفيذ اللطخة الغربية لتوضيح الآليات الأساسية التي من خلالها قام بينو بتحسين PIHF. تشبه إجراءات استخراج عينة البروتين وتحضيرها تلك المذكورة سابقًا في دراستنا (Chen et al.2020a). تم فحص الأغشية بالأجسام المضادة ضد العامل النووي ({1}} العامل 2 (Nrf2) ، الهيم أوكسيجيناز {{ 4}} (HO -1 ؛ 1: 2000 ، Abcam ، ab189491) ، p53 (1: 1000 ، تقنية تشوير الخلية ، 2524S) ، BCL -2 (1: 1000 ، تقنية تشوير الخلية ، 2870P) ، bax (1: 1000، Abcam، ab32503)، caspase مشقوق -3 (1: 1000، cell signaling technology، 9664 T)، collagen I (1: 1000، Affinity، AF7001)، glyceraldehyde -3- نازعة هيدروجين الفوسفات (GAPDH ، الخدمة ، GB12002) ، مع التصور اللاحق بواسطة الأجسام المضادة الثانوية المسمى HRP (الخدمة ، G1213 و G1214) وكواشف الكشف عن اللمعان الكيميائي. تم تحليل صور اللطخة في النهاية وقياسها بواسطة برنامج Image J.

زراعة خلايا عضلة القلب H9c2 والتخلص منها في المختبر. تمت زراعة خلايا عضلة القلب H9c2 المشتقة من قلب الفئران البطينية ، والتي تم شراؤها من مجموعة الثقافة الأمريكية (CRL -1446) ، للتحقق من التأثيرات التي يمارسها بينو في المختبر. تمت زراعة خلايا عضلة القلب H9c2 في وسط إيجل المعدّل (DMEM) / F12 الخاص بـ e Dulbecco والذي يحتوي على 10 بالمائة من مصل بقري جنيني (Sijiqing ، هانغتشو ، الصين) تحت درجة حرارة 37 درجة وجو 95 بالمائة هواء و 5 بالمائة ثاني أكسيد الكربون. الخلايا تم بذرها إلى 6- أطباق جيدة بعد النمو إلى 90 في المائة ، بالإضافة إلى ذلك ، تم استبدال وسط مصل يحتوي على 25 ميكرومتر أيزوبرينالين (ISO) لاحقًا للوسط العادي في 3 آبار لاحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة لتقليد حالة HF منذ ذلك الحين يتميز HF أيضًا بفرط تنشيط النغمة الودية وتحفيز مستقبلات الأدرينالية يولد ROS (Velusamy et al.2020). ثم تم تقسيم الخلايا إلى 6 مجموعات: (1) مجموعة التحكم ؛ (2) تمت إضافة وسيط التحكم بـ 25 ميكرومتر بينو لمدة 4 ساعات بالإضافة إلى مجموعة Pino） ؛ （i） وسط التحكم الذي تم احتضانه بواسطة 25 ميكرومتر بينو و 5 ميكرومتر ML385 لمدة 4 ساعات （Nrf2 ؛ MCE ، نيو جيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) (مجموعة التحكم بالإضافة إلى مجموعة Pino plus ML385) ؛ (4) مجموعة ISO ؛ v. وسيط ISO مع 4- حضانة بمقدار 25 ميكرومتر بينو （ISO بالإضافة إلى مجموعة بينو） ؛ السادس. ISO بالإضافة إلى 25 ميكرومتر بينو بالإضافة إلى مجموعة ML385 5 ميكرومتر. يشير تركيز الأدوية ووقت احتضانها إلى دراسات سابقة أو تعليمات (جين وآخرون 2015 ؛ أوليفيرا وآخرون 2017).

ثقافة الفئران العضلية الليفية القلبية حديثي الولادة ومقايسة الانتشار

تمت زراعة الأرومات العضلية الليفية القلبية للمواليد حديثي الولادة (CMFs) للتحقيق في تأثيرات Pino على إفراز الكولاجين. تم فصل CMFs باستخدام جرذان حديثي الولادة بعمر 3 أيام ، بالإشارة إلى الطرق الموضحة سابقًا (Cui وآخرون. 2 0 21). تم هضم القلوب المعزولة والمفرومة بواسطة 0. 125 في المائة من التربسين متبوعًا بكوكتيل يحتوي على 0. 25 في المائة من التربسين و 0.08 في المائة من الكولاجيناز عدة مرات ، مع الطرد المركزي والزرع في طبق بتري الذي تم إجراؤه لاحقًا لجمع خلايا من المادة الطافية. ثم تم استبدال الوسائط بوسط مصل مماثل لتلك المستخدمة في زراعة خلايا عضلة القلب H9c2 بعد الالتصاق لمدة 90 دقيقة. تلقت CMFs تصرفات متطابقة مثل تلك الموجودة على خلايا عضلة القلب H9c2. قمنا أيضًا بتنفيذ اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) (Dojindo ، اليابان) لاكتشاف انتشار CMFs عند الوصول إلى كثافة 1.5 × 10 درجة في كل بئر ، من خلال استغلال قارئ الصفيحة الدقيقة في طول موجي 450 نانومتر ، حيث تشير القيمة الأعلى إلى نشاط تكاثر معزز.

كشف ROS

تم قياس قدرة Pino على البحث عن ROS بواسطة مسبار ثنائي هيدرو إيثيديوم الفلوريسنت (DHE ؛ Beyotime ، شنغهاي ، الصين). تم تخفيف DHL ، الذي تم إذابته في DMSO ، إلى 5 ميكرومتر للأقسام المجمدة أو إضافته إلى وسط المصل ليتم تخفيفه إلى نفس التركيز وفقًا للتعليمات. تم تجميد القلوب الثابتة لامتصاص العرق متبوعة بتقطيعها إلى 4- ميكرومتر أقسام. تم تحضين المقاطع أو خلايا عضلة القلب H9c2 بمحلول DHE لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة ، وتم تصويرها بعد ذلك بواسطة مجهر الفلورسنت المقلوب (IX70 ؛ أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان). باختصار ، تم صبغ النواة المليئة بالحمض النووي والـ RNA باللون الأحمر المميز بسبب التقارب بين الحمض النووي و DHE. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت شدة التألق الأقوى إلى زيادة تراكم ROS.

الامتحانات البيوكيميائية

تم إجراء فحوصات كيميائية حيوية للتحقق من التغيرات في مصل BNP و SOD و malondialdehyde (MDA) في المصل والطاف الخلوي الذي يشير إلى النمط الظاهري HF والدفاع المؤكسد ، على التوالي. تم قياس التركيز باستخدام مجموعات المقايسة البيوكيميائية المقابلة وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة (Jiancheng ، Nanjing ، الصين).

تم استخراج هذه المقالة من Chen et al. Mol Med (2021) 27: 100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7