arلغة
الصفحة الرئيسية / معرفة / المحتوى

معرفة

التأثيرات الوقائية لـ Cistanche Tubulosa ضد H2O2 / UVB الناجم عن تدهور الكولاجين الجلدي عن طريق Hsa-microRNA -4535- بوساطة إشارات TGF / Smad

May 10, 2023

خلاصة

هدفت هذه الدراسة إلى التحقيق في الآلية الكامنة وراء التأثيرات الوقائية للتوقف ضد الضرر الناجم عن H2O2 / UVB باستخدام نماذج في المختبر وفي الجسم الحي للتلف الضوئي. علاوة على ذلك ، حددنا مشاركة تنظيم ميرنا في هذه العملية. تم استخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية HS68 المعالجة بـ H2O2 / UVB والفئران العارية C57BL / 6J المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية كما في النماذج المختبرية والحيوية للتلف الضوئي. أظهرت النتائج أنعلاج cistancheالتخفيف من انخفاض H2O2 / UVB الناجم عن بقاء الخلية ، ضعف إشارات TGF / Smad ، وشيخوخة الجلد. استنادًا إلى نتائج تحليلات مصفوفة microRNA وعمليات البحث في قاعدة البيانات ، تم تحديد has-miR -4535 على أنه ميرنا مرشح محتمل يستهدف Smad4. في المختبر،علاج cistancheتنشيط التعبير المركب Smad2 / 3/4 والمثبط لـ hsa-miR -4535 في الخلايا المعرضة لـ H2O2 / UVB. في الجسم الحي ، أدى التطبيق الموضعي لجرعات منخفضة (12 مجم / كجم) وجرعات عالية (24 مجم / كجم) من التماسك على الجلد الظهري للفئران العارية C57BL / 6J إلى التخفيف بشكل كبير من التلف الضوئي للجلد الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية من خلال تعزيز إشارات تخليق الكولاجين TGF / Smad ، تقليصتضخم البشرة وتشكيل التجاعيد وشيخوخة الجلد، إلى جانبمنع تعبير hsa-miR -4535. مجتمعة ، تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى وجود صلة بين hsa-miR -4535 وإشارات توليف الكولاجين TGF / Smadواقتراح هذه العوامل للمشاركة فيآلية الحماية من الصورcistancheفي الخلايا الليفية الجلديةضد H2O2/ الشيخوخة التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية. دلت الأدلة على ذلكcistancheمعخصائص مكافحة الشيخوخةيمكن ان يكونيعتبر مكمل في منتجات العناية بالبشرة.

Cistanche Anti-Aging

انقر هنا للحصول على منتجات مكافحة الشيخوخة من سيستانش

مقدمة

تشمل العلامات السريرية لشيخوخة جلد الإنسان زيادة التجاعيد ، والتراخي ، وعدم انتظام التصبغ [1]. عملية شيخوخة الجلد معقدة ويمكن تقسيمها إلى نوعين: الشيخوخة الذاتية والشيخوخة الخارجية. الشيخوخة الجوهرية ناتجة عن مرور الوقت والعوامل الوراثية ، في حين أن الشيخوخة الخارجية ، والتي تسمى أيضًا الشيخوخة الضوئية ، تنتج أساسًا عن التعرض للأشعة فوق البنفسجية [2 ، 3]. أظهرت الدراسات السابقة أن وفرة أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) تتولد أثناء الشيخوخة الذاتية والخارجية. يمكن أن يؤدي تراكم ROS إلى تحفيز إشارة بروتين كيناز (MAPK) المُنشط بالميتوجين وتفعيل عامل النسخ المصب ، البروتين المنشط -1 (AP -1). يمكن لـ AP المنشط -1 الانتقال إلى النواة والارتباط بمناطق المروج لمصفوفة البروتينات المعدنية (MMPs) [4]. MMPs هي مجموعة إندوبيبتيداز كبيرة تعتمد على الزنك ، تساهم في تدهور مصفوفة الجلد خارج الخلية (ECM). على وجه الخصوص ، MMP -1 ، كولاجيناز ، يشارك في انقسام نوعي الكولاجين الأول والثالث [5]. أنواع الكولاجين الأول والثالث ، وهما المكونان الرئيسيان للـ ECM ، قادران على منح الدعم والقوة للأدمة الجلدية ، ويؤدي عدم انتظامها إلى ظهور التجاعيد المميزة والتراخي للجلد المسن [6]. تحويل عامل النمو بيتا (TGF) هو سيتوكين قوي في كل مكان مع ثلاثة أشكال مختلفة ، TGF 1 و TGF 2 و TGF 3 ، والتي يمكن أن تنظم بشكل إيجابي تخليق الكولاجين في جلد الإنسان [2]. تبدأ TGF إشاراتها من خلال التفاعل مع معقدات مستقبلات سيرين / ثريونين كيناز على سطح الخلية ، بما في ذلك أنواع مستقبلات TGF I (T RI) و II (T RII). تؤدي الفسفرة في T RI إلى فسفرة R-Smads (Smad2 و Smad3). تتفاعل R-Smads المنشط مع Smad4 لتنظيم نقل نواتها وتنشيط أنواع الكولاجين الأول والثالث بشكل نسخي من خلال الارتباط بمروجي عناصر ربط Smad (SBE) [7 ، 8]. تشير الدلائل المتزايدة إلى أن توليد ROS المرتفع ، الناجم عن الجوهر أو التشيخ الضوئي ، يساهم في ضعف مسار إشارات TGF / Smad ، مما يؤدي بدوره إلى انخفاض تخليق الكولاجين في الخلايا الليفية الجلدية الجلدية للإنسان [9 ، 10].

Cistanche Anti-Aging


cistanche (3،5 ، 7- ثلاثي هيدروكسي فلافون) ، وهو عضو طبيعي من عائلة الفلافونويد ، متوفر بكثرة في Alpinia officinarum و Propolis. cistanche هو مرشح محتمل لعلاج السكتة الدماغية والسكري وأنواع مختلفة من السرطان [11-13]. بالإضافة إلى ذلك ، يمتلك cistanche أنشطة تنظيف جذرية ومضادة للالتهابات [14 ، 15]. لقد أظهرنا سابقًا أن cistanche يقلل من التهاب H2O 2- الذي يسبب الالتهاب ويعزز تكوين الكولاجين من خلال مستقبل عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGFI-R) / مسارات إشارات ERK1 / 2 في خلايا HS68 [16 ، 17]. علاوة على ذلك ، أشارت دراسة إلى أن cistanche تم تحديده كمركب من Alpinia officinarum وله تأثيرات مثبطة للكولاجيناز في الخلايا الليفية الجلدية [18]. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية الأكثر تفصيلاً المتعلقة بكيفية تنظيم القسطرة لشيخوخة الجلد غير معروفة.

MicroRNAs (miRNAs) عبارة عن مجموعة من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة أحادية الجديلة وغير المشفرة بمتوسط ​​طول يبلغ 22 نيوكليوتيد. يتم نسخ miRNAs الناضجة من تسلسل الحمض النووي. في معظم الحالات ، ترتبط الجزيئات المجهرية الناضجة بالمناطق غير المترجمة 3′ (UTRs) من الرنا المرسال المستهدف لإسكات ترجمة الرنا المرسال [19]. في جلد الإنسان ، تلعب الجزيئات المجهرية دورًا مهمًا في تنظيم التمثيل الغذائي للخلايا والسرطان والشيخوخة وتكوين الكولاجين [20-23]. على سبيل المثال ، يمكن لـ miR -377 تحفيز شيخوخة الخلايا الليفية الجلدية من خلال تثبيط تعبير DNA methyltransferase 1 (DNMT1) ، والذي يؤدي لاحقًا إلى تقليل الميثيل في محفز p53 وشيخوخة الخلايا الليفية الجلدية [22]. ملف تعريف ميرنا في الضرر الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية في الجلد البشري

تم فحص خلايا الحليمة (nHDPs) مسبقًا [24]. ومع ذلك ، كيف شيخوخة الخلايا الليفية الجلدية التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية من خلال تنظيم ميرنا ، وخاصة في مشاركة المركب الطبيعي غير معروف إلى حد كبير. هدفت هذه الدراسة إلى التحقيق في الآثار الوقائية للتقيؤ ضد تلف الجلد الناجم عن H2O2 / UVB وكذلك دور تحلل الكولاجين بوساطة microRNA في هذه العملية. لقد هدفنا كذلك إلى تحديد microRNAs المشاركة في تنظيم تخليق الكولاجين.

نتائج

cistanche يثبط سمية الخلايا التي يسببها UVB / H2O 2- في الخلايا الليفية الجلدية البشرية HS68

للتحقيق في السمية الخلوية للكستانش (الشكل 1 أ) في المختبر ، عولجت خلايا HS68 بملفات مختلفة من cistanche (0 ، 1 0 ، 2 0 ، 30 ، 40 ، 50 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. أظهرت نتائج فحص MTT أن cistanche لم يكن سامًا للخلايا لخلايا HS68 (الشكل 1B). بعد ذلك ، قمنا بتعريض خلايا HS68 لجرعات مختلفة من H2O2 (0 ، 100 ، 150 ، 200 ، 250 ، 300 ميكرومتر) و UVB (0 ، 25 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 مللي جول / سم 2) لمدة 24 ساعة. انخفض علاج H2O2 و UVB صلاحية الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 1C ، 1D). لتقييم الخواص الوقائية للخلايا للحالة بعد التعرض لـ H2O2 و UVB ، عالجنا خلية HS68 بتركيز مختلف من cistanche (10 ، 20 ، 30 ميكرومتر) بعد H2O 2- (200 ميكرومتر) والأشعة فوق البنفسجية المستحثة (40 مللي جول / سم² ) ضرر. علاج H2O2 أو UVB وحده

انخفاض كبير (40 في المئة) في جدوى خلايا HS68. ومع ذلك ، منع علاج cistanche موت الخلايا بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 1E ، 1F). أدى التركيز العالي من cistanche (30 ميكرومتر) إلى التخفيف بشكل بارز من H2O 2- والسمية الخلوية التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، تم استخدام جرعة 30 ميكرومتر من cistanche في دراسات لاحقة في المختبر لتقييم وقائها

التأثيرات في خلايا HS68.



يضعف cistanche شيخوخة الخلايا HS68 المستحث H2O 2- بدلاً من موت الخلايا المبرمج

لتحديد ما إذا كان الانخفاض في صلاحية الخلية ناتجًا عن موت الخلية أو تثبيط النمو ، قمنا بفحص التعبير عن العديد من علامات الاستماتة والبقاء عن طريق النشاف الغربي في خلايا HS68 المعرضة لجرعات مختلفة من H O (50 ، 100 ، 200 ، 300 ، 400 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. وجدنا انخفاضًا ملحوظًا في التعبير عن علامات البقاء ، مثل p-Akt ، وزيادة التعبير عن

apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 ميكرومتر H2O2 (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، أجرينا قياس التدفق الخلوي لتقييم الخلايا المبرمج باستخدام تلطيخ Annexin V و PI ولاحظنا نتائج مماثلة. مجتمعة ، 200 ميكرومتر H O لم يسبب موت الخلايا المبرمج HS68 (الشكل 2 ب). بعد ذلك ، اكتشفنا التعبير عن عدة
علامات الشيخوخة ، مثل p16 و p21 و SA - - gal ، لتحديد الخلايا الشائخة. أظهرت نتائجنا أن علاج cistanche أدى إلى انخفاض كبير في مستويات البروتين p16 و p21 المستحثة H2O 2- بالإضافة إلى عدد خلايا SA - - إيجابية gal (الشكل 2C ، 2D).



Cistanche Anti-Aging

الشكل 1. يثبط cistanche السمية الخلوية التي يسببها UVB / H2O في الخلايا الليفية الجلدية البشرية HS68. (أ) التركيب الكيميائي لل cistanche. (ب) قابلية بقاء خلايا HS68 المُعالجة بتركيزات مختلفة من cistanche (1 0 ، 2 0 ، 3 0 ، 4 0 ، 5 0 ميكرومتر ) لمدة 24 ساعة. (C و D) قابلية الخلية للخلايا HS68 المعرضة لجرعات مختلفة من H2O2 (100 ، 150 ، 200 ، 250 ، 300 ميكرومتر) أو المشعّة بـ UVB (25 ، 30 ، 40 ، 50 ، 60 جول / سم 2) لمدة 24 ساعة. (E و F) قابلية الخلية للخلايا HS68 المعرضة لـ H2O2 (200 ميكرومتر) أو المشعّة بـ UVB (40 J / cm2) لمدة ساعة واحدة ثم تعامل مع cistanche (10 ، 20 ، 30 ميكرومتر) لمدة 23 ساعة. تم تحديد آثار cistoprotective cistanche بواسطة مقايسة MTT. تم تخصيص صلاحية 100 بالمائة لخلايا التحكم. تظهر القيم على أنها تعني ± SE. يظهر القياس الكمي للنتائج (ن=3) * P <0.05 ، ** P <0.01 ، *** P <0.001 مقابل خلايا التحكم غير المعالجة ؛ ## P <0.01 ، ### P <0.001 مقابل H2O2 أو الخلايا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية.

Cistanche Anti-Aging

يضعف cistanche إنتاج UVB / H2O 2- المستحث داخل الخلايا / الميتوكوندريا ROS وعدم توازن MMP في خلايا HS68
يلعب الإجهاد التأكسدي دورًا رئيسيًا في العديد من الأمراض ، ويمكن أن يحدث بسبب عوامل داخلية أو خارجية. هنا ، استخدمنا H2O2 كعامل داخلي و UVB كعامل خارجي للحث على الضرر التأكسدي ثم قمنا بالتحقيق في ROS الذي يقضي على أنشطة cistanche. لتحديد مصادر ROS ، تم استخدام MitoSOX و DCFH-DA لتحديد ROS داخل الخلايا والميتوكوندريا. أظهرت نتائج التلوين أن علاج H2O2 و UVB تسبب في تراكم ROS بينما قلل علاج cistanche من توليد ROS (الشكل 3 أ ، 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن MMP غير المتوازن يمكن أن يبدأ موت الخلية ، استخدمنا JC -1 لتحديد التغييرات في MMP. متقدرية طبيعية متألقة باللون الأحمر (JC -1 ثنائيات) بينما ضعف الميتوكوندريا الفلورية الخضراء (JC -1 مونومرات). أدى التعرض لأشعة UVB و H2O2 إلى إحداث مستويات عالية من التألق الأخضر. والجدير بالذكر أن معالجة cistanche تحولت التألق الأخضر إلى اللون الأحمر ، مما يشير إلى إحياء وظائف الميتوكوندريا (الشكل 3C).


يخفف cistanche من ضعف مسار تخليق الكولاجين الذي يسببه H2O 2- في خلايا HS68

إشارات TGF / Smad تساعد على تكوين الكولاجين في أرومات الجلد الليفية الجلدية للإنسان [25-27]. لذلك ، قمنا بالتحقيق في دور التلازم في تخليق الكولاجين عبر مسار TGF / Smad في خلايا HS68 المعرضة لـ H2O2. أشارت نتائج اللطخة الغربية إلى أن cistanche عزز بشكل كبير إشارات TGF / Smad بالإضافة إلى تخليق الكولاجين في خلايا HS68 المكشوفة H2O 2- (الشكل 4 أ). علاوة على ذلك ، فإن عدم تنظيم الكولاجين من النوع الأول والثالث هو أحد الخصائص النموذجية للخلايا الليفية للجلد المسن [28]. منذ أن تورطت عائلة MMP في هدم الكولاجين [29] ، أكدنا بعد ذلك تأثير cistanche على تنشيط MMP -1. لقد وجدنا أن cistanche يمنع تدهور الكولاجين في خلايا HS68 عن طريق كبت مستوى H2O 2- MMP المحسن -1 (الشكل 4 أ).

علاوة على ذلك ، حددنا الآلية الجزيئية تحت الخلوية الكامنة وراء هذا الإجراء الوقائي من خلال مقارنة خلايا HS68 المعالجة بـ H2O2 بمفردها أو المعالجة المشتركة باستخدام cistanche باستخدام التلوين المناعي والتألق المناعي. عزز علاج cistanche التراكم النووي لـ p-smad2 / 3 و Smad4 الذي تعطل بسبب التعرض لـ H2O2 في خلايا HS68

(الشكل 4 ب ، 4 ج). أشارت هذه النتائج إلى أن التهدئة قد تحسن من تجزئة الكولاجين التي يسببها H2O 2- عن طريق تنشيط مسار TGF / Smad في خلايا HS68.


Cistanche Anti-Aging


الشكل 2. يضعف القوام 2- شيخوخة الخلايا HS68 الناجم عن H2O بدلاً من موت الخلايا المبرمج. (أ) تعرضت خلايا HS68 لجرعات مختلفة من H O (50 ، 100 ، 200 ، 300 ، 400 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة. تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج والعلامات المتعلقة بالبقاء على قيد الحياة بواسطة لطخة غربية. (ب) تم تحليل الخلايا الملطخة Annexin V & PI عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المبرمج تحت التعرض H2O2. (ج) كانت خلايا HS68
تتعرض لـ H2O2 (2 0 0 ميكرومتر) لمدة ساعة واحدة ثم يتم معالجتها بثبات (3 0 ميكرومتر) لمدة 23 ساعة. تم الكشف عن علامات الشيخوخة مثل p16 و p21 بواسطة لطخة غربية. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. (د) تم اكتشاف الخلايا الشائخة باستخدام مجموعة الكشف عن الجلاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة (SA {{1 0} غال). تظهر خلايا SA - - موجبة gal باللون الأخضر. (C) تظهر القيم على أنها تعني ± SE. يظهر القياس الكمي للنتائج (ن=3) ** P <0.01 ، *** P <0.001 مقابل خلايا التحكم غير المعالجة ؛ ## P <0.01 ، ### P <0.001 مقابل H2O 2- الخلايا المعالجة.


يقلل علاج cistanche من التعبير المنظم الناجم عن H2O 2- لـ hsa-miR -4535 ، والمتوقع لاستهداف Smad4
كشف تحليل مصفوفة miRNA لخلايا HS68 المعالجة بالكيستانتش أن تعبير hsa-miR -4535 قد انخفض في المجموعة المعالجة بالكيستانش مقارنةً بتلك الموجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 5 أ). علاوة على ذلك ، باستخدام قواعد بيانات miRNA ، مثل miRDB و TargetScanHuman ، توقعنا موقعًا مستهدفًا مفترضًا محفوظًا لـ hsa-miR -4535 في Smad 4-3 ′ - UTR (الشكل 5 ب). بعد تأكيد الموقع المستهدف ، Smad 4-3 ′ - UTR-WT و Smad 4-3 ′ - تم نقل تركيبات مراسل UTR MT إلى خلايا HS68 للتحقق من الارتباط المباشر لـ hsa-miR -4535 بـ صمد 4-
3′-UTR. لاحظنا انخفاضًا بنسبة 50 بالمائة في أنشطة luciferase بين النوع البري والمتحولة Smad 4-3 ′ - اتبعت مجموعات UTR عمليات نقل العدوى hsa-miR -4535 (الشكل 5C). قمنا بعد ذلك بتقييم تأثيرات H2O2 (100200 ميكرومتر) على تنظيم hsa-miR -4535 و Smad 4 في خلايا HS68 ، ووجدنا أن H2O2 المعتمد على الجرعة المعززة hsa-miR -4535 والحمض النووي الريبي Smad4 المكبوت التعبير (الشكل 6 أ ، 6 ب). بالإضافة إلى ذلك ، تم عكس هذا الاتجاه في تعبير hsa-miR -4535 وتعبير Smad4 بعد معالجة cistanche ، مما يشير إلى أن تنظيم إشارات Smad قد يكون متورطًا في التخفيف عن طريق cistanche من تلف خلايا HS68 الناجم عن H2O 2- ( الشكل 6 ج ، 6 د). مجتمعة ، اقترحت هذه النتائج أن التقلص يخفف 2- اختلال مسار TGF / Smad عن طريق تقليل تنظيم تعبير hsa-miR -4535 في الخلايا الليفية الجلدية للجلد البشري.


image

الشكل 4. يضعف التماسك H2O 2- الناجم عن TGF / Smad من ضعف مسار تخليق الكولاجين في خلايا HS68. (أ) تم تعريض خلايا HS68 لـ H2O2 (2 0 0 ميكرومتر) لمدة ساعة واحدة ثم عولجت بالثبات (3 0 ميكرومتر) لمدة 23 ساعة. تم الكشف عن التعبير البروتيني لمكونات المسار المرتبطة بتخليق الكولاجين (TGF ، p-smad2 / 3 ، Smad4 ، COL1A1 ، COL3A1) والبروتين المرتبط بتحلل الكولاجين (MMP -1) بواسطة لطخة ويسترن. (ب) تم الكشف عن تعبير البروتين عن p-smad2 / 3 ، Smad4 في الكسور النووية والخلوية بواسطة النشاف الغربي. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. تظهر القيم على أنها تعني ± SE. يتم عرض قياس النتائج (ن=3) * P <0. 0 5 ، ** P <0. 01 ، *** P <0.001 مقابل. خلايا التحكم غير المعالجة #P <0.05 ، ## P <0.01 ، ### P <0.001 مقابل H2O 2- الخلايا المعالجة. (C) تم استخدام Anti-p-Smad2 / 3 والجسم المضاد Smad4 والجسم المضاد الثانوي المترافق مع FITC / PE للكشف عن تعبير p-Smad2 / 3 (أخضر) و Smad4 (أحمر). أشار DAPI إلى موقع النواة (أزرق). تم التقاط الصور باستخدام مجهر الإزهار (200 ×).


Cistanche Anti-Aging

يدخل تعديل Smad4 بواسطة hsa-miR -4535 في تخليق الكولاجين في H2O 2- الذي يتعرض لليف الجلد البشري

لتحديد الآليات التي يمارس بها hsa-miR -4535 تأثيره على تعبير Smad4 وإشاراته النهائية في خلايا HS68 ، نقلنا خلايا HS68 باستخدام hsa-miR -4535 محاكيات أو مثبطات وقمنا بقياس Smad4 وتعبير الكولاجين المصب. أوضحت النتائج أن تثبيط hsa-miR -4535 بواسطة مثبط hsa-miR -4535 عكس بشكل ملحوظ تقليل تنظيم Smad4 mRNA وتعبير البروتين في خلايا HS68 المعالجة بـ H2O 2- (الشكل 7A-7C) . علاوة على ذلك ، أدى قمع hsa-miR -4535 المستعاد جزئيًا H2O 2- إلى حدوث خلل في COL1A1 و COL3A1 في خلايا HS68 المعالجة بـ H2O 2- (الشكل 7C).

على العكس من ذلك ، فإن تعبير hsa-miR -4535 المحسن كنتيجة لتقليد تعداء hsa-miR -4535 منعت الانتفاخ بوساطة cistanche لـ Smad4 في خلايا HS68 المعرضة لـ H2O2 (الشكل 7D-7F). إن الإفراط في التعبير عن miR -4535 قلل جزئيًا من مستويات COL1A1 و COL3A1 الناجم عن التقلص (الشكل 7F). أدى الإفراط في التعبير عن hsa-miR -4535 (الشكل 8A-8C) أو تثبيط Smad4 بواسطة siRNA (الشكل 8D ، 8E) إلى انخفاض تخليق الكولاجين تحت علاج cistanche بعد التعرض H2O2. والمثير للدهشة أننا وجدنا أن كلاهما يوجه Smad4

إسكات وعلاجات باستخدام hsa-miR -4535 تحاكي تخليق الكولاجين المستحث بالتوازن المعكوس في خلايا HS68 المعالجة بـ H2O 2-. مجتمعة ، خلصنا إلى أن تخليق الكولاجين ينظم تنظيمًا ، ويحتمل أن يكون ذلك عن طريق خفض مستوى hsa-miR -4535 لتعزيز إشارات Smad4 في خلايا HS68 المعرضة لـ H2O2.


image



الشكل 5. Hsa-miR -4535 يستهدف Smad4. (أ) تم تقييم تعبير MicroRNA في خلايا HS68 التي عولجت باستخدام cistanche باستخدام المصفوفات الدقيقة. (ب) مخطط فين الذي يصور مرشحين مرنا محتملين يمكن تنظيمها بواسطة hsa-miR -4535 استنادًا إلى قواعد بيانات miRDB و TargetScanHuman. تحليل تسلسل مواقع ربط miRNA المفترضة في Smad 4-3 ′ - UTR mRNA لـ hsa-miR -4535. تتم الإشارة إلى التطابقات بخطوط مستقيمة. (C) تم نقل خلايا HS68 بشكل مشترك مع Smad 4-3 ′ - UTR-WT (من النوع البري ؛ 0. 5 ميكروغرام / مل) بالإضافة إلى محاكاة hsa-miR -4535 (2 { {25}} nM) أو Smad 4-3 ′ - UTR MT (متحولة ؛ 0. 5 ميكروغرام / مل) بالإضافة إلى hsa-miR -4535 تقليد (20 نانومتر) لمدة 24 ساعة. تم تحديد نشاط Luciferase وتطبيعه مع نشاط Renilla. يتم عرض قياس النتائج (ن=3) ؛ *** P <0.001 ، مقابل مجموعة محاكاة Smad 4-3 ′ - UTR-MT plus hsa-miR -4535. G 1=التحكم ، G 2=cistanche (10 ميكرومتر) ، G 3=cistanche (30 ميكرومتر)



يعزز cistanche مسار تخليق الكولاجين TGF / Smad ويخفف من شيخوخة الجلد وكذلك تثبيط تعبير hsa-miR -4535 في خلايا HS68 المعرضة للأشعة فوق البنفسجيةنظرًا لأن الأشعة فوق البنفسجية تلعب دورًا مهمًا في العديد من اضطرابات الأدمة الجلدية ، بما في ذلك الالتهاب ، وكبت المناعة ، والسرطان ، والشيخوخة المبكرة [30-32] ، فقد درسنا تأثير الثبات على الإشارات المرتبطة بتخليق الكولاجين في خلايا HS68 المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. انخفضت مستويات البروتين لمكونات مسار TGF / Smad و COL1A1 و COL3A1 المصب في خلايا HS68 المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ولكن تم تنظيمها بشكل فعال بعد علاج cistanche (الشكل 9 أ).

أكدت نتائج النشاف الغربي أن cistanche كبح تعبير MMP المعزز بـ UVB -1 في خلايا HS68 (الشكل 9 أ). علاوة على ذلك ، أوضحنا التأثير المضاد للشيخوخة للتقيؤ في خلايا HS68 المعرضة للأشعة فوق البنفسجية من خلال إثبات أن التراجع يقلل من الارتفاع الناجم عن UVB لمستويات p16 و p21 (الشكل 9 أ). لتقييم ما إذا كان cistanche يمكن أن يخفف من تحلل الكولاجين الناجم عن UVB من خلال تثبيط hsa-miR -4535 الذي يستهدف Smad4 ، قمنا بفحص مستويات hsa-miR -4535 و Smad4 في UVB و cistanche الخلايا المعالجة المشتركة باستخدام qPCR. لقد وجدنا أن تعبير hsa-miR -4535 قد تم تنظيمه بشكل كبير في الخلايا المعرضة للأشعة فوق البنفسجية ولكن انخفض بعد علاج القسطرة. على العكس من ذلك ، تم قمع تعبير Smad4 عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية وتم عكس هذا القمع بشكل ملحوظ عن طريق علاج cistanche (الشكل 9 ب ، 9 ج). بشكل جماعي ، اقترحت النتائج التي توصلنا إليها أن cistanche يمارس تأثيرات مماثلة مثل H2O2 لاستعادة الانخفاض الناجم عن UVB في تكوين الكولاجين عن طريق كبت مستويات hsa-miR -4535 وذلك لتعزيز إشارات Smad4 في خلايا HS68.



يخفف التطبيق الموضعي للكيستانش من تضخم الجلد الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية وتدهور الكولاجين وكذلك يعزز إشارات TGF / Smad فيالجلد الظهري للفئران عارية C57BL6 / Jلتوضيح تأثير الحماية من الضوء للتوقف على إصابة الجلد التي يسببها UVB في الجسم الحي ، قمنا بتقييم مستوى microRNA -4535 و Smad4 وتغيرات أنسجة الجلد. يوضح الشكل 10 أ التخطيطي للتصميم التجريبي والجدول الزمني للتطبيق الموضعي للقيء بعد تشعيع الأشعة فوق البنفسجية على الجلد الظهري للفئران عارية C57BL6 / J. لوحظ تكوين التجاعيد على أقسام الجلد الظهرية للفئران C57BL / 6J في المجموعة المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. أدى التطبيق الموضعي للكيستانش إلى تقليل تكوين التجاعيد بشكل كبير ، مما يشير إلى زيادة محتوى الكولاجين بوساطة التواء للحفاظ على سلامة الجلد (الشكل 10 ب). علاوة على ذلك ، أظهر التحليل النسيجي لطبقة الجلد أن محتوى الكولاجين وكثافته في الجلدكانت أقل بشكل ملحوظ في المجموعة المعرضة للإشعاع فوق البنفسجي مقارنةً بمجموعة التحكم في السيارة. ومع ذلك ، فإن التطبيق الموضعي للكيستانش (12 مجم / كجم و 24 مجم / كجم) أدى إلى زيادة محتوى الكولاجين وكثافته بطريقة تعتمد على الجرعة مقارنةً بتلك الموجودة في الفئران المعرضة للإشعاع فوق البنفسجي (الشكل 11). تم تقييم شكل الجلد بواسطة تلطيخ H&E. UVBأدى التعرض إلى زيادة سماكة البشرة مقارنة بمجموعة التحكم في السيارة. ومع ذلك ، فإن التطبيق الموضعي للقيود خفف بشكل كبير من تضخم البشرة الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 11). بالإضافة إلى ذلك ، أدى تلطيخ المناعي الكيميائي إلى تطبيق cistanche المشار إليه إلى تقليل التعبير العالي في الجلد المشع بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 11). لتحديد ما إذا كان cistanche يمكن أن يحسن فقدان ألياف الكولاجين الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية من خلال تقليل تنظيم hsa-miR -4535 لتعزيز Smad4 في الجسم الحي ، تم تقييم تعبير RNA الخاص به في عينة الجلد الظهرية المستأصلة بواسطة qRT-PCR. كان تعبير hsa-miR -4535 مرتفعًا في الجلد المعرض للإشعاع فوق البنفسجي فوق البنفسجي ، ولكن تم تثبيطه بشكل ملحوظ في الجلد المعالج بالقسطرة عند الجرعات المنخفضة والعالية. علاوة على ذلك ، تمت استعادة المستويات المنخفضة من تعبير Smad4 RNA في الجلد المشع بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق علاج cistanche (الشكل 12 أ ، 12 ب)


بالإضافة إلى ذلك ، أنقذ تطبيق cistanche تعبير البروتين TGF و p smad2 / 3 و Smad4 في أنسجة الجلد التي تعاني من الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 12 ج). أشارت النتائج التي توصلنا إليها إلى أن الكستان يمكن أن يحمي الجلد من الأضرار التي تسببها الأشعة فوق البنفسجية عن طريق تثبيط hsamiR {6}} لتعزيز تعبير Smad4 لتنشيط P- smad2 / 3 لتعزيز تخليق الكولاجين أخيرًا (الشكل 13).


Cistanche Anti-Aging

الشكل 9: يحسن التوفيق مسار تخليق الكولاجين TGF / Smad ويخفف من شيخوخة الجلد وكذلك تثبيط تعبير hsa-miR -4535 في خلايا HS68 المعرضة للأشعة فوق البنفسجية. تعرضت خلايا HS68 للأشعة فوق البنفسجية B (4 0 مللي جول / سم 2) ثم عولجت بقسطرة (3 0 ميكرومتر) لمدة 23 ساعة. (أ) التعبير البروتيني عن مكونات المسار المتعلقة بتخليق الكولاجين (TGF ، p-smad2 / 3 ، Smad4 ، COL1A1 ، COL3A1) ، البروتين المرتبط بتحلل الكولاجين (MMP {{2 0}}) ، والشيخوخة- تم الكشف عن العلامات المرتبطة (p16 و p21) بواسطة لطخة غربية. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. (B و C) تم اكتشاف تعبير RNA لـ hsa-miR -4535 و Smad4 بواسطة qRT-PCR. تظهر القيم على أنها تعني ± SE. يتم عرض قياس النتائج (ن=3) * P <0. 05 ، ** P <0.01 ، مقابل خلايا التحكم غير المعالجة ؛ #P <0.05 ، ## P <0.01 مقابل الخلايا المعرضة للأشعة فوق البنفسجية.

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950

قد يعجبك ايضا