توقع دور LncRNA في شيخوخة الكلى بناءً على تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) Ⅱ

العلاقة بين lncRNA Gm43360 وmRNAs المستهدفة المحتملة

تم اختيار LncRNA Gm43360 للدراسة لأنه يربط بين شبكتي تعايش lncRNA-mRNA. ارتبط مستوى تعبير Adra1a بشكل إيجابي (rho=0.8650، p=0.026) مع مستوى Gm43360، وارتبط Csnk1a1 (الكازين كيناز 1A1) سلبًا (rho{{12) }}.8084، ص =0.0084) (الشكل 5 أ). لمزيد من التحقق من العلاقة بين lncRNA Gm43360 وmRNAs المستهدفة المحتملة Adra1a وCsnk1a1، تم تصميم بلازميد مفرط التعبير لـ lncRNA Gm43360 في هذه الدراسة. انخفض تعبير Csnk1a1 كما هو متوقع، كما انخفض تعبير Adra1a أيضًا، ولكن ليس بشكل ملحوظ. بعد ذلك، قمنا بإسقاط lncRNA Gm43360 بواسطة siRNA لاكتشاف ما إذا كان التعبير عن mRNAs المستهدف قد تأثر. كما هو متوقع ، تمت زيادة Csnk1a1 في خلايا ضربة قاضية lncRNA Gm43360 نسبة إلى مجموعة التحكم السلبية siRNA (الشكل 5 ب). عاشراً، اكتشفنا دور lncRNA Gm43360 في دورة الخلية. أظهرت نتائج مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8) أن lncRNA Gm43360 عزز قابلية الخلية للخلايا (الشكل 5 ج). أظهرت النتائج أن lncRNA Gm43360 زاد النسبة المئوية لخلايا الطور S وانخفض النسبة المئوية لخلايا الطور G1 مقارنة بالتحكم السلبي (الشكل 5 د). شاركت بروتينات Te p53 وp21 في تنظيم دورة الخلية وبالتالي كانت علامات شيخوخة الخلية. انخفضت مستويات التعبير لـ p53 وp21 بشكل ملحوظ في مجموعة الإفراط في التعبير مقارنة بالمجموعة الضابطة. تمت زيادة مستويات التعبير عن p53 و p21 بشكل ملحوظ في مجموعة siRNA مقارنة بمجموعة التحكم siRNA (الشكل 5 هـ). أدى الإفراط في التعبير عن lncRNA Gm43360 إلى انخفاض عدد الخلايا الإيجابية SA - - وزادت الخلايا الإيجابية في مجموعة Gm43360 المنقولة (الشكل 5f). مجتمعة، أشارت هذه النتائج إلى أن lncRNA Gm43360 يمنع شيخوخة الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية عن طريقتثبيط التعبير عن Csnk1a1.

انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% أكتيوسايد لوظيفة الكلى.

مناقشة

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم بيانات تعبير mRNA من كلى الفئران الصغيرة والكبيرة وأجرينا تحليلات للمعلومات الحيوية التي كشفت عن وظائف mRNA المعبر عنها بشكل شاذ. لاحظنا 347 mRNAs منظمًا و 355 mRNAs منظمًا بالإضافة إلى 130 lncRNAs منظمًا و 91 lncRNA منظمًا فيمقارنة كليتي الفأر الكبير بكلية الفأر الصغير. بالإضافة إلى ذلك، تبين أن هذه mRNAs تشارك في المسارات المرتبطة بالشيخوخة، مثلالفسفرة التأكسدية، ومسار إشارات AMPK، ومسار إشارات Wnt، ومسار إشارات Rap1، والأمراض المرتبطة بالعمر، والتي أظهرت وظائف mRNAs المعبر عنها تفاضليًا في التسبب في الشيخوخة الكلوية.

يعد RNA NEAT1 الطويل غير المشفر عاملاً وقائيًا في تطور تليف الكلى في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية [21]. من قبيل الصدفة، في نتائج التسلسل التي توصلنا إليها، تم التعبير عن lncRNA NEAT1 بمستويات أقل في كليتي الفئران المسنة مقارنةً بالفئران الصغيرة، وهو ما يتوافق مع النتائج السابقة. يقوم LincRNA-Gm4419 بتسريع الالتهاب والتليف بواسطة آليات الالتهاب NF-kB/NLRP3 في اعتلال الكلية السكري [22]. وفي نتائج التسلسل التي توصلنا إليها، وجدنا أيضًا أن التعبير عن Gm4419 كان أعلى في كليتي الفئران المسنة عنه في الفئران الصغيرة، ولكن لم يكن هناك فرق كبير. يقع LncRNA Gm43360 على الكروموسوم 5 (Chr5:122494022–122494908، 2887 سنة مضت). وفقًا لمتصفح الجينوم UCSC، يقع Gm43360 في إنترون جين ترميز البروتين Atp2a2. ومع ذلك، لم ترد أي تقارير حول تورط lncRNA Gm43360 في الأمراض حتى الآن. في هذه الدراسة، عززت ضربة قاضية lncRNA Gm43360 شيخوخة الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية. بالإضافة إلى ذلك، حددنا العديد من الـ lncRNAs المعبر عنها تفاضليًا في نتائج التسلسل وقمنا بالتحقيق فيها.

تم تصنيف LncRNAs إلى تنظيم رابطة الدول المستقلة أو التنظيم العابر بناءً على الآليات التنظيمية لـ lncRNA. يمكن أن تؤثر lncRNAs ذات المفعول cis على التعبير عن الجينات المجاورة من خلال الاعتماد على العناصر ذات المفعول cis، مثل المروجين والمعززات والتسلسلات التنظيمية، وهي مسافات بين lncRNAs وmRNAs تقل عن 100 كيلو بايت. تشير lncRNAs ذات المفعول المتحول إلى lncRNAs التي تغادر موقع ترنسفكأيشن وتعمل في مواقع بعيدة (أي المسافة بين lncRNAs وmRNAs أكثر من 100 كيلو بايت) [23]. يزيد lncRNA MAAT من التعبير عن الجين المجاور Mbnl1 من خلال وحدة تنظيمية لرابطة الدول المستقلة [24]. يلعب lncRNA Pnky دورًا كمنظم فعال في التطور القشري [25]. في هذه الدراسة، كانت هناك علاقة تنظيمية بين lncRNA Gm43360 وCsnk1a1. Csnk1a1 هو جين مثبط للورم [26] يقوم بتشفير البروتين الذي يشارك في دورة الخلية وعملية انقسام الخلايا [27]. يستحث تقليل التنظيم Csnk1a1الالتهابات المرتبطة بالشيخوخةالاستجابة مع توقف النمو في أورام القولون والمستقيم [26]. تم ضبط Csnk1a1 عندما تم تنظيم Gm43360 ؛ وبالتالي، فمن المحتمل أن يشارك فيه lncRNA Gm43360شيخوخة الكلىبواسطةتنظيم التعبير Csnk1a1.

الاستنتاجات

تحقيقنا في شبكة التعبير lncRNA-mRNA فيشيخوخة الكلىكشفت أن lncRNA، lncRNA Gm43360، قد يلعب دورًا وقائيًا في شيخوخة الكلى ووسع فهمنا للآليات المشاركة فيشيخوخة الكلى

المواد والأساليب

تم شراء العينات من فئران ذكور C57BL/6J الصغيرة (3-شهر) والفئران القديمة (24-شهر) من مركز الحيوانات التجريبية بجامعة شيامن وتم تربيتها في بيئة قياسية. تتمتع جميع الفئران بحرية الوصول إلى الطعام والماء. وتم تأقلم الفئران مع المنشأة الجديدة لمدة شهر قبل أن يتم التضحية بها. تم تخدير الفئران باليوريتان عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 750 ملغم / كغم قبل جمع العينات. تم التضحية بالفئران الصغيرة والكبار في نفس اليوم.كلية الفأر المتبقيةتم استخدام الأنسجة للتسلسل في كل اختبار. تم إجراء RNA-seq والتشريح المرضيالكلى منفصلةمن نفس الماوس تم جمع أنسجة الكلى من الفئران. تم غمر كلية واحدة على الفور في 10٪ من الفورمالين المخزن المؤقت المحايد لتضمين القسم اللاحق، وتم تقسيم الكلية الأخرى إلى عدة أنسجة ووضعها على الفور في النيتروجين السائل ثم تخزينها عند درجة -80 . تم دعم الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة شيان جياوتونغ (شنشي، الصين) (رقم 2018-G-164). تم تنفيذ جميع الأساليب من خلال المبادئ التوجيهية واللوائح الأخلاقية الحيوانية. تم إجراء هذه الدراسة وفقًا لإرشادات ARRIVE.

التشريح المرضي للكلى

تم إصلاح عينات الأنسجة الكلوية من الفئران الصغيرة والكبار في محلول بارافورمالدهيد 10٪ طوال الليل. تم تجفيف عشرة من المقاطع، ومضمنة بالبرافين، ومقطعة بسمك 4- ميكرومتر. تم إجراء تلطيخ PAS وMasson ثلاثي الألوان باستخدام البروتوكولات القياسية. تم التقاط الصور بواسطة الكاميرا، وتم قياس المنطقة الإيجابية للتلطيخ. تم حساب مساحة صور كاميرا التشريح المرضي باستخدام Image-Pro Plus 6.0.

تلطيخ SA--gal

تم تحليل نشاط SA{{0}} gal باستخدام مجموعة تلوين SA- - gal (تقنية تشوير الخلية رقم 9860) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم قياس مساحة الصبغة الإيجابية، وتم حساب الخلايا الإيجابية SA- - باستخدام Image-Pro Plus 6.0.

بناء مكتبة استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) وتسلسلها

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.تم استخدام 0 لإنشاء مكتبة التسلسل. بعد استخراج الحمض النووي الريبي الكلي، تمت تنقية mRNA من الحمض النووي الريبي الكلي (5 ميكروغرام) باستخدام Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher، CA، USA) مع جولتين من التنقية. بعد التنقية، تم تقسيم mRNA إلى أجزاء قصيرة باستخدام الكاتيونات ثنائية التكافؤ عند درجات حرارة عالية (وحدة تجزئة RNA المغنيسيوم (NEB، cat. e6150، الولايات المتحدة الأمريكية) تحت 94 درجة 5-7 دقيقة). بعد ذلك، تم النسخ العكسي لشظايا الحمض النووي الريبي (RNA) المشقوق للحصول على cDNA بواسطة SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen، قطة 1،896،649، الولايات المتحدة الأمريكية)، والتي تم استخدامها بعد ذلك لتجميع الحمض النووي DNA الثاني الذي يحمل علامة U مع E. coli DNA بوليميريز I ( NEB، cat.m0209، الولايات المتحدة الأمريكية)، RNase H (NEB، cat.m0297، الولايات المتحدة الأمريكية) وdUTP Solution (Termo Fisher، cat.R0133، الولايات المتحدة الأمريكية). تمت بعد ذلك إضافة قاعدة A إلى الأطراف الحادة لكل حبلا، وإعدادها للربط بالمحولات المفهرسة. يحتوي كل محول على تراكب قاعدة T لربط المحول بالحمض النووي المجزأ ذي الذيل. تم ربط محولات الفهرس المزدوج بالأجزاء، وتم إجراء اختيار الحجم باستخدام خرز AMPureXP. بعد معالجة إنزيم UDG القابل للحرارة (NEB، cat.m0280، الولايات المتحدة الأمريكية) للحمض النووي الثاني الذي تقطعت به السبل والذي يحمل علامة U، تم تضخيم المنتجات المربوطة باستخدام PCR بالشروط التالية: تمسخ الطبيعة الأولي عند 95 درجة لمدة 3 دقائق؛ 8 دورات تمسخ عند 98 درجة لمدة 15 ثانية، التلدين عند 60 درجة لمدة 15 ثانية، والتمديد عند 72 درجة لمدة 30 ثانية؛ ثم التمديد النهائي عند 72 درجة لمدة 5 دقائق. كان متوسط ​​طول الإدخال لمكتبات [كدنا] النهائية 300 ± 50 نقطة أساس. أخيرًا، أجرينا تسلسل النهاية المزدوجة 2 × 150 نقطة أساس (PE150) على Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd.، Hangzhou، الصين) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة [28].

تحليل المعلوماتية الحيوية تسلسل وتصفية القراءات النظيفة

مكتبة [كدنا] تم إنشاؤها بواسطة التكنولوجيا من الحمض النووي الريبي المجمعة منعينات الكلىتم تسلسل الفئران وتشغيلها باستخدام منصة التسلسل Illumina NovaseqTM 6000. باستخدام نهج Illumina المزدوج RNA-seq، قمنا بتسلسل النسخة، مما أدى إلى توليد إجمالي قراءات نهاية مزدوجة 2 × 150 نقطة أساس. القراءات التي تم الحصول عليها من آلات التسلسل تشمل القراءات الأولية التي تحتوي على محولات أو قواعد منخفضة الجودة والتي ستؤثر على التجميع والتحليل التاليين. وبالتالي، للحصول على قراءات نظيفة عالية الجودة، تمت تصفية القراءات بشكل أكبر بواسطة Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). وكانت المعلمات على النحو التالي:

1) إزالة القراءات التي تحتوي على محولات؛

2) إزالة القراءات التي تحتوي على polyA وpoly؛

3) إزالة القراءات التي تحتوي على أكثر من 5% من النيوكليوتيدات غير المعروفة (N)؛

4) إزالة القراءات منخفضة الجودة التي تحتوي على أكثر من 20% من القواعد منخفضة الجودة (Q-value أقل من أو تساوي 20).

تم التحقق من جودة عشرة تسلسلات باستخدام FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). بما في ذلك محتوى Q20 وQ30 وGC للبيانات النظيفة. بعد ذلك، تم إنتاج ما مجموعه G bp من القراءات المزدوجة والمنظفة. تم إرسال بيانات التسلسل الأولية إلى مجموعات بيانات NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) برقم الانضمام GSE154223.

كان الجينوم/التعليق التوضيحي المرجعي Mus_musculus.GRCm38. كان مصدر وإصدار الشرح الجيني المستخدم في التحليلات هو Ensembl_v88.

تجميع النصوص

أولاً، تم استخدام Cutadapt [29] لإزالة القراءات التي تحتوي على تلوث المحول، والقواعد منخفضة الجودة، والقواعد غير المحددة. تم تغذية عشرة جودة تسلسلية للغاية باستخدام FastQC (//www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). استخدمنا Bowtie2 [31] وHisat2 [32] لرسم خريطة لجينوم الفأر. تم تجميع القراءات المعينة لكل عينة باستخدام StringTie [33]. عشرة، جميع النصوص منعينات الكلىتم دمجها لإعادة بناء نسخة شاملة باستخدام نصوص بيرل. بعد إنشاء النسخة النهائية، تم استخدام StringTie [33] وedgeR [34] لتقدير مستويات التعبير لجميع النصوص.

تحديد LncRNA

أولا وقبل كل شيء، تم تجاهل النصوص التي تتداخل مع mRNAs المعروفة والنصوص التي يقل طولها عن 200 نقطة أساس. ثم استخدمنا CPC [35] و CNCI [36] للتنبؤ بالنصوص ذات إمكانية الترميز. جميع النصوص مع درجة تكلفة النقرة<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

تحليل جينات التحليل المعبر عنها تفاضليًا (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 تم اعتبارها جينات معبر عنها تفاضليًا.

التنبؤ الجيني المستهدف والتحليل الوظيفي لل lncRNAs

لاستكشاف وظيفة وظيفة lncRNAs، توقعنا الجينات المستهدفة لرابطة الدول المستقلة لـ lncRNAs. قد تلعب LncRNAs دورًا في رابطة الدول المستقلة في العمل على الجينات المستهدفة المجاورة. في هذه الدراسة، تم اختيار جينات الترميز في 100،000 من المنبع والمصب بواسطة برنامج بيرل النصي. بعد ذلك، أظهرنا تحليلًا وظيفيًا للجينات المستهدفة لـ lncRNAs باستخدام البرامج النصية BLAST2GO [39]. رابط الأوامر الكاملة إلى المجال العام كان Jie-Li/README.md في الرئيسي · dandan-li/Jie-Li (github.com).

فئات علم الجينات (GO) وتحليل موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG)

تم إجراء تحليل المعلوماتية الحيوية لتسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام أدوات OmicStudio (//www.omicssudio.cn/tool). تم استخدام تحليل التخصيب الوظيفي لعلم الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) [37-39] لتحليل الوظائف البيولوجية للجينات المستهدفة المتوقعة. يوضح تحليل GO العمليات البيولوجية الرئيسية من خلال ثلاثة جوانب: تكوين الخلية، والوظائف الجزيئية، والعمليات البيولوجية (http://www.geneontology.org/). يضع التحليل أولاً جميع الجينات المعبر عنها تفاضليًا وجينات الخلفية في قاعدة بيانات GO. يتم تعيين كل عنصر، ويتم حساب عدد الجينات في كل عنصر، ويستخدم التوزيع الهندسي الفائق لإجراء اختبار الفرضيات للحصول على القيمة P لنتيجة التخصيب. كلما انخفضت قيمة P، كلما زادت أهمية نتيجة التخصيب. KEGG هو مورد قاعدة بيانات يقوم بتحليل mRNAs المعبر عنها تفاضليًا بواسطة البيولوجيا الوراثية لاستكشاف المسارات المهمة المتعلقة بالجينات المستهدفة (https://www.genome.jp/kegg/). يتم التعبير عن النتائج بواسطة القيم p؛ كلما انخفضت القيمة p، زادت أهمية نتيجة التخصيب.

كيو آر تي – PCR

تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي. ثم تم حساب مستويات التعبير النسبي للجينات غير المعروفة. تم تصميم جميع الاشعال وتوليفها خصيصا لهذه التجربة. وقد تم تسويق الاشعال لGAPDH. تم تحديد خصوصية الاشعال Adra1a وCsnk1a1 من خلال الذروة الوحيدة لمنحنى الذوبان.

بناء شبكة التعبير mRNA-lncRNA

تم إجراء عملية التحويل على أساس البحث، ومن ثم تم حساب الطاقة العابرة. كلما كانت الطاقة العابرة أصغر، كلما زادت إمكانية الارتباط. ثم تم حساب معامل الارتباط لـ mRNA-lncRNA أيضًا. تم إنشاء شبكة mRNA-lncRNA عن طريق اختيار معامل ارتباط Spearman الذي يتجاوز 0.9. تم إنشاء شبكة التعبير mRNA-lncRNA باستخدام برنامج Cytoscape (الإصدار 3.7.1).

زراعة الخلايا

تمت زراعة الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة من كلى الفأر (MRPT-EpiCs) في الخلايا الظهارية المتوسطة الحيوانية (EpiCM-a، Cat. #4131) التي تحتوي على 2٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS، Cat. #0010) ومكمل نمو الخلايا الظهارية-الحيوانية (EpiCGS-a, Cat. #4182) بدون مضادات حيوية في حاضنة مرطبة عند 37 درجة و5% ثاني أكسيد الكربون. تم تغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام. تم زراعة الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي عندما وصل النمو إلى 90٪. تم زرع معلق الخلية المهضوم بواسطة التربسين في 6-صفائح بئر تحتوي على 2*104 -5*104 خلية في كل بئر. كانت الخلايا المستخدمة في ترنسفكأيشن كلها بين الأجيال 2 و 5.

بناء البلازميد وترنسفكأيشن الخلية

تم إنشاء بلازميد التعبير الزائد lncRNA Gm43360 بواسطة GeneChem (شنغهاي ، الصين). كان العمود الفقري البلازميد هو GV658، وقاد مروج CMV تعبير lncRNA. يتم توفير تسلسل النيوكليوتيدات المستنسخة في المادة التكميلية. بالنسبة لضربة قاضية lncRNA Gm43360، يجب على ثلاثة lncRNA ENS 00000197656- استهداف siRNAs (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA تم تصميم وتوليف UGAAGUUTT-3'; وlncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAAUAACUCAAUGGGTT-3') في GenePharma (شنغهاي، الصين). وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، تم نقل الخلايا باستخدام 2500 نانوغرام من البلازميد أو 100 ميلي مول من سيرنا مع 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية) لكل بئر. تم الكشف عن مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين بعد 48 ساعة من ترنسفكأيشن، وتكررت كل تجربة ثلاث مرات على الأقل. تم استخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي للتحقق من كفاءة التعبير الزائد وضربة قاضية lncRNA Gm43360.

تحليل لطخة غربية

تم غسل الخلايا المستنبتة باستخدام PBS المثلج، وأضيف 120 ميكرولتر من محلول RIPA (القلب، الصين)، وأضيف مثبط الأنزيم البروتيني وPMSF (القلب، الصين) لمدة 30 دقيقة على الجليد. بعد جمع الخلايا في أنابيب ميكروسينتريفوجي مختلفة، تم قياس تركيز البروتين كميا. تمت إضافة مخزن التحميل المؤقت إلى كل عينة ثم غليه لمدة 7 دقائق. تم فصل ثلاثين ميكروغرامًا من العينة بنسبة 12٪ SDS-PAGE (Beyotime، الصين) وتم نقلها كهربيًا إلى أغشية PVDF (Thermo Fisher، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تم سد الأغشية بـ 5% حليب. تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة أولية محددة: anti-p21 (1:1000، Abcam، ab109199)، anti-p53 (1:1000، Proteintech، 10442-1-AP)، وanti-GAPDH (1:3000، Profintech ، 60004-1-Ig) ليلاً عند درجة 4 . بعد الغسيل باستخدام TBST، تم تحضين الأغشية بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وقد لوحظت نطاقات البروتين باستخدام مجموعة التألق الكيميائي (ميليبور، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام التعبير عن GAPDH لتطبيع مستويات البروتين.

فحص تكاثر الخلايا

تم تحديد قدرة تكاثر الخلايا من خلال اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK -8). بعد ثمانية وأربعين ساعة من ترنسفكأيشن، تمت إضافة 90 ميكرولتر من الوسط الجديد و10 ميكرولتر من محلول CCK -8 إلى كل بئر (Beyotime، C0042). تم تحضين الخلايا لمدة 1-4 ساعات عند 37 درجة في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون وتم قياسها عند 450 نانومتر بواسطة قارئ صفيحة ميكروية عالمي (Bio-Tek، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل التدفق الخلوي

تم طلاء الخلايا في 6-ألواح جيدة في اليوم السابق للترنسفكأيشن. بعد ثمانية وأربعين ساعة من ترنسفكأيشن، تم تجريب الخلايا وطردها عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم تثبيت الخلايا في 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات لمدة 4 ساعات على الأقل. بعد الطرد المركزي ، تمت إضافة محلول تلطيخ RNase A وبروبيديوم يوديد (PI) إلى الخلايا ، ثم تم تحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم تحليل الخلايا الملطخة باستخدام ACEA NovoCyte (العلوم البيولوجية، الولايات المتحدة الأمريكية).

تحليل احصائي

يتم عرض بيانات القياس بالتوزيع الطبيعي على أنها متوسط ​​± SD. تم تحديد الفرق بين المجموعتين المختلفتين باستخدام اختبارات t للطالب غير المقترنة ثنائية الذيل، واعتبرت القيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم إجراء جميع الحسابات باستخدام GraphPad Prism 8 (GraphPad Software، Inc.، USA).

مراجع

1. دوكيرتي إم إتش، أوسوليفان إد، بونفنتر جي في، فيرينباخ دي إيه. الشيخوخة الخلوية في الكلى. J صباحا سوك نيفرول. 2019;30(5):726–36.

2. بارتريدج إل، ديلين جيه، سلاغبوم بي إي. مواجهة التحديات العالمية للشيخوخة. طبيعة. 2018;561(7721):45–56.

3. عموم جي اكس. يعزز LncRNA H19 تصلب الشرايين عن طريق تنظيم مسارات إشارات MAPK وNF-kB. يورو القس ميد فارماكول العلوم. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW، Abignano G، Hermes H، Malaab M، Ross RL، Jimenez SA، Chang HY، Feghali-Bostwick CA، Del Galdo F. RNA HOTAIR الطويل غير المشفر يدفع EZH 2- إلى تنشيط الخلايا الليفية العضلية المعتمدة على EZH في الجهازية التصلب من خلال التنشيط المعتمد على miRNA 34a لـ NOTCH. آن الروماتيزمية. 2020;79(4):507–17.

5. لوه جيه، وانج كيه، يه إس، صن واي، ليانج إل، شياو واي، شو دبليو، نيو واي، تشينج إل، مايتي إس إن، وآخرون. يغير LncRNA-p21 تمايز الغدد الصم العصبية الناجم عن سرطان البروستاتا الناتج عن إنزالوتاميد المضاد للأندروجين من خلال تعديل إشارات EZH2 / STAT3. نات كومون. 2019;10(1):2571.

6. وانغ واي، يانغ إل، تشن تي، ليو إكس، قوه واي، تشو كيو، تونغ إكس، يانغ دبليو، شو كيو، هوانغ دي، وآخرون. تعمل رواية lncRNA MCM3AP-AS1 الجديدة على تعزيز نمو سرطان خلايا الكبد من خلال استهداف محور miR -194-5 p / FOXA1. سرطان مول. 2019;18(1):28.

7. وو واي، كو HC. الأدوار الوظيفية وشبكات الـ RNA غير المشفرة في التسبب في الأمراض التنكسية العصبية. ي العلوم الحيوية. 2020;27(1):49.

8. لي زد، وانغ زد. شيخوخة الكلى والأمراض المرتبطة بالشيخوخة. تجربة متقدمة ميد بيول. 2018;1086:169–87.

9. وانغ إكس، فرتيسكا تي جيه، أفولا آر تي، والترز إل آر، تشاكيرا إتش إيه، كريمرز دبليو كيه، ليرمان لو، رول آي دي. يرتبط العمر ووظائف الكلى وعوامل الخطر بشكل مختلف بالحجم القشري والنخاعي للكلية. كثافة العمليات في الكلى. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR يستهدف miR-126-5p لتعزيز تطور مرض باركنسون من خلال RAB3IP. بيول كيم. 2019;400(9):1217–28.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop