3. النتائج والمناقشة
3.1. تخليق واقتران حمض الغال مع الببتيد
تم الحصول على الببتيدات المحضرة TPPTTP و galloyl-TPPTTP (Gal-Pep) و Gal2-Pep وتنقيتها باستخدام RP- شبه التحضيري.HPLC. يوضح الشكل 1 أ والمخطط 1 إستراتيجية الاقتران لحمض الغال مع KTPPTTP كـ Gal2 – Pep. في طريقة SPPS ، عادةً ما تتضمن الشوائب المتولدة أثناء تخليق الببتيد الببتيدات ذات التفاعل الجانبي ، ومجموعات حماية الأحماض الأمينية ، والمذيبات المستخدمة في التخليق والتنقية. من المعروف أن HOBt المستخدم في تخليق الببتيد يمنع عملية التعرق ويحسن كفاءة تخليق الببتيد. عملية تخليق الببتيد. حتى بعد خطوة الغسيل الأخيرة ، لا تزال الشوائب بما في ذلك مجموعات حماية الأحماض الأمينية موجودة بكميات ضئيلة. من أجل تلبية نقاوة الببتيد لأكثر من 90 في المائة التي أبلغ عنها العديد من الباحثين ، تم إجراء 20-22 شبه تحضير HPLC كخطوة تلميع للحصول على الببتيد النهائي بنسبة نقاء 99.2 في المائة نتيجة لتحليل HPLC (انظر الشكل. S1 †). تم تحليل منتج الببتيد المنقى باستخدام Q-TOF لإعادة تأكيد تركيبها الناجح (الشكل 1 ب-د).
انقر هنا للحصول على مزيد من المعلومات حول علاج سيستانش لمكافحة الشيخوخة
3.2 فحوصات جدوى الخلية
للتحقق من السمية الخلوية للببتيدات المُصنَّعة ، تم علاج خلايا الخلايا الليفية الجلدية البشرية بتركيزات مختلفة من GA و TPPTTP و Gal-Pep و Gal2-Pepلمدة 24 ساعة وتحليلها باستخدام مقايسات CCK -8. كان يخدعفايصدم ذلكلم يكن للببتيدات المركبة أي تأثير سامعلى الخلايا المعالجة ،مع صلاحية الخلية بنسبة 88 بالمائة على الأقل لجميع العينات وجميعتم اختبار التركيزات (الشكل 2 أ و ب) ، مما يشير إلى أن TPPTTP ،فتاه–بيب وجال2–بيب مناسب للاستخدام في تطبيقات مستحضرات التجميلالايونات الموجبة. بالإضافة إلى ذلك ، كان يخدعفايتم تصميمه بواسطة MTT و LDH و Griessكاشف المقايسة أننال الببتيد لا يسبب سمية في HAو F وفلوريدااستجابة تعويضية في الخام 264.7. (الشكل S2–S4†).
3.3 النشاط المضاد للأكسدة للببتيدات المركبة
الآليات المشاركة فيشيخوخة الجلديشملنشاط ROS، طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا، وتقصير التيلوميرات ، والتغيرات الهرمونية ، وخاصة عند النساء .23 تعمل أنواع الأكسجين التفاعلية كخليةإشارات الجزيئات للعديد من العمليات الخلوية ، مثل التمايزوالانتشار.24 ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي ROS المفرط إلىالانقسام والربط غير الطبيعي لسلاسل الكولاجين والإيلاستينوزيادة التعبير عن MMP -1 ، وهو إنزيم ينكسرأسفل الكولاجين ، وبالتالي تسريع الشيخوخة وموت الخلايا المبرمج. هناكفي المقام الأول ، من المهم إزالة أنواع الأكسجين التفاعلية من خلايا الجلد لتعزيز مكافحة الشيخوخةتأثيرات. في هذه الدراسة ، نؤمنصدم النشاط المضاد للأكسدةالببتيدات المركبة من خلال مقايسات DPPH و DCF-DA.يعرض الشكل 3 أ نتائج نشاط الكسح الجذريمن الببتيدات المركبة كما تم قياسها باستخدام مقايسة DPPH.
لم يكن لدى TPPTTP نشاط تنظيف جذري في أي تركيز ، بينما أظهر GA ، Gal-Pep ، و Gal2-Pep نشاطًا أعلى في الكسح الجذري بطريقة تعتمد على التركيز.
فيخاص غال2–أظهر بيب الأكثر فعاليةمضادات الأكسدةنشاط؛ بتركيز 10mM ، GA ، غال–بيب وجال2–بيبنشاط تنظيف جذري بنسبة 13.6 في المائة ، و 24.23 في المائة ، و 26. 0 في المائة ،على التوالى. يشير هذا إلى أن ربط TPPTTP بـ GA يفعللا تمنع نشاط الكسح الجذري. الشكل 3 بnfirms الاستقرار العينات كما يخدعفايصدمت من خلال تقييم الراديكاليةنشاط الكسح عند تخزينه في درجة حرارة الغرفة. تم الاحتفاظ بـ GAنشاطها الجذري في الكسح لمدة تصل إلى أسبوع واحد ولكن ، أقدمأو أسبوعين، انخفض هذا النشاط بأكثر من 60 بالمائة. من جهة أخرىيد غال–بيب وجال2–حافظ بيب على نشاطه في الكسحلأكثر من أسبوعين. على وجه الخصوص ، غال2–كان بيب سكاف جذريًامشاركة بنسبة 50 في المائة حتى في الأسبوع الرابع. هذه النتائجتشير إلى أن ربط GA بـ TPPTTP يعمل على استقرار عملية الكسح الجذرينشاط. أظهرت بعض الدراسات أن حمض الأسكوربيك مستقربربطها بالببتيدات.12,25 نعتقد أن GA قد يكون ثابتًاlized عن طريق ربطها بالببتيد بنفس الطريقة.
التأثير مضادات الأكسدة من الببتيداتتم اختباره أيضًا باستخدام فحوصات DCF DA في وجود إجهاد مؤكسد داخل الخلايا الناجم عن H O (الشكل 4). بعد 24 ساعة من معالجة العينات على الخلايا بتركيز 100 ملي مولار ، تم تحميل DCF-DA على الخلايا ، ثم عولجت الخلايا بـ H O لمدة 30 دقيقة ولوحظت شدة التألق لـ DCF عند الإثارة الطول الموجي 485 نانومتر وطول موجة الانبعاث 535 نانومتر. أظهرت الخلايا المعرضة للإجهاد التأكسدي مع 1 ملي مولار H O شدة التألق التي كانت أعلى بثلاث مرات من التحكم السلبي ؛ ومع ذلك ، أنتجت معالجة Gal2 – Pep مضانًا كان 67 بالمائة فقط من تلك التي تنتجها الخلايا المعالجة بـ H2O2 فقط. في وجود TPPTTP ، الذي لم يُظهر نشاط الكسح الجذري (الشكل 3 أ) ، تم تقليل إجهاد ROS الناجم عن H2O2 بحوالي 20 بالمائة ، مما يدعم الأبحاث السابقة التي أفادت بأن TPPTTP يقلل من مستويات ROS في الخلايا. تم علاجهم باستخدام GA فقط ، ولم يكن هناك تغيير كبير في مستويات ROS. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن Gal2 – Pep ، الذي يجمع بين جزيئين GA مع الببتيد ، هو أحد مضادات الأكسدة المستقرة والفعالة.
3.4. تأثير الببتيدات المركبة على إمكانات غشاء الميتوكوندريا
في هذه الدراسة ، تم استخدام صبغة JC -1 للتحقق من تأثير الببتيدات المركبة على MmP (DJm). يعمل MmP كمعامل مهم لوظيفة الميتوكوندريا ومن المعروف أنه مرتبط بالعديد من الأمراض مثل الزهايمر ومرض هنتنغتون. تنتج صبغة JC {2}} قميصًا أحمر من الانبعاثات الخضراء عن طريق التراكم في الميتوكوندريا وتشكيل J- الركام. بعد معالجة HaCaT وخلايا الخلايا الليفية بالببتيدات المركبة لمدة 24 ساعة ، تعرضت الخلايا لصبغة JC -1 لمدة 10 دقائق ، ثم تم قياس شدة التألق باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة (أخضر lEx ¼ 475 نانومتر و lEm ¼ 530 نانومتر ، أحمر lEx ¼ 475 نانومتر و lEm ¼ 590 نانومتر). تم التعبير عن نسبة التألق الأحمر إلى الأخضر كتغيير الطية مقارنةً بالتحكم السلبي (الشكل 5). لم تظهر خلايا HaCaT المعالجة بـ GA والببتيد بشكل مستقل أي تغيير معنوي مقارنة بمجموعة التحكم السلبية ، بينما أظهر Gal2 – Pep فرقًا معنويًا ، حيث زاد 1. 45- ضعفًا مقارنةً بالمجموعة الضابطة. كما تم علاج الخلايا الليفية بـ Gal2 – Pep بشكل ملحوظ
زيادة 1. 12- أضعاف مقارنة بالتحكم السلبي. تشير الزيادة في MmP مع معالجة Gal2 – Pep بوضوح إلى أن Gal2 – Pep هو جزيء حيوي يمكن استخدامه في مستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة.
الشكل 4 مقايسات نشاط مضادات الأكسدة داخل الخلايا باستخدام DCF-DA بتركيزات حمض الغال والببتيد 1 0 0 ملي مولار. بعد 24 ساعة من العلاج ، تمت إضافة H2O2 واحتضانها لمدة 3 0 دقائق ، متبوعًا بقياس كثافة التألق DCF. تشير العلامات النجمية إلى فروق ذات دلالة إحصائية (* p <0.05 ، ** p <0.005 ، *** p <0.001).
الشكل 5 قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام صبغة JC -1 في (أ) خلايا HaCaT و (ب) الخلايا الليفية الجلدية. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية (* p <0. 0 5، ** p <0.005، *** p<0.001)
الشكل 6 قياس نشاط الإيلاستاز في الخلايا الليفية الجلدية بتركيزات حمض الغال والببتيد 1 0 0 ملي مولار. تشير العلامات النجمية إلى فروق ذات دلالة إحصائية (* p <0. 05 ، ** p <0.005 ، *** p <0.001).
3.5 النشاط المثبط للإيلاستاز
يعزز الإيلاستاز شيخوخة الجلد عن طريق تكسير الكولاجين أو الإيلاستين في الجلد ، لذلك يمكن أن يمنع شيخوخة الجلد عن طريق تثبيط الإيلاستاز. 27 يوضح الشكل 6 نشاط الإيلاستاز في خلايا CCD -1064 Skتعامل مع كل عينة. TPPTTP له تأثير نادرعلى الإيلاستازكبت. ومع ذلك ، العلاج بحمض الغال ، غال–بيب وفتاه2–أظهر Pep نشاط الإيلاستاز بنسبة 69 في المائة و 84 في المائة و 76 في المائة ،على التوالى. فتاه2–يمنع البيب الإيلاستاز بنسبة 7 في المائة أقل منGA. ومع ذلك ، عند النظر في نتائج القياستأثير مضادات الأكسدة، الاستقرار على المدى الطويل ، والميتوكوندرياإمكانات الغشاء ، غال2–كان بيب أكثر فعاليةمن GA باعتبارهعامل مكافحة الشيخوخة.
3.6 التعبير عن النوع الأول من الكولاجين و MMP -1 و PGC -1 الجينات
يوضح الشكل 7 بيانات RT-qPCR من النوع الأول الكولاجين و MMP -1 و PGC -1 تعبير جيني. الكولاجين من النوع الأول ، وهو مكون رئيسي من عائلة الكولاجين الموجودة في الجلد ، يتناقص مع تقدم العمريتقدم.28 عندما غال2–تم استخدام بيب للعلاجليفية8 ساعات و 24 ساعة ، زاد التعبير عن النوع الأول من الكولاجينحوالي 1. 19- و 1. 21- أضعاف ، على التوالي. مع GA وفتاه–بيب ، لم يكن هناك أهميةتغيير أقدم2 ساعة و 8 ساعات ، لكنزاد تعبير الكولاجين من النوع الأول 1. 16- و 1. 26- أضعاف بعد 24ح ، على التوالي. مع علاج TTPTTP ، ومع ذلك ، التعبيربنسبة 1. 24- أضعاف فيفايأول ساعتين ثم تدريجيًاانخفض. أقدمأي 24 ساعة ، كان مستوى التعبير مشابهًا لمستوىالسيطرة السلبية (الشكل 7 أ). بالنسبة إلى MMP -1 ، مستويات التعبير لـ{0}. 43 و 0. 44 و 0. تمت ملاحظة 68- ضعفًاقدم24 ساعة مع GA، Gal–بيب وجال2–العلاج بيب ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنزادت مستويات التعبير باستخدام علاج GA بنسبة 1. 46- أضعاف بعد 2ح. باستخدام TPPTTP ، انخفض تعبير MMP {0}} بمقدار 0. 87- أضعاف بعد 2ح ، ولكن بعد ذلك أصبحت مشابهة لتلك السلبيةيتحكم. وعموما ، يعيد الكولاجين إلى مستوياته ، ما عدا ذلكيتناقص مع التقدم في السن ، ويساعد على تحسين التجاعيد.28
الشكل 7 تحليل التعبير الجيني في الخلايا الليفية الجلدية باستخدام RT-qPCR: (أ) النوع الأول من الكولاجين ، (ب) MMP -1 ، و (ج) PGC -1 أ.
كان التعبير عن PGC -1 أعلى مستوى له بعد 8 ساعات لجميع المعالجات ، مع زيادة معدلات تعبير GA و TPPTTP و Gal – Pep و Gal2 – Pep 2. 06- ، 1. {6} } و 1. 07- و 2. 05- أضعاف على التوالي. ومع ذلك ، على عكس العلاجات الأخرى ، زاد Gal2 – Pep من PGC -1 تعبير 1. 27- أضعاف بعد 24 ساعة. PGC -1 أينظم التوليف والتأثيرات المضادة للأكسدة للميتوكوندرياويبلغ عنهاتنخفض مع تقدم العمر.29-32 لذلك ، فإن Gal2 – Pep لديه القدرة على استخدامه كمضاد أكسدة فعال يمكن أن يحمي بشكل فعال من ROS.
إجمالاً ، زاد Gal2 – Pep من تعبير PGC -1 والكولاجين مقارنةً بتأثيرات GA و TPPTTP وحدهما ، في حين أنيميل التعبير عن MMP -1 إلى الانخفاض، مما يوضح إمكانية استخدامه فيمستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة.
4. الخلاصة
في هذه الدراسة ، أظهر Gal2 – Pep ، الذي تم تطويره من خلال الجمع بين GA والببتيد TPPTTP ، أداءً ممتازًاالنشاط المضاد للأكسدةوتنشيط الميتوكوندريا في خلايا الجلد. أشارت نتائج بقاء الخلية بوضوح إلى أن Gal2 – Pep ليس له تأثير سام للخلايا على خلايا الجلد. أظهر Gal2 – Pep أيضًا نشاطًا مضادًا للأكسدة يعتمد على الجرعة ونشاط إزالة الجذور الحرة ،مع نشاط الكسح ROS أكثر من 50 في المائة حتى بعد ذلكr تخزين لـأربعة أسابيع في درجة حرارة الغرفة. كما أنها أثرت بشكل إيجابي MmP وزيادة تعبير PGC -1a، أيّينظم تركيب الميتوكوندريا وله مضادات الأكسدة هـوما يليهاإلخعن طريق القضاء على الجذور الحرة داخل الجلد. فتاه2–بيب أيضايزيد من التعبير عن النوع الأول من الكولاجين ويقلل من الإيلاستازالنشاط والتعبير عن MMP -1 ، مما يثبت صحتهوعد للاستخدام في مستحضرات التجميل المضادة للشيخوخة.
تضارب المصالح
لا توجد صراعات للإعلان.
شكر وتقدير
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من شركة مجمع كوريا الصناعي (KICOX ، NTIS رقم 1415165722) ومنحة أبحاث جامعة Inha.
مراجع
1 P. Brenneisen، H. Sies and K. Scharffetter-Kochanek، Ann. نيويورك أكاد. علوم ، 2002 ، 973 ، 31–43.
2 A. Trifunovic، A. Wredenberg، M. Falkenberg، JN Spelbrink، AT Rovio، CE Bruder، M. Bohlooly-Y، S. Gldl ¨of، A. Oldfors، R. Wibom و J. T¨ornell و HT Jacobs و NG Larsson ،
Nature، 2004، 429، 417–423.
3 SB Khan و CS Kong و JA Kim و SK Kim و Biotechnol. هندسة العمليات الحيوية ، 2010 ، 15 ، 191-198.
4 H.-J. كيم ، ك. كيم ، ب. يو و H.-Y. Chung ، Free Radical Biol. ميد. ، 2000 ، 28 ، 683-692.
5 إم إردن إينال ، أ. كهرمان وتي كوكن ، كلين. إكسب ديرماتول ، 2001 ، 26 ، 536-539.
6 HS Jin و SY Park و JY Kim و JE Lee و HS Lee و NJ Kang و DW Lee و Biotechnol. هندسة العمليات الحيوية ، 2019 ، 24 ، 240-249.
7 H. Masaki، J. Dermatol. علوم ، 2010 ، 58 ، 85-90.
8 TSA Thring، P. Hili and DP Naughton، BMC Complementary Altern. ميد. ، 2009 ، 9 ، 27.
9 L. Quiles-Carrillo، S. Montava-Jord a، T. Boronat، C. Sammon، R. Balart and S. Torres-Giner، Polymers، 2019، 12، 31. 10 DH Park، DH Jung، SJ Kim، SH Kim and KM Park ،
BMC Biochem.، 2014 ، 15 ، 4-10.
11 YJ Cheng و GF Luo و JY Zhu و XD Xu و X. Zeng و DB Cheng و YM Li و Y. Wu و XZ Zhang و RX Zhuo و F. He و ACS Appl. ماتر. واجهات ، 2015 ، 7 ، 9078-9087.
12 H. Lee، ATE Vilian، JY Kim، MH Chun، JS Suh، HH Seo، SH Cho، IS Shin، SJ Kim، SH Park، Y.-K. هان وجيه إتش لي واي إس هوه ، محامي RSC ، 2017 ، (48) ، 30205-30213.
13 Y. Kong، C. Xu، ZL He، QM Zhou، J. Bin Wang، ZY Li and X. Ming، Peptides، 2014، 53، 70–78.
14 H. Kim و JS Kim و YG Kim و Y. Jeong و JE Kim و NS Paek و CH Kang و Biotechnol. هندسة العمليات الحيوية ، 2020 ، 25 ، 421-430.
15 MA Frezzini و F. Castellani و N. De Francesco و M.
16 A.Rengaraj، P. Puthiaraj، NS Heo، H. Lee، SK Hwang، S. Kwon، WS Ahn and YS Huh، Colloids Surf.، B، 2017،160، 1–10.
17 تي ميازاوا ، ت. أوتوماتسو ، واي. فوكوي ، ت. يامادا ، إس كواتا ، ج. كيم. Soc.، Chem. كومون ، 1988 ، 419-420.
18 SM Mali ، M. Ganesh Kumar ، MM Katariya and HN Gopi ، Org. بيومول. كيم ، 2014 ، 12 ، 8462-8472. 19 تي ميشيلز ، آر دي سولنغ ، يو هابركورن و دبليو مير ، أورغ. Lett. ، 2012 ، 14 ، 5218-5221.
20 P. Song، W. Du، W. Li، L. Zhu، W. Zhang، X. Gao، Y. Tao and F. Ge، Nanomater. تقنية النانو ، 2020 ، 10 ، 1-10.
21 إم دي زوتي ، بيوندي ، واي.بارك ، K.-S. Hahm، M. Crisma، C. Toniolo and F. Formaggio، Amino Acids، 2012، 43، 1761–1777.
22 Z. Zhai، K. Xu، L. Mei، C. Wu، J. Liu، Z. Liu، L. Wan and W. Zhong، So Matter، 2019، 15، 8603 - {{4 }}.
23 دي جي توبين ، جيه. Tissue Viability ، 2017 ، 26 ، 37-46.
24 إم. شيبر و إن إس شاندل ، كور. بيول ، 2014 ، 24 ، 453-462.
