التأثير الواقي للكلية من Isoliquiritigenin على إصابات الكلى الحادة التي يسببها سيسبلاتين من خلال تثبيط FPR2 في البلاعم

لمزيد من المعلومات ، يرجى الاتصال بـ: ali.ma@wecistanche.com

تان روي زي وآخرون

انقر فوق Cistanche من أجل علاج أمراض الكلى

الملخص

إصابة الكلى الحاد (AKI) هو اختلاط خطير في المرضى ذوي الحالات الحرجة. أشارت الأدلة المتراكمة إلى أن البلاعم تلعب دورًا مهمًا في الالتهاباتإصابة الكلى الحادو إنزيم إيزولتيكويريتيجينين (ISL) يمكن أن يثبط الالتهاب البلعمي ، لكن دوره فيإصابة الكلى الحادوالآلية الأساسية غير معروفة. تهدف الدراسة الحالية إلى التحقيق في تأثير الحماية الكلوية لـ ISL على AKI ودور مستقبلات Formylpeptide 2 (FPR2) في هذه العملية. في هذه الدراسة ، تم استخدام نموذج AKI الناجم عن السيسبلاتين ونموذج الالتهاب الضامة الناجم عن عديد السكاريد الشحمي لإجراء التجارب في الجسم الحي وفي المختبر. وأظهرت النتائج أن ISL مرتاح بشدةإصابة في الكلىويثبط الالتهاب الكلوي في الجسم الحي ويثبط الاستجابة الالتهابية البلعمية في المختبر. الأهم من ذلك ، وجد أن FPR2 تم تنظيمه بشكل كبير مقارنة بمجموعة التحكم في الضامة التي يسببها AKI و LPS ، في حين تم قمعه بشدة بواسطة ISL. ومن المثير للاهتمام ، أن الإفراط في التعبير عن FPR2 مع تعداء PCDNA3. 1- عكس FPR2 بشكل فعال التأثير المضاد للالتهابات لـ ISL في البلاعم ، مما يشير إلى أن FPR2 قد يكون الهدف المحتمل لـ ISL لمنع الالتهاب وتحسينإصابة في الكلىمنإصابة الكلى الحاد. مجتمعة ، أشارت هذه النتائج إلى أن ISL تحسن الناجم عن السيسبلاتينإصابة في الكلىعن طريق تثبيط FPR2 ينطوي على التهاب بلعمي ، والذي قد يوفر خيارًا علاجيًا محتملاً لـ AKI.

1 المقدمة

بَصِيرالكلىالإصابة (AKI) هي نوع حاد شائع منالكلىالمرض مع ارتفاع معدل الوفيات 1 ويتميز بانخفاض سريع في وظائف الكلى يحدث في غضون 7 أيام أو أقل. أفادت المنشورات الحديثة أن نسبة الإصابة بالتهاب المفاصل الروماتويدي تصل إلى 5 في المائة من المرضى الداخليين و 30 في المائة من المرضى الحادة ، وAKIيسبب 2 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم كل عام ، والتي أصبحت مشكلة صحية عالمية. على الرغم من أن التعريف عادي وموحد ، يمكن أن يكون سبب القصور الكلوي الحاد هو مجموعة متنوعة من الأسباب ، بما في ذلك تناول الأدوية السامة للكلية ، وإصابة نقص التروية - ضخه (إصابة نقص التروية ، ضخه الدم ، IRI) ، الإنتان ، جراحة القلب والأوعية الدموية ، ارتفاع ضغط الدم ، والسكري. يزيد العمر والسكري وفشل القلب من خطر الإصابة بـ AKI ، مما يؤدي عادةً إلى مرض الكلى المزمن الذي لا رجعة فيه (CKD) وأمراض الكلى في نهاية المرحلة (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) في بعض المرضى .4 والجدير بالذكر أن الدراسات أظهرت أن جميع الخلايا المناعية تقريبًا متورطة في الالتهاب المناعي للكلية في AKI.5 من بينها ، ثبت أن الضامة تلعب دورًا مهمًا في تعزيز التهاب الكلى .6 حذف الضامة يحسن إصابة الكلى الكلوية والتهابات .7 لذلك ، قد يكون التثبيط الفعال للالتهاب البلاعم مفيدًا تحسين الأساليب العلاجية الحالية لإدارة القصور الكلوي الحاد.

Isoliquiritigenin (ISL) هو فلافونويد له بنية كالكون ، وهو متجذر في الطب العشبي الصيني التقليدي الشهير .8 في السنوات الأخيرة ، جذب اهتمامًا واسعًا من العلماء بسبب مضادات الأكسدة ، ومضاد الالتهاب ، ومضاد تراكم الصفائح الدموية ، ومضاد البكتيريا. ، مضاد للفيروسات ، مضاد للأورام ، وقائي للكبد ، وقائي للأعصاب ، وحماية القلب ، وخصائص إزالة السموم. وقد ثبت أن ISL يمنع تكاثر الخلايا ، ويقلل من أنواع الأكسجين التفاعلية ، ويحث الخلايا السرطانية على موت الخلايا المبرمج والنخرية وموتها إلى درجات مختلفة. أشارت التقارير إلى أن عقار إنزولتيكويريتجينين يمكن أن يثبط إنتاج IL -6 و TNF-a الناجم عن جزء LPS من LPS في RAW264.7 الضامة ويقلل من تكوين مركب LPS-TLR4 / MD -2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ ISL تحفيز موت الخلايا المبرمج لخلايا HepG2 من خلال مسارات إشارات MAPK و STAT3 و NF-kB بوساطة ROS. كما أظهرت الأدلة التجريبية أن ISL تحفز التنشيط الجوهري بوساطة ROS وتنشط آلية بروتين سيتوكوندريا سيتوكروم سي سيستين. من موت الخلايا المبرمج للكمبيوتر الشخصي -12. تجدر الإشارة إلى أن ISL غالبًا ما يستخدم كمكمل غذائي للنساء. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ISL له تأثير كبير مضاد للالتهابات على القصور الكلوي الحاد ، لكن آلية العمل المحددة لا تزال غير واضحة.

وجد بحث سابق من فريقنا أن Mincle ، وهو نوع C من النوع C الناجم عن الضامة ، هو مستقبل التعرف على الأنماط عبر الغشاء المتورط في التهاب الكلى ، 13 من خلاله ، قمنا بفحص مستقبلات الببتيد الفورميل 2 (FPR2) التي لها علاقة معينة مع Mincle من قاعدة بيانات GEO. ومع ذلك ، لم يتم التحقق من دورها في أمراض الكلى الحادة. FPR2 هو جين مشفر للبروتين ينتمي إلى عائلة المستقبلات المقترنة بالبروتين G ويحتوي على 351 من بقايا الأحماض الأمينية. الانجذاب الكيميائي الخلوي ، والالتصاق الخلوي ، اللذان يرتبطان ارتباطًا وثيقًا بحدوث وتطور أمراض مختلفة .16 يصل تماثلها مع FPR1 و FPR3 إلى 69 بالمائة و 83 بالمائة. يتم توطين الخلايا الفرعية FPR2 في غشاء الخلية وهي بروتينات غشاء متعددة التمريرات. يتم التعبير عنها بشكل رئيسي في العدلات ، الحمضات ، الخلايا الوحيدة ، الخلايا الظهارية ، الخلايا الليفية ، الخلايا الدبقية ، الخلايا ميسانجيال ، إلخ ، موزعة في أعضاء مختلفة مثل الرئة والطحال والكبد. بشكل ملحوظ ، يتم التعبير عن FPR2 بكثرة في الخلالي الكلوي ، 17 حيث توجد الخلايا الالتهابية. تتمثل الوظيفة الرئيسية لـ FPR2 في الجمع بين بعض الوسائط المعززة للتحلل المتخصصة (SPM) للتوسط في نشاط هذه المستقلبات في قمع الالتهاب والقضاء عليه. ومع ذلك ، لا يزال دور FPR2 في التهاب القصور الكلوي الحاد وما إذا كان يمكن استخدامه كهدف للتدخل الدوائي غير معروف.

في هذه الدراسة الحالية ، استخدمنا نموذج AKI للفأر الناجم عن عقار سيسبلاتين السام للكلية ونموذج الخلية الالتهابية المستحثة بـ LPS لاستكشاف تأثير تحسين ISL على إصابة والتهاب الكلى في AKI ، وكذلك الدور الرئيسي لـ FPR2 في التهاب الكلى و ISL علاج التهاب المفاصل الروماتويدي. ستوفر هذه الدراسة اتجاهات جديدة لفهم آلية الإصابة الالتهابية واستراتيجيات علاج القصور الكلوي الحاد.

2. المواد والأساليب

2.1. المخدرات

Isoliquiritigenin (purity>98 في المائة) مركب إيسوفلافون مستخرج من جذر عرق السوس. صيغته الجزيئية هي C15H12O4. في هذه الدراسة ، تم شراء إنزولتيكويريتيجينين من Chengdu Bio Purify Phytochemicals Ltd. (BP0787) ، المذاب في 10 بالمائة DMSO (ST038 ، Beyotime ، الصين) ، وتم إعطاء الفئران التي يسببها السيسبلاتين داخل المعدة بجرعة 7.5 مجم / كجم و 30 مجم. / كجم على التوالي.

2.2. عزل BMDM

تم اختيار ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 6e8 أسابيع لعزل خلايا BMDM. افصل بعناية عظم الساق الخلفية عن عظم الفخذ وقم بإزالة العضلات المتصلة. طحن العظام في برنامج تلفزيوني بقذائف الهاون حتى يتغير لون العظام من الأحمر إلى الأبيض. بعد ذلك ، قم بجمع المادة الطافية والمرشح من خلال مصفاة 70 ، متبوعًا بالطرد المركزي عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تم تكسير كريات الدم الحمراء في سائل مفلتر باستخدام PBS 10 - ، والذي تم ترشيحه بعد ذلك على مصفاة خلية 40 مم. احتضان الخلايا التي تم الحصول عليها في طبق ثقافة 10 سم والحث مع 30 في المئة L929 طاف لمدة 7 أيام. تم تحفيز خلايا BMDM بـ 100 نانوغرام / مل LPS لبناء نموذج الخلية الالتهابية.

2.3 الضربة القاضية والإفراط في التعبير عن FPR2 في BMDM

تم تنظيم FPR2 عن طريق ترنسفكأيشن باستخدام Zeta LifeAdvanced Transfection Reagent (AD600050، Zeta life، USA) وFPR2 siRNA إلى BMDM (تسلسل FPR2 siRNA: Sense، 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT {{7 }A-AUAUAC، 5'AUAUAC CAUCUCCTT -3 ". Sangon Biotech ، الصين). وبالمثل ، تم نقل pcDNA3. 1- FPR2 بلازميد (تم إنشاؤه بواسطة Fenghui Biotech ، الصين) إلى BMDM باستخدام ZETA لإفراط في التعبير عن FPR2 في الخلايا.

2.4 التجارب على الحيوانات

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للإرشادات الصادرة عن لجنة الأخلاقيات بجامعة ساوث ويست الطبية. تم شراء 32 فئران C57BL / 6 من الذكور من ChengduDaShuo Animal Co. ، Ltd ، والتي تم تقسيمها عشوائيًا إلى 4 مجموعات: مجموعة الشام ، مجموعة نموذجية (مجموعة AKI التي يسببها سيسبلاتين) ، مجموعة جرعات منخفضة من ISL (7.5 مجم / كجم ، المجموعة L) ، ومجموعة الجرعات العالية (30 مجم / كجم ، المجموعة H). تم حقن المجموعة النموذجية بـ 20 مجم / كجم سيسبلاتين (P4394 ، سيجما الدريش ، الولايات المتحدة الأمريكية) في اليوم الأول ، بينما أعطيت المجموعة ذات الجرعة المنخفضة 7.5 مجم / كجم ISL وأعطيت المجموعة العالية 30 مجم / كجم ISL لمدة 3 أيام . بعد 3 أيام ، تم جمع مصل الدم والكلى من الفئران التي تم التضحية بها.

2.5 اختبار وظائف الكلى

بعد جمع مصل كل مجموعة من الفئران ، اتبع بدقة تعليمات المجموعات لاكتشاف مستويات كرياتينين المصل (C 011-2-1 ، Jiancheng Biotech ، الصين) ونيتروجين اليوريا (C 013-2-1 ، Jiancheng Biotech ، الصين).

2.6. تلطيخ مرضي

تلطيخ H&E: قسم إزالة الشمع بشكل روتيني وإعادة التميؤ ، تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، شطف ماء RO ، فصل الكحول بحمض الهيدروكلوريك بنسبة 1 في المائة لمدة ثانيتين ، شطف ماء الصنبور ، غمر الإيثانول بنسبة 75 في المائة لمدة 2 ثانية ، 1 في المائة يوزين قابل للذوبان في الكحول لمدة 30 ثانية ، شطف ماء الصنبور ، إيثانول 100 في المائة يجف لمدة دقيقة واحدة ، جاف ، زيلين شفاف لمدة 10 دقائق ، جاف ، محكم الإغلاق بوسط بلسم محايد (36313ES60 ، يبسن ، الصين).

تلطيخ PAS: تم وضع الشرائح في محلول حمضي دوري عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5e8 دقيقة ، ثم شطفها مرتين بماء RO. بعد ذلك ، ضع هذه الشرائح في كاشف شيف لمدة 10e20 دقيقة ، وشطفها بماء الصنبور لمدة 10 دقائق ، وملطخة بالهيماتوكسيلين لمدة 1e2 دقيقة ، ومجففة وشفافة في كحول 100٪ ، وجافة ، ومحكمة الإغلاق بوسط بلسم محايد.

2.7. المناعي

ضع أقسام الأنسجة المجمدة في برنامج تلفزيوني ، واغسل مرتين ، ثم إصلاحها بنسبة 10 في المائة من الفورمالديهايد لمدة 10 دقائق. تم حظر الأنسجة الموجودة على الأقسام باستخدام مصل الماعز بنسبة 5 في المائة لمدة 30 دقيقة ، متبوعًا باحتضانها بمضاد الفئران الأساسي FPR2 (1: 200 ، sc -57141 ، سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومضاد الفئران F4 / 80 الأجسام المضادة (1: 200 ، sc -52664 ، سانتا كروز ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 4 - درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل المقاطع مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، واحتضانها بجسم مضاد ثانوي (1: 200) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، وصبغ النواة باستخدام DAPI. تم التقاط الصور بواسطة نظام EVOS.

2.8. إليسا

تم تحليل تركيز IL -1 b ، IL -6 ، TNF-a في المصل والطاف الخلوي باستخدام ELISA Kits (EMC001B ، EMC004 ، EMC102A ، Neobioscience ، الصين) وفقًا لتعليمات المجموعة.

2.9 RealTime-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي (تيانجين ، الصين) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بعد النسخ العكسي للـ RNA المستخرج إلى cDNA ، إضافته إلى نظام تفاعل 1 0 مل لأداء PCR في الوقت الفعلي بواسطة نظام Roche LightCycler 48 0 ونظام التفاعل على النحو التالي: Eastep® qPCR MasterMix 2 - ، 5 مل ؛ قالب كدنا ، 1 مل ؛ التمهيدي المنبع (10 ملم) ، 0.5 مل ؛ التمهيدي المصب (10 ملم) ، 0.5 مل ؛ مياه خالية من نوكلياز ، 3 مل. تم تصنيع الاشعال المستخدمة في هذه التجربة بواسطة Sangon (شنغهاي ، الصين) ، ويتم سرد تسلسل جميع الاشعال في الجدول 1.

2.10. لطخة غربية

تم استخدام محلول تحلل RIPA لاستخراج البروتين من أنسجة الكلى وخلايا BMDM. بعد حل البروتين في 10 في المائة من SDS-PAGEgel ونقله إلى غشاء PVDF ، سد الغشاء في 5 في المائة من مساحة سطح الجسم لمدة ساعة واحدة وغسله باستخدام TBST 3 مرات ، متبوعًا باحتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية عند درجة حرارة 4 - مئوية طوال الليل (تم تحضيره) مع 5 بالمائة من مساحة سطح الجسم ، 1: 1000). بعد ذلك ، تم تحضين الأغشية بالأجسام المضادة الثانوية (Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG (ZB -2305 ، 1: 3000) ، Goat anti-Rabbit IgG (ZB -2301 ، 1: 3000)) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم التقاط الصور بواسطة نظام التصوير الهلامي (BIORAD ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب كثافة اللون الرمادي للنطاقات بواسطة برنامج Image J.

2.11. تحليل احصائي

تم عرض النتائج على أنها تعني ± الانحراف المعياري. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا بمقارنة متعددة مع اختبار LSD باستخدام برنامج SPSS 21. 0. تم اعتبار P <0. 05="" ذات="" دلالة="" إحصائية.="" كل="" مجموعة="" من="" التجارب="" تتكرر="" 3="">

3. النتائج

3.1. يحسن Isoliquiritigenin إصابة الكلى التي يسببها السيسبلاتين ويثبط التهاب الكلى

للتحقيق في التأثيرات الواقية للكلية والمضادة للالتهابات من إنزيمولتيكويريتجينين في AKI ، اكتشفنا مستويات كري و BUN في المصل لكل مجموعة ، وكذلك تعبير وإفراز السيتوكين الالتهابي بواسطة PCR في الوقت الحقيقي و ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس أمراض الكلى عن طريق تلطيخ H&E و PAS. أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المجموعة الطبيعية ، زادت مستويات كري و BUN في مصل الدم في نموذج AKI ، بينما أدت المعاملة بـ 7.5 مجم / كجم أو 30 مجم / كجم من ISL إلى انخفاض كبير في مستويات مصل Cre و BUN ، من بينها ، 30 مجم / كجم للجرعة أفضل تأثير علاجي (الشكل 1 أ و ب). والجدير بالذكر أن 30 مجم / كجم من ISL يمكن أن يحسن التلف الأنبوبي الكلوي وفقًا لنسبة النخر الأنبوبي المقدر (الشكل 1C). أظهرت نتائج ELISA و PCR أن إفراز IL -1 b و IL -6 و TNF-a قد قلل من التنظيم بعد تدخل ISL (7.5 مجم / كجم و 30 مجم / كجم) وتعبير mRNA من IL -1 b و IL -6 و TNF-a تم تخفيضها بشكل ملحوظ أيضًا عن طريق إعطاء 30 مجم / كجم من ISL (الشكل 1DeI). من ناحية أخرى ، أظهرت نتائج تلطيخ H&E و PAS أن الكلى في مجموعة AKI تسبب تلفًا أنبوبيًا كلويًا شديدًا ، وسفك ظهارة كلوية ، وخلايا ميسانجيل وتضخم خلالي مسراق ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، بشكل مدهش ، 30 مجم / كجم من ISL يمكن أن يعكس بشكل فعال إصابة الكلى في AKI (الشكل 1J). أظهرت جميع النتائج أن إعطاء 7.5 مجم / كجم و 30 مجم / كجم ISL يمكن أن يحسن من إصابة الكلى التي يسببها السيسبلاتين ويمنع التهاب الكلى ، حيث يكون لـ 30 مجم / كجم ISL أفضل تأثير.

3.2 قلل Isoliquiritigenin من التعبير عن FPR2 في الضامة لفئران AKI

أشارت الكثير من التقارير السابقة إلى أن FPR2 يلعب دورًا حيويًا في الاستجابة المناعية والأمراض المرتبطة بالالتهابات. ومع ذلك ، فإن التأثير المحتمل لـ FPR2 في كلية القصور الكلوي الحاد غير معروف. في هذه الدراسة ، أجرينا التألق المناعي لتحديد موقع FPR2 والضامة (F4 / 80 ، صانع الضامة). أظهرت النتائج أن الضامة (البقع الخضراء) تم اختراقها بشكل كبير في كلية فئران AKI ، وفي الوقت نفسه ، تم تحديد موقع FPR2 (بقع حمراء) مع F4 / 80 ، مما يوضح أن FPR2 تم التعبير عنه بشكل أساسي على البلاعم وكان مستوى FPR2 بشكل كبير زيادة في الكلى من الفئران AKI (الشكل 2 أ). اكتشفنا أيضًا التعبير عن FPR2 mRNA والبروتينات المرتبطة بالالتهاب عن طريق PCR في الوقت الفعلي والنشاف الغربي في الكلى ، وأظهرت النتائج أن 30 مجم / كجم من ISL يمكن أن تقلل بشكل فعال من مستويات الرنا المرسال والبروتين في FPR2 في الكلى لفئران AKI مقارنة مع 7.5 ملغم / كغم من مجموعة ISL (الشكل 2 ب ، ز ، ح). الأهم من ذلك ، أظهرت نتائج النشاف الغربي أن 30 مجم / كجم من ISL أعاقت أيضًا تنشيط p -65 وقللت مستويات البروتين في TNF-a و IL -6 و IL {{28} } ب في كلية الفئران AKI (الشكل 2CeF). تشير جميع البيانات المذكورة أعلاه إلى أن ISL يخفف الالتهاب الكلوي لفئران AKI قد يرتبط بتقليل التعبير عن FPR2 في الضامة.

3.3 قمع Isoliquiritigenin تعبير وإفراز FPR2 والسيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM التي يسببها LPS

لمزيد من الكشف عن تأثيرات ISL على خلايا BMDM المستحثة بـ LPS ، قمنا بفحص مستوى mRNA لـ FPR2 والتعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS بعد إدارة ISL بواسطة PCR في الوقت الحقيقي و ELISA. أظهرت النتائج أن ISL خفض مستوى الرنا المرسال لكل من FPR2 و IL -1 b و IL -6 و TNF-a (الشكل 3AeD) ، بالإضافة إلى إفراز IL -1 ب و IL -6 و TNF-a في طاف خلوي في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS (الشكل 3EeG). تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أن معالجة ISL بتركيز 40 ملي مولت بشدة الالتهاب في خلايا BMDM التي يسببها LPS.

3.4. قلل Isoliquiritigenin مستويات البروتين لـ FPR2 والسيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS

اكتشفنا أيضًا مستويات البروتين لـ FPR2 والسيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS بعد إعطاء ISL عن طريق النشاف الغربي. أظهرت البيانات أنه مقارنة بالمجموعة الضابطة ، زادت مستويات البروتين لـ FPR2 و p-p65 و IL -6 و TNF-a بشكل ملحوظ في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS ، وانخفضت بشدة باستخدام 40 ملي مولار من إدارة ISL ( الشكل 4AeE). أوضحت هذه النتائج أيضًا أن ISL يمكن أن يثبط تنشيط NF-kB ويقلل من تنظيم مستويات البروتين من السيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM التي يسببها LPS.

3.5 تثبيط FPR2 قمع الالتهاب الناجم عن LPS في خلايا BMDM

لاستكشاف دور FPR2 في التهاب البلاعم ، استخدمنا siRNA لضرب FPR2 في خلايا BMDM. أظهرت النتائج أن تعداء siRNA يمكن أن تثبط بشكل كبير التعبير عن FPR2 في الضامة المستحثة بـ LPS (الشكل 5 أ) ، وتقلل بشكل فعال من تعبير IL -1 b و TNF-a (الشكل 5 ب و ج). بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت نتائج اللطخة الغربية أنه بعد تعداء siRNA ، تم تثبيط مستوى البروتين في FPR2 بشكل كبير ، بغض النظر عما إذا كان قد تم تحفيزه بواسطة LPS (الشكل 5D و E). والجدير بالذكر أن هدم FPR2 قلل بشكل كبير من مستويات البروتين في السيتوكينات الالتهابية وأعاق نشاط إشارات NF-kB (الشكل 5FeK) ، مما يشير إلى أن FPR2 يلعب دورًا مهمًا في تعزيز الاستجابة الالتهابية في البلاعم. أيضًا ، قد يكون الهدف الرئيسي لـ ISL هو منع التهاب البلاعم.

3.6 أدى الإفراط في التعبير عن FPR2 إلى مواجهة التأثير المضاد للالتهابات لعقار إيزليكويريتجينين في خلايا BMDM التي يسببها LPS

لتحديد أن ISL يثبط الالتهاب في AKI من خلال تثبيط FPR2 في البلاعم ، استخدمنا FPR2 overexpression plasmid لزيادة تنظيم التعبير عن FPR2 في خلايا BMDM الالتهابية المعالجة بـ ISL. كما هو مبين في الشكل 6 ، تمت زيادة مستوى البروتين و mRNA لـ FPR2 بشكل كبير في PCDNA3. 1- مجموعة FPR2 المنقولة (الشكل 6 أ ، ب ، ز) ، وألغى الإفراط في التعبير عن FPR2 بشكل فعال التأثير المثبط لـ 40 mM ISL عند تنشيط p65 ومستويات البروتين لـ IL -1 b و IL -6 و TNF-a في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS (الشكل 6CeF). وبالمثل ، أزال التنظيم الأعلى لـ FPR2 التأثير القمعي لـ 40 ملي ISL على التعبير وإفراز السيتوكينات الالتهابية في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS ، مثل IL -1 b و IL -6 و TNF-a (الشكل 6HeM) ، مما يشير إلى أن ISL قلل الالتهاب في خلايا BMDM المستحثة بـ LPS عن طريق تثبيط FPR2.

4. مناقشة

تعد إصابة الكلى الحادة أحد الأمراض السريرية الشائعة. عادة ما يؤدي إلى ضعف وظيفة المناعة لدى المرضى في فترة قصيرة. في حالات الإصابة بفقدان الدم ، وتلف الأعضاء ، والصدمة ، تكون الكلى هي العضو الأكثر حساسية وعرضة للتطور إلى إصابة حادة. كهدف تدخل محتمل لعلاج القصور الكلوي الحاد. في السنوات الأخيرة ، حققت الأدوية الصينية تقدمًا هائلاً في علاج الالتهاب ، بما في ذلك الكركمين ، والكيرسيتين ، والنارينجين ، ومونومرات أخرى. Iso-Liquiritigenin هو مركب فلافونويد ، له العديد من الأنشطة البيولوجية ، مثل مضادات الالتهاب ، ومضاد الجذور الحرة ، ومضاد الأورام ، وتأثيرات أخرى. 21 وجدت الدراسات السابقة أن ISL يثبط موت الخلايا المبرمج ، والالتهاب ، وإنتاج المصفوفة خارج الخلية في الأنجيوتنسين. خلايا HK -2 المستحثة II. 22 أظهرت دراسات من Wu Yangping أن ISL يمكنه تقليل تنظيم IL {11}} و IL -8 عن طريق تثبيط نشاط NF-kB في نموذج الصدفية ، مما يشير إلى قد يكون ISL مرشحًا لعلاج الصدفية وأمراض التهابات المناعة الذاتية الأخرى .23 من ناحية أخرى ، أظهرت دراسة حديثة أن ISL يمكن أن يخفف من التهاب المفاصل الروماتويدي الإنتاني عن طريق قمع إزاحة NF-kB p65 وتثبيط الاستجابات الالتهابية .24 في هذه الدراسة ، نحن وجد أن ISL يمكن أن يحسن بشكل فعال وظائف الكلى في الفئران التي يسببها السيسبلاتين AKI ، ويقلل من تلف الكلى ، ويمنع التهاب الكلى. ومع ذلك ، فإن الآلية الدقيقة لتثبيط التهاب ISL غير واضح.

ينتمي FPR2 إلى عائلة المستقبلات الكيميائية وهو مستقبلات مقترنة بالبروتين G من 7 مرات عبر الغشاء. وجدت الدراسات السابقة أن FPR2 متورط في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، بما في ذلك الاستجابات الدفاعية ، والالتهابات ، والأمراض التنكسية العصبية ، والأورام ، والاضطرابات المتعلقة بأيض الجلوكوز والدهون. والبروستاغلاندين E2 في العملية الالتهابية التي قد تلعب دورًا مضادًا للالتهابات ومحفزًا للالتهابات. 27،28 تعتمد التأثيرات المختلفة لـ FPR2 على الالتهاب على البيئة والروابط التي تنشط مسارات الإشارات المختلفة. يتم التعبير عن FPR2 بشكل رئيسي في الضامة في الخلالي الكلوي ، ويتم التعبير عنها بشكل كبير في كلية الفئران الناجم عن السيسبلاتين ، مما يشير إلى أن FPR2 في البلاعم قد يكون متورطًا في الاستجابة الالتهابية للبلاعم في الكلى AKI. أكدت أدلة متزايدة أن عددًا كبيرًا من البلاعم تسلل إلى الكلى في غضون ساعات قليلة بعد حدوث التهاب المفاصل الروماتويدي ، وتسبب في تفاقم تلف الكلى من خلال الاستجابة للالتهاب. يكون اتجاهًا مهمًا لتحسين AKI ، وما إذا كان FPR2 متورطًا في هذه العملية غير معروف.

أظهرت نتائجنا التجريبية أن العلاج بجرعة منخفضة وعالية من ISL في فئران AKI التي يسببها السيسبلاتين ، لا يمكن فقط تحسين بنية الكلى ووظيفتها ، ولكن أيضًا تقليل مستوى السيتوكينات الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لـ ISL خفض مستوى البروتين في FPR2 ونشاط p65 بشكل فعال. نظرًا لأن FPR2 يتم التعبير عنه بشكل أساسي في البلاعم ، فإنه يشير إلى أن ISL قد يحسن التهاب الكلى عن طريق تثبيط FPR2 في البلاعم. نظرًا للدور المهم للبلاعم المتسللة في التهاب الكلى ، قمنا بعد ذلك باستخراج الضامة الأولية المشتقة من نخاع العظم للكشف في المختبر عن تأثير تحسين ISL على التهاب الضامة والآلية المحتملة. أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن ISL يمكن أن يثبط بشكل كبير التهاب البلاعم الناجم عن LPS ويقلل من تنظيم تعبير وإفراز العوامل الالتهابية IL -1 b و IL -6 و TNF-a. في الوقت نفسه ، يمكن لـ ISL أيضًا تقليل مستوى البروتين للجزيئات الالتهابية في البلاعم وتثبيط تعبير mRNA ومستويات البروتين لـFPR2 التي يحفزها LPS. للتحقق من الدور الرئيسي لتثبيط FPR2 للالتهاب باستخدام ISL ، استخدمنا pcDNA3. 1- FPR2 بلازميد لإفراط في التعبير عن FPR2 ووجدنا أنه في البلاعم الالتهابي المُعالج بـ ISL ، فإن الإفراط في التعبير عن FPR2 يحيد التأثير المثبط لـ ISL على الالتهاب ، مما يشير إلى أن التهاب الضامة الخاضع للتنظيم ISL يتم بشكل أساسي من خلال تثبيط FPR2. بشكل ملحوظ ، استخدمنا نموذج AKI الناجم عن السيسبلاتين في الجسم الحي واخترنا نموذج الخلية الالتهابية التي يسببها LPS في المختبر. على الرغم من أن الكواشف التحريضية للنموذجين ليست متسقة ، فإن هاتين الطريقتين معترف بهما حاليًا لبناء نماذج التهاب في الجسم الحي وفي المختبر ، على التوالي. بالنظر إلى أن هذا البحث يركز على الاستجابات الالتهابية ، فمن الممكن استخدام هاتين الطريقتين في دراسة واحدة.

أثبتت هذه البيانات أن ISL يمكن أن يقلل بشكل فعال من التعبير عن العوامل الالتهابية في الجسم الحي وفي المختبر ، ويمكن تحقيقه عن طريق تثبيط التعبير عن FPR2. وبالتالي قد يكون ISL بمثابة دواء علاجي محتمل لـ AKI.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال مشروع Luzhou - Southwest MedicalUniversity المشترك (2017LZXNYD-P01 و 2018LZXNYD-PT03) ، والمشروع المشترك لمستشفى الطب التقليدي التابع للجامعة الطبية الجنوبية الغربية (2018XYLH -034) ، وهو مشروع بناء مختبر مقاطعة سيتشوان الرئيسي في الطب (2018 # 53) ، مشروع Luzhou للعلوم والتكنولوجيا (2020- JYJ -56) والمنحة الخاصة المشتركة لجامعة Luzhou Municipal - Southwest Medical لتقديم المواهب عالية المستوى (فريق Lan Hui-Yao ).

مراجع

1. Soares DB ، Mambrini JVM ، Botelho GR ، Girundi FF ، Botoni FA ، Martins MAP. العلاج بالعقاقير والعوامل الأخرى المرتبطة بتطور إصابة الكلى الحادة في المرضى المصابين بأمراض خطيرة: دراسة مقطعية.بيرج. 2018 ؛ 6: e5405. e-pub قبل طباعة 2018/08/22.

2. Sato Y، Yanagita M. الخلايا المناعية و in الذخيرة في AKI لتقدم CKD.أنا J Physiol Ren Physiol. 2018 ؛ 315 (6): F1501eF1512. e-pub قبل طباعة 2018/08/30.

3. Ram P ، Mezue K ، Pressman G ، Rangaswami J. إصابة الكلى الحادة بعد استبدال الصمام الأورطي عن طريق القسطرة.كلين كارديول. 2017 ؛ 40 (12): 1357e1362. e-pub قبل طباعة 2017/12/19.

4. YH H ، IJ C ، YF L ، YJ C ، YH L ، HW C. يساهم اللاكتوفيرين في التأثير الوقائي في إصابة الكلى الحادة والتليف الكلوي المبكر.المستحضرات الصيدلانية. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A، Singbartl K. مراجعة لدور الخلايا المناعية في إصابة الكلى الحادة.بيدياتر نيفرول. 2018 ؛ 33 (10): 1629e1639. e-pub قبل طباعة 2017/08/13.

6. Li J ، Tang Y ، Tang PMK ، وآخرون. يحمي منع العامل المثبط لهجرة البلاعم من إصابة الكلى الحادة التي يسببها سيسبلاتين في الفئران.مول هناك. 2018 ؛ 26 (10): 2523e2532. e-pub قبل طباعة 2018/08/06.

7. Ferenbach DA، Sheldrake TA، Dhaliwal K، et al. البلاعم / استنفاد الوحيدات عن طريق الكلودرونات ، ولكن ليس ذيفان الخناق ، يحسن الإصابة بنقص التروية الكلوية / إعادة التروية في الفئران.الكلى Int. 2012 ؛ 82 (8): 928e933. e-pub قبل طباعة 2012/06/08.

8. JQ ، JC ، BM ، وآخرون. يمنع Isoliquiritigenin تصلب الشرايين عن طريق منع تعبير قناة TRPC5.علاجات القلب والأوعية الدموية. 2020;2020:1926249.

9. YG ، XL ، HY ، LP ، X C. يمارس Isoliquiritigenin تأثيرات مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات عن طريق تنشيط مسار KEAP -1 / Nrf2 وتثبيط مسارات NF-kB و NLRP3 في ذات الجنب الناجم عن الكاراجينان.غذاء& وظيفة. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS ، XY ، XY ، YW ، Q Z. يحفز Isoliquiritigenin موت الخلايا المبرمج لسرطان المثانة البشري T24 عبر آلية كيناز تعتمد على السيكلين.رسائل الأورام. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR ، Luo YH ، Piao XJ ، وآخرون. الآليات الكامنة وراء موت الخلايا المبرمج الناجم عن الانزلايكوريتيجينين وتوقف دورة الخلية عبر مسارات MAPK / STAT3 / NF- kappaB بوساطة ROS في خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية.تطوير المخدراتالدقة. 2019 ؛ 80 (4): 461e470. e-pub قبل طباعة 2019/01/31.

12. AH ، CS ، YY ، وآخرون. تقييم النشاط الاستروجين لأنواع عرق السوس بالمقارنة مع القفزات المستخدمة في النباتات لأعراض انقطاع الطمث.بلوسواحد. 2013;8(7):e67947.

13. LL L ، PM T ، CJ L ، وآخرون. يعتبر مستقبل التعرف على الأنماط ، Mincle ، ضروريًا للحفاظ على النمط الظاهري للبلاعم M1 في حالة الكلى الحادة في الذروة.الكلى Int. 2017;91(3):587e602.

14. شرودر ن ، شافراث أ ، ويلتر جا وآخرون. يحسن تثبيط مستقبلات الببتيد الفورميل النتيجة في نموذج فأر لمرض الزهايمر.Jالتهاب الأعصاب. 2020 ؛ 17 (1): 131. e-pub قبل طباعة 2020/04/26.

15. Neymeyer H ، Labels R ، Reverte V ، وآخرون. تنشيط إشارات الملحق A1 في الخلايا الصخرية الكلوية يؤدي إلى تأثيرات مضادة للالتهاب.اكتا فيسيول. 2015 ؛ 215 (3): 144e158. e-pub قبل طباعة 2015/09/04.

16. FC ، MP ، R A. سلاسل إشارات مميزة ناتجة عن ناهضات مستقبلات الببتيد 2 (FPR2) المختلفة.كثافة العمليات J مول علوم. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW ، XP ، YG ، وآخرون. مركب مشتق من الجانوديرما- أ يمارس تأثيرًا مثبطًا من خلال مستقبل الببتيد الفورميل 2.فارماكول الجبهة. 2020;11:337.

18. وانغ واي ، تساي جي ، تانغ سي ، دونغ ز. ميتوفاجي في إصابات الكلى الحادة وإصلاح الكلى.الخلايا. 2020 ؛ 9 (2). e-pub قبل طباعة 2020/02/07.

19. Sato Y ، Takahashi M ، Yanagita M. الفيزيولوجيا المرضية لتطور AKI إلى CKD.سيمين نفرول. 2020 ؛ 40 (2): 206e215. e-pub قبل طباعة 2020/04/19.

20. Ronco C ، Bellomo R ، Kellum JA. إصابة الكلى الحاد.لانسيت. 2019 ؛ 394 (10212): 1949 هـ 1964. e-pub قبل طباعة 2019/11/30.

21. PZ ، HM J ، JW Z ، وآخرون. التأثير الوقائي لعقار إنزيمولتيكويريتجينين ضد الإصابة الدماغية في الفئران الإنتانية عن طريق التوهين لـ NF-kB.فيflاموفارماكولوجي. 2019;27(4): 809e816.

22. DX، WH، ST Y، YS T. Isoliquiritigenin خفف من إصابة الكلى المفرطة التوتر التي يسببها Ang II من خلال قمع السيتوكينات الالتهابية والموت الخلايا المبرمج الناتج عن الإجهاد التأكسدي عبر مسارات Nrf2 و NF-kB.Biochem BiophysRes Coممun. 2018;506(1):161e168.

23. YW ، XC ، XG ، وآخرون. يمنع Isoliquiritigenin تطور الأعراض الشبيهة بالصدفية عن طريق تثبيط السيتوكينات النمائية NF-kB والبروين.J مولميد(بيرل). 2016;94(2):195e206.