التحديد السريع والمتزامن لستة مكونات فعالة في Cistanche Tubulosa بواسطة التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء القريبة

1. مقدمة

Cistanche (Hoffmg. Et Link) هو جنس phanerogamic معمر من عائلة نباتات Orobanchaceae. تم استخدام معظم الأنواع التي تنتمي إلى جنس Cistanche كنبات طبي لآلاف السنين في الصين؛ تتمتع بسمعة طيبة كمنشط متفوق. وتعرف باسم "جينسنغ الصحارى". Cistanche tubulosa هو طفيل إلزامي لجذور النبات المعمر Tamarix chinensis. وقد تم توثيقه في دستور الأدوية الصيني باعتباره المصدر الحقيقي للسيستانشس هربا(الاسم الصيني: Roucongrong) من طبعة 2005. بدأت الأبحاث الدوائية الحديثة على أنواع السيستانش في الثمانينات. أظهرت التحقيقات الدوائية أن مستخلصات نباتات السيستانش تمتلك مجموعة واسعة من الأنشطة، مثل علاج قصور الكلى والإمساك الشيخوخي، وتعزيز القدرة على التعلم والحفظ، ومكافحة مرض الزهايمر، وتعزيز المناعة، ومكافحة الشيخوخة، ومكافحة التعب، وما إلى ذلك. في العقود الثلاثة الماضية، تم الجمع بين الدراسات الدوائية الشاملة والمنهجية مع التحقيقات الكيميائية النباتية لإلقاء الضوء على الأساس المادي للتأثيرات المفيدة لجذور نباتات السيستانش. تشير هذه الدراسات الاستقصائية إلى أن جليكوسيدات الفينيليثانويد (PhGs) كانت المكونات الفعالة الرئيسية في نباتات Cistanche التي تلعب أدوارًا رئيسية في علاج قصور الكلى، والعجز الجنسي، ومكافحة الشيخوخة، ومرض الزهايمر. كانت محتويات اثنين من PhGs (echinacoside وverbascoside) مطلوبة في دستور الأدوية الصيني. وفي الوقت نفسه، فإن الكربوهيدرات مثل المانيتول والسكروز والجلوكوز والفركتوز في نباتات السيستانش تمتلك وظيفة ملين ومجموعات الكربوهيدرات في نبات السيستانش لها وظيفة ملين.نباتات سيستانشوقد استخدمت لعلاج الإمساك.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتعزيز هرمون التستوستيرون PHGS75% ECH 30% ACT 12%

يتم توزيع الموارد البرية لـ C. tubulosa بشكل رئيسي في المنطقة المحيطة بصحراء تاكلامكان في منطقة شينجيانغ ذاتية الحكم بجنوب الصين. على غرار العديد من الأنواع الأخرى المستخدمة كأدوية صينية تقليدية، فإن C. tubulosa لها قيمة اقتصادية كبيرة وهي على وشك الانقراض في بيئتها البرية بسبب الإفراط في جمعها. بدأت زراعة نبات C. tubulosa في التسعينيات في الصين لضمان توريد المواد الخام لنبات Cistanches Herba بالإضافة إلى حماية موارد النباتات البرية. اعتبارًا من عام 2017، يوجد ما يقرب من 13 ألف هكتار من نباتات C. tubulosa المزروعة في ولاية هوتان في شينجيانغ. هناك حاجة إلى التقدم في تكنولوجيا الزراعة لتوسيع نطاق الزراعة وكذلك تحسين جودة C. tubulosa.

الغرض الأساسي من زراعة C. tubulosa هو إنتاج Cistanches Herba، كونها غنية بتلك المكونات الفعالة. ومع ذلك، فإن محتويات المكونات الفعالة الموجودة فيهسيستانشس هربا، مثل PhGs و oligosaccharides، يمكن أن تتأثر بشكل كبير بالعديد من العوامل أثناء الإنتاج. وينبغي استكشاف نظام الكشف في الوقت الحقيقي عن نوعية C. tubulosa. ولذلك، فمن الضروري تطوير طريقة إنتاجية عالية للوفاء بمتطلبات تحليل عدد كبير من العينات خلال فترة قصيرة. تقليديا، تحديد تلك المكونات الفعالة الأولية، مثل PhGs والكربوهيدرات، في C. tubulosa يتم تحقيقه عادة باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء (HPLC). وعلى الرغم من كونها دقيقة وموثوقة، إلا أنها تستغرق وقتًا طويلاً وشاقة في جمع البيانات ومعالجتها. بالإضافة إلى ذلك، يلزم أيضًا قدر كبير من الوقت والجهد لإعداد العينة والذي يتضمن عادةً سحق فحوصات HPLC واستخلاصها وترشيحها. ولذلك، هناك حاجة إلى مبدأ واضح وأداة سهلة التشغيل للحصول على كمية كبيرة نسبيا من البيانات. ولحسن الحظ، تم استخدام التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء القريبة (NIRS) على نطاق واسع لتقييم المنتجات الزراعية والأغذية والعينات الطبية والمنتجات الصيدلانية لأنه سريع وغير مدمر. لذلك، يمكن أن تتطابق NIRS تمامًا مع متطلبات القياسات الفعالة لأشكال الطب الصيني التقليدي، وليس من المستغرب أن يتم تطبيق NIRS لتحديد النوعي والتقدير الكمي للمركبات في أشكال الطب الصيني التقليدي.

في هذه الدراسة، محتويات ستة مكونات فعالة، بما في ذلكإشيناكوسيد، فيرباسكوسيد، مانيتول، السكروز، الجلوكوز، والفركتوزفي 116 دفعة من عينات C. tubulosa التي تم جمعها من ولاية Hotan في شينجيانغ في 2013-2015 تم تحديدها لأول مرة بواسطة HPLC. بعد ذلك، تم إنشاء نماذج المعايرة لهذه المكونات الستة باستخدام طريقة انحدار المربعات الصغرى الجزئية (PLSR). تم بعد ذلك التحقق من صحة هذه النماذج باستخدام معاملات الارتباط وأخطاء التنبؤ في مجموعات المعايرة. أظهرت النتائج أنه يمكن استخدام الطريقة المطورة كوسيلة موثوقة للتحليل الكمي لـ C. tubulosa.

2. النتائج

2.1. تحليل HPLC

محتوياتإشيناكوسيد و فيرباسكوسيدتم تحديدها بواسطة طريقة HPLC-UV محددة جيدًا في الأدبيات وتم تحديد أربعة كربوهيدرات (المانيتول والسكروز والجلوكوز والفركتوز) بواسطة طريقة HPLC-ELSD محددة جيدًا في الأدبيات لجميع العينات الـ 116. تم وصف طرق تحضير العينات وتحديدها في القسمين 3.1 و3.3. ويبين الشكل 1 المخططات اللونية المميزة للمعايير المختلطة. ويمكن ملاحظة أن جميع المكونات الستة الفعالة تم فصلها عن خط الأساس وبالتالي يمكن قياسها كمياً. تم التحقق من صحة طريقة HPLC قبل اختبار العينة. يتم سرد النتائج الرئيسية لطريقة HPLC في الجدول 1. وتظهر العلاقة الخطية المواتية (r=0.9998) والاسترداد (98.5٪) من طريقة تحديد الإيتشيناكوسيد في النتائج، وهي نفس النتيجة مثل جميع الطرق الخمسة عناصر. ولذلك يمكن تحديد محتويات المكونات الستة الفعالة بدقة. يتم تلخيص جميع نطاقات المحتوى المحددة في الجدول 1.

2.2. تحليل NIRS

يوضح الشكل 2 أطياف NIR (4000–10,000 cm−1) لعينات C. tubulosa. ظهرت قمم امتصاص كبيرة من 4000 سم إلى 7500 سم في جميع العينات، بينما ظهرت تقلبات لطيفة من 7500 سم إلى 10000 سم. حدث الانجراف الأساسي لأطياف NIR لأن العينة تأثرت بسهولة بعوامل مثل حجم الجسيمات واللون (الشكل 2A). تم استخدام المعالجات الرياضية للأطياف لتقليل تأثير المعلومات غير الضرورية إلى حد ما. تضمنت المعالجات الرياضية الاشتقاق الأول (الاشتقاق الأول)، والاشتقاق الثاني (الاشتقاق الثاني)، والصنف العادي القياسي (SNV)، وتصحيح الانتثار المضاعف (MSC). يوضح الشكل 2B الاشتقاق الثاني لأطياف NIR لـ C. tubulosa، وقد لوحظت الاختلافات الكبيرة التي حدثت من ثلاث مناطق، 4000-4500 سم، و5000-5500 سم، و7000-7500 سم.

2.3. إنشاء نماذج المعايرة الكمية

يعد انحدار المربعات الصغرى الجزئية (PLSR) طريقة نمذجة كلاسيكية وقد تم تطبيقه على نطاق واسع في النماذج الكمية بسبب الجودة العالية للنتائج. وتشمل مزايا PLSR قدرته الجيدة على التنبؤ وبساطته النسبية. تم أيضًا تطبيق PLSR على نطاق واسع في إنشاء نماذج المعايرة الكمية لأشكال الطب الصيني التقليدي [25]. استناداً إلى أطياف NIR المعالجة، تم إنشاء نموذج تحليل كمي NIR للمكونات الستة الفعالة في C. tubulosa باستخدام طريقة PLSR مع بيانات تحليل HPLC كقيم حقيقية. تم تقسيم العينات الـ 116 بشكل عشوائي إلى مجموعات المعايرة والتحقق بنسبة 3:1. تم اختيار الظروف الأكثر ملاءمة للمعايرة من خلال انخفاض RMSEC ومعامل الارتباط العالي.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. اختيار النطاق الموجي لنماذج المعايرة

كان اختيار نطاق الموجة المناسب خطوة مهمة لبناء نموذج المعايرة. في هذه الدراسة، تمت مقارنة أطياف الفاصل الزمني NIR البالغة 4000–7500 سم−1 (موصى بها بواسطة برنامج محلل TQ) و4000–10000 سم−1. وقد لوحظ أن هذا النطاق غير مناسب للمعايرة عند الفاصل الزمني بين 4000 سم و7500 سم من الجدول 2. ومن ثم، في الدراسة الحالية، تم اختيار الفترات الطيفية للمكونات الكيميائية الستة جميعها من الفاصل الزمني من 4000 إلى 10000 سم من خلال مقارنة أداء RMSEC ومعامل الارتباط.

2.3.2. اختيار العدد الأمثل من العوامل لنماذج المعايرة

يشرح PLSR الحد الأقصى لمقدار التباين في البيانات عن طريق تقليل أبعاد بيانات الأطياف عن طريق حساب العوامل. ظهرت مشكلة "عدم الملاءمة" بسبب عدم كفاية المعلومات نتيجة لعدد محدود من العوامل؛ ومع ذلك، فإن اختيار العوامل الأكبر من القيم المثلى المقدمة في النموذج سيؤدي إلى مشكلة "التجهيز الزائد". إما أن يؤدي "نقص التجهيز" أو "التجهيز الزائد" إلى تقليل القدرة التنبؤية للنماذج القائمة [22]. ويبين الشكل 3 العلاقة بين RMSECV والعوامل لجميع المركبات الستة. ولذلك، اخترنا تلك العوامل المقابلة لأدنى قيم RMSECV. يتم سرد الاختيار الأمثل للعوامل لنماذج المعايرة في الجدول 3.

2.3.3. اختيار المعالجة الطيفية لنماذج المعايرة

هناك عامل مؤثر حاسم آخر لنماذج المعايرة وهو المعالجة الطيفية التي تهدف إلى تقليل تأثير التشتت والانجراف الأساسي، وتعزيز نسب الإشارة إلى الضوضاء، وإزالة الاختلافات غير المنتظمة. تم استخدام تصحيح الانتثار المضاعف (MSC) وطرق المتغير العادي القياسي (SNV) للقضاء على تأثير تشتت الإشعاع. لحل آثار الانجراف الأساسي، تمت مقارنة أطياف المشتق الأول والثاني وتم اختيار الاشتقاق الثاني. للحصول على التأثير المرغوب فيه، قمنا بتنعيم الأطياف باستخدام خوارزمية مرشح Savitzky-Golay (SG) قبل الاشتقاق لمنع تكبير الضوضاء. ويبين الجدول 3 المعلومات المتعلقة بالمعالجة الطيفية ونتائجها لنماذج المعايرة.

2.4. تقييم النماذج المعمول بها

يجب أن يحتوي نموذج معايرة NIRS الجيد على قيم RMSEC وRMSEP منخفضة، بالإضافة إلى معامل ارتباط مرتفع (r) وفروق صغيرة بين RMSEC وRMSEP. تم إنشاء نماذج المعايرة للمركبات الستة المختارة وفقًا للإجراءات المذكورة أعلاه (الجدول 3). كانت قيم RMSEC وr لمجموعة معايرة echinacoside هي 27.6 و0.9808 على التوالي. يتم سرد معلمات الأداء لنماذج المركبات الكيميائية الأخرى في الجدول 3، والتي يمكننا من خلالها أن نستنتج أن النماذج المحددة تظهر نتائج تنبؤ مرضية، ويمكن استخدامها للتحليل الكمي السريع لـ C. tubulosa. تظهر المخططات المبعثرة للمركبات الكيميائية الستة في الشكل 4 لجعل نماذج المعايرة أكثر وصفية وملاحظة بصريًا. كما هو مبين في الشكل 4، حدثت اختلافات طفيفة بين القيم التنبؤية والقيم المقاسة، لأن معظم النقاط تم توزيعها حول المنحنى التراجعي بمعادلة مثل y=x. ولذلك، لوحظت الأداء التنبؤي الممتاز في الشكل 4.

3. المواد والأساليب

3.1. إعداد عينة

تم جمع مائة وستة عشر عينة من C. tubulosa من ولاية هوتان في منطقة شينجيانغ ذاتية الحكم في الفترة من 2013 إلى 2015. تمت زراعة جميع العينات، ولكن تم جمعها في مراحل نمو مختلفة. تراوح الوزن الطازج للعينات من 20 جرام إلى 1000 جرام. بعد التجفيف بالشمس، تم سحق العينات المجففة وغربلتها من خلال منخل شبكي 60-.

3.2. جمع البيانات الطيفية NIR

تم جمع أطياف NIR للعينات بفاصل زمني قدره 8 سم على المنطقة الطيفية البالغة 4 000 -10000 سم باستخدام نظام Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific، Madison، WI، USA) المجهز بـ محول انعكاس الألياف الضوئية المحمول باليد. تم الحصول على كل طيف بمتوسط ​​64 عملية مسح. تم السماح لجميع العينات بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) قبل إجراء مسح أطياف NIR للتأكد من تحليل العينات عند نفس درجة الحرارة. تم الحفاظ على الرطوبة في المختبر عند المستوى المحيط.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين وظيفة الكلى PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. جمع بيانات HPLC

3.3.1. تحضير الاستخراج

تم استخلاص جرام واحد من مسحوق C. tubulosa مع 50 مل من 50% ميثانول في دورق مخروطي مع صوتنة فائقة (500 واط، 40 كيلو هرتز) لمدة 30 دقيقة. تم تخزين المستخلص عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم ترشيح المادة الطافية للمستخلص للحصول على عينة لتحليل HPLC.

3.3.2. التحديد المتزامن لـ Echinacoside وVerbascoside مع HPLC-UV

تم إجراء التحليل الكروماتوجرافي السائل على نظام Shimadzu UHPLC (شيمادزو، كيوتو، اليابان) الذي يتكون من وحدتي توصيل المذيبات LC-20ADXR، ومضخة LC-20AD، ومضخة SIL-20ACXR أوتوماتيكية جهاز أخذ العينات، وفرن عمود CTO-20AC، وكاشف SPD-M20A DAD، ومزيل الغاز DGU-20A3R، ووحدة تحكم CBM-20A.

تم الحفاظ على عمود Grace Prevail Carbohydra ES (150 × 2.1 مم، 2.7 مم) المستخدم في عمليات الفصل الكروماتوغرافي عند 35 درجة مئوية. يتكون الطور المتحرك من الأسيتونيتريل (A) و0.1% حمض الفورميك المائي (B) وتم تسليمه بعد برنامج التدرج على النحو التالي: 0–7 دقيقة، التدرج الخطي 10-20% أ؛ 7-15 دقيقة، 20% أ؛ و15-20 دقيقة، التدرج الخطي من 20-10% أ. وكان معدل تدفق الطور المتحرك 0.4 مل/دقيقة. تم إجراء مراقبة الأشعة فوق البنفسجية عند 330 نانومتر.

3.3.3. التحديد المتزامن للمانيتول والسكروز والجلوكوز والفركتوز باستخدام HPLC-ELSD

تم إجراء HPLC على نظام LC من سلسلة Agilent 1100 (بالو ألتو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) يتكون من جهاز إزالة الغاز G1322A، ومضخة رباعية G1311A، ووحدة أخذ عينات تلقائية G1311A، ووحدة تحكم في درجة حرارة العمود G1316A وكاشف G1315B DAD.

تم استخدام عمود Sigma Prevail Carbohydra ES (4.6 × 25 0 مم، 5 ميكرومتر) للفصل الكروماتوجرافي وتم الحفاظ عليه عند درجة حرارة عمود تبلغ 25 درجة مئوية. يتكون الطور المتحرك من الأسيتونيتريل والماء (77:23، حجم / حجم) وحليف إيزوقراطي يتم توفيره بمعدل تدفق قدره 0.7 مل / دقيقة. تمت مراقبة النفايات السائلة باستخدام كاشف تشتت الضوء التبخيري (ELSD) مع المعلمات الافتراضية.

3.4. معالجة البيانات

تم استخدام TQ Analyst (الإصدار 8.0، Thermo Scientific، Madison، WI، USA) لإجراء تقسيم مجموعات المعايرة والتحقق من الصحة، والمعالجة الرياضية المسبقة للأطياف، وإنشاء نماذج المعايرة، والحسابات الأخرى . تم استخدام الأصل (الإصدار 9.1) لعمل الأرقام.

4 - نتائج

في هذه الدراسة، اقترحنا طريقة سريعة وغير مدمرة للتحليل المتزامن للإشيناكوسيد، فيرباسكوسيد، مانيتول، السكروز، الجلوكوز، والفركتوزفيجيم توبولوسابواسطة NIRS. أظهرت تحليلات RMSEC ومعامل الارتباط وقيم RMSEP وRp أنه يمكن استخدام نماذج NIR الكمية المحددة للتنبؤ بدقة بمحتويات المكونات الفعالة الستة المختارة فيجيم توبولوسا. بالمقارنة مع HPLC، يمكن أن توفر طريقة NIRS المذكورة في هذه الدراسة قدرًا كبيرًا من العمل والوقت، مع الحفاظ على قدرة تحليل كمي مرضية. ولذلك، فإن الطريقة المذكورة هنا لديها القدرة على استخدامها في مراقبة الجودةجيم توبولوساوبالتالي توجيه تطوير تكنولوجيا الزراعة والعملياتجيم توبولوسا.

سيستانش توبولوسا الطبيعي لتحسين الوظيفة الجنسية PHGS75% ECH 30% ACT 12%