دراسة بروتينية كمية تكشف مسار الفيبرينوجين في مرض الكبد المتعدد الكيسات
Nov 21, 2023
خلاصة:(1) الخلفية: مرض الكبد المتعدد الكيسات (PLD) هو مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الخلقية التي تتميز بتوسع القناة الصفراوية وتطور الكيس المشتق من الخلايا الصفراوية. ومع ذلك، فإن آلية تكون المثانة غير معروفة حاليًا ويقتصر علاج PLD على زراعة الكبد. هناك حاجة إلى أساليب علاجية جديدة وفعالة. في هذا السياق، يهدف العمل الحالي بشكل رئيسي إلى إيجاد مسارات جزيئية جديدة، بالإضافة إلى أهداف علاجية جديدة، تشارك في عملية تكوين المثانة الكبدية. (2) الطرق: تم إجراء البروتينات الكمية المعتمدة على تقنية SWATH-MS بمقارنة البروتينات الكبدية لـالنوع البريوالكبد المتحول/متعدد الكيسات في أمرض الكلية متعددة الكيسات(PKD) نموذج الفئران (Pkd1cond/كوند; تام كري−/+). (3) النتائج: حددنا العديد من البروتينات التي تم تغييرها بكثرة، مع تنظيم قطعي مزدوج أو تنظيم سفلي وتعديل.p-ترتبط القيمة بشكل كبير بتكوين المثانة الكبدي. بعد ذلك، أجرينا تحليلًا للبروتين والإثراء لتحديد مجموعة تركز على الفيبرينوجينات الكبدية. أخيرًا، قمنا بالتحقق من صحة مجموعة مختارة من الأهداف بواسطة RT-qPCR،النشاف الغربي,والكيمياء المناعية، وإيجاد علاقة عالية مع بيانات البروتينات الكمية والتحقق من صحة مجمع الفيبرينوجين. (4) الاستنتاجات: حدد هذا العمل مسارًا جزيئيًا جديدًا في مرض الكبد الكيسي، وسلط الضوء على مركب الفيبرينوجين كهدف علاجي جديد محتمل لـ PLD.
الكلمات الدالة:بي إل دي؛ سواث؛ البروتينات الكمية. الأهداف العلاجية
1 المقدمة
مرض الكبد المتعدد الكيسات(PLD) هي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الخلقية التي تتميز بتوسع القناة الصفراوية وتطور الكيس المشتق من الخلايا الصفراوية (الخلايا الظهارية من القناة الصفراوية). تنتشر الأكياس العديدة وتتقدم في جميع أنحاء حمة الكبد مما يؤثر على وظيفتها [1]. يتم توريث PLDs بشكل سائد أو متنحي ويمكن أن يحدث بشكل منفصل (مرض الكبد المتعدد الكيسات المعزولأوPLD) أو، بشكل أكثر شيوعًا، كـمظاهر خارج الكلىمن جسميمرض الكلى المتعدد الكيسات السائد لدى البالغين(بكد) [2]. فيمرض الكلى المتعدد الكيسات السائد(ADPKD)، يصاب حوالي 85٪ من المرضى بكيسات الكبد في جميع أنحاء الحمة الكبدية ويمكن أن تتراوح شدتها من عدد قليل من الأكياس إلى تكوين المثانة الكبدي الحاد [3،4]. في الوقت نفسهمرض الكلى المتعدد الكيسات المتنحية(ARPKD)، يمكن أن تتطور أكياس الكبد، ولكن المضاعفات الكبدية الرئيسية هي إعادة تشكيل معيبة للوحة الأقنية مع التليف الكبدي الخلقي [5،6]. بالنسبة لكليهما، PLD هو المظهر الرئيسي خارج الكلى ويتطلب إدارة وعلاجًا سريريًا [2،5]. النهج السريري الرئيسي لمرضى PLD هو تقليل الأعراض السريرية. إدارة مضاعفات القناة الصفراوية هي السمة السريرية الرئيسية التي يجب السيطرة عليها، وعادة ما تكون استراتيجية العلاج النهائية هي زرع الكبد [7]، حيث لا يوجد علاج دوائي فعال لـ PLD [2،5]. ارتبطت مسارات جزيئية متعددة بالمرض [8]، مثل زيادة إفراز السوائل [9،10]، والتكاثر [11]، والتليف [12،13]، والعيوب الهدبية [14] وغيرها [7،8]؛ ولكن الآلية الرئيسية التي تخضع لتكوين المثانة لا تزال بحاجة إلى توضيح. هناك حاجة ملحة لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة الجديدة. استندت كل هذه الدراسات إلى دراسات جزيئية باستخدام أدوات جزيئية كلاسيكية مختلفة: زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد [7,8]، الكيمياء المناعية [7-9,11,12]، ELISA [9,11]، المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) [12] ، الكيمياء المناعية [11]، RT-qPCR (PCR في الوقت الحقيقي الكمي) [7،8،10،11] واللطخة الغربية [7،8،10-12]. إن الاقتراب من دراسة المرض من وجهات نظر جديدة، والنماذج الحيوانية قبل السريرية الراسخة، والاستفادة من التقنيات الجديدة، يمكن أن يكون مفيدًا في اكتشاف آليات جزيئية جديدة للمرض لترجمة الاكتشافات الجزيئية إلى علاجات جديدة.
كان التحليل اللوني السائل المقترن بقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC – MS / MS) هو التكنولوجيا الأكثر استخدامًا لتوصيف بروتينات المرض بالإضافة إلى تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة للمرض أو فحص الأدوية [15،16]. تسمح الإستراتيجية الناشئة المسماة SWATH – MS (اكتساب النافذة المتسلسلة لجميع أطياف الشظايا الأيونية والكتلة النظرية) بتقدير كمي قابل للتكرار وموثوق وعالي الإنتاجية مع ما يصل إلى آلاف البروتينات التي تم تحليلها لكل عينة بيولوجية، مع إمكانية الأداء في وقت واحد عدد كبير من المقايسات [16،17]. بالنسبة لهذه التقنية، يتم هضم العينات باستخدام التربسين وتحليلها بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل إلى جانب تحليل كروماتوجرافي جماعي ترادفي يعمل في ما يسمى بوضع الحصول على البيانات المستقلة (DIA) [16] (انظر المواد والطرق). تسمح تقنية SWATH-MS للبروتينات من الجيل التالي بقياس كمية البروتين وتحديد الاختلافات في وفرة البروتين في العينات والظروف المختلفة.
في هذه الدراسة، أجرينا تحليلًا كميًا بروتينيًا تفاضليًا يعتمد على تقنية SWATH-MS في مرض الكبد المتعدد الكيسات من نماذج حيوانية متحولة. نقوم بالإبلاغ عن قائمة البروتينات ذات الأهمية الإحصائية لوفرة البروتين التفاضلي، والتي تميزت بتحليلات تخصيب مختلفة وتنظيم البيانات. أخيرًا، قمنا بالتحقق من صحة بيانات SWATH من خلال تحديد وتسليط الضوء على مركب الفيبرينوجين كآلية جديدة للمرض وهدف علاجي جديد محتمل لـ PLD.
2. المواد والأساليب
2.1. نموذج الفئران
في هذه الدراسة، استخدمنا نموذجًا حيوانيًا للفئران بالضربة القاضية المشروطة Pkd1، C57/BL6 k Pkd1cond/cond؛ تام كري [18,19]. تم استخدام نموذج Cre-mouse كأنواع Wild (WT)، وCre+ كـ Mutant (KO). تم تأكيد الأنماط الجينية بواسطة PCR القياسي، باتباع الشروط والبادئات الموصوفة [18]. كان حذف Pkd1 دائمًا في أيام ما بعد الولادة 10 و11 (ص 10 وص 11) مع حقنة واحدة داخل الصفاق من عقار تاموكسيفين (10 مجم / 40 جم) (Sigma®، St. Louis، MO، USA رقم T5648)، مخفف في زيت الذرة (Sigma – Aldrich®، St. Louis، MO، USA No. C8267)، سيتم حث كلا اليومين في أم الفضلات. تم الموت الرحيم للحيوانات في يوم ما بعد الولادة 30 (ص 30). تم إنشاء المجموعات من قبل أفراد مختلفين وتم تنظيمها بشكل عشوائي (عشوائي) مع الحفاظ على نسبة 1: 1 بين الذكور والإناث في جميع المجموعات. تم استخدام السمات التشريحية المميزة لتحديد جنس الحيوانات. تم إيواء الفئران في منشأة خالية من مسببات الأمراض (SPF) وفقا للشروط المعمول بها في جامعة سانتياغو.
2.2. استخراج البروتين والهضم
عند نقطة التضحية p30، تم تخزين الكبد المشرح عند −80 ◦C. تم طحن الكبد بالكامل في النيتروجين السائل باستخدام ملاط مبرد بالنيتروجين السائل (DD Biolab®، برشلونة، إسبانيا رقم 088763)، مع تخصيص نصف الأنسجة لاستخراج البروتين والنصف الآخر لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA). تم تحضير مستخلصات البروتين باستخدام RIPA lyses buffer (10 ملي TRIS، 5 ملي EDTA، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.1% SDS، 1% TRITON X -100 و1% ديوكسيكولات الصوديوم). تمت إضافة 1٪ أيضًا من مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (Sigma® No. P8340 y No. P0044). خضعت محللة الأنسجة هذه لعملية طرد مركزي (لمدة 30 دقيقة عند 4 ◦ مئوية و14 000 دورة في الدقيقة). تم بعد ذلك جمع الطاف وقياس كميته بواسطة اختبار بروتين برادفورد (Bio-Rad® No. 5000001). تم تركيز قسامات البروتين (100 ميكروغرام) في شريط واحد في 10٪ من كبريتات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي (SDSPAGE)، وتم قطعها وتقديمها للهضم اليدوي كما هو موضح سابقًا [20]. وأخيرا، تم إذابة الببتيدات المستخرجة في حمض الفورميك 0.1٪ لمزيد من التحليل.
2.3. البروتينات
2.3.1. بيانات DDA
تم تحليل التحليل التابع 4 ميكرولتر من كل عينة (أكثر من 4 ميكروغرام من البروتين) من خلال نهج الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) بواسطة micro-LC – MS / MS. تم فصل العينات بواسطة نظام Ekspert nLC425 micro-LC (Eksigen®، دبلن، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام عمود مصيدة YMC-TRIART C18 بحجم جسيم 3 مم وحجم مسام 120 Å (YMC Technologies، Teknokroma، برشلونة، إسبانيا) وعمود Chrom XP C{{10}} مم × 0.30 مم، حجم الجسيمات 3 مم وحجم المسام 120 Å (Eksigen® ) بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة. وكانت المذيبات المستخدمة هي المذيب A (ماء، 0.1% حمض الفورميك) والمذيب B (ACN، 0.1% حمض الفورميك). كان التدرج من 5% إلى 95% B لمدة 30 دقيقة، و5 دقائق عند 90% B، وأخيراً، 5 دقائق أخرى عند 5% B لموازنة العمود، لمدة إجمالية قدرها 40 دقيقة. كان مطياف الكتلة المقترن عبارة عن مطياف كتلة هجين رباعي الأقطاب TOF، 6600 (SCIEX®، Framingham، MA، USA) يعمل مع نظام اكتساب يعتمد على البيانات في وضع الأيونات الإيجابية. باستخدام مطياف الكتلة، تم إجراء مسح مسح 250 مللي ثانية عند 400 إلى 1250 م/ض متبوعًا بتجارب MS/MS عند 100 إلى 1500 م/ض (25 مللي ثانية من وقت الاستحواذ) لمدة دورة إجمالية قدرها 2.8 ثانية. تمت إضافة السلائف المجزأة إلى قائمة الاستبعاد الديناميكي لمدة 15 ثانية، وتم استبعاد أي أيون بشحنة +1 من تحليل MS/MS. تم الجمع بين عمليات البحث عن الملفات الأولية وقاعدة بيانات MS وتنفيذها باستخدام برنامج ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®، Framingham، MA، USA) باستخدام قاعدة بيانات UniProt Swiss-Prot الخاصة بالماوس. من الضروري تحديد ألكلة السيستين يودو أسيتاميد كتعديل ثابت وهضم التربسين. تم ضبط معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) على 1 للببتيدات والبروتينات بدرجة ثقة أكبر من 99% [21].
2.3.2. جيل المراجع
المكتبة الطيفية تم تنفيذ المكتبة الطيفية بطريقة DDA كما هو موضح أعلاه، ولكن بدلاً من كل عينة مستقلة، تم إجراء مجموعة من كل مجموعة باستخدام 4 ميكرولتر من كل عينة (أكثر من 4 ميكروغرام من البروتين) من أجل الحصول على بروتين أكثر تمثيلاً تحديد الهوية في المكتبة الطيفية. تم إطلاق جميع الملفات الأولية معًا في قاعدة بيانات Uniprot للحصول على المكتبة الطيفية باستخدام الشروط التجريبية للبروتين المذكورة في القسم السابق.
2.3.3. القياس الكمي بواسطة SWATH وتحليل البيانات
تم إجراء عملية الاستحواذ SWATH-MS باستخدام طريقة DIA. استخدمنا 4 مجموعات مع 4 مكررات بيولوجية لكل مجموعة و3 مكررات تقنية لكل عينة (انظر الجدول S1 لمزيد من التفاصيل). تم تحليل الأنسجة، وفي جميع الحالات، تمت مقارنتها في ظروف Wild Type (من Pkd1cond/cond؛ Tam-Cre− mouse) وشروط Mutant (من Pkd1cond/cond؛ Tam-Cre + mouse). تم تشغيل 4 ميكروغرام من البروتين لكل عينة والنسخ المتماثلة التقنية باستخدام طريقة SWATH. بالنسبة لكل مجموعة من العينات، تم تحسين عرض النوافذ المتغيرة البالغ عددها 100 وفقًا للكثافة الأيونية الموجودة في المكتبة التي يديرها DDA باستخدام جدول بيانات النافذة المتغيرة Sciex SWATH. لذلك، اعتمدت طريقة SWATH على دورة من التكرارات التي تتألف من الحصول على عمليات مسح 100TOF MS/MS (400 إلى 1500 م/ض، وضع الحساسية العالية، وقت الاستحواذ 50 مللي ثانية) لنوافذ العزل لمتغيرات السلائف المتداخلة المتسلسلة ذات العرض (تداخل 1 م/ض) يغطي نطاق الكتلة من 400 إلى 1250 م/ض مع فحص TOF MS سابق (400 إلى 1500 م/ض، وقت اكتساب 50 مللي ثانية) لكل دورة. كان إجمالي وقت الدورة 6.3 ثانية.
2.3.4. تحليل البيانات
تم قياس كمية جميع البروتينات الموجودة في مكتبة الأيونات والتي تم تحديدها بواسطة ProteinPilot مع FDR أقل من 1٪ بواسطة طريقة SWATH. بمجرد الحصول على عينات فردية، تم إجراء المحاذاة الطيفية واستخراج البيانات المستهدفة بواسطة PeakView v.2.2. (SCIEX®، Framingham، MA، USA) مطابقة للمكتبة الطيفية المرجعية كما هو موضح أدناه [22-26]. تمت إعادة تنظيم أوقات الاحتفاظ بالببتيدات التي تم اختيارها لكل بروتين في كل شوط وفقًا لببتيدات iRT الموجودة في كل عينة وتم التخلص منها على طول المحور طوال الوقت. ثم تم إنشاء المخططات اللونية الأيونية المستخرجة لكل أيون من الجزء المحدد؛ تم الحصول على مناطق الذروة للببتيدات عن طريق إضافة مناطق الذروة لأيونات الأجزاء المقابلة. قام PeakView بحساب FDR ودرجة لكل ببتيد معين وفقًا للمكونات الكروماتوغرافية والأطياف؛ تم استخدام الببتيدات ذات FDR أقل من 5٪ فقط لتقدير كمية البروتين. وبالمثل، للحصول على مجالات القياس الكمي للبروتين كدالة لكثافة الإشارة، تم اختيار ما يصل إلى 10 ببتيدات لكل بروتين وسبعة أجزاء لكل ببتيد. تم استبعاد جميع الببتيدات المشتركة والمعدلة من المعالجة. تم استخدام نوافذ مدتها خمس دقائق وعرض 30 جزء في المليون لاستخراج المخططات اللونية الأيونية.
2.3.5. تحليل مسار الإشارة
تم إجراء تحليل وظيفي مختلف باستخدام البروتينات المعبر عنها تفاضليًا لتقييم شبكات التفاعل الأكثر صلة والمسارات ذات الصلة أو المكونات الخلوية والبروتينات أو المسارات الأخرى المرتبطة بها. تم استخدام أرقام وصول بروتين UniProt (https://www.uniprot.org/، 28 أغسطس 2021). تم إخضاع البروتينات ذات الاختلافات في وفرة البروتين إلى: String® (https://string-db.org/، 25 أكتوبر 2021) باستخدام مصطلحات علم الجينات (GO) وFunRich® (http://funrich.org/index.html) ، 21 أكتوبر 2021) لدراسة شبكات البروتين والارتباط البيولوجي بين البروتينات؛ وإلى Reactome® (https://reactome.org/، 25 أكتوبر 2021) لدراسة المسارات المتعلقة بالعلاقة أو التفاعل مع البروتينات المعبر عنها بشكل ملحوظ.
2.4. الأنسجة وقياس المؤشر الكيسي
تم دائمًا تثبيت الفص الأكبر من كبد الحيوانات في بارافورمالدهيد (4٪ محلول بارافورمالدهيد المخزن، الرقم الهيدروجيني=7، Labbox No. FORM-D0P-10K) طوال الليل عند الساعة 4 ◦ج. تم بعد ذلك تجفيف الكبد باستخدام الزيلين والإيثانول ثم دمجه أخيرًا في البارافين. تم جمع المقاطع العرضية من 4.5 ميكرون. تم استخدام البروتوكولات القياسية لتلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين (HE) وماسون ثلاثي الألوان.
بالنسبة للقياس الكمي، تم دائمًا التقاط شرائح المقاطع الطولية للفص الأكبر من الكبد كصور تمثيلية، وتم استخدام ستة أقسام مختلفة على الأقل لكل حيوان، تم تصويرها تحت مجهر أوليمبوس BX51 متصل بكاميرا أوليمبوس DP70، لتقدير كمية مؤشر الكيسي وعدد من الخراجات. تم حساب القياس الكمي لكلا المعلمتين باستخدام أداة برمجية للتعرف التلقائي على الكيس تسمى CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser، 1 يوليو 2020) كما هو موضح سابقًا [35].
2.5. الكيمياء السريرية
تم جمع الدم قبل القتل الرحيم، وتم الحصول على المصل باستخدام أنابيب BD Vacutainer SST II Advance. تم قياس ناقلة أمين الألانين في الدم (ALT) والفوسفاتيز القلوي (ALP) باستخدام نظام الكيمياء ADVIA 2400 (Siemens Healthineers، Erlangen، ألمانيا).
2.6. استخراج الحمض النووي الريبي
تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) كما هو موضح سابقًا [36] باستخدام بروتوكول TRIzol (TRI Reagent، Sigma®، St. Louis، MO، USA، No. T9424)، حيث كان الكلوروفورم (Sigma® No. C2432) بمثابة عامل تغيير طبيعة الخلايا وكان الأيزوبروبانول (Sigma® No. 650447) هو العامل المعجل للحمض النووي الريبي (RNA). تم تخفيف المادة المترسبة في ماء DEPC (Ambion®، Austin، TX، USA، رقم AM9920)، والذي يحتوي أيضًا على 1% SUPERaseIn RNase Inhibitor (Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA، رقم AM2694).
2.7. في الوقت الحقيقي PCR الكمي
تمت معالجة ميكروغرام واحد من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) للكبد باستخدام DNase I (Invitrogen®، Carlsbad، CA، USA، No. 18068015). بعد ذلك، تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen®، رقم 18080051)، وتحليل التعبير الجيني بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® رقم 04913914001) ) في نظام Mx3005P (Agilent Technologies®، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصميم الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة باستخدام Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y، 11 مارس 2020) وتستند إلى التسلسلات المرجعية لـ cDNA المنشورة في متصفح الجينوم Ensembl (http://www.ensembl.org) /index.html، 11 مارس 2020). تم العثور على التسلسل الكامل لجميع الاشعال المستخدمة في الدراسة في الجدول S2. تم استخدام البرنامج التالي لجميع تفاعلات PCR الكاملة: خطوة تمسخ الطبيعة لمدة 30 ثانية عند 95 درجة مئوية؛ 45 دورة كل منها 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، ودقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية و30 ثانية عند 72 درجة مئوية؛ تليها خطوة التبريد. كما نفذنا سابقًا [36]، تم تشغيل كل عينة (ن=6 لكل مجموعة) في ثلاث نسخ في كل تجربة. وتم تحليل النتائج من خلال طريقة القياس الكمي المطلق. وبالتالي، تم استخدام منحنى قياسي بتركيزات معروفة في الاختبار، وبالإضافة إلى ذلك، تم تطبيع كل عينة إلى جين تعبير ثابت. في هذه الدراسة، تم استخدام جين Gapdh (نازع هيدروجين الفوسفات جليسرالديهايد) كجين التدبير المنزلي.
2.8. النشاف الغربي
تم إجراء فحوصات النشاف الغربي على lysates الكبد كله. تم تحديد محتوى البروتين الكلي باستخدام اختبار بروتين برادفورد (Bio-Rad®، Hercules، CA، USA، No. 5000001) وتم تحديد نفس الكمية من كل بروتين (20-30 ميكروغرام). يتم غليها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ويتم فصلها في 10% SDS-PAGE تحت ظروف مخفضة. تم استخدام PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA، No. 26616) كمعيار للوزن الجزيئي للبروتين. بعد ذلك، تم نقل البروتينات إلى أغشية النيتروسليلوز (Bio-Rad® رقم 1620115). لتجنب الارتباط غير المحدد، تم حظر الأغشية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول BSA 2.5٪ (NZYTech®، Lisboa، Portugal، No. MB046) للبروتينات المفسفرة، أو SuperBlock Blocking Buffer (Thermo Fisher®، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم 37515). بعد ذلك، تم تحضين الأغشية طوال الليل عند درجة حرارة 4◦ مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ثم غسلها بنسبة 0.3% توين -20 في برنامج تلفزيوني. أخيرًا، تم تحضين أغشية النيتروسليلوز لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بـ HRP. تم تطوير الإشارات باستخدام مجموعة SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA، رقم 34580) أو مجموعة PierceTM ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA رقم 32109) مسبقًا للتصور في نظام التصوير ChemiDoc™ (Bio-Rad®، Hercules، CA، USA). تم قياس نطاقات البروتين باستخدام برنامج ImageJ® Lab (الإصدار 4.0.1، https://imagej.nih.gov/ij/، 26 مارس 2021). تم تطبيع مستويات قياس كثافة البروتين لبروتينات التدبير المنزلي GAPDH أو -ACTIN. لكل مجموعة. تم استخدام N=6 في جميع التجارب.
الأجسام المضادة الأولية التالية مطلوبة للنشاف الغربي: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA #sc-28385)، anti -SAMP (1:500، Santa Cruz Biotechnology Inc.®، Dallas، TX، USA، No. sc-393948)، مضاد FIBB (1:500، Santa Cruz Biotech nology Inc.®، Dallas، TX، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم sc-271035)، مكافحة الاتحاد الدولي لكرة السلة (1:500، Santa Cruz Biotechnology Inc.®، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم sc-398806)، مكافحة الاتحاد الدولي لكرة السلة (1:500) ، Santa Cruz Biotechnology Inc.®، Dallas، TX، USA، No. sc-133157)، anti-HAO2 (1:1000، Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA، No. 113442)، anti-GAPDH (1:1000، Cusabio®، هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم CSB-RA009232A0HU) ومضاد - -ACTIN (1:1000، Cell Signaling Technology®، Danvers، MA، USA، رقم 8457)، كما بالإضافة إلى الجسم المضاد الثانوي Goat anti-Rabbit IgG HRP (1:5000، Thermo Fisher®، Waltham، MA، USA، رقم 31460) أو Goat anti-Mouse IgG HRP (1:5000، Thermo Fisher®، Waltham، MA، الولايات المتحدة الأمريكية، رقم 31430).
2.9. الكيمياء المناعية والقياس الكمي
بالنسبة للكيمياء المناعية، تم استخدام الرقم الهيدروجيني لسيترات الصوديوم=6 (Agilent Dako®، Glostrup، الدنمارك رقم S2369) لاسترجاع المستضد وتم حظر الأنسجة باستخدام مادة مخففة للجسم المضاد (Agilent Dako® No. K8006). كان الجسم المضاد المستخدم في التحليل الكيميائي المناعي هو الفيبرينوجين (Agilent Dako® No. A0080)، ونظام الكشف المترافق مع HPR للكشف المناعي. أخيرًا، تم إجراء القياس الكمي للكيمياء المناعية باستخدام وظيفة "تقسيم القنوات" (القناة الخضراء) من برنامج Fiji-ImageJ® (https: //imagej.net/software/fiji/، 13 أكتوبر 2021). لكل عينة، تم استخدام n أكبر من أو يساوي 6 صور.
2.10. التحليل الإحصائي
Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 كقطع. تم إجراء تحليل إحصائي متعدد المتغيرات غير خاضع للرقابة باستخدام تحليل المكون الرئيسي (PCA) لمقارنة البيانات عبر العينات.
الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:
البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com
واتساب/هاتف:+86 15292862950
تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
