يتيح تعلم الخوف المسبق الاستيعاب السريع لذكريات الخوف الجديدة مباشرة في الشبكات القشرية - الجزء 3

تصميم تجريبي

تم تقييم إمكانية تكرار نتائج البيانات مع مكررات مختلفة (الجدول S1). تم إجراء تجارب تعطيل CNQX الأولى في Te2 (الشكل 1A-1C) في عدد أكبر من التكرارات لأنها كانت التجارب الأولى التي أجريناها وعملت على اختبار الفرضية الرئيسية لدراستنا. تم تخصيص الحيوانات مسبقًا لمجموعات سلوكية مختلفة بطريقة متوازنة الوزن. تم توزيع الحيوانات الذكور من نفس الحضنة بشكل عشوائي على كل مجموعة تجريبية. لقد تناولنا أولاً الفرضية الرئيسية لدراستنا، أي أن التعطيل القشري قد يؤثر بشكل مختلف على تعزيز ذاكرة الخوف الجديدة في الفئران الساذجة تجريبياً وفي الحيوانات التي تعلمت حدث خوف سابق.

تتمتع ذكور الحيوانات بذاكرة قوية للغاية لأن لديها غريزة بقاء أقوى ورغبة في التكاثر. تحتاج الحيوانات التي تعيش في البرية إلى تذكر الكثير من المعلومات الجغرافية وأنواع الطعام ومسارات الحيوانات المفترسة ومواقع أفراد المجموعة للتكيف بشكل أفضل مع البيئة وحماية الحياة.

على سبيل المثال، يحتاج ذكور الأسود إلى تذكر حالة المنطقة بأكملها، وعلاقات العضوية، ومواقع المنافسين لحماية المنطقة وحالتهم. يحتاج ذكور الحمير الوحشية إلى تذكر موقع مصادر المياه والغذاء في الأراضي العشبية من أجل البقاء والتكاثر. نشرت إحدى شركات المشروبات الغازية ذات مرة إعلانًا يظهر أن الدب القطبي الذكر يمكنه أن يتذكر الغواص ورائحته الفريدة حتى يتمكن من التعرف عليه في المرة التالية التي يرونه فيها.

لذلك، تحتاج ذكور الحيوانات إلى ذاكرة قوية فيما يتعلق بحماية أراضيها، وتوفير ما يكفي من الغذاء، وتكاثر النسل. وهذا يجعلهم أيضًا موضوعات مهمة في الأبحاث البشرية، على سبيل المثال، لاستكشاف أمراض مثل ضعف الذاكرة ومرض الزهايمر.

وفي العالم البشري، يمكننا أيضًا أن نستلهم من ذاكرة ذكور الحيوانات. إن التعرض المستمر لأشياء جديدة، والتعلم المستمر، والتفكير يمكن أن يعزز ذاكرتنا وقدرتنا على التكيف، ويحسن مستويات معيشتنا وكفاءة العمل. لذلك، دعونا نتعلم من ذكور الحيوانات، ونستمر في تجميع المعرفة والخبرة، ونمتلك غرائز البقاء القوية والرغبات الإنجابية، ونخلق مستقبلًا أفضل. يمكن ملاحظة أننا بحاجة إلى تحسين ذاكرتنا. يمكن لـ Cistanche deserticola أن يحسن الذاكرة بشكل كبير لأن Cistanche deserticola هي مادة طبية صينية تقليدية لها العديد من التأثيرات الفريدة، أحدها هو تحسين الذاكرة. تأتي فعالية اللحم المفروم من المكونات النشطة المختلفة التي يحتوي عليها، بما في ذلك الأحماض والسكريات والفلافونويد وما إلى ذلك. ويمكن لهذه المكونات أن تعزز صحة الدماغ بعدة طرق.

انقر فوق معرفة طرق تحسين وظائف المخ

في حالة وجود فروق إحصائية بين هذه المجموعات، قمنا في نهاية المطاف بإجراء مجموعات مراقبة إضافية من خلال حقن المياه المالحة. تم تطبيق نهج مماثل على تجارب علم البصريات الوراثي، حيث تم إجراء مجموعة التحكم AAV فقط بعد اكتشاف فروق إحصائية بين الفئران الساذجة والفئران المدربة مسبقًا. سمحت لنا هذه الجداول التجريبية بتجنب مجموعات المراقبة غير الضرورية واستخدام الحيوانات غير الضرورية، وهي قضية رئيسية في التشريعات الأوروبية والإيطالية بشأن التجارب على الحيوانات (مبدأ 3 Rs).

الإجراءات السلوكية

أجريت جميع التجارب خلال مرحلة الضوء من النهار (8 صباحًا إلى 4 مساءً). تم نقل الحيوانات منفردة من المنشأة إلى غرف التجربة ضمن دلاء صغيرة شفافة مختلفة حسب متطلبات التجربة.

التدريب السمعي: الجلسة السلوكية الأولى. الحيوانات السمعية المكيفة بالخوف (CS1-CS2). في هذه المجموعة، تم أخذ الفئران بلطف من قفصها المنزلي ونقلها من غرفة السكن إلى الغرفة العازلة للصوت. بمجرد الوصول إلى هناك، تم وضع الحيوانات داخل جهاز التكييف الذي يتكون من قفص أسود مستطيل (35 × 40 سم) مزود بشبكة قضبان من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 1 سم، متباعدة 1.5 سم) متصلة بإعداد توصيل الصدمات.

تم ترك الفئران دون إزعاج لمدة دقيقة واحدة. بعد هذا الوقت، تم إعطاء 7 محفزات مكيفة (CSs) تتكون من نغمة نقية تبلغ 15 كيلو هرتز من التردد (مدة كل منها 15 ثانية، 8 0 ديسيبل، فاصل زمني للتجارب 36 ثانية). تم إقران آخر 1 ثانية من كل نغمة بالولايات المتحدة المؤلمة (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية). في نهاية جلسة التكييف، أعيد الفئران إلى قفصهم المنزلي.

حيوانات الصدمة فقط (صدمة CS2). في هذه المجموعة، تم وضع الفئران بالمثل داخل نفس جهاز التكييف. بعد ذلك مباشرة، تم تعريض كل فأر إلى 7-صدمات بالقدم (1 ثانية، 0.5 مللي أمبير) واحدة تلو الأخرى مباشرة. في نهاية التحفيز، أعيدت الحيوانات إلى قفصها المنزلي. كان زمن البقاء في قفص التكييف أقل من 9 ثواني. أظهرت الدراسات السابقة أن هذا الإجراء يسمح بتجنب العمليات الارتباطية بين المحفزات المؤلمة والمحفزات الحسية [29،30].

الحيوانات المكيفة بالخوف من الرائحة (odor-CS2). في هذه المجموعة، تم وضع الفئران داخل نفس القفص الأسود المستطيل المستخدم في المجموعات التجريبية المذكورة أعلاه وتم توصيلها بإعداد توصيل الصدمة. تم ترك الفئران دون إزعاج لمدة دقيقتين. بعد هذا الوقت، تم إعطاء 7 CSs تتكون من روائح الفانيليا (1 0 ثانية من المدة لكل منها، فاصل تجريبي مدته 24 ثانية). تم إقران آخر 1 ثانية من كل رائحة بالولايات المتحدة المؤلمة (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية). تم وضع وحدة التكييف بالقرب من مصدر التهوية لتجنب استمرار المحفزات المسلمة بعد إزاحتها. تم تزويد القفص بشبكة علوية. تم تقديم الروائح باستخدام مقياس الشم لتخفيف التدفق. تم توجيه الهواء النظيف (1.5 لتر/دقيقة) إلى صمام ذو ملف لولبي، والذي عند تشغيله، يمرر الهواء إلى زجاجة سعة 15 مل تحتوي على 10 مل من رائحة الفانيليا.

حيوانات ذات نغمة فقط (Tone-CS2). تم وضع الفئران في هذه المجموعة داخل نفس القفص الأسود وتم تقديم نغمة 15- كيلو هرتز (7 محفزات، 15 ثانية من المدة، 36 ثانية ITI) تم تسليمها في غياب الولايات المتحدة.

الحيوانات المعرضة مسبقًا (Tone-CS1-CS2). تم وضع الفئران داخل قفص التكييف، وبعد دقيقة واحدة، تم تقديمها 20 مرة بنغمة 15- كيلو هرتز وحدها، وبعد 24 ساعة تم إقران نفس النغمة مع الولايات المتحدة لتصبح CS1.

الحيوانات المكيفة بالخوف من الضوضاء البيضاء (WN-CS2). في هذه المجموعة، تم وضع الفئران داخل القفص الأسود المستطيل وتركت دون إزعاج لمدة دقيقة واحدة. بعد هذا الوقت، تم إعطاء 7 وحدات CS تتكون من WN (مدة كل منها 15 ثانية، 75 ديسيبل، فاصل زمني بين التجارب 36 ثانية). تم إقران آخر 1 ثانية من كل نغمة بالولايات المتحدة المؤلمة (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية). في نهاية جلسة التكييف، أعيد الفئران إلى قفصهم المنزلي.

تعلم الخوف السمعي: التدريب السلوكي الثاني. بعد أسبوعين من الإجراءات الموضحة في الفقرة أعلاه، تم تدريب الحيوانات على مهمة تكييف الخوف السمعي المختلفة. تم وضع الفئران في صندوق سكينر قياسي، كما في عملنا السابق [10]، وتركها دون إزعاج لمدة دقيقتين. بعد هذا الوقت، تم تسليم 7 CSs تتكون من نغمات نقية بتردد 3 كيلو هرتز (مدة كل منها 8 ثوانٍ، 80 ديسيبل، فاصل زمني بين التجارب 22 ثانية). تم إقران آخر 1 ثانية من كل نغمة بالولايات المتحدة المؤلمة (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية). في نهاية جلسة التكييف، أعيد الفئران إلى قفصهم المنزلي.

الخوف من احتباس الذاكرة. تم اختبار الاحتفاظ بذاكرة الخوف السمعية المكتسبة مؤخرًا إلى CS2 (3 كيلو هرتز) بعد 4 أيام. بالنسبة لتجارب علم البصريات الوراثي، تم إجراء اختبار الذاكرة الحديثة باستخدام الليزر لمدة 24 ساعة بعد تعلم CS 2- بالولايات المتحدة قياسًا على الفاصل الزمني الذي أجرينا فيه التعطيل القشري من خلال إدارة CNQX (أي 24 ساعة بعد تمرين). تم تعويد الفئران على جهاز مختلف عن ذلك المستخدم للتكييف ووضعها في غرفة مختلفة لتجنب سلوك الخوف المشروط تجاه الإشارات السياقية [10،62].

يتكون الجهاز الجديد من قفص بلاستيكي شفاف ذو جانب مطلي باللون الأسود ومحاط بصندوق مخفف للصوت مزود بمروحة عادم، مما يزيل الهواء الكريه من العلبة ويوفر ضوضاء خلفية تبلغ 60 ديسيبل. تم السماح للحيوانات باستكشاف القفص لمدة 5 دقائق يوميًا خلال جلسة التعود. في يوم اختبار الاحتفاظ بذاكرة الخوف، بعد دقيقتين من الاستكشاف المجاني، قمنا بتسليم 4 CS2 بتردد 3 كيلو هرتز (8 ثوانٍ - 22 ITI) لم تتبعها أي الولايات المتحدة.

إذا كان الطلب التجريبي مطلوبًا، تم بعد ذلك اختبار الفئران للاحتفاظ بذاكرة الخوف عن بعد، والتي تم الحصول عليها قبل أسبوعين من تجربة تكييف الخوف السمعي الثانية. لتحقيق هذا الهدف، بعد 7 أيام من اختبار الاحتفاظ بذاكرة الخوف لنغمة 3- كيلو هرتز، تم وضع الحيوانات في بيئة جديدة (قفص مخطط بالأبيض والأسود) ثم تم تقديمها بنغمة 15- كيلو هرتز. تم تقديم أربع نغمات على فترات 36 ثانية.

التدريب السياقي: الجلسة السلوكية الأولى. مجموعة تكييف الخوف السياقي (CtxA-CtxB). في هذه المجموعة، تم أخذ الفئران بلطف من قفصها المنزلي، ووضعها في دلو، ونقلها من غرفة السكن إلى الغرفة العازلة للصوت. وبمجرد الوصول إلى هناك، تم وضع الحيوانات داخل جهاز التكييف الذي يتكون من القفص الأسود المستطيل المذكور أعلاه، والمجهز بشبكة قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ المتصلة بإعداد توصيل الصدمات. تم ترك الفئران دون إزعاج لمدة دقيقة واحدة. بعد هذا الوقت، تم إعطاء 5 US (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية) بفواصل زمنية مدتها 51 ثانية. وفي نهاية الجلسة، أعيدت الحيوانات إلى قفصها المنزلي.

مجموعة الصدمة فقط (shock-CtxB). بمجرد وضع الفئران داخل جهاز التكييف، تلقت على الفور 5-صدمات بالقدم (1 ثانية، 0.5 مللي أمبير) واحدة تلو الأخرى مباشرة. كان زمن الدوام في قفص التكييف أقل من 7 ثواني. أظهرت الدراسات السابقة أن هذا الإجراء يسمح بتجنب العمليات الارتباطية بين المحفزات المؤلمة والمحفزات الحسية [29،30].

مجموعة الصدمة فقط (shock-CtxB). بمجرد وضع الفئران داخل جهاز التكييف، تلقت على الفور 5-صدمات بالقدم (1 ثانية، 0.5 مللي أمبير) واحدة تلو الأخرى مباشرة. كان زمن الدوام في قفص التكييف أقل من 7 ثواني. أظهرت الدراسات السابقة أن هذا الإجراء يسمح بتجنب العمليات الارتباطية بين المحفزات المؤلمة والمحفزات الحسية [29،30].

تكييف الخوف السياقي الجديد والاحتفاظ بذاكرة الخوف الحديثة. بعد أسبوعين من الإجراءات الموضحة في الفقرة أعلاه، تم تدريب جميع المجموعات على ربط بيئة سياقية جديدة (وحدة صندوق سكينر، الموضوعة في غرفة مختلفة) مع الولايات المتحدة المؤلمة (0.5 مللي أمبير، 1 ثانية) . تم وضع كل حيوان داخل الغرفة الجديدة وتركه دون إزعاج لمدة دقيقتين. ثم تم تعريضه لـ 5 US مفصولة بفواصل زمنية قدرها 30 ثانية.

تم اختبار الاحتفاظ بذاكرة الخوف السياقية بعد 4 أيام من إجراء تكييف الخوف عن طريق وضع الفئران مرة أخرى في حجرة صندوق سكينر لمدة 3 دقائق. بالنسبة لتجارب علم البصريات الوراثي، تم إجراء اختبار الذاكرة الحديثة باستخدام توصيل الليزر لمدة 24 ساعة بعد تعلم CtxB-US قياسًا على الفاصل الزمني الذي أجرينا فيه التعطيل القشري من خلال إدارة CNQX (أي 24 ساعة بعد التدريب). إذا كان الطلب التجريبي مطلوبًا، تم بعد ذلك اختبار الفئران للاحتفاظ بذاكرة الخوف عن بعد عن طريق وضع الحيوانات في السياق المقترن بالولايات المتحدة قبل أسبوعين من الارتباط الجديد.

تم نقل الحيوانات في دلاءين مختلفين إلى غرف التكييف وفقًا للإجراءات السياقية المختلفة.

قياس التجميد. في جميع الإجراءات التجريبية، تم تحديد تقييم الاحتفاظ بذاكرة الخوف كاستجابة تجميد [10]، وتم تحليلها على أنها الغياب الكامل للتنقل الجسدي باستثناء حركات الجهاز التنفسي. بالنسبة لكل حيوان، تم قياس مقدار الوقت (بالثواني) الذي يقضيه في التجميد دون الاتصال بالإنترنت بواسطة مراقبين مستقلين لم يتمكنا من رؤية مجموعات الحيوانات.

الإجراءات الجراحية

لإدارة المواد المختارة في المواقع المستهدفة، تم تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلورين: تم إجراء التحريض بنسبة 4% [حجم/حجم] في 2 لتر/دقيقة من الهواء الطبي وتم تمديده إلى التعرض المستمر بنسبة 2% [حجم/حجم]) عندما تم تركيب الفئران في جهاز التجسيمي.

تم إجراء شق في الجمجمة، وتم حفر ثقوب صغيرة للسماح باختراق إبرة التسريب 28-. تم استخدام محقنة 10-ul Hamilton مثبتة على مضخة تسريب لتوصيل المواد. بعد الحقن، تُترك الإبرة في مكانها لمدة 3 دقائق إضافية. تم بعد ذلك إغلاق الشق بمشابك جرح من الفولاذ المقاوم للصدأ، وتم إعطاء الحيوان حقنة تحت الجلد من الكيتوبروفين المسكن/المضاد للالتهابات (2 ملغم/كغم من وزن الجسم)، وتم إبقاء الحيوان دافئًا وتحت المراقبة حتى الشفاء من التخدير.

كما هو الحال في الدراسات السابقة [10،32-34]، لم يكن إدخال القنية للحيوانات ضروريًا، حيث يتم إعطاء المركبات النشطة مباشرة بطريقة التجسيمي. يعد هذا الإجراء مفيدًا لأنه يتم تجنب الصدمة الجراحية المتأصلة في إجراء القنية الدائمة، وبالتالي يقتصر الصدمة على اختراق إبرة واحدة [10،32-34]. في الواقع، التخدير العام لا يؤثر بشكل كبير على تعزيز الذاكرة [10،32-34]. للتأكد من أن توقيت إدارة المركبات المتعلقة بتجربة التعلم كان دقيقًا بحيث تلقت الفئران المركبات المختارة حوالي ساعة واحدة وحوالي يوم واحد بعد التدريب، تم تحفيز تخدير الأيزوفلورين قبل 5 دقائق من توقيت الحقن المخطط له، على سبيل المثال، عند 55 دقيقة. تم علاج دقيقة في الفئران لمدة 60 دقيقة بعد التدريب و23 ساعة و55 دقيقة في الحيوانات التي تم حقنها بعد 24 ساعة من التدريب. تم تكييف كل فأر ثم تشغيله بشكل منفصل. تم التلاعب بالحيوانات التي تنتمي إلى مجموعات سلوكية مختلفة بطريقة متداخلة.

المثبط الانتقائي لمستقبلات AMPA/kainate glutamate CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-ديون) (Tocris، 10 نانوغرام) /ul) تم إذابة [20,21] في محلول ملحي معقم (NaCl، 0.9%) وتم تعديله إلى درجة الحموضة 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. تمت إذابة مثبط تخليق البروتين anisomycin (Merck، 125 ميكروغرام/ul) في HCl متساوي المولولات، وتم تخفيفه بمحلول ملحي معقم، وتم ضبطه إلى pH 7.4 باستخدام NaOH. تم استخدام محلول ملحي معقم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) للتحكم في السيارة. تم حقن هذه المواد ثنائيًا بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة وحجم 0.5 ميكرولتر لكل موقع في الإحداثيات التجسيمية التالية المأخوذة من أطلس باكسينوس وواتسون [26]، مع توجيه المجال القشري Te2 إلى أطلس زيلز [25]:

القشرة السمعية الثانوية (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

القشرة الحزامية الأمامية (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

تم اختيار حجم الحقن (0.5 ul لكل موقع) بناءً على الدراسات السابقة حيث تم حقن المركبات النشطة في Te2 [10,34] وACC [55,63] في الفئران البالغة.

لتعطيل الحصين الظهري، تم حقن المركبات النشطة بحجم 0.6 ميكرو لكل موقع في الإحداثيات التجسيمية التالية:

الحصين الظهري: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

تم إحداث الآفات التي لا رجعة فيها في الحصين الظهري عن طريق إعطاء NMDA (Tocris، 18 ميكروغرام / ul، مذاب في محلول ملحي معقم، 0،4 ul لكل موقع) بمعدل 0.1 ul/ دقيقة عند نقاط عند الإحداثيات المذكورة أعلاه. تم استخدام نفس الإحداثيات لعناصر التحكم التي يتم حقنها بالمحلول الملحي والحيوانات التي يتم تشغيلها بشكل صوري.

تم حقن Red Retrobeads (Lumafluor، تخفيف 1: 2 في محلول ملحي، 0.6 ul) في BLA وفقًا للإحداثيات التالية: AP: −2.8؛ ل: ±5.4؛ العنف المنزلي: −8.3.

وفي نهاية التجارب، تم التحقق من الناحية النسيجية من مسارات الإبرة في حالة حقن CNQX أو الأنيسومايسين أو المياه المالحة أو امتداد الآفات في حالة حقن NMDA. تم تخدير الفئران بعمق وإرواءها داخل القلب باستخدام الفورمالديهايد بنسبة 4٪. تم تقسيم أدمغتهم عند 30 ميكرومتر على ناظم البرد. تم تحضير المقاطع التسلسلية الملطخة بـ Nissl باستخدام الإجراء التقليدي وتم التحقق من المقاطع تشريحيًا تحت المجهر المكبر بمقدار 2.5 ×.

التجارب الضوئية

حقن الفيروس. تم الحصول على الفيروس المرتبط بالغدة AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry وناقل التحكم AAV5:CaMKII -cherry من جامعة نورث كارولينا Vector Core (تشابل هيل، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت الجملة عيار الفيروس 5:8 عيار الفيروس 5.8 × 10^12 vg/ml لكلا الفيروسين. يتيح استخدام مروج CaMKII التعبير عن الجينات لصالح الخلايا العصبية الهرمية. تم وضع الفيروسات في ثلاجة تبلغ درجة حرارتها −80˚C. تم إجراء عمليات الحقن الفيروسية التي تستهدف Te2 أو ACC عند إحداثيات التجسيمي المذكورة أعلاه بأحجام 0.5 ميكرولتر لكل ثقب. تم حقن الفيروس بمعدل 0.1 ميكرولتر/دقيقة، وتركت الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق إضافية. تم إجراء الحقن الفيروسية قبل 4 أسابيع من تجارب علم البصريات الوراثي.

إضاءة.

تم زرع الألياف الضوئية (Plexon، 200/230 ميكرومتر؛ طول 10 مم) بشكل ثنائي في BLA (AP=−2.8، L=± 5.4، V=−8.2 مم) من بريجما). تم الحصول على تثبيط بصري لإسقاطات Te2 إلى BLA أو لإسقاطات ACC إلى BLA باستخدام نظام PlexBright Optogenetic Stimulation System المقترن بصمام ثنائي ليزر (Laserglow Technologies). يتولد الضوء الأصفر (589 نانومتر) ويمرر عبر الألياف الضوئية. كانت كثافة الطاقة المقدرة عند طرف الألياف الضوئية تتراوح بين 10 إلى 15 ميجاوات لإضاءة مواقع الإسقاط. أثناء الاحتفاظ بذاكرة الخوف، بدأ انبعاث الضوء قبل 4 ثوانٍ من بداية النغمة، واستمر طوال النغمة، وتم إيقافه لمدة 4 ثوانٍ بعد إزاحة النغمة. تلقت الحيوانات التي تنتمي إلى مجموعات تكييف الخوف السياقية تحفيزًا خفيفًا أثناء استكشاف السياق بأكمله (3 دقائق). تم تعريف الفئران بسلك التصحيح لمدة يومين قبل تجربة الاحتفاظ بالذاكرة.

الكيمياء المناعية. عند الانتهاء من تجارب علم البصريات الوراثي، تم تخدير الفئران بعمق وإرواءها داخل القلب باستخدام 4٪ من PAF لفحص انتشار الفيروس. تم تشريح الأدمغة، وتخزينها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ثم نقلها أخيرًا إلى 30٪ سكروز. تم قطع المقاطع الإكليلية (30 ميكرومتر) على ناظم البرد وجمعها في برنامج تلفزيوني. تم تحضين المقاطع العائمة الحرة في محلول مانع لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تم تحضينهم في الأجسام المضادة الأولية للفأر وحيدة النسيلة المضادة لـ mCherry (التخفيف 1:500، Abcam) في محلول الحظر طوال الليل عند RT. بعد ذلك ، تم غسل المقاطع باستخدام PBS واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام جسم مضاد للفأر AlexaFluor -568 فلورسنت ثانوي (1: 600 ، Invitrogen) مخفف في PBS. تم غسل المقاطع في برنامج تلفزيوني، والتي تم تركيبها مع وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي على DAPI (ناقل)، وساترة.

تم جمع أدمغة الفئران التي خضعت لحقن NMDA بالمثل. تم تحضين المقاطع العائمة الحرة، بعد عدة عمليات شطف، باستخدام الأجسام المضادة الأولية أحادية النسيلة المضادة للنيون (1:1، 000 التخفيف، Merck) في محلول الحظر طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تم غسل المقاطع باستخدام PBS واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجسم المضاد المضاد للفأر الذي يحتوي على بيوتينيل (1: 2 0 0 تخفيف ، ناقل). تم ربط مجمع avidin-biotin (مجمع ABC 1: 100، Vector، ساعتين ونصف من الحضانة) بـ diaminobenzidine (0.03٪، Merck) لصبغ نيون. تم بعد ذلك شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني ونقلها إلى شرائح مغلفة بالجيلاتين، وتجفيفها، وتغطيتها بغطاء.

خضعت أقسام Te2 من الفئران المحقونة بالخرز الرجعية للحضانة مع الأجسام المضادة الأولية للأرنب متعدد النسيلة المضادة لـ Fos (1: 2، 000، إشارات الخلية) في محلول الحظر طوال الليل عند RT. بعد ذلك ، تم غسل الشرائح باستخدام PBS واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام Alexa 488 المضاد للأرنب (1: 1، 000، Invitrogen، في PBS). أخيرًا، تم غسل المقاطع ذات العلامات المناعية في برنامج تلفزيوني، وتم تركيبها على شرائح مغلفة بالجيلاتين، ومغطاة بوسيط تركيب مكمل DAPI.

الفحص المجهري

تم فحص علامات mCherry باستخدام مجهر Zeiss Airyscan متحد البؤر: تم استخدام ليزرين (4 0 5 و 561 نانومتر)، يتوافق كل منهما مع طيف انبعاث الذروة لـ DAPI (صبغة Nissl لنواة الخلية) و Alexa 568 (mCherry )، على التوالى. لتحليل انتشار الفيروس في مواقع الحقن، تم الحصول على صور مجهرية لـ Te2 وACC كصور فسيفساء (تم الحصول على كل واحدة باستخدام هدف 10×). تم تحليل محطات Axon في BLA باستخدام هدف 40 × كمجموعة z مكونة من 10 أقسام، متباعدة 1 ميكرومتر (159 ميكرومتر مربع؛ جزء التكبير/التصغير، 1.0).

بالنسبة للحيوانات التي تم حقنها بالخرزات الرجعية والتي خضعت للتطعيم المناعي لـ cFos، تم الحصول على الصور بتكبير 40× (159 ميكرومتر مربع؛ جزء التكبير/التصغير، 1.0) باستخدام 3 أشعة ليزر مختلفة، تتوافق مع طيف انبعاث الذروة لـ DAPI (Nissl وصمة عار لنواة الخلية)، AlexaFluor 488 (cFos)، وTexas Red (Retrobeads)، على التوالي. تم الحصول على مقاطع بحجم 0.7 ميكرومتر على طول مكدس z 10- ميكرومتر. تم تحديد عدد النوى التي تعبر عن cFos، والخرز المسمى، والإيجابي المزدوج (خرز cFos + المسمى) لكل حيوان في منطقة Te2 عند الإحداثيات الأمامية الخلفية من 6.7 إلى 7.3 ملم من bregma [10]. ثم تم حساب متوسط ​​البيانات للحصول على متوسط ​​كل حيوان وتمت مقارنة النتائج إحصائيا. تم تحليل صور المقاطع ذات تلطيخ DAB لـ Neun باستخدام برنامج Neurolucida المتصل بالمجهر عبر كاميرا CCD ملونة [10].

تحليل البيانات ومعايير الاستبعاد

تم إنشاء n لكل مجموعة مسبقًا وفقًا لدراساتنا السابقة [10،16،17]، والأعمال المنشورة مسبقًا في هذا المجال (انظر كمراجع لـ ACC [6،22،55] وTe2 [10،59])، ومن خلال تقديرات G-power حسب الجدول التالي (الجدول 1):

لكل تحليل، قمنا بتقدير العدد المتوسط ​​النهائي من 8 إلى 10 حيوانات لكل مجموعة. تم تشغيل المجموعات باستخدام الضوابط الداخلية في نفس الجلسة التجريبية (جدول S1). ونظرًا لتباين الإجراءات الجراحية والسلوكية، فقد قمنا مسبقًا بتضمين عدد أكبر من الأشخاص التجريبيين (ما يصل إلى 15٪ أكثر) الذين استوفوا المعايير التجريبية في بعض الحالات وتم إدراجهم، وبالتالي تجنب الاستبعاد التعسفي. في حالة دراسات الحصين، لتقييم آثار حقن NMDA وCNQX على فترات زمنية مختلفة، قمنا بموازنة العدد الإجمالي لحيوانات المراقبة بين الفئران التي يتم تشغيلها بالمركبة والصورة بين المجموعات المختلفة.

تم إجراء التحليل السلوكي، وعمليات التفتيش النسيجي، وعدد الخلايا بشكل أعمى. تم استبعاد الحيوانات ذات التوطين غير الكافي لمسار الإبرة أو الآفة في حالة آفات NMDA التي لا رجعة فيها من تحليل البيانات (جدول S1). في الدراسات الدوائية، استبعدنا 57 حيوانًا من إجمالي 465 حيوانًا بسبب وضع إبرة غير صحيح (22/255 لـ Te2، 31/179 لـ ACC، و4/31 للحصين). في دراسات التتبع، التي أجريت على 21 حيوانًا، قمنا بإزالة 3 موضوعات أخطأ فيها حقن الخرز الرجعي BLA. في دراسات علم البصريات الضوئية Te2، على إجمالي 30 حيوانًا، استبعدنا فأرًا واحدًا لأن موضع الألياف البصرية لم يكن أعلى من المنطقة المستهدفة، فأرًا واحدًا. بعد كل شيء، كان الفيروس غائبا في Te2، و2 من الفئران لأن انتشار الفيروس كان على التوالي أقل من 4.7٪ و5.3٪ من منطقة Te2 في مواقع الحقن. في الفئران المشمولة في التحليل الإحصائي، كان الحد الأدنى لانتشار الفيروس هو 39.6% في الإحداثيات التجسيمية الأمامية و50.2% في الإحداثيات التجسيمية الخلفية.

وبالمثل، في تجارب علم البصريات الوراثي التي أجرتها لجنة التنسيق الإدارية، على إجمالي 32 حيوانًا، تم القضاء على فئران لأن وضع الألياف البصرية لم يكن أعلى من المنطقة المستهدفة. تم استبعاد فئران بسبب غياب الفيروس في ACC، وحيوان واحد لأن الفيروس كان في القشرة الحركية الثانوية المجاورة، وفأر واحد لأن انتشار الفيروس كان أقل من 2.3% من منطقة ACC في مواقع الحقن. في الفئران المتبقية، كان الحد الأدنى لانتشار الفيروس 33.3% في الإحداثيات التجسيمية الأمامية و42.2% في الإحداثيات الخلفية.

في دراسات آفات NMDA، استهدفت الآفات في الغالب منطقة CA1 في الحصين الظهري. كان الحد الأدنى (الأحمر) والامتداد الأقصى (الوردي) لآفات الحصين على كامل منطقة الحصين الظهري 23.2% و53.5% على التوالي في الإحداثيات التجسيمية الأمامية و28.3% و62.3% في الإحداثيات الخلفية. على إجمالي 73 حيوانًا، تم القضاء على 4 فئران نظرًا لغياب الآفة، بينما تم التخلص من 3 حيوانات إضافية لأن امتداد الآفات كان أقل من 5.0% (أي 4.8%، 4.3%، 3.1) %) فيما يتعلق بمنطقة الحصين عند الإحداثيات 2.

تم إجراء تحليل كفاف المنطقة من خلال الفحص البصري والقياس الكمي اليدوي باستخدام أداة كفاف المنطقة لبرنامج ZEN 3.0. ثم تم تطبيع قيم المساحة على المساحة الإجمالية للمنطقة. استندت الإحداثيات التجسيمية لـ Te2 وACC والحصين إلى أطلس باكسينوس [26]، وفي حالة Te2، مع توجيه المجال القشري إلى أطلس زيليس [25].

تحليل احصائي

يتم تقديم كافة البيانات على أنها تعني ± SEM. اجتازت جميع البيانات اختبار ليفين لمساواة التباين. وهكذا، تم استخدام الإحصائيات البارامترية في جميع التجارب. تمت مقارنة البيانات من مجموعتين باستخدام 2-اختبارات الطالب غير المقترنة. تم تقييم مقارنات المجموعات المتعددة باستخدام اختبار 1-طريقة ANOVA مع اختبار توكي اللاحق. لمعالجة الاختلافات بين المجموعات وداخلها، قمنا بحساب نموذج ANOVA ذو التصميم المختلط 3 × 2 مع مجموعة (CS 1-CS2، Tone-CS1-CS2، WN-CS2) باعتبارها بين- متغير المواضيع والحالة (قبل وبعد التكييف الأخير + الحقن) كمتغير داخل المواضيع. عندما كان تفاعل حالة المجموعة × مهمًا، أجرينا تحليلًا بسيطًا للتأثيرات الرئيسية وقمنا بتعديل كل قيمة p باستخدام تصحيح Bonferroni. بالنسبة لكل نموذج ANOVA مختلط، قمنا بتقييم افتراض الكروية من خلال اختبار Mauchly للكروية.

تم الإبلاغ عن المعلمات الإحصائية (أي القيمة الدقيقة لـ n لكل مجموعة، وSEM، والاختبار الإحصائي، وحجم التأثير، والقيمة p الدقيقة) في وسائل الإيضاح. بالنسبة لأحجام العينات المتساوية، تم تحديد أحجام التأثير لاختبارات t غير المقترنة عن طريق حساب Cohen's d أو Glass's d وفقًا لتشابه SDs بينما، بالنسبة لأحجام العينات المختلفة، تم حساب Hedges'g. تم حساب الارتباطات بين عدد الخلايا والتجميد باستخدام معامل بيرسون. لتحديد ما إذا كانت البيانات تلبي افتراضات النهج الإحصائي، رفضنا الفرضية الصفرية عند مستوى P <0.05. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام SPSS Statistics 22 (IBM).

دعم المعلومات

S1 الشكل: تكبير مسارات إبرة Te2 (A) وقشرة ACC (B) المحقونة بـ CNQX، تم اختيارها كأمثلة. (ج) عندما تم تمثيلها بنفس السياق بعد أسبوعين من الإجراء، أظهرت الحيوانات المصابة بالصدمة فقط استجابة خوف منخفضة، مما يدل على أن الإجراء لم يثير التجميد المشروط في السياق الذي تم فيه تسليم الصدمة. (D) تم الحصول على نتائج مماثلة كما في الشكل 1 من خلال موازنة النغمتين المستخدمتين كنغمتين CS (CS1، 3 كيلو هرتز وCS2، 15 كيلو هرتز) (اختبار الطالب t، t(14)=3.44، p {{ 13}}.0040، جلاس د=4.14). (E) في الفئران المكيفة ذات الرائحة CS التي تتجمد للرائحة، بعد أسبوعين من التكييف، كانت مرتفعة حتى لو تم اختبارها في بيئة مختلفة فيما يتعلق بسياق التكييف، مما يوضح أن الخوف كان مرتبطًا على وجه التحديد بتسليم الإشارة هذه. أشرطة النطاق، 300 ميكرومتر. ��ف <0.01. جميع البيانات تعني وSEM. يمكن العثور على البيانات الموجزة الخاصة بـ S1 Fig في المعلومات الداعمة في الملف المسمى S1 Supporting Figure Data. (تيف)

S2 الشكل: أدى حقن CNQX إلى إضعاف الاحتفاظ بذكريات الخوف السمعي الحديثة لدى الفئران حيث تم تخفيض تعميم الخوف عن طريق التعرض المسبق للنغمة وحدها أو عن طريق استخدام نغمة ضوضاء بيضاء مثل CS1. A 3 × 2 تصميم مختلط ANOVA (التأثير الرئيسي للمجموعة: F(2,42)=6.478، p {{10}}.00 4، η2=0.236، التأثير الرئيسي للشرط: F(1,42)=0.161، ص=0.691، η2=0.004، المجموعة × تفاعل الحالة F(2,42)=3.942، p=0.027، η2=0.158) أظهر أن التجميد إلى نغمة 3 كيلو هرتز قبل ارتباطه بالولايات المتحدة كان أقل في الحيوانات التي تلقت تعريضًا مسبقًا للنغمة بمقدار 15 كيلو هرتز قبل الاقتران بـ 15 كيلو هرتز-الولايات المتحدة (n=10، p=0.001) أو في الفئران المكيفة للضوضاء البيضاء (n=13 ، ص=0.008) بالمقارنة مع حيوانات CS 1- CS2 (ن=22) التي أظهرت استجابة تعميم الخوف المتغير. ومع ذلك، بعد التعلم CS-US وحقن cnqx في قشرة Te2، ضعفت ذاكرة الخوف الأخيرة في جميع المجموعات (P > 0.05). التأثير الرئيسي البسيط داخل المجموعات (قبل وبعد تعلم CS-US متبوعًا بحقن cnqx): CS1-CS2, p=0.025; نغمة-CS1-CS2، ص=0.189؛ WN-CS2، ص=0.347) P <0.05، ��P <0.01. جميع البيانات تعني وSEM. يمكن العثور على البيانات الموجزة الخاصة بـ S2 Fig في المعلومات الداعمة في الملف المسمى S1 Supporting Figure Data. (تيف)

S3 الشكل (أ) مثال عشوائي لحقن retrobeads الذي يستهدف BLA. (ب وج) أمثلة على مواضع الألياف الضوئية فوق BLA للحيوانات التي تم حقنها بنواقل AAV في Te2 (B) وقشرة ACC (C). أشرطة النطاق، 500 ميكرومتر.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور إي ماناسيرو على دعمهم المستمر ونصائحهم.

الكاتب الاشتراكات

تصور: جوليا كونسينا، أناماريا رينا، بينيديتو ساكيتي.

تنظيم البيانات: جوليا كونسينا، لويزيلا ميلانو، بينيديتو ساكيتي.

التحليل الرسمي: جوليا كونسينا، أناماريا رينا، لويزيلا ميلانو.

الحصول على التمويل: جوليا كونسينا، بينيديتو ساكيتي.

التحقيق: جوليا كونسينا، أناماريا رينا، لويزيلا ميلانو.

المنهجية: جوليا كونسينا، أناماريا رينا، لويزيلا ميلانو.

الإشراف: بينيديتو ساكيتي.

التحقق من الصحة: ​​بينيديتو ساكيتي.

الكتابة – المسودة الأصلية: جوليا كونسينا، بينيديتو ساكيتي.

كتابة – مراجعة وتحرير: أناماريا رينا، لويزيلا ميلانو.

مراجع
1. Frankland PW، Bontempi B. تنظيم الذكريات الحديثة والبعيدة. نات القس نيوروسي. 2005; 6: 119-130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 بميد: 15685217

2. Dudai Y. البيولوجيا العصبية للتوحيد، أو ما مدى استقرار الإنجرام؟ آنو القس النفسي. 2004; 55:51-86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. سكواير إل آر، جينزل إل، ويكستد جي تي، موريس آر جي. توحيد الذاكرة. الربيع البارد حرب منظور بيول. 2015؛ 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. ألفاريز بي، سكواير إل آر. توحيد الذاكرة والفص الصدغي الإنسي: نموذج شبكة بسيط. Proc Natl Acad Sci الولايات المتحدة أ. 1994؛ 91:7041-7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. ماكليلاند جي إل، ماكنوتون بي إل، أورايلي آر سي. لماذا توجد أنظمة تعليمية تكميلية في الحصين والقشرة المخية الحديثة: رؤى من نجاحات وإخفاقات النماذج الترابطية للتعلم والذاكرة. القس النفسي 1995؛ 102: 419-457.

For more information:1950477648nn@gmail.com