كشف وتوصيف الجسيمات النانوية المعدنية العضوية في الكلى البشرية

تسوي يين وونغ^1,2,*، تشنغ يو وو^1,2,3,* وآخرون

يرتبط التكلس خارج الرحم بأمراض بشرية مختلفة ، بما في ذلك تصلب الشرايين والسرطان ،مزمنالكلىمرض، وداء السكريدخان. على الرغم من اكتشاف الجسيمات النانوية المعدنية في الأوعية الدموية المتكلسة ، إلا أن طبيعة ودور هذه الجسيمات في جسم الإنسان لا تزال غير واضحة. هنا نظهر لأول مرة ذلك الإنسانالكلىالأنسجة التي تم الحصول عليها من المرحلة النهائيةمزمنالكلىمرضأو مرضى سرطان الكلى يحتويون على جسيمات معدنية دائرية متعددة الطبقات تتراوح من 50 إلى 1500 نانومتر ، بينما لا توجد جزيئات في الضوابط الصحية. تم العثور على الجسيمات المعدنية بشكل رئيسي في المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأنابيب الملتفة ، وقنوات جمع وحلقات Henle وكذلك داخل السيتوبلازم لخلايا تحديد الأنابيب ، وتتكون من فوسفات الكالسيوم متعدد البلورات المشابهة للمعادن الموجودة في العظام والتكلسات خارج الرحم. الالكلىتحتوي الجسيمات النانوية المعدنية على العديد من بروتينات المصل التي تمنع التكلس خارج الرحم في سوائل الجسم ، بما في ذلك الألبومين ، والفيتوين A ، والبروتين البروتيني A1. نظرًا لأن الجسيمات النانوية المعدنية العضوية توجد ليس فقط داخل الرواسب المتكلسة ولكن أيضًا في المناطق الخالية من التكلسات المجهرية ، تشير ملاحظاتنا إلى أن الجسيمات النانوية قد تمثل سلائف التكلس وحصى الكلى في البشر.

اتصال:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساب: 008618081934791

يرتبط التكلس خارج الرحم بتصلب الشرايين والسرطانمزمنالكلىمرض، وداء السكري 1-3. تشير الدراسات الحديثة إلى أن تصلب الشرايين ومزمنالكلىمرضيُظهر المرضى الذين يعانون من علامات تكلس الأوعية الدموية زيادة في مخاطر المراضة والوفيات ، مما يشير إلى أن التكلس خارج الرحم يضر بصحة الإنسان. لوحظ تكلس غير مرغوب فيه أيضًا لدى الأفراد المتقدمين في السن ، ومعظم الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 60 عامًا تظهر عليهم علامات تكلس الأوعية الدموية. لهذه الأسباب ، يمثل فك رموز العوامل التي تحفز التكلس خارج الرحم وتطوير علاج فعال أهدافًا مهمة.

يمكن تعريف التكلس خارج الرحم على أنه اختلال التوازن بين مثبطات ومحفزات التكلس في الجسم. تشمل مثبطات التكلس بروتينات المصل مثل الألبومين ، فيتوين أ ، أوستوبونتين ، وبروتين GLA المصفوفة بالإضافة إلى المركبات الصغيرة مثل بيروفوسفات ، بينما يمثل فرط فوسفات الدم والالتهاب المحفزات الرئيسية للتكلس 5-7. تشير الدراسات الحديثة إلى أن محفزات التكلس تنشط عملية خلوية مماثلة لتكوين العظام أثناء تكلس الأوعية الدموية. حويصلات المصفوفة المشابهة لتلك التي تحفز التمعدن في العظام النامية تم اكتشافها أيضًا في الأنسجة الرخوة المتكلسة 7-9. من المحتمل أن يتم إطلاق حويصلات المصفوفة هذه بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية التي تتمايز إلى خلايا شبيهة بخلايا بانيات العظم ، مما يؤدي إلى التكلس.

تم اكتشاف الجسيمات النانوية المعدنية (NPs) في الأنسجة الرخوة التي تظهر عليها علامات تكلس خارج الرحم. برايس وآخرون. وجد أن مصل الفئران المعالج إما بـ bisphosphonate etidronate أو بفيتامين D يحتوي على معقدات بروتينية تحتوي على مثبطات التكلس فيتوين A ومصفوفة بروتين GLA 10،11. وبالمثل ، فإن Jahnen-Dechent et al. لاحظ أن المجمعات المعدنية المحتوية على فيتوين أ ، والتي كانت تسمى جزيئات البروتين الكلسي (CPPs) ، يمكن اكتشافها في السائل الاستسقائي للمرضى الذين يعانون من التهاب الصفاق المتكلس. دراسة حديثة قام بها Bertazzo et al. أظهر وجود NPs المعدنية في الصمامات الأبهري والشرايين التاجية لكل من مرضى تصلب الشرايين والحمى الروماتيزمية. بينما ركزت الدراسات حول تكوين الجزيئات المعدنية عادةً على نظام القلب والأوعية الدموية للإنسان ، لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن العثور على الجزيئات في أنسجة أخرى وما إذا كانت هذه الكيانات تلعب دورًا في الصحة أو المرض.

لاحظنا سابقًا أن NPS المعدنية العضوية تتشكل تلقائيًا في سوائل جسم الإنسان والحيوان 14-28. تم وصف هذه المعادن NPs في البداية على أنها بكتيريا نانوية (NB) وكان يُعتقد أنها ليست فقط أصغر الخلايا على وجه الأرض ، ولكن أيضًا سبب محتمل للانتقال للعديد من الأمراض ، بما في ذلك مرض الزهايمر وتصلب الشرايين والسرطان ،الكلىحصاةتشكيل متعدد الكيساتالكلىمرضوالتهاب البروستات 30 - 32. ومع ذلك ، فقد أظهرت نتائجنا أن NB هو في الواقع NPs المعدنية غير الحية التي تحاكي البكتيريا الشائعة من حيث التشكل والنمو والتكاثر والثقافة الفرعية. لا يزال يتعين فحص احتمال وجود جزيئات معدنية مشابهة لما يسمى NB في الأنسجة البشرية وما إذا كانت هذه الجسيمات تلعب دورًا في المرض.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير نهج المواد النانوية لاكتشاف وتحليل المعادن العضوية الصافية في الإنسان المصاب.الكلىمناديل. نظهر أن أنسجة الكلى من مرضى الكلى المزمن في المرحلة النهائية وسرطان الكلى تحتوي على NPs المعدنية متعددة الألواح المشابهة لجزيئات المعادن المحاكية الحيوية التي تترسب تلقائيًا في سوائل الجسم في المختبر. تكشف نتائجنا عن رؤى نقدية بشأن التركيب الكيميائي الحيوي ، وآلية التكوين ، والوظيفة البيولوجية لهذه الجزيئات المعدنية العضوية ، كما أنها تلقي الضوء على آليات التكلس خارج الرحم وبدء المرض في جسم الإنسان.

نتائج

لقد فحصنا أنسجة الكلى التي تمت إزالتها جراحيًا من مرضى بشريين يعانون إما من مرض الكلى المزمن في مراحله الأخيرة (ن=2) أو سرطان الكلى (ن=18 ؛ انظر الجدول 1 ؛ بالنسبة لعينات سرطان الكلى ، ركزنا على غير - جزء سرطاني من النسيج). كعناصر تحكم صحية ، درسنا خزعات الكلى التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من صدمة أو ورم دموي ولكن لم يكن لديهم وظيفة كلوية غير طبيعية سابقًا (ن=2 ؛ الجدول 1).

أظهرت أنسجة الكلى من الأفراد الأصحاء سمات نسيجية طبيعية ، ولم يلاحظ أي تكلس خارج الرحم بعد تلطيخ فون كوسا (الشكل 1 أ ، ب). من ناحية أخرى ، أظهرت أنسجة الكلى المأخوذة من الأفراد المصابين والملطخة بالهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E) دليلًا على تلف الأنسجة (الشكل 2 أ-ج ، يشار إليه بالسهام) ، وأظهرت 80 بالمائة من الأنسجة المريضة التي تم فحصها ترسبات معدنية كما تم الكشف عنها بواسطة تلطيخ فون كوسا (الشكل 1C-T ، الشكل 2E ، F ، يكون التكلس مرئيًا كمادة سوداء يشار إليها بالسهام السوداء ؛ انظر أيضًا الجدول 1). لوحظت الترسبات المتكلسة في القشرة والنخاع ، بما في ذلك الفراغ خارج الخلية المحيط بالأنابيب الملتوية البعيدة ، والأنابيب الملتوية القريبة ، ومجاري التجميع وحلقات Henle بالإضافة إلى سيتوبلازم الخلايا التي تحدد الأنابيب والقنوات (الشكل 1C-T والشكل 1C-T والشكل 1C). . 2E، F). لم يتم الكشف عن تكلس في الجسم الكلوي (الشكل 2 د).

لفحص طبيعة رواسب المعادن ، قمنا بإعداد أقسام الكلى الرقيقة جدًا للمراقبة عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني (TEM). في العينات التي تحتوي على رواسب معدنية مجهرية ، تم اكتشاف جزيئات معدنية أو حبيبات في سيتوبلازم الخلايا الظهارية الكلوية ، في المصفوفة خارج الخلية أسفل الغشاء القاعدي ، وداخل تجويف الأنابيب الملتفة القريبة والبعيدة (الشكل 3 أ ، ب ، يتم تكبير الجسيمات في اللوحات A1 ​​– A4 و B1 – B4). كما لوحظت NPs المعدنية داخل الخلايا التي تبطن حلقات Henle ومجاري التجميع (الشكل 3C ، D ، الموسعة في الألواح C1 و C2 و D1). تم العثور على بعض الجسيمات داخل الحويصلات داخل الخلايا في الخلايا الكلوية (الشكل 3 أ ، الألواح A1 و A2). سمح لنا نهج المجهر الإلكتروني المستخدم هنا أيضًا بتصور الجزء الداخلي من جزيئات المعادن ؛ تحتوي بعض الجسيمات على حلقات كثيفة الإلكترون بالتناوب مع طبقات الضوء ذات الإلكترون الواضحة (الشكل 3 أ ، الألواح A3 و A4 ، الشكل 3 ج ، اللوحة C1). العديد من الأوعية الدموية ، مثل الأوعية المستقيمة المؤجرة (الشرايين المستقيمة للكلية) ، نحن محاطون بأعداد كبيرة من NPs المعدنية (الشكل ثلاثي الأبعاد ، اللوحة D1). وهكذا تم العثور على NPs المعدنية في مواقع مختلفة في جميع أنسجة الكلى البشرية تظهر علامات التكلس خارج الرحم ، في حين لم يتم العثور على جزيئات في الضوابط الصحية التي تم فحصها.

يبدو أن جزيئات المعادن الموجودة في أنسجة الكلى تشبه إلى حد بعيد جزيئات NPs المعدنية العضوية الموصوفة التي تتشكل تلقائيًا في سوائل الجسم في دراساتنا السابقة (والتي أطلقنا عليها اسم bions24). للتحقق من هذا الاحتمال ، قمنا بإعداد NPs العضوية المعدنية (أو البيونات) باستخدام طريقة الترسيب كما وصفنا سابقًا. تتكون هذه الطريقة من إضافة أيونات مترسبة مثل الكالسيوم والفوسفات إلى وسط استنبات الخلية (وسط Dulbecco's Eagle's Moded أو DMEM) الذي يحتوي على سائل في الجسم مثل مصل بشري (HS) ، متبوعًا بحضانة في ظروف زراعة الخلايا (انظر الطرق). كانت الجسيمات التي تم إنتاجها بهذه الطريقة (HS-NPS) إما كروية أو إهليلجية وأظهرت سطحًا معدنيًا أملسًا أو بلوريًا (الشكل 4 أ-هـ) ، على غرار الجسيمات الموصوفة سابقًا في سوائل الجسم وكذلك في استسقاء الإنسان 12 و الشرايين المتكلسة 13. كانت جزيئات المعادن متشابهة جدًا مع الحبيبات المعدنية أو الحبيبات التي لوحظت في أنسجة الكلى من حيث التشكل العام والبنية متعددة الطبقات وخصائص السطح (الشكل 4F-J). كان حجم الجسيمات المشتقة من HS وحبيبات الكلى متشابهين أيضًا ، حيث تراوح قطرها من 50 إلى 1500 نانومتر (الشكل 4A-E ، F-J). كما هو مذكور أعلاه ، كانت بعض حبيبات الكلى محاطة بغشاء دهني ، ربما تمثل حويصلات البضائع داخل الخلايا أو حويصلات الغشاء خارج الخلية (الشكل 4H ، I ، الأغشية يرمز إليها بالسهام) ؛ كانت مثل هذه الهياكل الغشائية غائبة في عينات HS-NP المحضرة في المختبر (الشكل 4A-E). تشير هذه الملاحظات إلى أن حبيبات الكلى تشبه NPs المعدنية العضوية المجمعة في مصل الدم.

باستخدام تحليل حيود الإلكترون في المنطقة المختارة ، لاحظنا أن الطور المعدني لـ HS-NPs الذي تم تقليصه مسبقًا في المختبر يتكون من مادة نانوية متعددة البلورات (الشكل 4E ، داخلي ؛ لاحظ الحلقات الباهتة متحدة المركز). تم الحصول على نتائج مماثلة لحبيبات الكلى (الشكل 4J ، أقحم) والعظام والتكلسات خارج الرحم كما هو موضح في الدراسات السابقة.

درسنا التركيب الكيميائي لـ HS-NPs وحبيبات الكلى باستخدام التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX). أظهر HS-NPs قممًا كبيرة من الكربون (C) والكالسيوم (Ca) والأكسجين (O) والفوسفور (P) (الشكل 4 K) ، بما يتوافق مع وجود معدن فوسفات الكالسيوم. لوحظ أيضًا انخفاض ذروة السيليكون (Si) في HS-NPs (الشكل 4 K) ، ربما يمثل مكونًا صغيرًا للجسيمات. أظهرت حبيبات الكلى أيضًا قممًا من الكربون والكالسيوم والأكسجين والفوسفور ، مما يدل على وجود معدن فوسفات الكالسيوم ، إلى جانب قمم إضافية من السيليكون والحديد (Fe) (الشكل 4 لتر). نُسبت قمم اليورانيوم (U) إلى أسيتات اليورانيل المستخدمة ككاشف متباين أثناء تحضير العينة (قد يُعزى وجود اليورانيوم في بعض عينات الجسيمات المعدنية مثل حبيبات الكلى وغيابه في أنسجة التحكم في الشكل 4M إلى ارتفاع تقارب اليورانيوم للفوسفات ، كما ورد سابقًا (35). أظهر التحكم في أطياف EDX لأنسجة الكلى المحيطة بالجسيمات قممًا من الكربون والأكسجين (الشكل 4M) ، مما يشير إلى أن الكالسيوم والفوسفور تم العثور عليه بشكل أساسي في جزيئات المعادن.

اختلفت نسب الكالسيوم: الفوسفور (Ca: P) من HS-NPs وحبيبات الكلى من 0. 65 إلى 1.18. تختلف هذه النسب عن القيمة النظرية البالغة 1.67 التي لوحظت بالنسبة للهيدروكسيباتيت المتكافئ ولكنها لا تزال ضمن النطاق الذي شوهد سابقًا لفوسفات الكالسيوم وبلورات الأباتيت التي لوحظت عند درجات مختلفة من التبلور. تؤكد هذه النتائج معًا أن حبيبات الكلى تتكون من فوسفات الكالسيوم NPs.

تم العثور على بروتينات مختلفة تمنع التكلس خارج الرحم بطريقة نظامية في الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يُعتقد أن هالة البروتين الموجودة على سطح NPs الاصطناعية تحدد التوزيع الحيوي وتأثيرات الجزيئات على الخلايا في الجسم الحي. من ناحية أخرى ، لا يزال التركيب البروتيني للـ NPs المعدنية العضوية الموجودة في أنسجة الكلى البشرية غير مفهومة تمامًا. لقد وجدنا سابقًا أن الألبومين ، والفيتوين- A ، والبروتين البروتيني A1 (apo-A1) يمثل البروتينات الرئيسية التي تتفاعل مع NPs العضوية المعدنية المتكونة في سوائل الجسم. استخدمنا هنا وضع العلامات المناعية لفحص وجود هذه البروتينات وموقعها داخل حبيبات الكلى.

استخدمنا أجسامًا مضادة متعددة النسيلة ضد ألبومين المصل البشري (HSA) ، ومصل fetuin-A البشري (HSF) ، و apo البشري -1 A ، و HS الكامل لفحص وجود بروتينات المصل في HS-NPs وحبيبات الكلى. تم التحقق من خصوصية الأجسام المضادة متعددة النسيلة (المحضرة كما هو موضح سابقًا) باستخدام النشاف الغربي (الشكل 5). تفاعل كل واحد من الأجسام المضادة متعددة النسيلة بشكل إيجابي مع HS-NPs المحضرة في المختبر وكذلك مع الحبيبات المعدنية الموجودة في أنسجة الكلى البشرية (الشكل 6 أ ، ب ، اللوحات A1 ​​– A3 و B1 – B3 ؛ النقاط السوداء). تفاعلت الأجسام المضادة بشكل أساسي مع الطبقات كثيفة الإلكترون أو النواة المظلمة لـ HS-NPs وحبيبات الكلى (الشكل 6 أ ، ب) ، مما يشير إلى أن هذه المناطق المظلمة قد تحتوي على مستويات أعلى من البروتينات مقارنة بالمناطق ذات الإلكترون. الضوابط السلبية التي أجريت بدون الجسم المضاد الأولي لم ينتج عنها أي تفاعل (الشكل 6 أ ، ب ، الألواح A4 و B4 ، التحكم). خلصنا إلى أن حبيبات الكلى تمثل NPs المعدنية العضوية المشابهة لـ HS-NPs لا تعتمد فقط على شكلها وتركيبها المعدني ولكن أيضًا على ارتباطها بمثبطات التكلس الرئيسية الموجودة في المصل.

تم استخدام الفحص المجهري المناعي بعد ذلك لتأكيد وجود حبيبات معدنية تحتوي على HSA و HSF في الكلى البشرية المريضة. باستخدام هذه التقنية ، أظهرت أنسجة الكلى البشرية

تلطيخ إيجابي للبروتينين في مناطق مختلفة ، بما في ذلك النسيج الخلالي المحيط بالأنابيب الكلوية بالإضافة إلى السيتوبلازم لخلايا تحديد الأنابيب (الشكل 7 أ ، الألواح A1 و A2). لوحظت أيضًا جزيئات البروتين التي تحتوي على كل من الألبومين والفيتوين A في هذه المناطق ، وإن كان بكميات أقل مقارنة بتلطيخ البروتينات المفردة (الشكل 7 أ واللوحة A3 ، تم دمج تلطيخ باللون الأصفر). بشكل ملحوظ ، لاحظنا أن تلطيخ البروتين المكتشف عن طريق التألق المناعي يتداخل بشكل وثيق مع نمط التكلس خارج الرحم الذي لوحظ باستخدام تلطيخ فون كوسا (الشكل 7 أ ، ب ، التكلس مرئي كمادة سوداء يشار إليها بالسهام في ب). توفر هذه النتائج مزيدًا من الدعم لوجود جزيئات عضوية معدنية في أنسجة الكلى البشرية التي تم فحصها.

مناقشة

بينما تم إحراز تقدم في فهمنا للتفاعلات بين NPs الاصطناعية والخلايا البشرية ، فإننا نعرف القليل عن تأثيرات NPs المعدنية العضوية التي تتشكل تلقائيًا في سوائل الجسم. أظهرت دراساتنا السابقة أن هذه الجسيمات تتشكل في السوائل البيولوجية عندما تتجاوز تركيزات الكالسيوم والفوسفات التشبع. لاحظنا أيضًا أن الخلايا المناعية تستوعب هذه الجزيئات ولكن الجسيمات الكبيرة فقط تحفز تفاعلات مناعية مؤيدة للالتهابات. ومع ذلك ، فإن توزيع هذه الجسيمات في الأنسجة البشرية وما إذا كانت تلعب أي أدوار فسيولوجية أو مرضية في الجسم لم يتم فحصها حتى الآن.

في هذه الدراسة ، اكتشفنا لأول مرة NPs المعدنية العضوية في الكلى لدى المرضى الذين يعانون من مرض الكلى في نهاية المرحلة أو سرطان الكلى. تحتوي NPs المعدنية العضوية التي تم اكتشافها على فوسفات الكالسيوم المتبلور بشكل سيئ والمشابه لمعدن العظام ، بالإضافة إلى الألبومين ، و fetuin-A ، و apo-A1 التي تعمل كمثبطات تكلس جهازية في سوائل الجسم. تتفق نتائجنا مع التقارير السابقة التي وصفت وجود مجمعات البروتينات المعدنية في أنسجة الأوعية الدموية وسوائل الجسم. نظرًا لأن الجسيمات التي لاحظناها وجدت في مناطق لا تحتوي على تكلسات مجهرية ، فإن ملاحظاتنا تشير إلى أن الجسيمات قد تمثل سلائف تكلس خارج الرحم في الأنسجة البشرية. بالنظر إلى احتمال أن تنمو NPs المعدنية العضوية تدريجياً في الحجم وتخضع لتحويل الجسيمات إلى فيلم في ظل ظروف مواتية كما هو موضح في دراساتنا السابقة ، فإن الملاحظات المقدمة هنا تشير إلى أن السلائف المعدنية قد تؤدي إلى تكوين أكبر الرواسب المعدنية في الجسم الحي ، مثل لوحة راندال وحصى الكلى.

تتوافق ملاحظاتنا التي تشير إلى وجود تكلسات معدنية خارج الرحم و NPs عضوية معدنية في العديد من الهياكل التشريحية للكلى مع النتائج السابقة للتكلسات خارج الرحم في هذا العضو. أشارت ملاحظات إيفان وزملاؤه إلى أن التمعدن في كليتي المرضى المصابين بتحصي الكلية قد يبدأ ويحدث في الغالب في النسيج الخلالي لحلقات Henle. لاحظ هؤلاء المؤلفون أن الرواسب المعدنية المتكونة في هذه المنطقة قد تبرز من الجانب القاعدي من المسالك البولية وتؤدي إلى تكوين حصوات الكلى. تشير ملاحظاتنا إلى أنه بالإضافة إلى حلقات Henle ، قد تحتوي مناطق الكلى الأخرى على NPs المعدنية والتي قد تتطور في النهاية لتشكل رواسب معدنية كبيرة في الكلى البشرية. نحن ندرس أيضًا إمكانية انتقال المعادن NP التي تتشكل في الدورة الدموية إلى أنسجة الكلى وتحفز التكلس خارج الرحم وتكوين الحصوات في الكلى.

تم العثور على العديد من حبيبات الكلى التي تم اكتشافها في هذه الدراسة داخل الحويصلات داخل الخلايا أو خارجها (الشكل 4H ، I) وهي تشبه حويصلات المصفوفة التي تظهر أنها تحفز التكلس في العظام والأسنان. لاحظنا مؤخرًا أن الحويصلات المعزولة من مصل الإنسان والحيوان تحفز تكوين NPs المعدنية والرواسب المجهرية في المختبر. لاحظ شليبر وزملاؤه 34 أيضًا أن الجزيئات المعدنية الموجودة في الشرايين مرتبطة بهياكل الأغشية واقترحوا أن حويصلات المصفوفة أو أجسام موت الخلايا المبرمج قد تمثل نوى جزيئات معدنية في هذه الأنسجة. وبالمثل ، خان وآخرون. ذكرت أن رواسب فوسفات الكالسيوم الموجودة في الكلى لدى المرضى الذين يعانون من حصوات الكلى مجهولة السبب مرتبطة بألياف الكولاجين وحويصلات المصفوفة. تشير هذه النتائج إلى أن NPs المعدنية العضوية المكتشفة في أنسجة الكلى قد تتشكل عبر آلية تنطوي على حويصلات غشاء ، وهو وضع مشابه لما يظهر في الشرايين المتصلبة. من ناحية أخرى ، أظهرت دراسة حديثة أن التكلس خارج الرحم الموجود في شرايين الثدي لدى النساء لم يكن مرتبطًا بعلامات الخلايا العظمية أو الأبوطوزية ، مما يشير إلى أن آلية التكلس قد تكون خاصة بالعضو أو السياق البيولوجي المعني. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتشكل NPs المعدنية العضوية مثل تلك الموصوفة هنا أنسجة الكلى البشرية بسبب الفشل في الحفاظ على التركيزات الفسيولوجية للأيونات (على سبيل المثال ، الكالسيوم والفوسفات) ومثبطات التكلس (على سبيل المثال ، الألبومين ، فيتوين- A ، و apo -A1) في سوائل جسم الإنسان.

تشير نتائجنا إلى أن الطبقة كثيفة الإلكترون ولب من المعادن العضوية NPs قد تحتوي على مستويات أعلى من البروتينات والجزيئات العضوية مقارنة بالمناطق الإلكترونية الجذابة من الجسيمات (الشكل 6 أ ، ب). تبدو هذه الطبقات كثيفة الإلكترون وكأنها ممعدنة كما يتضح من الطبيعة البلورية لهذه المادة تحت TEM (انظر الشكل 4A-J). اقترح مؤلفون آخرون ، بما في ذلك Ryall41 و Evan et al 44 ، أن طبقة الإلكترون الواضحة قد تمثل المعادن بينما قد تتوافق الطبقات كثيفة الإلكترون مع الجزيئات العضوية. قد ترجع هذه التفسيرات جزئيًا على الأقل إلى الطريقة التي تمت بها معالجة العينات وفحصها في كل دراسة بالإضافة إلى طبيعة أنسجة البداية المستخدمة.

بالإضافة إلى لعب دور في التكلس خارج الرحم ، فإن جزيئات المعادن العضوية قد تسبب التهابًا في أنسجة الكلى. لقد أظهرنا مؤخرًا أنه بينما تفشل NPs المعدنية العضوية في تحفيز إفراز الإنترلوكين المؤيد للالتهابات -1 بواسطة الضامة البشرية ، فإن التجمعات المعدنية التي يزيد حجمها عن 1 ميكرومتر قادرة على القيام بذلك. لقد ثبت أن إطلاق الإنترلوكين -1 استجابةً للمواد البلورية يعتمد على تنشيط المجمعات الجزيئية داخل الخلايا المسماة بالجسيمات الالتهابية 45-47. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف جزيئات المعادن في الكلى التي تحتوي على أورام ، وأصبح الارتباط بين السرطان والالتهاب معروفًا جيدًا الآن 48. لا يزال يتعين التحقيق في احتمال أن الجزيئات المعدنية المتراكمة قد تنشط جسيمًا ملتهبًا وتساهم في تطور الالتهاب والسرطان في الكلى أو الأنسجة الأخرى.

بالإضافة إلى التكلس خارج الرحم ، قد تشارك الحبيبات المعدنية الموصوفة هنا في عمليات مرضية أخرى. على سبيل المثال ، اقترحنا سابقًا أن NPs المعدنية قد ترتبط ببروتينات مختلفة في سوائل الجسم وتستنفد هذه الجزيئات العضوية من سوائل الجسم. من ناحية أخرى ، قد يمنع جسم الإنسان تكوين وتراكم NPs المعدنية في ظل الظروف العادية من خلال الاعتماد على وجود مثبطات التكلس والجهاز الشبكي البطاني (أي الضامة). وبالتالي قد تتراكم NPs المعدنية فقط بمجرد اضطراب استتباب الكالسيوم النظامي أو المحلي وعندما تفشل آليات الحماية في جسم الإنسان.

نقترح أنه يمكن استخدام نهج المواد النانوية الذي تم تطويره هنا لدراسة تكوين NPs العضوية المعدنية في الأنسجة الحيوانية والبشرية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الأجسام المضادة التي يتم رفعها ضد بروتينات مثبطات التكلس مثل الألبومين ، و fetuin-A ، و apo-A1 جنبًا إلى جنب مع تحليل المعادن لاكتشاف وتوصيف تكوين NPs المعدنية العضوية في أنسجة نماذج الحيوانات. يمكن تطبيق النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النهج على القياسات السريرية التي أجريت على سوائل جسم الإنسان من أجل تحديد المعلمات البيولوجية التي تعكس حالة تكوين الجسيمات المعدنية والتكلس خارج الرحم في الجسم. نتوقع أن تؤدي هذه المعرفة إلى تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للوقاية من الأمراض والحالات البشرية المرتبطة بالتكلس خارج الرحم وعلاجها.

طُرق

أنسجة الكلى.تمت الموافقة على استخدام الأنسجة البشرية والتجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى تشانغ جونج التذكاري ؛ تم تنفيذ الأساليب والتجارب وفقًا للإرشادات المعتمدة. تم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من المرضى. تم الحصول على أنسجة الكلى السليمة للتحكم من خزعات مرضى الرضوض والورم الدموي الذين ليس لديهم تاريخ للإصابة بأمراض الكلى (ن=2) ؛ تم الحصول على أنسجة الكلى أيضًا من مرضى سرطان الكلى (ن=20) ومن مرضى الكلى في المرحلة النهائية (ن=2) الذين تمت إزالة كليتهم أو أخذ خزعة منها أثناء جراحة الزرع (الجدول 1). بالنسبة لأنسجة سرطان الكلى ، تم تشريح الجزء غير السرطاني من الأنسجة وتحليلها في هذه الدراسة.

التحليل النسيجي.تم تركيب أنسجة الكلى على كتل البارافين. تم قطع الكتل وتم تسخين شرائح الأنسجة على صفيحة ساخنة عند 70 درجة لمدة 30 دقيقة لإزالة البارافين. تم غمر المقاطع في محلول جديد من الزيلين ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لإزالة البارافين المتبقي تمامًا. تمت إعادة ترطيب المقاطع بنسبة 95 بالمائة و 80 بالمائة و 70 بالمائة من الإيثانول لمدة 5 دقائق في كل مرة. تم غسل العينات المرطبة بالماء المقطر المزدوج (ddH2O) لمدة 5 دقائق. تم تلوين نوى الخلية بالهيموكسيلين لمدة 8 دقائق. تمت إزالة الصبغة من العينات بالماء الدافئ لمدة 10 دقائق. تم شطف عينات الكلى في ddH2O وتم غمسها 10 مرات في 95 بالمائة من الإيثانول. تم تلطيخ العينات المعالجة بالإيثانول باستخدام يوزين Y لمدة دقيقة واحدة. تم تجفيف العينات باستخدام 95 بالمائة و 100 بالمائة من الإيثانول لمدة 10 دقائق في كل مرة ، متبوعة بخطوة التجفيف في الزيلين لمدة 10 دقائق. تم تركيب عينات الكلى المجففة النهائية على شرائح زجاجية بنسبة 50 في المائة من الجلسرين وتم ملاحظتها تحت نطاق دقيق خفيف مزود بكاميرا رقمية.

تم تحضير العينات منزوعة البارافين والمرطبة كما هو موصوف لتلطيخ H&E. تم تلطيخ المقاطع التي تم ترطيبها بنترات الفضة (5 بالمائة) ، يليها التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة. يغسل المحلول بـ ddH2O لمدة 15 دقيقة. كانت المقاطع ملطخة بثيوكبريتات الصوديوم (5 بالمائة) لمدة 5 دقائق ، يليها الغسيل بـ ddH2O لمدة 15 دقيقة. كانت المقاطع ملطخة باللون الأحمر النووي السريع (Sigma-Aldrich ، St. Louis ، MI) لمدة 5 دقائق. تم تجفيف العينات الملطخة على التوالي باستخدام 95 في المائة و 100 في المائة من الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل منهما ، قبل الجفاف في الزيلين لمدة 10 دقائق. تم تركيب عينات الكلى على شرائح زجاجية وفحصها كما هو موضح أعلاه.

المجهر الإلكتروني وتحليل EDX.تم تقطيع عينات الكلى إلى قطع صغيرة بسمك أقل من 1 مم باستخدام مجهر تشريح LGPS (أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان). تم إصلاح الأنسجة بنسبة 2.5 في المائة من الجلوتارالدهيد و 1 في المائة من بارافورمالدهيد في 0. 1 M كاكوديلات عازلة عند 4 درجات طوال الليل. تم غسل العينات الثابتة ثلاث مرات باستخدام محلول 0. 1 مولار من محلول كاكوديلاتي في 8 في المائة من السكروز (الرقم الهيدروجيني 7.2) على الجليد لمدة 10 دقائق. تم تحضين الأنسجة المغسولة في محلول ملحي مخزّن بالفوسفات (PBS ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي مول كلوريد ، 10 ملي مولار Na2HPO4) تحتوي على 1 في المائة من رابع أكسيد الأوزميوم و 1.5 في المائة من فيروسيانيد البوتاسيوم لمدة ساعتين على الجليد. تم غسل الأنسجة بـ ddH O على الجليد لمدة 10 دقائق ثلاث مرات. تم تلطيخ الأنسجة المغسولة على الجليد مع 1 في المائة من خلات اليورانيل في ddH2O لمدة ساعة واحدة ، قبل الغسيل ثلاث مرات باستخدام ddH O على الجليد. تم تجفيف أنسجة الكلى باستخدام 30 ، 50 ، 70 ، 80 ، و 90 بالمائة من الإيثانول لمدة 10 دقائق في كل مرة ، باستثناء عندما يصل الإيثانول إلى 70 بالمائة ، وفي هذه الحالة تم تخزين العينات في 4 درجات بين عشية وضحاها. تم تلطيخ الأنسجة بنسبة 1 في المائة من حمض الفوسفوتونجستيك في 95 في المائة من الإيثانول لمدة 15 دقيقة ، قبل الجفاف مع 95 في المائة من الإيثانول لمدة 5 دقائق. تم غمر العينات في أكسيد البروبيلين عند 40 و 57 و 67 و 100 بالمائة في الإيثانول لمدة 10 دقائق في كل مرة ، متبوعًا بغمر آخر في أكسيد البروبيلين بنسبة 100 بالمائة لمدة 5 دقائق. تم اختراق أنسجة الكلى بـ 50 و 70 و 100 بالمائة Eponate 812 (Ted Pella ، Redding ، CA) لمدة ساعة واحدة في كل مرة. تم تحضير عينات الكلى المضمنة Eponate 812- عن طريق الحضانة مرتين في Eponate بنسبة 100 بالمائة. تم تحضين العينات المضمنة في فرن عند 60 درجة طوال الليل للسماح ببلمرة الراتنج.

تم إصلاح حبيبات HS-NP المغسولة التي تم الحصول عليها على النحو الوارد أعلاه مع الجلوتارالدهيد (2.5 بالمائة) وامتصاص العرق (1 بالمائة) في ddH2O لمدة 4 ساعات عند 4 درجات. تم غسل الكريات الثابتة بـ ddH O ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. تم تجفيف الكريات مع حضانات متتالية إلى 30 ، 50 ، 70 ، 80 ، 90 ، 95 ، و 100 بالمائة من الإيثانول ، لمدة 10 دقائق في كل مرة ، باستثناء عندما وصل الإيثانول إلى 70 بالمائة ، حيث تم تخزين الكريات في 4 درجات بين عشية وضحاها. تم وضع محاليل الإيثانول الأخرى على اتصال مع الكريات لمدة 10 دقائق فقط. تم اختراق الكريات المجففة بوسط التضمين الأبيض LR (Electron Microscopy Sciences ، Hatfield ، PA) باستخدام نسب مختلفة من الإيثانول ووسط LR (3: 1 ، 1: 1 ، و 1: 3) لمدة 30 دقيقة لكل منهما. تم اختراق الكريات بوسط LR جديد (100 بالمائة) طوال الليل قبل البلمرة. تم تحضين الكريات المخترقة بوسط LR في فرن عند 60 درجة لمدة يومين للسماح ببلمرة الراتنج. تم تقسيم كتل الكلى و HS-NPs لإنتاج شرائح بسمك 70-100 نانومتر باستخدام مبضع Reichert Ultracut S (لايكا ، ويتزلار ، ألمانيا). كانت أقسام الأنسجة ملطخة بنسبة 4 في المائة من خلات اليورانيل قبل التصور تحت المجهر الإلكتروني للإرسال JEM 1230 (JEOL ، طوكيو ، اليابان) الذي يعمل عند 100 كيلو فولت. تم الحصول على أنماط حيود الإلكترون باستخدام نفس النظام. تم استخدام شبكات النيكل كدعم.

لتحليل EDX ، تم تلوين أقسام رقيقة من أنسجة الكلى بخلات اليورانيل وغسلها بـ ddH O على النحو الوارد أعلاه ، متبوعًا بالتجفيف في خزانة مجفف إلكترونية. لوحظت العينات تحت المجهر الإلكتروني عالي الدقة للإرسال JEM 2100 (JEOL) الذي يعمل عند 120 كيلو فولت. تم الحصول على أطياف EDX في ثلاث نسخ باستخدام نظام INCA Energy EDS (Oxford Instruments ، Abingdon ، UK). لوحظت أقسام رقيقة من HS-NPs دون تلطيخ.

تحضير NPs المعدنية العضوية.تم تعديل جميع محاليل البداية إلى درجة الحموضة 7.4 وتعقيمها بالترشيح من خلال 0 أغشية 2 ميكرومتر قبل الاستخدام. تم الحصول على HS من متطوعين بشريين أصحاء باستخدام تقنية بزل الوريد التقليدية. تمت الموافقة على استخدام السوائل البيولوجية البشرية في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمستشفى Linko Chang Gung Memorial وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المتطوعين. تم تحضير HS-NPs بإضافة 3 ملي مولار CaCl و Na2HPO4 لكل منهما في DMEM (Gibco ، Carlsbad ، CA) يحتوي على 10 في المائة من H2S ، تليها الحضانة لمدة أسبوع واحد في ظروف ثقافة الخلية (37 درجة ، 5 في المائة من ثاني أكسيد الكربون ، الهواء المرطب). تم تكوير الجسيمات بالطرد المركزي عند 16 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات وغسلها مرتين باستخدام محلول HEPES (20 ملي مولار HEPES ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم ، 2 ملي مولار Na2HPO4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم) باستخدام نفس إجراء الطرد المركزي.

SDS-PAGE والنشاف الغربي.تم إجراء SDS-PAGE وتحليل لطخة ويسترن بشكل أساسي كما كان من قبل. باختصار ، 0. 2 ميكروغرام (الشكل 5 أ ، د) أو 1.2 ميكروغرام (الشكل 5 ب ، ج) من بروتينات HS ، 47 ميكروغرام (الشكل 5 أ ، ب ، د) أو 59 0 ميكروغرام من بروتينات HS-NP (الشكل 5C) ، 0. 1 ميكروغرام من HSA (الشكل 5A-D) ، و 0. 6ug (الشكل 5A ، C ، D) أو {{23} } تم إذابة 15 ميكروغرام من HSF (الشكل 5 ب) في 5 × "محلول تحميل" (0. 313 M Tris-HCl الأس الهيدروجيني 6.8 ، 10 بالمائة SDS ، 0.05 بالمائة أزرق بروموفينول ، 50 بالمائة جلسرين ، 12.5 بالمائة - مركابتوإيثانول) إلى تركيز نهائي قدره 1 × ، قبل التسخين عند 95 درجة لمدة 5 دقائق والفصل تحت ظروف تغيير الطبيعة وتقليلها على 10 بالمائة SDS-PAGE باستخدام نظام هلام صغير (Hoefer ، هوليستون ، ماساتشوستس). يتكون عنصر التحكم NP (المستخدم في الممر 1 من الشكل 5A-D) من NPs المعدنية المحضرة بإضافة 3 ملي مولار من CaCl2 و Na2HPO4 لكل منهما في DMEM (الحجم النهائي 1 مل) ، متبوعًا بحضانة لمدة يوم واحد في ظروف ثقافة الخلية ؛ تم تكوير الجسيمات بالطرد المركزي عند 16 ، 000 × جم لمدة 15 دقيقة ، وغسلها مرتين باستخدام محلول HEPES ، وأعيد تعليقها في 50ul من محلول HEPES. تمت معالجة جزء من 20ul من الجسيمات المعلقة لـ SDS-PAGE على النحو الوارد أعلاه. تم حظر أغشية PVDF لمدة ساعة واحدة في 5 بالمائة (وزن / حجم) حليب منزوع الدسم في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التي تم إنشاؤها داخليًا كما هو موضح سابقًا 25 بتخفيف 1: 1 ، 000 (-apo-A1 و -HS-NP) ، 1: 3 ، 000 (-HSF) ، أو 1: 6 ، 000 (-HSA). تم استخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيداز الماعز المضاد للأرانب بناءً على الإرشادات المقدمة من الشركة المصنعة (Millipore ، Billerica ، MA). تم الكشف عن البقع باستخدام التلألؤ الكيميائي المحسن (Amersham Biosciences ، Amersham ، المملكة المتحدة) وأفلام التصوير الشعاعي التلقائي.

وضع العلامات المناعية.تم تحضير العينات لرصد TEM. تم تقسيم كتل HS-NP إلى شرائح أقل من 7 0 نانومتر. تم حظر أقسام العينة على الشبكات باستخدام 1 في المائة من جيلاتين السمك (Sigma) في 0. 1 M HEPES buffer (pH 8.0) لمدة 25 دقيقة. تم تحضين الشبكات بالأجسام المضادة الأولية التالية: -HSA ، 1:30 ؛ - HSF ، 1:50 ؛ -أبو A1 ، 1:30 ؛ -HS-NP ، 1:60. لا يحتوي التحكم السلبي على أي جسم مضاد أولي (1 في المائة من جيلاتين السمك في محلول HEPES). تم شطف المقاطع المحتضنة بمحلول HEPES لمدة 15 دقيقة. تم سد المقاطع المغسولة بنسبة 1 في المائة من جيلاتين السمك في محلول HEPES لمدة 20 دقيقة. عولجت العينات بـ IgG ثانوي من نوع 5- نانومتر مترافق من الذهب الماعز المضاد للأرنب لمدة ساعة واحدة. تم غسل العينات باستخدام محلول HEPES لمدة 10 دقائق ، قبل الغسيل بـ ddH2O لمدة 10 دقائق. تم إجراء ملاحظات TEM على النحو الوارد أعلاه.

المجهر مضان.تم حظر الشرائح النسيجية لأنسجة الكلى المحضرة على النحو الوارد أعلاه مع 1 في المائة من ألبومين مصل البقر لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضين الشرائح بأجسام مضادة أولية متعددة النسيلة بتخفيف 1: 4 ، 000. بعد خطوات الغسيل ، تم تحضين العينات بالأجسام المضادة الثانوية الماعز المضاد للأرانب- FITC (492/520 نانومتر) والماعز المضاد للأرنب- TRITC (550/570 نانومتر) (Jackson Immuno Research ، West Grove ، PA) عند 1: 100 لـ 1 ساعة. تم غسل المجمعات بـ PBST لمدة 15 دقيقة. تم استخدام صبغة الفلورسنت 4 ′ ، 6- ديميدينو -2- فينيليندول (DAPI) بمعدل 10 ميكروغرام / مل لمدة 15 دقيقة. تم تجفيف العينات الملطخة بـ DAPI بـ 95 و 100 بالمائة من الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل منهما ، متبوعًا بالجفاف في الزيلين لمدة 10 دقائق أخرى. تم تركيب عينات الكلى المجففة باستخدام وسيط تركيب مضان Vectashield H -1000 (Vector Laboratories ، Burlingame ، CA) وتمت ملاحظتها تحت مجهر متحد البؤر (LSM510 Meta ؛ Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا) مزودة بكاميرا Spot Flex.

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول على العينة

مراجع

1. Giachelli ، التكلس خارج الرحم CM: جمع الحقائق الثابتة حول تمعدن الأنسجة الرخوة. آم جيه باتول 154 ، 671-675 (1999).

2. عابدين ، م ، تينتوت ، واي وديمير ، إل إل تكلس الأوعية الدموية: الآليات والتشعبات السريرية. تصلب الشرايين Thromb Vasc Biol 24 ، 1161-1170 (2004).

3. Alexopoulos، N. & Raggi، P. تكلس في تصلب الشرايين. نات ريف كارديول 6 ، 681-688 (2009).

4. أليسون ، ماجستير ، كريكي ، إم إتش ورايت ، أنماط سم وعوامل الخطر لتصلب الشرايين الجهازي المتكلس. تصلب الشرايين Thromb Vasc Biol 24 ، 331-336 (2004).

5. Ketteler، M. et al. أوجه القصور في البروتينات المنظمة للكالسيوم في مرضى غسيل الكلى: مفهوم جديد لتكلس القلب والأوعية الدموية في البول. الكلى Int Suppl 84 ، S84–87 (2003).

6. Kapustin، A. & Shanahan، CM استهداف تكلس الأوعية الدموية: تليين هدف صعب. فارماكول Opin بالعملة 9 ، 84-89 (2009).

7. Kapustin، AN & Shanahan، CM تنظيم الكالسيوم لحويصلات المصفوفة المشتقة من خلايا العضلات الملساء الوعائية. اتجاهات كارديوفاسك ميد 22 ، 133-137 (2012).

8. دوهرتي ، تي إم وآخرون. التكلس في تصلب الشرايين: بيولوجيا العظام والالتهابات المزمنة عند مفترق طرق الشرايين. Proc Natl Acad Sci USA 100 ، 11201-11206 (2003).

9. Khan، SR، Rodriguez، DE، Gower، LB & Monga، M. رابطة لويحات راندال مع ألياف الكولاجين وحويصلات الأغشية. J أورول 187 ، 1094-1100 (2012).

10. Price، PA، Nguyen، TM & Williamson، MK التوصيف الكيميائي الحيوي لمركب فيتوين المصل المعدني. جي بيول كيم 278 ، 22153-22160 (2003).

11. Price، PA، Williamson، MK، Nguyen، TM & Than، TN مستويات مصل مركب فيتوين المعدني ترتبط بتكلس الشريان في الفئران. جي بيول كيم 279 ، 1594-1600 (2004).

12. هيس ، إيه وآخرون. الدور الهرمي لفيتوين أ وبروتينات المصل الحمضية في تكوين وتثبيت جزيئات فوسفات الكالسيوم. جي بيول كيم 283 ، 14815 - 14825 (2008).

13. Bertazzo، S. et al. يكشف الفحص المجهري الإلكتروني التحليلي النانوي عن رؤى أساسية في تكلس أنسجة القلب والأوعية الدموية البشرية. نات ماتر 12 ، 576-583 (2013).

14. Martel، J. & Young، JD يزعم وجود البكتيريا النانوية في دم الإنسان كجسيمات نانوية كربونات الكالسيوم. Proc Natl Acad Sci USA 105 ، 5549-554 (2008).

15. يونغ ، جي دي وآخرون. تمثل البكتيريا النانوية المفترضة البقايا الفسيولوجية وثقافة المنتجات الثانوية لاستتباب الكالسيوم الطبيعي. بلوس وان 4 ، إي 4417 (2009).

16. يونغ ، جيه دي وآخرون. توصيف تحبيب الكالسيوم والأباتيت في مصل الدم كمجمعات بروتينية معدنية متعددة الأشكال وكسلائف للبكتيريا النانوية المفترضة. بلوس وان 4 ، 5421 (2009).

17. Wu ، CY ، Martel ، J. ، Young ، D. & Young ، JD Fetuin-A / مجمعات الألبومين المعدنية التي تشبه حبيبات الكالسيوم في الدم والبكتيريا النانوية المفترضة: عرض لمفهوم التثبيط المزدوج. بلوس وان 4 ، e8058 (2009).

18. يونغ ، جي دي ومارتل ، جي. صعود وهبوط البكتيريا النانوية. Sci Am 302 ، 52-59 (2010).

19. Martel ، J. ، Wu ، CY & Young ، JD تقييم نقدي للمصل المشع بأشعة غاما المستخدم كمغذي في الثقافة وإظهار البكتيريا النانوية المفترضة والجسيمات النانوية المتكلسة. بلوس ون 5 ، إي 10343 (2010).

20. Martel، J. et al. تحليل بروتيني شامل للجسيمات النانوية المعدنية المستمدة من سوائل جسم الإنسان وتحليلها بواسطة كروماتوجرافيا سائلة - ترادفية مطياف الكتلة. الشرج Biochem 418 ، 111-125 (2011).