علامات جودة Cistanches Herba على أساس العلاقة بين تأثير الطيف ومضادات الأكسدة

خلاصة

الهدف: إنشاء طريقة بحث لعلامات الجودة (Q-markers).سيستانشس هربا(CH) على أساسالعلاقة بين تأثير الطيف المضاد للأكسدةمما يوفر أساسًا لدراسة المواد الدوائية ومراقبة الجودة. الطرق: تم استخدام التحليل اللوني السائل عالي الأداء (UPLC) لإنشاء ملفات تعريف بصمات الأصابع لمدة 10 دفعات من CH. تم إنشاء نموذج الضرر التأكسدي للخلايا باستخدام H2O2، وتم تحديد قدرة مضادات الأكسدة لـ CH بناءً على التركيز المثبط النصف الأقصى لأنواع الأكسجين التفاعلية، بالإضافة إلى مستويات فائق الأكسدة والكاتلاز كمؤشرات دوائية. تم بناء العلاقة بين الطيف والتأثير من خلال تحليل المكونات الرئيسية، وتحليل ارتباط بيرسون، وتحليل انحدار المربعات الصغرى الجزئية. تم إخضاع المكونات النشطة للتحقق الدوائي. النتائج: تم إنشاء ملفات تعريف بصمات الأصابع لـ CH باستخدام UPLC، مع تحديد 17 قمة شائعة. واستناداً إلى تحليل ارتباط تأثير الطيف، تم اختيار تسعة مكونات. أشارت نتائج التحقق الدوائي إلى أن حمض الجينيبوديك، 8-حمض الإيبلوجانيك،إشنكوسيد, com.acteoside,إيزواكتيوسايد، وتوبولوسيد أأظهر نشاط مضادات الأكسدة بطريقة تعتمد على التركيز. الاستنتاج: استكشفت هذه الدراسة علامات Q لـ CH بناءً على علاقة تأثير الطيف، مما يوفر معلومات مرجعية لأساس المادة الدوائية وتحسين معايير الجودة.

الكلمات الدالة:سيستانشس هربا; علامة Q؛العلاقة بين تأثير الطيف; مضادات الأكسدة

مستخلص سيستانش عضوي يحتوي على 30% من الإكيناكوسيد و12% أكتيوسايد لوظيفة الكلى

سيستانشهو ساق لحمي مجفف بأوراق متقشرة من Cistanche deserticola YCMa أو Cistanche tubulosa (Schenk) Wight، وهو نبات ينتمي إلى جنس Cistanche من عائلة Orobanchiaceae. تم تسجيله لأول مرة في "Shen Nong's Materia Medica" وتم إدراجه كأعلى درجة [1]. إنه دافئ بطبيعته وحلو ومالح في الذوق. يعود إلى خطوط الطول في الكلى والأمعاء الغليظة. له تأثيرات تغذية يانغ الكلى، وتجديد الجوهر والدم، وترطيب الأمعاء وملين، وهو دواء مهم لتقوية الكلى وتجديد الجوهر [2-3]. تقوم الكلى بتخزين الجوهر، ويأتي الجوهر والدم من نفس المصدر. إذا نقص الجوهر والدم، فسيؤثر ذلك على أنشطة الحياة العامة لجسم الإنسان؛ يتم تخزين النخاع المنتج للجوهر في العظام، والدماغ هو بحر النخاع. إذا كان جوهر الكلى غير كاف، فإن العظام سوف تفقد تغذيتها وسيكون الدماغ ناقصا، مما يؤدي إلى تغيرات تنكسية في العظام مثل الملمس الرخو، وفقدان الأسنان، وفقدان الذاكرة، والخرف، وانخفاض وظيفة المناعة [4-6]. يحتوي Cistanche deserticola على جليكوسيدات فينيل إيثانول، إيريدويدات، قشور ومكونات هيكلية أخرى، بما في ذلك إشيناسيسيد، فيرباسكوسيد، إيزورباسكوسيد، حمض جينيبينيك، وحمض إبستريانيك 8-. ، توبولين A، الخ. [7]. تنص مراقبة الجودة الحالية لـ Cistanche deserticola في طبعة 2020 من "دستور جمهورية الصين الشعبية" فقط على محتوى الإشناسيسيد والفيرباسكوسايد، والذي لا يمكن أن يعكس بشكل كامل خصائص العمل المتعددة المكونات ومتعددة الأهداف للطب الصيني التقليدي. ، وهو ما لا يفضي إلى مراقبة الجودة والتقييم.

من أجل تحسين مستوى مراقبة الجودة للطب الصيني التقليدي وتحسين تقييم جودة الطب الصيني التقليدي، اقترح الأكاديمي ليو تشانغشياو المفهوم الجديد لعلامة الجودة (Q-marker) للطب الصيني التقليدي [8]. ومن بينها، "الفعالية" هي العنصر الأساسي في "المبادئ الخمسة" لـ Q-marker [9] وهي أيضًا جوهر تقييم جودة الأدوية الصينية التقليدية.

في ضوء الوضع البحثي الحالي المتمثل في ضعف الارتباط بين معايير الجودة وفعالية الأدوية، فإن استكشاف علامات Q للأدوية الصينية التقليدية ووضع معايير جودة أكثر علمية ومعقولة له أهمية كبيرة لتحسين جودة الأدوية الصينية التقليدية. تتمثل العلاقة بين الطيف والتأثير في ربط القمم الكروماتوغرافية لبصمات الأصابع في الطب الصيني التقليدي ببيانات ديناميكية دوائية محددة للعثور على المواد الفعالة في الطب الصيني التقليدي، مما يعكس الجودة المتأصلة في الطب الصيني التقليدي [10]. إن إنشاء نموذج رياضي للكفاءة الطيفية يمكن أن يوضح QMarker للطب الصيني التقليدي من منظور "نظرة شمولية"، مما يوفر المزيد من المرجع لمراقبة جودة الطب الصيني التقليدي لاحقًا، وصياغة معايير الجودة وفحص المكونات النشطة. تستخدم هذه الدراسة بصمات الأصابع مقترنة بمعدل نصف التثبيط لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS IC50)، ومحتويات ديسموتاز الفائق أكسيد (SOD) والكاتلاز (CAT) لدراسة العلاقة بين تأثير الطيف للطب الصيني التقليدي، وتستخدم تحليل المكونات الرئيسية. (PCA))، وتحليل ارتباط بيرسون (PCC) وتحليل انحدار المربعات الصغرى الجزئية (PLS) لإجراء تحليل شامل لعلامة Q لـ Cistanche deserticola لتوفير أساس لمراقبة الجودة.

1 مادة

1.1 العينة

سيستانش ديزيرتيكولاتم حصاده من مقاطعة يوتيان وشينجيانغ وقاعدة زراعة الممارسات الزراعية الجيدة Cistanche deserticola (GAP) في منغوليا الداخلية. تم التعرف عليه من قبل الباحث تشانغ تيجون من شركة معهد تيانجين للأبحاث الصيدلانية المحدودة باسم Cistanche tubulosa (Schenk) Wight وCistanche deserticola.

YC Ma، يتم عرض المعلومات التفصيلية في الجدول 1.

1.2 اختبار الطب

تم شراء كل من الإكيناسيسيد (رقم الدفعة: 111670-201907، النقاء: 91.8%) والفيرباسكوسايد (رقم الدفعة: 111530-201914، النقاء: 95.2%) من المعهد الصيني لمراقبة الأغذية والأدوية؛ إيزوسكوسيد (رقم الدفعة: 61303-13 -7)، ساليدروسيد (رقم الدفعة: 10338-51-9)، 8- حمض إبستريشنويك (رقم الدفعة: 82509-41-9)، حمض الجينيبينيك (رقم الدفعة: Z24A10X95926) ، توبروسين B (رقم الدفعة: 112516-04-08)، 2- أسيتيل يوجينول جليكوسيد (رقم الدفعة: 94492-24-7) تم شراؤها من Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.، نقاء أكبر من أو يساوي 98%; تم شراء Cistanche جليكوسيد A (رقم الدفعة: MUST -20062806، النقاء: 98.51٪) والفاسكولين A (رقم الدفعة: MUST19110102، النقاء: 98.57٪) من Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.؛ تم شراء الأسيتونيتريل وحمض الفورميك النقي كروماتوغرافيًا من شركة Tianjin Concord Technology Co., Ltd. المياه النقية (شركة مجموعة هانغتشو واهاها المحدودة). فيتامين هـ (VE، V8010، شركة بكين سولاربيو)؛

ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO, D2660-100ML، شركة Sigma، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ مجموعة أدوات الكشف عن تكاثر الخلايا ذات المحلول الواحد CellTiter 96® AQueous (G3580، شركة Promega، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ تم شراء مجموعة أدوات الكشف عن CAT (S0051) ومجموعة أدوات الكشف عن نشاط SOD S0101M) ومجموعة أدوات الكشف عن ROS (S0033S) من شركة Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 الأدوات

جهاز كروماتوجرافيا سائل عالي الأداء من Waters H-class-PDA (شركة Waters، الولايات المتحدة الأمريكية)؛ الميزان الإلكتروني Sartorius BT25S (شركة Sartorius، ألمانيا)؛ جهاز طرد مركزي عالي السرعة لسطح المكتب H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.)؛ سبكترا ماكس ام 5

قارئ صفيحة ميكروسكوبية (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.)؛ WYS-41المجهر البيولوجي XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1.4 خلايا

تم استخدام خلايا الكلى الجنينية البشرية HEK 293 في هذه التجربة وتم شراؤها من بنك الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوم.

2 طرق

2.1 إنشاء خريطة بصمات الأصابع

2.1.1 تحضير محلول الاختبار: وزن 2 جرام من المادة الطبية Cistanche deserticola، أضف 10 مرة من كمية الماء والحرارة والارتجاع 3 مرات، 1 ساعة في كل مرة، جهاز طرد مركزي عند 1.0 ×105r·min-1 لمدة 15 دقيقة (نصف قطر الطرد المركزي 300 مم)، اجمع المواد الطافية وركزها لعمل محلول مخزون بتركيز كتلة 100 مجم·مل-1، خففه 10 مرات، وتصفيته من خلال غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر للحصول عليه.

2.1.2 تحضير محلول مرجعي مختلط

خذ 8-حمض إبيسترريشنيك، وساليدروسيد، وإكيناسيسيد، وسيستانش جليكوسيد A، وحمض جينيبينيك، وفيرباسكوسيد، وأنثوسيانوسايد A، وإيزورباسكوسيد، و2'-أسيتيل يوجينول. تم قياس المادة المرجعية جليكوسيد وأنجيوسيد ب بكميات مناسبة ووزنها بدقة. أضف 50% من محلول الميثانول لإذابة وتحضير محلول مادة مرجعية مختلطة بتركيز كتلة 20 ميكروجرام · مل-1.

2.1.3 الظروف الكروماتوغرافية

عمود ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 مم × 2.1 مم، 1.7 ميكرومتر)؛ الطور المتحرك هو الأسيتونتريل (A) ~ 0.1% محلول حمض الفورميك (B)، برنامج شطف التدرج (0 ~ 6 دقيقة، 5% ~ 8% A؛ 6 ~ 10 دقيقة، 8% ~ 15%A 10 ~ 13 دقيقة، 15% ~ 19% أ، 13 ~ 20 دقيقة، 19% ~ 25% أ)؛ الطول الموجي للكشف هو 237 نانومتر؛ معدل التدفق هو 0.4 مل · دقيقة -1؛ درجة حرارة العمود 40 درجة؛ حجم الحقن 3 ميكرولتر.

2.1.4 اختيار الذروة المرجعية

في اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) لـ Cistanche deserticola، تم اختيار الذروة ذات أكبر نسبة لمنطقة الذروة ووقت الاحتفاظ المعتدل والفصل الجيد باعتبارها الذروة المرجعية لطيف بصمات الأصابع.

2.1.5 المراجعة المنهجية

اختبار الدقة: خذ عينة T1 وقم بإعداد محلول الاختبار وفقًا للطريقة المذكورة في 2.1.1. حقن العينة 6 مرات متواصلة وتسجيل البصمة. أظهرت النتائج أن منطقة الذروة النسبية RSD لكل قمة هي 0.10%~4.61%، ووقت الاحتفاظ النسبي RSD هو 0.08%~1.32%، مما يشير إلى أن الأداة جيدة دقة.

اختبار التكرار: أخذ عينة T1 وإعداد 6 عينات من محلول الاختبار بالتوازي وفقا للطريقة المذكورة في 2.1.1، وحقن العينة بشكل مستمر. أظهرت النتائج أن منطقة الذروة النسبية RSD لكل ذروة كروماتوغرافية هي 1.35%~4.80%، ووقت الاحتفاظ النسبي RSD هو 0.10%~1.80%، وهو ما يلبي متطلبات بصمة الإصبع ويظهر أن التكرار الصك جيد.

اختبار الثبات: خذ عينة T1 وقم بإعداد محلول الاختبار وفقًا للطريقة الواردة في 2.1.1، واحقن العينات للاختبار عند 0، 2، 4، 8، و12 ساعة، وقم بتسجيل بصمة الإصبع. RSD المحسوب لمنطقة الذروة النسبية لكل ذروة كروماتوغرافية هو 0.53%~4.82%، وRSD لوقت الاستبقاء النسبي هو 0.09%~2.17%، وهو ما يلبي المتطلبات من بصمة الإصبع ويشير إلى أن منتج الاختبار مستقر خلال 12 ساعة.

2.2 بحث عن تأثير مضادات الأكسدة في Cistanche deserticola

2.2.1 تحضير السائل الأم Cistanche deserticola

خذ المحلول الأم تحت البند 2.1.1، وقم بتصفيته وتعقيمه، وتخفيفه باستخدام وسط الاستنبات إلى التركيز المطلوب قبل الاستخدام.

2.2.2 Cistanche deserticola والسيطرة الإيجابية

تم تعيين تأثير VE على صلاحية خلايا HEK 293 كمجموعة طبيعية (تعليق الخلية)، مجموعة إدارة Cistanche deserticola (25، 50، 100، 200، 400 ميكروغرام · مل – 1)، مجموعة VE (20، 40، 60 ، 80، 100 ميكرومول · لتر – 1)، قم بتعيين 6 آبار مكررة لكل تركيز، ثقافة لمدة 24 ساعة، أضف 20 ميكرولتر من كاشف المحلول الفردي CellTiter 96® AQueous إلى كل بئر للكشف عن صلاحية الخلية، استمر في الثقافة لمدة ساعتين، واستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية للكشف عن صلاحية الخلية عند 490 نانومتر. تم استخدام قيمة الامتصاص (OD) لكل بئر لحساب معدل بقاء الخلية وفقًا للصيغة (1). معدل البقاء (%)=(مجموعة OD التجريبية/مجموعة OD الفارغة) × 100% (1)

2.2.3 Cistanche deserticola على تحريض H2O2

تأثير ROS على خلايا HEK 293. تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة طبيعية (تعليق الخلية) ومجموعة إعطاء Cistanche deserticola (6.25، 12.5، 25، 50، 100 ميكروجرام · مل – 1 Cistanche deserticola و 60 ميكرومتر · لتر – 1 H2O2)، وتم تربيتها على مدار 24 ساعة. اتبع خطوات مجموعة أدوات الكشف عن ROS للعمليات اللاحقة، ولاحظ مباشرة تلطيخ الخلية من خلال المجهر، واستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية للكشف عن كثافة الفلورة لكل مجموعة. استخدمت إعدادات المعلمة طول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 525 نانومتر. التجربة أعيدت ثلاث مرات.

2.2.4 زوج سيستانش ديسيرتيكولا

تأثير H2O2 على SOD في خلايا HEK 293. تم تقسيم الخلايا إلى مجموعة طبيعية (تعليق خلية)، مجموعة نموذجية (60 ميكرومتر · لتر – 1 H2O2)، مجموعة VE (60 ميكرومتر · لتر – 1 VE و 60 ميكرومتر · لتر – 1 H2O2)، مجموعة إدارة Cistanche deserticola (100 خلية). ميكروجرام · مل – 1 Cistanche deserticola و 60 ميكرومتر · لتر – 1 H2O2)، اجمع الخلايا بعد 24 ساعة من الاستزراع، وأضف محلول تحضير عينة SOD لتحلل الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات و12000 دورة · دقيقة {{22} } دقيقة (نصف قطر الطرد المركزي 300 مم)، خذ المادة طافية كالعينة المراد اختبارها، واتبع خطوات مجموعة أدوات الكشف عن SOD للعمليات اللاحقة. التجربة أعيدت ثلاث مرات.

2.2.5 Cistanche deserticola على تحريض H2O2

تمت معالجة تأثيرات CAT على خلايا HEK 293 وفقًا للطريقة المذكورة في 2.2.4 وتم تجميعها في مجموعات. بعد العلاج، أضف محلول التحلل، جهاز طرد مركزي عند 4 درجات و12000 دورة · دقيقة -1 لمدة 10 دقائق (نصف قطر الطرد المركزي 300 مم)، خذ المادة الطافية، واتبع خطوات مجموعة أدوات الكشف CAT للعمليات اللاحقة . التجربة أعيدت ثلاث مرات.

2.2.6 التحليل الإحصائي

تم استخدام برنامج SPSS 26.0 للتحليل الإحصائي. تم تمثيل كل مجموعة من البيانات بواسطة (±±()). تم إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه على البيانات المطابقة للتوزيع الطبيعي. إذا كانت التباينات متساوية، تم استخدام طريقة الفرق الأقل أهمية. إذا كانت التباينات متساوية متفاوتة، تم استخدام طريقة Dunnett's T3 GraphPad Prism 8 للرسوم البيانية، وتم استخدام P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 تحليل ارتباط تأثير الطيف لمضادات الأكسدة Cistanche deserticola

2.3.1 PCA تم تطبيع مناطق الذروة للقمم المشتركة لـ 10 دفعات من Cistanche deserticola التي حددت بصمات الأصابع بقيمة Z، وتم تحويلها إلى مصفوفة بيانات ترتيب 10 × 17، والتي تم استيرادها إلى برنامج SPSS 26.0 للPCA.

2.3.2 PCC

تم استخدام برنامج SPSS 26.0 لإجراء تحليل ثنائي المتغير لدراسة علاقة الكفاءة الطيفية بين بصمات نبات Cistanche deserticola ومضادات الأكسدة. تم إجراء اختبار الأهمية باستخدام اختبار على الوجهين (T)، مع P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 الثابتة والمتنقلة

قم باستيراد النتائج التجريبية لمنطقة الذروة الموحدة لـ Cistanche deserticola ومضادات الأكسدة إلى برنامج SIMCA-P 14.1، وقم بتعيين منطقة الذروة كمتغير X، وقم بتعيين مؤشر الديناميكية الدوائية كمتغير Y لأداء PLS.

2.4 التحقق من نشاط مضادات الأكسدة Cistanche deserticola Q-marker

2.4.1 تحضير المحلول الأم للمكونات النشطة. قم بوزن الكميات المناسبة من حمض الجينيبينيك، 8- حمض إبستريتشنيك، إشيناسيسيد، فيرباسكوسيد، إيزوريباسكوسيد، وأنثوسيانوسيد A، وأضف DMSO لإذابتها في 10 مليمول · لتر -1 من المحلول المرجعي.

2.4.2 تأثير المكونات النشطة على السمية الخلوية لـ HEK 293.

بعد احتضان خلايا HEK 293 لمدة 24 ساعة، أضف تركيزات مختلفة من محاليل المكونات النشطة تحت 2.4.1 إلى كل بئر ({{5}).781، 1.563، 3.125، 6.25، 12.5، 25، 50، 100 ميكرومول · لتر – 1 ) 100 ميكرولتر، التحفيز المستمر

بعد حضانة الخلايا لمدة 24 ساعة، تمت إضافة كاشف المحلول الفردي CellTiter 96® AQueous للكشف عن صلاحية الخلية.

2.4.3 تأثير الضرر المضاد للأكسدة للمكونات النشطة على خلايا HEK 293 المستحثة بـ H2O 2-.

يتم تجميع الخلايا على النحو التالي: يتم تجميع المجموعة العادية والمجموعة النموذجية ومجموعة VE وفقًا لـ 2.2.4. المجموعة التجريبية (0.781، 1.563، 3.125 ميكرومتر · لتر – 1 تركيبة نشاط و 60 ميكرومتر · لتر – 1 H2O2)، تم تربيتها لمدة 24 ساعة. تحديد مستويات ROS داخل الخلايا ومحتويات إنزيم SOD وCAT وفقًا للطرق الواردة تحت 2.2.3 و2.2.4 و2.2.5 على التوالي.

الخدمة الداعمة لـ Wecistanche

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop