منظم التخلق المتوالي BRD4 متورط في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم في كلى الفئران

لمزيد من المعلومات: ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

يمنع Cistanche tubulosa أمراض الكلى ، انقر هنا للحصول علىالمنتجات و Cistanche DHT

نبذة مختصرة

تم وصف الكادميوم (Cd) بأنه محفز محتمل للالتهابات بينما تظهر الأدلة المتزايدة أن الالتهاب غير المناسب هو عامل مساهم فيإصابة في الكلى. ومن ثم ، فإن البحث عن الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم ذو أهمية كبيرة لتوضيح آلية السمية الكلوية التي يسببها الكادميوم. 4 التي تحتوي على برومودومين(BRD4) هو منظم جيني مهم يشارك في تطوير العديد من الأمراض الالتهابية ، ولكن أدواره التنظيمية في Cd- أثارالتهاباتالرد لا يزال يتعين توضيحه. هنا ، وجدنا أن العلاج بـ Cd في جرذان Sprague-Dawley (2 مجم / كجم من وزن الجسم ، IP ، 5 أيام متتالية) وفي الفئرانخلية الكلىتسبب الخط (NRK {0} E ، 0 - 10 ميكرومتر ، 12 ساعة) في نسخ السيتوكينات الالتهابية ، والتي يمكن تقليلها بواسطة JQ1 (مثبط BRD4 ، 25 مجم / كجم من وزن الجسم ، IP ، 3 أيام متتالية في الجسم الحي ؛ 0.5 ميكرومتر ، 12 ساعة في المختبر) أو BRD4 صغيرة متداخلة من الحمض النووي الريبي (سيرنا ، في المختبر) ، مما يشير إلى أن BRD4 يشارك في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم. بعد ذلك ، أوضحت دراستنا دور BRD4 في الاستجابة الالتهابية الناتجة عن الكادميوم. أدى تثبيط BRD4 إلى تقليل الانتقال النووي NF-B الذي يروج له الكادميوم وتنشيطه في الجسم الحي وفي المختبر. زاد الكادميوم من مستوى الأستلة لـ RelA K310 وتعزيز ارتباط BRD4 بالأسيتيل NF-B RelA في الجسم الحي وفي المختبر ، والذي تم إلغاؤه عن طريق تثبيط BRD4. باختصار ، تشير دراستنا إلى أن BRD4 متورط في نسخ السيتوكينات الالتهابية التي تسببها الأقراص المضغوطة عن طريق التوسط في تنشيط مسار إشارات NF-B وزيادة ارتباط نفسه بـ NF-B RelA المؤسس في الفئران.الكلى،لذلك ، يمكن أن يكون BRD4 هدفًا علاجيًا محتملاً لأمراض الكلى التي يسببها الكادميوم.

الكلمات الدالة: BRD4الكادميومالتهاب الكلىالسيتوكينات NF-κB JQ1

1 المقدمة

الكادميوم (Cd) هو ملوث للمعادن الثقيلة ذو سمية عالية وعمر نصف طويل. مع تطور الإنتاج الصناعي ، أثار التهديد المتزايد لتلوث الكادميوم على الأمن البيئي وصحة الإنسان القلق (Wang et al. ، 2020 ؛ Horiguchi and Oguma ، 2016). بعد أن يمتصه الجسم ، يتسبب الكادميوم في تلف أعضاء متعددة والكلىهو العضو المستهدف الرئيسي (Fernando et al. ، 2020 ؛ Zhao et al. ، 2021). في السابق ، تحققنا بشكل منهجي من أن تثبيط الالتهام الذاتي ، والإجهاد التأكسدي ، وموت الخلايا المبرمج يساهم بشكل تآزري في السمية الكلوية التي يسببها الكادميوم في الفئران (Liu et al. ، 2017 ؛ Wang et al. ، 2017). الالتهاب هو استجابة فسيولوجية تعمل كرد فعل دفاعي ضد العدوى أو الإصابة ، ولكن الاستجابات الالتهابية غير الخاضعة للرقابة والتي يسببها الكادميوم يمكن أن تسبب ضررًا مثل إتلاف الأنسجة الطبيعية الموجودة في المتفرج وتعزيز أمراض المناعة الذاتية (Hossein-Khannazer et al.، 2020؛ Zhang et آل ، 2020). أدت الاستجابة الالتهابية التي تسببها الأقراص المضغوطة إلى تفاقم أمراض القلب والأوعية الدموية وتلف الكبد ، مما يشير إلى أن الالتهاب قد يلعب أدوارًا مهمة في التوسط في الكادميوم.الكلىالعمليات المرضية (Fagerberg et al. ، 2017 ؛ Almeer et al. ، 2019).

يشير علم التخلق إلى تعديلات وراثية في التعبير الجيني بناءً على تغييرات تسلسل غير الحمض النووي ، وتتيح إمكانية عكس هذه التعديلات اكتشاف أهداف علاجية جديدة (Vendetti and Rudin ، 2013). تشتمل عائلة البرومودومين والمجال الطرفي الإضافي (BET) على 2 برومودومين المحتوي على (BRD2) و BRD3 و BRD4 و bromodomain الخاص بالخصية (BRDT) ، والتي تتميز بنطاقين من البرومودومين والارتباط مع ليسينات أسيتيل من الهيستونات وغير هيستون ( Lochrin et al.، 2014؛ Chatterjee and Bohmann، 2018). تعمل بروتينات BET كمنشط مشارك نسخي للعديد من الجينات ، وبالتالي تنظم دورة الخلية والاستجابة الالتهابية والإجهاد التأكسدي والعمليات الفسيولوجية الأخرى في نماذج مرضية مختلفة (Jiao et al. ، 2020 ؛ Wang et al. ، 2019b). BRD4 هو عضو تمت دراسته جيدًا بشكل خاص في عائلة بروتين BET ، وقد أبلغت التحقيقات المتراكمة عن أنه هدف جيني جديد في تنظيم متنوعأمراض الكلى، بما في ذلك التهاب الكلية المزمن ، واعتلال الكلية السكري ، والتلف الكلوي التجريبي (Zeng and Zhou ، 2002 ؛ Morgado-Pascual et al. ، 2019). تم تأكيد BRD4 للمشاركة في عملية النسخ المعتمدة على العامل النووي B (NF-κB) لتنظيم الاستجابات الالتهابية في العديد من الأمراض (Xu and Vakoc ، 2014 ؛ Suarez-Alvarez et al. ، 2017). يمكن تجنيد BRD4 بواسطة أسيتيل RelA (الوحدة الفرعية NF-κB ، جين ترميز البروتين) في lysine 310 (RelA-K310ac) عبر نطاقات البرومود ، وبالتالي تنشيط كيناز 9 المعتمد على السيكلين (CDK9) وفسفرة الحمض النووي الريبي بوليميريز II لتعزيز نسخ الجينات المستهدفة NF-B (Hajmirza et al. ، 2018). تشير الدراسات الحديثة إلى أن مثبطات BRD4 يمكن أن تكون خيارًا علاجيًا محتملاً للأمراض الالتهابية. في نماذج إصابة الحبل الشوكي عند الفئران ، أدى تثبيط BRD4 إلى تخفيف الاستجابة الالتهابية وتعزيز الاسترداد الوظيفي للخلايا الدبقية الصغيرة (Dey et al. ، 2019). أيضًا ، أدى تثبيط BRD4 إلى إلغاء الالتهاب الكلوي التجريبي في نماذج الفئران لانسداد الحالب أحادي الجانب ، ومضاد الغشاء القاعدي GN ، وتسريب أنجيوتنسين 2 (Suarez-Alvarez et al. ، 2017).

في ضوء التأثيرات المحتملة المؤيدة للالتهابات لـ Cd والتأثيرات التنظيمية لـ BRD4 على الالتهاب ، افترضنا أن BRD4 متورط في الاستجابة الالتهابية التي تسببها Cd. كما هو متوقع ، يتوسط BRD4 في عملية نسخ السيتوكينات الالتهابية في نماذج كلى الفئران المعرضة للكادميوم. تكشف دراستنا عن آلية محتملة في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم وتقدم رؤى جديدة في علاج السمية الكلوية التي يسببها الكادميوم.

2. المواد والأساليب

2.1. الكيماويات والأجسام المضادة

تم شراء كلوريد الكادميوم (CdCl2 ، لا مائي ، 439800) من Sigma-Aldrich (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). (plus) -JQ1 (HY -13030) تم الحصول عليها من MedChemExpress (Monmouth Junction ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مجموعة استخلاص البروتين النووي من معهد Beyotime للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي ، الصين ، P0027). تم الحصول على مجموعة إضاءة كيميائية فعالة (ECL ، 32209) وكاشف فحص بروتين حمض البيسينشونينيك (BCA ، 23225) من Thermo Fisher Scientific (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام الأجسام المضادة الأولية ضد البروتينات التالية: تم شراء NF-κB p65 (10745-1- AP) و IL -1 (26048-1- AP) و TNF- (17590-1- AP) من مجموعة Proteintech (ووهان ، الصين) ؛ - اكتين (3700 ثانية) ، هيستون H3 (His3 ، 4499) ، Sirtuin 1 (Sirt1 ، 8469) ، أرنب عادي IgG (IgG ، 4394) تم شراؤها من Cell Signaling Technology (Danvers ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ تم شراء BRD4 (ab128874) ، K (ليسين) أسيتيل ترانسفيراز 3 (KAT3B / Ep300 ، ab14984) ، NF-κB RelA (أسيتيل K310) (RelA-K310ac ، ab19870) ، Alexa Fluor® 488 –مضاد للأرنب المترافق (ab150073) من Abcam (كامبريدج ، المملكة المتحدة). الأجسام المضادة الثانية: Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) و Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) تم شراؤها من Jackson ImmunoResearch (West Grove ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية ).

2.2. الحيوانات والتجارب

تم شراء أربعة وعشرين فأرًا من جرذان Sprague-Dawley (ذكور ، 6 أسابيع ، 110-120 جم) من شركة Pengyue Experimental Animal Breeding Co. ، Ltd (جينان ، شاندونغ ، الصين). سُمح للفئران بالوصول المجاني إلى الطعام والماء في غرفة يتم التحكم فيها بيئيًا (24 ± 5 ​​درجة ، 12 ساعة من الضوء / دورة مظلمة). كانت الإجراءات التجريبية قابلة للتطبيق على توجيه مجلس المجتمعات الأوروبية 2010/63 / EU للتجارب على الحيوانات ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة Yangzhou. بعد أسبوع واحد من التأقلم ، تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: (1) المجموعة الضابطة: تم حقنها داخل الصفاق بالمذيب المقابل (محلول ملحي فسيولوجي أو محلول {{11} هيدروكسي بروبيل - - سيكلوديكسترين). (2) مجموعة الكادميوم: CdCl2 (2 ملجم / كجم من وزن الجسم ، مذاب في محلول ملحي فسيولوجي) يحقن داخل الصفاق لمدة 5 أيام متتالية لإنشاء نموذج التسمم بالقرص المضغوط. (3) مجموعة Cd plus JQ1: CdCl2 (2 مجم / كجم من وزن الجسم) يتم حقنها داخل الصفاق لمدة 5 أيام متتالية لإنشاء نموذج التسمم بالقرص المضغوط ، و JQ1 (25 مجم / كجم من وزن الجسم ، مذاب في 2- هيدروكسي بروبيل {{ يتم حقن 25}} محلول دكسترين حلقي) داخل الصفاق في اليوم 6-8. (4) مجموعة JQ1: JQ1 (25 مجم / كجم من وزن الجسم) يتم حقنها داخل الصفاق في الأيام 6-8. تم إدراج إحصائيات محتوى الكادميوم في مصل الفئران وأنسجة الكلى في الجدول S1 ، مما يعكس التأسيس الناجح لنماذج الفئران المعرضة للقرص المضغوط.

بعد 8 أيام من العلاج ، قُتلت الفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العميق بعد 12 ساعة من الصيام. تم تشريح أنسجة الكلى وتم تخزين أنسجة 1 جم من كل كلية بسرعة عند -80 درجة مئوية لمتابعة اللطخة الغربية وتحليل PCR الكمي (qPCR). تم إصلاح الكمية المتبقية من الأنسجة بسرعة في 4 في المائة لامتصاص العرق (PFA) لتلطيخ المناعي الكيميائي (IHC).

2.3 زراعة الخلايا وعلاجها

تم الحصول على خط خلايا الكلى لدى الفئران (NRK {0} E) من Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. NRK -52 تمت زراعة الخلايا E باستخدام وسيط Dulbecco المعدّل (DMEM ، Gibco ، 12800-017) الذي يحتوي على 5 بالمائة من مصل الأبقار الجنيني (FBS ، Gibco ، 10437-028) ، البنسلين ، والستربتومايسين (1 0 0 وحدة / مل) في حالة رطبة بنسبة 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95 بالمائة من الهواء عند 37 درجة. تم تخزين CdCl2 (ماء عالي النقاوة - مذاب) و JQ1 (ثنائي ميثيل سلفوكسيد مذاب) بشكل منفصل عند 4 درجات و - 20 درجة ، وتم تخفيفه في محاليل عمل قبل الاستخدام. كان التصميم التجريبي على النحو التالي: (1) تمت معالجة الخلايا بـ 0 ، 2.5 ، 5 ، 10 ميكرومتر Cd لمدة 12 ساعة ، أو 5 ميكرومتر Cd لمدة 0 ، 6 ، 12 ، 24 ساعة لإجراء الاختبارات اللاحقة. (2) عولجت الخلايا بـ 5 ميكرومتر Cd و / أو 0.5 ميكرومتر JQ1 لمدة 12 ساعة لإجراء الاختبارات اللاحقة. (3) تم نقل الخلايا باستخدام siBRD4 و / أو معالجتها بـ 5 ميكرومتر Cd لمدة 12 ساعة أخرى لإجراء الاختبارات اللاحقة.

2.4 تعداء الحمض النووي الريبي المتداخل الصغيرة

نقلنا 20 نانومتر BRD4 من الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siBRD4 ، Invitrogen ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى خلايا NRK -52 E بواسطة كاشف نقل العدوى Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific ، Cat # 13778150) لمدة 24 ساعة وفقًا لأدلة المنتج. تم استخدام المعنى التالي siRNAs:

siBRD4 ، مع تسلسل مستهدف 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA -3 ′ ؛

siCt (تحكم سلبي siRNA) ، مع تسلسل مستهدف 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ′.

2.5 النشاف الغربي

تم تحليل عينات أنسجة الكلى وخلايا NRK {0}} في محلول RIPA يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني لاستخراج البروتين الكلي. تم تحضير البروتين النووي من الأنسجة والخلايا الطازجة مسبقًا وتخزينها عند -80 درجة. تم فصل عينات البروتين (20-30 ميكروغرام لكل عينة) بواسطة الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، ثم نقلت إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (ميليبور ، ISEQ00010). تم حظر الأغشية باستخدام حليب مقشود بنسبة 5 في المائة لمدة 90 دقيقة ، واحتضانها لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مع الأجسام المضادة الأولية التالية: -اكتين (1: 5000) ، NF-κB p65 (1: 1000) ، IL -1 ( 1: 600) ، TNF- (1: 600) ، BRD4 (1: 1000) ، Ep300 (1: 1000) ، Sirt1 (1: 1000) ، His3 (1: 1000) ، RelA-K310ac (1: 1000). ثم تم غسل الأغشية باستخدام TBST واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية المقابلة (1: 10000) لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة (RT). تم تحضين الأغشية باستخدام اللمعان الكهربائي (ECL ، ThermoFisher Scientific) وتم تحديدها على Chemidoc XRS (Bio-Rad ، Marnes-La Coquette ، فرنسا) ، وتم تحليل الكثافة الضوئية باستخدام ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، إم دي ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.6. تلطيخ المناعي (IF)

نمت الخلايا الإلكترونية NRK {0} المصنفة في 24- صفيحة آبار إلى حوالي 6 0 بالمائة من التقاء. عولجت الخلايا بـ 5 ميكرومتر من الكادميوم و / أو 0.5 ميكرومتر JQ1 لمدة 12 ساعة ، ثم تم إصلاحها باستخدام PFA (4 بالمائة ، 10 دقائق) ، تم نفاذه باستخدام Triton X - 100 (0.1 بالمائة ، 15 دقيقة) ، محجوبًا باستخدام BSA (2 بالمائة ، 90 دقيقة) عند درجة حرارة الغرفة ، واحتضانها بالأجسام المضادة الأولية (NF-B p65 ، تخفيف 1:50) طوال الليل عند 4 درجات. بعد غسلها ببرنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد ثانوي (تخفيف 1: 500) لمدة 90 دقيقة ، ومع DAPI لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة ، ثم لوحظت الخلايا تحت مجهر متحد البؤر. تم تحليل الانتقال النووي NF-B في ثلاث دراسات مستقلة.

2.7. qPCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي لأنسجة الكلى وخلايا NRK {0}} E باستخدام مجموعة RNAiso Plus (Takara Bio ، Shiga ، اليابان). تم استخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتجميع (كدنا) السلسلة الأولى وفقًا لدليل الشركة المصنعة (روش ، بازل ، سويسرا). تم أخذ 2 ميكرولتر من الحمض النووي التكميلي (cDNA) لكل بئر للكشف عن مستويات الرنا النسبي باستخدام نظام LightCycler® 96 Real-Time PCR (Roche). احسب مستويات mRNA النسبية وفقًا للمعادلة 2- △△ CT. تم سرد الاشعال في الجدول S2. - كان اكتين جين مرجعي للفئران.

2.8. الترسيب المناعي المشترك (Co-IP)

تم تحليل أنسجة الكلى وخلايا NRK -52 في محلول تحلل الخلايا الطازج (20 ملي مولار HEPES-KOH pH 7.5 ، 150 ملي مول / لتر كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مول / لتر EDTA ، 1 بالمائة Triton X {{8} }) تحتوي على PMSF. تم خلط خرز البروتين G (100 ميكرولتر لكل عينة ، Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 2 ميكروغرام BRD4 أو RelA-K310ac أو جسم مضاد IgG لكل عينة ، وتم تدويرها لمدة 10 دقائق عند RT. بعد ذلك ، تم تحضين محلول البروتين الكلي مع مركب حبيبات - جسم مضاد طوال الليل عند 4 درجات. بعد غسلها بمخزن تحلل الخلية ثلاث مرات ، تم تعليق الراسبات المناعية باستخدام محلول عازل 1 × SDS PAGE لتكوين العينات. تم الكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام النشاف الغربي مع الأجسام المضادة الأولية لـ BRD4 و Anti-RelA K310ac.

2.9 تحليل احصائي

تم الحصول على جميع البيانات من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل وتم التعبير عنها على أنها متوسط ​​± SEM ما لم يذكر خلاف ذلك. تمت مقارنة المجموعات التجريبية عن طريق اختبار t للطالب ثنائي الذيل أو تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام SPSS 22. 0 (SPSS Inc.، Chicago، IL، USA). تم تعيين المعنى عند p <0.>

3. النتائج

3.1. يحث الكادميوم على التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في الجسم الحي وفي المختبر

باعتباره ملوثًا بيئيًا ، فقد ثبت أن الكادميوم يسبب تلفًا في الكلى من خلال تنظيم سلسلة من العمليات البيولوجية (Wang et al.، 2019c). في هذه الدراسة ، تم فحص التغييرات في مستويات النسخ من السيتوكينات الالتهابية بعد التعرض للـ Cd للتحقق مما إذا كان الالتهاب متورطًا في السمية الكلوية التي يسببها الكادميوم. أظهرت البيانات أن التعرض للقرص المضغوط أدى إلى زيادة كبيرة في الإنترلوكين (IL) -1 وعامل نخر الورم (TNF) - مستويات البروتين في الخلايا E NRK -52 (الشكل 1 أ-ب) وأنسجة الكلى لدى الفئران (الشكل 1 ج) -د). وفي الوقت نفسه ، كما هو موضح في الشكل 1E-F ، عزز التعرض للكادميوم مستويات النسخ من السيتوكينات الالتهابية (IL -1 ، IL -6 ، TNF- ، و (Monocyte chemoattractant protein -1) MCP -1) في الجسم الحي وفي المختبر. تشير هذه النتائج إلى أن الكادميوم يحث على التعبير عن السيتوكينات الالتهابية في كلى الفئران.

3.2 يشارك BRD4 في عملية نسخ السيتوكينات الالتهابية التي يسببها الكادميوم

BRD4 هو منظم جيني موصوف حديثًا يرتبط بالهيستونات الأسيتيل أو غير الهيستون لتنظيم عمليات الالتهاب في العديد من الأمراض. هنا ، تم استخدام مثبط BRD4 JQ1 و BRD 4- siRNA لفحص دور BRD4 في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم. أظهرت البيانات أن مستويات البروتين IL -1 و TNF- المرتفعة Cd تم تنظيمها عن طريق علاج JQ1 في الجسم الحي وفي المختبر (الشكل 2A-D) وبضربة قاضية BRD4 في المختبر (الشكل S1A-B). وفي الوقت نفسه ، أدى علاج JQ1 إلى تثبيط مستويات النسخ المحسن للـ Cd لـ IL -1 و IL -6 و TNF- و MCP -1 في خلايا NRK -52 E (الشكل 2E) وأنسجة الكلى الفئران (الشكل 2F). أيضًا ، خفضت ضربة قاضية BRD4 بشكل ملحوظ مستويات النسخ المتزايدة من الكادميوم من السيتوكينات الالتهابية في الخلايا E NRK -52 (الشكل S1C). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن BRD4 هو منظم مهم للاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم في كلى الفئران.

3.3 تظل مستويات تعبير BRD4 دون تغيير بعد التعرض للقرص المضغوط

بعد ذلك ، تم الكشف عن تغييرات في مستويات التعبير عن BRD4 بعد التعرض للقرص المضغوط. عولجت الخلايا NRK -52 باستخدام الكادميوم تحت تدرج تركيز ، وحُقنت الفئران داخل الصفاق بالكادميوم لمدة 5 أيام لتوضيح تأثير الكادميوم على تعبير BRD4 في الكلى في الجسم الحي وفي المختبر. أظهرت النتائج أن مستويات البروتين BRD4 لم تتغير في كل من الخلايا E المعرضة للـ Cd -52 (الشكل 3A-B) وأنسجة الكلى لدى الفئران (الشكل 3C-D). أيضًا ، لم تتغير مستويات BRD4 mRNA بعد التعرض لـ Cd (الشكل 3E-F). تشير هذه النتائج إلى أن BRD4 يتوسط الاستجابة الالتهابية التي تسببها الأقراص المضغوطة لا تعتمد على التغييرات في مستوى التعبير.

3.4. BRD4 ينظم النقل النووي NF-B الذي يروج لـ Cd

تم استكشاف أدوار BRD4 في الاستجابة الالتهابية التي تسببها Cd في دراستنا. يرتبط تغيير مسار إشارات NF-B ارتباطًا وثيقًا بنسخ السيتوكينات الالتهابية (تشي وآخرون ، 2021). وجدت دراستنا أن BRD4 متورط في الإزاحة النووية المنظمة للقرص المضغوط وتفعيل NF-B. أولاً ، تم تحديد التوطين الخلوي لـ NF-B بواسطة تلطيخ IF وتلطيخ IHC. أظهرت البيانات في الشكلين 4 أ و د أن JQ1 يثبط الانتقال النووي NF-B المعزز للـ Cd في خلايا NRK -52 E وأنسجة الكلى لدى الفئران. في غضون ذلك ، أظهرت نتائج اللطخة الغربية أن JQ1 قلل بشكل ملحوظ مستويات البروتين النووي المتزايدة من الكادميوم لـ NF-B في الجسم الحي (الشكل 4B-C) وفي المختبر (الشكل 4E-F). وبالمثل ، أدت ضربة قاضية BRD4 أيضًا إلى تثبيط الانتقال النووي NF-B المُروج للـ Cd (الشكل S2A) وخفض مستويات البروتين النووي المتزايد الكادميوم لـ NF-κB (الشكل S2B-C) في خلايا NRK -52 E. مجتمعة ، يمكن أن يؤدي تثبيط BRD4 إلى تقليل الانتقال النووي NF-B الذي يروج له الكادميوم ، مما يشير إلى أن BRD4 يتوسط في تنشيط مسار إشارات NF-B في الكلى بعد التعرض لـ Cd.

3.5 يزيد القرص المضغوط من مستويات أسيتيل RelA K310

أكدت الدراسات أن BRD4 يرتبط بـ RelA K310 الأسيتيل من خلال مجالات البروم لتنظيم النسخ المعتمد على NF- B (Morgado-Pascual et al.، 2019؛ Zhong et al.، 2018). وهكذا ، تم الكشف عن مستوى الأستلة في RelA K310 والتعبير عن إنزيمين. أظهرت البيانات أن مستويات بروتين RelA-K310ac و acetylase Ep300 انخفضت باستمرار مع زيادة تركيز الكادميوم ، بينما زاد مستوى بروتين ديستيلاز Sirt1 تدريجيًا في NRK -52 الخلايا E (الشكل 5 أ-ب) وأنسجة الكلى لدى الفئران (الشكل 5 أ-ب). . 5C-D). أيضًا ، أظهرت مستويات Ep300 و Sirt1 mRNA نفس الاتجاهات (الشكل 5E-F). تشير هذه النتائج إلى أن الكادميوم يعزز مستوى الأستلة في RelA K310 ، وبالتالي قد يكون BRD4 متورطًا في نسخ السيتوكينات الالتهابية التي يسببها الكادميوم في الكلى.

3.6 يزيد القرص المضغوط من ارتباط BRD4 بـ RelA-K310ac لتحسين وظيفة النسخ

الارتباط بمواقع الأسيتيل هو الأساس لتنظيم النسخ لـ BRD4 (Huang et al. ، 2009). للتحقق مما إذا كان Cd ينظم وظيفة BRD4 عن طريق زيادة ربط BRD4 بـ RelA-K310ac ، تم اكتشاف التفاعل بين RelA-K310ac و BRD4 عبر Co-IP. أظهرت البيانات الواردة في الشكل 6 أ أن الكادميوم عزز بشكل كبير التفاعل بين RelA-K310ac و BRD4 في خلايا NRK -52 E ، والتي تم تخفيفها عن طريق علاج JQ1 أو ضربة قاضية BRD4. أيضا ، لوحظ نفس الاتجاه في أنسجة الكلى الفئران (الشكل 6 ب). توضح هذه النتائج أن الكادميوم يعزز ارتباط BRD4 بـ RelA-K310ac ، والذي يعزز النسخ المعتمد على NF- B ويساهم لاحقًا في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم.

4. مناقشة

تم الإبلاغ عن الكادميوم باعتباره محفزًا محتملاً للالتهاب بسبب سميته العالية ، في حين أن الآلية الدقيقة لا تزال غير مفهومة تمامًا (Arab-Nozari et al. ، 2020 ؛ Ghosh ، 2018). أكدت دراستنا أن الكادميوم يحفز تعبير السيتوكينات الالتهابية في خلايا الفئران الكلوية ، ووجدنا أن BRD4 ، وهو هدف جيني له وظائف حرجة في سلسلة من العمليات الخلوية بما في ذلك الالتهاب ، يساهم في الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم. أشارت تجارب أخرى إلى أن BRD4 متورط في تنشيط مسار إشارات NF-B المعزز بـ Cd. أيضًا ، زاد الكادميوم من مستوى الأستلة في RelA K310 ، وبالتالي زاد ارتباط BRD4 بـ NF-B RelA الأسيتيل لتعزيز نسخ السيتوكينات الالتهابية المعتمدة على NF-B.

الالتهاب هو أحد آليات الدفاع الطبيعية ضد المواد الكيميائية الخارجية ، في حين أن الاستجابة الالتهابية غير الخاضعة للرقابة وغير المناسبة يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة الطبيعية وتحفز أمراض المناعة الذاتية (جيان وآخرون ، 2018). غالبًا ما ارتبطت العلامات البيولوجية المتزايدة من الكادميوم للالتهاب بأمراض مختلفة. أظهرت الدراسات أن الالتهاب الناجم عن الكادميوم متورط في تصلب الشرايين (تينكوف وآخرون ، 2018). علاوة على ذلك ، عزز الكادميوم التعبير عن السيتوكينات الالتهابية ، مما ساهم في تلف أنسجة الرئة والخصية ويسبب تسمم الكبد (كوبسامي نايدو وآخرون ، 2019 ؛ عرفة وآخرون ، 2014). تتوافق هذه الآثار الضارة مع نتائجنا ، حيث أن الاستجابة الالتهابية متورطة في إصابة الكلى التي يسببها الكادميوم. ركزت الأبحاث المتزايدة على آليات حدوث الالتهاب الناجم عن الكادميوم. كعضو في عائلة بروتين BET المدروسة جيدًا ، يلعب BRD4 دورًا مهمًا في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الالتهاب. هنا ، تم استخدام JQ1 (مثبط لـ BRD4) و siRNA لتحرير النشاط الوظيفي لـ BRD4 ووجد أن تثبيط BRD4 قلل من النسخ الناجم عن Cd للسيتوكينات الالتهابية في كلى الفئران ، مما يشير إلى أن BRD4 يشارك في الاستجابة الالتهابية الناتجة عن الكادميوم. . يُعتقد عمومًا أن خلل تنظيم تعبير BRD4 هو حدث حاسم في حدوث الاستجابة الالتهابية. في إصابة الحبل الشوكي ، والتضخم القلبي المرضي ، والأمراض الأخرى المرتبطة بالالتهابات ، ساهم تعبير BRD4 المضطرب في التعبير عن السيتوكينات الالتهابية (Zhu et al. ، 2020 ؛ Marazzi et al. ، 2018 ؛ Ren et al. ، 2019). ومع ذلك ، لم يكن للـ Cd أي تأثير على مستويات التعبير عن BRD4 في ظل الظروف التجريبية الحالية ، مما دفعنا إلى التفكير فيما إذا كان BRD4 يتوسط الاستجابة الالتهابية التي تسببها الكادميوم عبر مسارات أخرى.

NF-B هو عامل تنظيمي مهم في العمليات الالتهابية وهو مسؤول عن التحكم في التعبير عن العديد من الوسطاء الالتهابيين (لورانس ، 2009). تم الإبلاغ عن دراسات أن BRD4 تشارك في تنظيم مسار إشارات NF-B. هوانغ وآخرون. (2017) اقترح أن BRD4 ينظم تنشيط NF-B بوساطة IKK من خلال مسارات p38 و JNK-MAPK. وانغ وآخرون. (2019 أ) وجد أن ضربة قاضية BRD4 أو علاج JQ1 منعت مسار إشارات NF-B المنشط لعديد السكاريد الدهني (LPS) في الخلايا الدبقية الصغيرة. منغ وآخرون. (2014) أظهر أن علاج JQ1 منع التعبير عن السيتوكينات الالتهابية عن طريق تثبيط تنشيط NF-B في خلايا RAW 264.7 المعالجة بـ LPS. أشارت هذه التقارير إلى أن BRD4 يتوسط في تنشيط NF-B في العديد من نماذج الالتهاب بينما يُعد تثبيط BRD4 نهجًا علاجيًا فعالًا لمكافحة الالتهاب. في الدراسة الحالية ، منع تثبيط BRD4 الانتقال النووي لـ NF-B في أنسجة الكلى للفئران المعرضة للكادميوم وخلايا NRK -52 E ، مما يشير إلى أن BRD4 يتوسط مسار إشارات NF-B الذي ينشط على شكل قرص مضغوط.

عادةً ، بعد تنشيط NF-B بواسطة محفزات مختلفة وينتقل إلى النواة ، يرتبط BRD4 بـ NF-B RelA المؤسس في موقع K310 ، مما يزيد من استقراره ونشاط النسخ في النواة (Hajmirza et al. ، 2018). وبالتالي فإن مستوى الأستلة في RelA K310 يؤثر على الوظيفة التنظيمية لـ BRD4 على الاستجابة الالتهابية. في الخلايا العصبية الحصينية ، توسط نزع الأسيتيل Sirt1 RelA K310 لتنظيم التعبير BACE1 ، مما ساهم في إنتاج الأميلويد العصبي (Flores-Leon et al. ، 2019). في خلايا الورم الأرومي الدبقي ، أدى إجهاد العلاج الضوئي إلى خفض مستوى نزع الأسيتيل Sirt1 وتنشيط acetylase Ep300 ، مما أدى إلى زيادة مستويات RelA-K310ac وأدى إلى زيادة إنتاج أكسيد النيتريك المؤيد للبقاء (Fahey et al. ، 2019). وجدت دراستنا أن Cd يعزز مستوى acetylation لـ RelA K310 عن طريق زيادة تعبير Ep300 وتقليل تعبير Sirt1 ، مما يشير إلى أن Cd يؤثر على الوظيفة التنظيمية BRD4 عن طريق زيادة مستويات acetylation لـ RelA K310.

والجدير بالذكر أن نتائجنا أظهرت أن علاج JQ1 كان أكثر فعالية من ضربة قاضية BRD4 في التخفيف من الاستجابة الالتهابية التي يسببها الكادميوم. يحتوي JQ1 على تقارب ارتباط عالٍ مع BRD4 ويمكن أن يمنع ارتباط BRD4 تمامًا بالكروموسوم ، بينما يمكن أن يتداخل siBRD4 فقط مع تعبير بروتين BRD4 لتقليل ارتباط BRD4 بالموقع المستهدف ، مما يشير إلى أن BRD4 يتوسط الاستجابة الالتهابية التي تسببها Cd قد تعتمد على ملزمة مع الأسيتيل NF-B RelA. أظهرت الدراسات الحديثة آلية تنظيمية مماثلة: بعد النقل والتفعيل النووي لـ NF-B ، تفاعل BRD4 بعد ذلك مع الأسيتيل RelA لتنشيط التنشيط النسخي لـ NF-B (Huang et al. ، 2009). تم تجنيد RelA-BRD4 إلى المروجين الهدف NF-B في ظروف تحفيز التهابية مختلفة ، بينما عمل علاج JQ1 عن طريق منع ارتباط BRD4 بـ NF-B RelA ، وبالتالي تقليل نشاط النسخ لـ NF-B (Zou et al. ، 2014). أظهرت نتائجنا أن تثبيط BRD4 يحجب التفاعل المعزز Cd بين BRD4 و RelA-K310ac في كلى الفئران ، مما يدعم نتائجنا أعلاه التي تثبط BRD4 وتثبط نشاط النسخ الناجم عن Cd لـ NF-B ، مما يشير إلى أن Cd يعزز ارتباط BRD4 بالأسيتيل. NF-κB RelA لزيادة نسخ السيتوكينات الالتهابية.

باختصار ، كشفت دراستنا عن الآليات التنظيمية لـ BRD4 في الاستجابة الالتهابية التي تسببها الكادميوم في كلى الفئران: (1) يتوسط BRD4 الإزاحة النووية التي يسببها NF-κB وتنشيطها. (2) يزيد الكادميوم من مستويات الأستلة RelA K310 ويعزز ارتباط BRD4 بالأسيتيل NF-B RelA ، والذي يعزز نسخ السيتوكينات الالتهابية المعتمدة على NF-B. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تثبيط BRD4 خفف بشكل كبير من مستويات السيتوكين الالتهابي المرتفع Cd ، مما يشير إلى أن BRD4 المستهدف لديه القدرة على تطويره كوسيلة فعالة لعلاج الأمراض الالتهابية بما في ذلك التهاب الكلية الناجم عن Cd.

بيان مساهمة التأليف CRediT

Zhongguo Gong: التصور ، المنهجية ، التصور ، التحليل الرسمي ، التحقق من الصحة ، التحقيق ، التحليل الرسمي ، تنظيم البيانات ، الكتابة - المسودة الأصلية. جانج ليو: تصور المفاهيم ، المنهجية ، التصور ، تنظيم البيانات ، الكتابة - المسودة الأصلية ، إدارة المشروع ، الحصول على التمويل. Wenjing Liu: البرمجيات والموارد والمنهجية والتحليل الرسمي. Hui Zou: إدارة المشروع ، الإشراف. Ruilong Song: البرمجيات ، التحليل الرسمي ، الإشراف. Hongyan Zhao: برنامج ، تحليل رسمي ، إشراف. يان يوان: الإشراف. Jianhong Gu: الإشراف. Jianchun Bian: اقتناء التمويل والإشراف. Jiaqiao Zhu: الكتابة - مراجعة وتحرير ، إشراف. Zongping Liu: الكتابة - مراجعة وتحرير ، إشراف ،

إدارة المشروع ، حيازة التمويل ، وضع المفاهيم.

إعلان تضارب المصالح

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل الوارد في هذه الورقة.

إعتراف

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31872533 ، 31902329 ، 32072933) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير في الصين (رقم 2016YFD0501208) ، ومشروع تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية للتعليم العالي في جيانغسو المؤسسة (PADP). تم تحرير المخطوطة من أجل اللغة الإنجليزية الصحيحة ، والقواعد ، وعلامات الترقيم ، والهجاء ، والأسلوب العام من قبل واحد أو أكثر من المحررين الناطقين باللغة الإنجليزية المؤهلين تأهيلا عاليا في ELIXIGEN.

مراجع

المير ، RS ، البعشر ، GI ، العريفي ، س ، القحطاني ، س ، علي ، د ، عبد المنعم ، عبدالمنعم ، 2019. غذاء ملكات النحل يخفف من السمية الكلوية التي يسببها الكادميوم في ذكور الفئران. علوم. ممثل 9 (1) ، 5825.

Arab-Nozari، M.، Mohammadi، E.، Shokrzadeh، M.، Ahangar، N.، Amiri، FT، Shaki، F.، 2020. إن التعرض المشترك لمستويات غير سامة من الكادميوم والفلوريد يؤدي إلى تسمم الكبد في الفئران عن طريق مما يؤدي إلى حدوث ضرر مؤكسد للميتوكوندريا ، وموت الخلايا المبرمج ، ومسارات NF-kB. بيئة. علوم. بولوت. الدقة. كثافة العمليات 27 (19) ، 24048-24058.

عرفة ، محمد ، عطية ، عطية ، 2014. مسحوق بذور الحلبة يخفف من تلف الخصية الناجم عن الكادميوم والسمية الكبدية في ذكور الجرذان. إكسب. توكسيكول. باتول. 66 (7) ، 293-300.

Chatterjee، N.، Bohmann، D.، 2018. BET-ting on Nrf2: كيف يمكن أن تؤثر إشارات Nrf2 على الأنشطة العلاجية لمثبطات بروتين BET. Bioessays 40 (5) ، 1800007.

Chi، Q.، Zhang، Q.، Lu، Y.، Zhang، Y.، Xu، S.، Li، S.، 2021. التهاب الشرايين الناقص. الأكسدة والاختزال بيول. 44 ، 102003 داي ، إيه ، يانغ ، دبليو ، جيغون ، إيه ، نيشياما ، إيه ، بان ، آر ، ياغي ، آر ، جرينبيرج ، إيه ، فينكلمان ، إف دي ، فايفر ، كيه ، تشو ، جي .، Singer، D.، Zhu، J.، Ozato، K.، 2019. BRD4 يوجه تطوير الخلايا الجذعية المكونة للدم وينظم الاستجابات الالتهابية للبلاعم. EMBO J. 38 (7)

فاجربيرج ، ب، Y. ، Barregard ، L. ، Sallsten ، G. ، Forsgard ، N. ، Hedblad ، B. ، Persson ، M. ، Engstrm، G.، 2017. يرتبط التعرض للكادميوم بمستقبل منشط البلازمينوجين urokinase القابل للذوبان ، وهو علامة منتشرة للالتهاب وأمراض القلب والأوعية الدموية في المستقبل. بيئة. الدقة. 152 ، 185 - 191.

Fahey ، JM ، Korytowski ، W. ، Girotti ، AW ، 2019. تؤدي أحداث الإشارات الأولية إلى زيادة إنتاج أكسيد النيتريك المؤيد للبقاء في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تواجه تحديًا ديناميكيًا. راديك مجاني. بيول. ميد. 137 ، 37-45.

Fernando، TD، Jayawardena، BM، Mathota Arachchige، YLN، 2020. تباين المستقلبات المختلفة والمعادن الثقيلة في Oryza sativa L. ، المتعلقة بمرض الكلى المزمن مجهول السبب في سريلانكا. الكيموسفير 247 ، 125836.

Flores-Leon، M.، Perez-Dominguez، M.، Gonzalez-Barrios، R.، Arias، C.، 2019. يرتبط نضوب NAD (زائد) الناجم عن حمض البالمتيك بانخفاض وظيفة SIRT1 وزيادة التعبير عن BACE1 في الخلايا العصبية الحُصين. نيوروتشيم. الدقة. 44 (7) ، 1745-1754.

Ghosh، KNI، 2018. يحفز علاج الكادميوم داء المشوكات وتلف الحمض النووي والالتهاب والاستماتة في الأنسجة القلبية لفئران ويستار البيضاء. بيئة. توكسيكول. فارماكول. 59 ، 43-52. الالتهابات والسرطان. الطب الحيوي 6 (1) ، 16.

Horiguchi، H.، Oguma، E.، 2016. يؤدي التعرض الحاد للكادميوم إلى زيادة العدلات لفترات طويلة جنبًا إلى جنب مع تأخر تحريض عامل تحفيز مستعمرة المحببات في كبد الفئران. قوس. توكسيكول. 90 (12) ، 3005-3015.

حسين خنازير ، ن. ، عزيزي ، ج ، إسلامي ، س ، الحسن محمد ، هـ ، فاياز ، ف ، حسين زاده ، ر. ، عثمان ، أب ، كمالي ، أن ، محمدي ، هـ ، جديدي نيارا ، F.، Dehghanifard، E.، Noorisepehr، M.، 2020. آثار التعرض للكادميوم في تحريض الالتهاب. إمونوفارماكول. السمية المناعية. 42 (1) ، 1-8.