العمل الترويجي لـ Oenothera Biennis على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الشائخة الجزء 1

خلاصة: يؤدي تراكم الأرومات الليفية الجلدية المتشيخة إلى شيخوخة الجلد. إن إعادة تنشيط الانتشار هي إحدى الاستراتيجيات لتعديل شيخوخة الخلايا. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن التركيب الكيميائي الدقيق للمستخلص المحبة للماء لمزارع خلايا Oenothera biennis (ObHEx) وأظهرنا خصائص الجلد المضادة للشيخوخة. يهدف هذا العمل إلى تقييم تأثيره البيولوجي على وجه التحديد على شيخوخة الخلايا. تم تقييم تأثير ObHEx على الأرومات الليفية الجلدية الطبيعية التي تتعرض للشيخوخة المبكرة الناجمة عن الإجهاد (SIPS) من خلال تحليل بروتيني عميق للغاية ، مما يؤدي إلى أكثر البروتينات المرتبطة بالشيخوخة العالمية حتى الآن. تُظهر بيانات قياس الطيف الكتلي أن العلاج باستخدام ObHEx يعيد إنشاء مستويات البروتينات الانقسامية الحاسمة ، والتي يتم تنظيمها بقوة في الخلايا الشائخة. للتحقق من صحة نتائج البروتينات التي توصلنا إليها ، أثبتنا أن ObHEx يمكنه جزئيًا استعادة نشاط "ß-galactosidase المرتبط بالشيخوخة" ، وهي السمة المميزة الأكثر شيوعًا للخلايا الشائخة. علاوة على ذلك ، لتقييم ما إذا كان تنظيم مستويات البروتين الانقسامي يترجم إلى إعادة دخول دورة الخلية ، تم إجراء تجارب FACS ، مما يدل على إعادة تنشيط صغيرة ولكنها مهمة لتكاثر الخلايا الشائخة بواسطة ObHEx. في الختام ، يوفر التنميط البروتيني العالمي المرتبط بالشيخوخة العميقة المنشور هنا لوحة من مئات البروتينات التي تم تحريرها بواسطة SIPS والتي يمكن استخدامها من قبل المجتمع لمزيد من فهم الشيخوخة وتأثير المغيرات المحتملة الجديدة. علاوة على ذلك ، أشار تحليل البروتينات إلى تأثير معين مؤيد للانقسام الفتيلي لـ ObHEx على الخلايا الشائخة. وبالتالي ، فإننا نقترح ObHEx كمساعد قوي ضد الشيخوخة المرتبطة بشيخوخة الجلد.

يمكن أن يزيد الجليكوزيد من cistanche أيضًا من نشاط SOD في أنسجة القلب والكبد ، ويقلل بشكل كبير من محتوى lipofuscin و MDA في كل نسيج ، ويزيل بشكل فعال العديد من جذور الأكسجين التفاعلية (OH- ، H₂O₂ ، إلخ) والحماية من تلف الحمض النووي الناتج عن ذلك. بواسطة OH- الجذور. جليكوسيدات Cistanche phenylethanoid لديها قدرة قوية على إزالة الجذور الحرة ، وقدرة تخفيض أعلى من فيتامين C ، وتحسن نشاط SOD في تعليق الحيوانات المنوية ، وتقليل محتوى MDA ، ولها تأثير وقائي معين على وظيفة غشاء الحيوانات المنوية. يمكن أن يعزز عديد السكاريد القارص نشاط SOD و GSH-Px في كريات الدم الحمراء وأنسجة الرئة للفئران المسنة تجريبياً الناتجة عن D-galactose ، وكذلك تقليل محتوى MDA والكولاجين في الرئة والبلازما ، وزيادة محتوى الإيلاستين ، تأثير الكسح الجيد على DPPH ، وإطالة وقت نقص الأكسجة في الفئران الشائخة ، وتحسين نشاط SOD في مصل الدم ، وتأخير التنكس الفسيولوجي للرئة في الفئران الشائخة تجريبياً مع التنكس المورفولوجي الخلوي ، أظهرت التجارب أن Cistanche لديه قدرة جيدة على مضادات الأكسدة وله القدرة على أن يكون دواءً لمنع وعلاج أمراض شيخوخة الجلد. في الوقت نفسه ، يتمتع إشنكوسايد في Cistanche بقدرة كبيرة على البحث عن الجذور الحرة لـ DPPH ويمكنه البحث عن أنواع الأكسجين التفاعلية ، ومنع تدهور الكولاجين الناجم عن الجذور الحرة ، وله أيضًا تأثير إصلاح جيد على تلف أنيون الثايمين الجذور الحرة.

انقر فوق ملحق Cistanche Tubulosa

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】

الكلمات الدالة: مستخلص Oenothera biennis ماء ؛ الشيخوخة. الليفية؛ البروتينات. قياس الطيف الكتلي؛ diaPASEF. الانقسام المتساوي؛ شيخوخة الجلد

1 المقدمة

الشيخوخة هي السبب الرئيسي للشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر. تخضع الخلايا الشائخة لتوقف التكاثر كاستجابة لتآكل التيلومير الفسيولوجي (الشيخوخة التكرارية) أو لمحفزات الإجهاد بما في ذلك تلف الحمض النووي ، والإجهاد التأكسدي ، وسلالة العضية ، وتفعيل الجينات الورمية (الشيخوخة المبكرة التي يسببها الإجهاد ، SIPS) [1]. على الرغم من توقف النمو الناجم عن استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ، فإن الخلايا الشائخة تظهر حالة استقلابية عالية ونشاط ليسوزوميًا ، وهو أمر حاسم لزيادة نشاطها الإفرازي ، والمعروف باسم النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) [2،3]. تتضمن عوامل SASP عدة عائلات من البروتينات القابلة للذوبان (الإنترلوكينات ، والكيموكينات ، وعوامل النمو ، والبروتياز المفرز) والبروتينات غير القابلة للذوبان (البروتينات غير القابلة للذوبان المفرزة ومكونات المصفوفة خارج الخلية) التي تؤثر سلبًا على الأنسجة المحيطة ، مما يؤدي إلى حدوث حالة التهابية مزمنة منخفضة الدرجة.

يؤدي تراكم الأرومات الليفية الشائخة في الجلد إلى شيخوخة الجلد ، مما يضعف سلامة المصفوفة خارج الخلوية (ECM) ووظيفة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المجاورة ، والخلايا الصباغية للبشرة ، والخلايا الكيراتينية [4-6]. الاستراتيجيات الثلاث الرئيسية لمواجهة الشيخوخة تشمل (1) إزالة الخلايا المتشيخة عن طريق تحريض موت الخلايا المبرمج أو التنشيط المناعي ؛ (2) تعديل SASP و (3) إعادة تنشيط تكاثر الخلايا. في الواقع ، على الرغم من وصف الشيخوخة في الأصل على أنها توقف دورة الخلية بشكل لا رجوع فيه ، فإن الأدلة الحالية تشير إلى أنه يمكن استعادة الانتشار [7-9].

في هذا السيناريو ، تعتبر المكونات القادرة على منع و / أو تعديل الشيخوخة الخلوية ذات أهمية كبيرة في مجال مستحضرات التجميل كأسلحة قيمة لمواجهة شيخوخة الجلد. على وجه الخصوص ، يتم استخدام المستخلصات المشتقة من نوع Oenothera biennis (O. biennis ، زهرة الربيع المسائية) ، التي تنتمي إلى عائلة Onagraceae ، بشكل تقليدي للتطبيقات التجميلية نظرًا لأنشطتها المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة [10]. تحتوي المستخلصات الميثانولية المحضرة من الأجزاء الهوائية ومستخلصات الأوراق المائية بشكل أساسي على الأحماض الفينولية والفلافونويدات ، بينما تحتوي المستخلصات الميثانولية التي يتم الحصول عليها من الجذور في الغالب على الستيرولات والتريتربين [11]. على الرغم من إثبات الأنشطة البيولوجية لمستخلصات الأجزاء الهوائية الكحولية والكحولية المائية [12-14] ، فإن أكثر مستخلصات O. biennis استخدامًا هي الزيوت المستخلصة من البذور ، وهي غنية جدًا بالأحماض الدهنية. في الواقع ، نظرًا لأن محتواها العالي من حمض اللينوليك (LA) وحمض اللينولينيك (GLA) ، تعمل زيوت بذور O. biennis على تحسين الأداء السليم للجلد ، وعلى وجه الخصوص ، فقد أظهرت آثارًا مفيدة في مرضى التهاب الجلد المزمن [11 ، 15].

في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح مقتطفات تم الحصول عليها من مزارع الخلايا O. biennis لاستبدال مستخلصات نباتات تلقائية تمامًا لأنها مستدامة بيولوجيًا ، وخالية من الملوثات ، ومخاليط مستقلبات ثانوية معيارية [16]. إن توليفة المركبات مع تأثيرها التآزري بالتحديد هي المسؤولة عن النشاط الكلي للمستخلصات النباتية [17].

هنا ، ركزنا على المستخلص المحب للماء لمزارع خلايا O. biennis (ObHEx) ، الغنية بالقشور والتريتربين ، حيث أظهرت خصائص مقاومة الشيخوخة للجلد عند اختبارها في النماذج المختبرية وخارج الجسم الحي [18]. أظهر التوصيف الكيميائي القائم على قياس الطيف الكتلي لهذا المستخلص أنه يحتوي على عدة فئات من المستقلبات الثانوية المثيرة للاهتمام. وهي تنتمي إلى قشور (سلفادوراسايد وليريوديندرون) وتريتربينيس (حمض مرياتيك وحمض أرجونوليك وحمض الأسبارتيك وهيدراجينين) ، وقد ارتبط بعضها سابقًا بإنتاج الكولاجين الأول في الخلايا الليفية البشرية [19 ، 20]. على وجه الخصوص ، لقد أثبتنا سابقًا أن ObHEx يعزز تقلص كولاجين المصفوفة ، وبلمرة الأكتين ، وإنتاج بروتينات ECM ، وبالتالي تحسين ثبات الجلد ومرونته ، من خلال زيادة التعبير الجيني لسلسلة كيناز Myosin الخفيفة (MYLK).

حتى الآن ، لم يتم التحقيق في الآليات الجزيئية لتأثيرات ObHEx على شيخوخة الجلد والشيخوخة الخلوية ، على وجه الخصوص. يهدف هذا العمل إلى استكشاف نشاط ObHEx على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الشائخة. استخدمنا نهجًا بروتينيًا عميقًا للغاية لقياس الطيف الكتلي غير المعتمد على البيانات للحصول على تلميحات حول آلية العمل وطرق التعامد الحيوي للتحقق من صحتها والتحقيق فيها (الشكل 1).

2. النتائج

تم إجراء الشيخوخة المبكرة الناجمة عن الإجهاد (SIPS) في الخلايا الليفية الجلدية البشرية الطبيعية (NHDF) عن طريق العلاج باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H2O2). تعتبر الخلايا المتشيخة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي نموذجًا ممتازًا في المختبر لأبحاث الشيخوخة ويستخدم H2O2 على نطاق واسع لتحقيق ذلك [21 ، 22].

لفهم المسارات البيولوجية التي تم تغييرها بواسطة ObHEx على خلايا NHDF الشائخة ، استخدمنا نهجًا بروتينيًا شديد العمق. تمت معالجة SIPS وخلايا التحكم أم لا لمدة 48 ساعة بالمستخلص عند 0. 01 بالمائة (p / v) لأنه ، من اختبار MTT المبلغ عنه في [18] ، ينتج عن هذا أعلى تركيز لا يسبب أي سمية خلوية بعد 48 ساعة من الحضانة.

ثم تم تعريض محللات الخلية لعملية الهضم التجريبي وتحليل MS / MS النانوي UPLC. للحصول على العمق الأمثل للبروتين ، تم الحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي في وضع الاكتساب المستقل للبيانات (DIA) ، والذي سمح بالتقدير القوي لـ 9650 بروتينًا (الجدول S1) ، مع اكتمال البيانات بنسبة 98 بالمائة. تشير دراستنا إلى التحليل البروتيني الأكثر اكتمالا للخلايا الشائخة حتى الآن.

2.1. تقييم الشيخوخة المبكرة الناجمة عن الإجهاد (SIPS)

بادئ ذي بدء ، تحققنا مما إذا كان تحريض الشيخوخة في NHDF ناجحًا ، وتحليل البروتين العالمي لـ H2O 2- المعالج بـ NHDF عن طريق قياس الطيف الكتلي (MS) وفحص مورفولوجيتها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

2.1.1. تقييم SIPS عن طريق قياس الطيف الكتلي (MS)

لتقييم تحريض SIPS ، قمنا بمقارنة البروتين الكلي لخلايا NHDF المعالجة بـ H2O 2- مقابل الخلايا غير المعالجة. من بين 3256 بروتينًا تم تحريرها ، تم العثور على العديد من المؤشرات الحيوية للشيخوخة تم تغييرها بشكل كبير (الشكل 2 أ ، ب). أولاً ، لاحظنا زيادة تنظيم أكثر العلامات الحيوية شيخًا استخدامًا ، وهي "الشيخوخة المرتبطة بـ ß-galactosidase" (SA - - gal ، GLB1). تعكس المستويات المتزايدة من الإنزيمات الليزوزومية GLB1 و Tissue alpha-L-fucosidase (FUCA1) ، والتي تم تنظيمها أيضًا بواسطة MS ، الزيادة المميزة في المحتوى الليزوزومي للخلايا المتشيخة [23 ، 24]. في الواقع ، تفضل الجسيمات الحالة عمليات التقويض ، التي توفر الطاقة والمواد الخام التي يتطلبها الإفراز المرتبط بالشيخوخة [25].

ثانيًا ، تم أيضًا زيادة مستوى بروتين سيرين / ثريونين-بروتين كيناز ATR وجهاز الصراف الآلي سيرين بروتين كيناز ، وكلاهما يشارك في إشارات DDR ، [26]. يتم تنشيط DDR عن طريق تلف الحمض النووي النووي ، المرتبط عمومًا بتكوين الشيخوخة الخلوية ، ويتحول إلى تنشيط مثبط الورم p53. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضًا تنظيم متغيرات هيستون 2A MACROH2A1 و MACRO2A2. تشارك هذه البروتينات في التكوين المعتمد على ATR لبؤر الهيتروكروماتين المرتبطة بالشيخوخة (SAHFs) ، هياكل الكروماتين الكثيفة والقمعية المميزة للخلايا الشائخة [1،2،27].

أخيرًا ، تعكس المستويات المحررة من مثبط كيناز 1A المعتمد على Cyclin أو p21 (CDK1NA) وبروتين علامة الانتشار Ki -67 (MKI67) توقيف دورة الخلية الشائخة في المرحلة G2 [28،29]. في الواقع ، يزيد p21 من المستويات ، التي يعززها مسار p53 الناجم عن تلف الحمض النووي ، ويثبط مركب CDK 2- cyclin E. يؤدي هذا إلى نزع الفسفرة من بروتين الورم الأرومي الشبكي (RB) ، والذي في حالته الفسفورية التي تحتوي على عازل E2F ، وهو عامل نسخي يفضل تقدم دورة الخلية [2].

إلى جانب هذه العلامات المعروفة بالفعل للشيخوخة ، يشير تحليل إثراء المسار الأوسع للبروتينات الأكثر تنظيمًا في خلايا H2O2 المعالجة مقابل خلايا التحكم إلى تنشيط مسار p53 / p21 الناجم عن تلف الحمض النووي (الشكل 2C ، الجدول S2). بدلاً من ذلك ، يتم تنظيم البروتينات المرتبطة بالانتشار والانقسام ، مما يشير إلى توقف الانتشار الناتج (الشكل 2 د ، الجدول S3).

2.1.2. تقييم SIPS عن طريق قياس التدفق الخلوي

كما تم تأكيد SIPS عن طريق تحليل التدفق الخلوي. لاحظنا زيادة في الحبيبات السيتوبلازمية للخلايا المعالجة بـ H2O 2- (الشكل S1A ، B) ، بسبب الزيادة في عدد وحجم الجسيمات الحالة في الخلايا الشائخة. هذا هو نتيجة التوازن بين التراكم التدريجي لللازوزومات المختلة وإنتاج أخرى جديدة [25]. علاوة على ذلك ، اكتشفنا أيضًا تراكمًا داخل الليزوزومات من aggresomes الدهنية: هذا النمو ، المرتبط بزيادة التألق الذاتي في قناة ممر النطاق 525/50 نانومتر لمقياس التدفق الخلوي ، هو علامة أخرى للشيخوخة المرتبطة بخلل في الجسيمات الحالة (الشكل S1C ، د) [30].

2.2. البروتينات الانقسامية المستعادة جزئيًا ObHEx يتم تنظيمها في خلايا NHDF الشائخة

كان علاج ObHEx قادرًا على استعادة مستويات 71 بروتينًا تم تحريرها في حالة الشيخوخة جزئيًا (اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه q-value <0. 05). بتعبير أدق ، تم تنظيم 46 بروتينًا بواسطة المستخلص وتم تنظيم 25 بروتينًا (الشكل 3 أ والجداول S4 و S5).

يشير تحليل التخصيب التفاعلي للبروتينات الـ 46 التي انخفضت مستوياتها بواسطة ObHEx إلى أن المستخلص يمكن أن يقلل من تنشيط مسار p53 ويؤثر على استقلاب فسفاتيديلينوسيتول وإشارات القنفذ ، التي تم العثور على تعديلاتها في الشيخوخة [31،32] (الشكل 3 ب ، الجدول S6).

فيما يتعلق بالبروتينات الـ 25 المنتظمة ، يشير تحليل التخصيب إلى إعادة تنشيط مسار دورة الخلية الانقسامية ، وعلى وجه الخصوص ، إلى فك الحمض النووي وتكراره ، وتكثيف الكروموسوم ، ودقة الكروماتيدات الشقيقة (الشكل 3 ج ، الجدول S7).

يُظهر تحليل متعمق أن 18 من 25 بروتينًا مستعادًا تتجمع بقوة معًا (الشكل 4 أ). في هذه المجموعة ، من الممكن تمييز CDK1 ، وجميع الوحدات الفرعية لمركب condensin I (SMC2 و SMC4 و NCAPD2 و NCAPH و NCAPG) وثلاثة بروتينات مرتبطة بالحركية (KNTC1 و NUF2 و TRIP13) ، وجميع الوحدات الفرعية الست لمركب صيانة الكروموسوم الصغير التكاثري (MCM) (MCM 2-7) مع IQGAP3 و PBK و DHFR.

تظهر قدرة ObHEx على استعادة مستويات هذه البروتينات جزئيًا في مخططات الملف الشخصي في الشكل 4 ب: كانت مستويات التعبير عن البروتين في الغالب دون تغيير في الخلايا المتكاثرة التي عولجت أو لم تتم معالجتها بالمستخلص ، وسقطت في الخلايا الشائخة ، وزادت جزئيًا بعد علاج ObHEx.

2.3 أكدت الاختبارات البيولوجية على آلية عمل ObHEx التعزيزية

السمة المميزة الأكثر شيوعًا للخلايا الشائخة هي زيادة نشاط SA {0} gal الذي يمكن تقييمه عن طريق اختبار التلوين. تظهر نتائجنا أن علاج H2O2 تسبب في زيادة ملحوظة في عدد الخلايا الإيجابية (باللون الأزرق) من SA - - ، من 4.7 في المائة إلى 22.9 في المائة (الشكل 5 أ ، ب). خفضت حضانة ObHEx بشكل كبير نشاط SA - - غال مع انخفاض بنسبة 38.4 في المائة (p <0.01).

علاوة على ذلك ، لتقييم ما إذا كانت استعادة التعبير البروتيني الانقسامي بواسطة ObHEx تترجم إلى إعادة تنشيط دورة الخلية ، تمت معالجة خلايا التحكم والخلايا المتشيخة أم لا باستخدام المستخلص لمدة 72 ساعة وتم إجراء تجارب فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS). أظهرت نتائج الخلايا الشائخة وجود كتلة في مراحل G2 / M من دورة الخلية (36.8 بالمائة) ، بينما كان جزء أقل بكثير من خلايا التحكم (7.2 بالمائة) في هذه المراحل منذ أن وصلت إلى التقاء ، وفقًا للأدبيات [ 33] (الشكل 5C ، D). كان علاج الخلايا الشائخة باستخدام ObHEx قادرًا على تقليل عدد G2 / M بنسبة 4.3 بالمائة (p <0. 05). من الملاحظ ، عندما يتعلق الأمر بجزء خلية الشيخوخة بعد SIPS (22.9 بالمائة) ، يمكن تقدير هروب G2 / M بنسبة 18.9 بالمائة. تم إجراء نفس علاج ObHEx لمدة 48 ساعة ، لكن النتائج لم تكن ذات دلالة إحصائية.

【لمزيد من المعلومات: george.deng@wecistanche.com / WhatApp: 86 13632399501】