الشيخوخة تعيد أسلاك الاستشعار عن البيئة الدقيقة لتسهيل المناعة المضادة للأورام

خلاصة

تتضمن الشيخوخة الخلوية توقفًا مستقرًا للدورة الخلوية مقترنًا ببرنامج إفرازي يحفز، في بعض الحالات، التصفية المناعية للخلايا الهرمة. باستخدام نموذج سرطان الكبد ذي الكفاءة المناعية، والذي يؤدي فيه الشيخوخة إلى رفض الورم بواسطة الخلايا التائية CD8، نظهر أن الشيخوخة أيضًا تعيد تشكيل بروتين سطح الخلية لتغيير كيفية استشعار الخلايا السرطانية للعوامل البيئية، كما يتضح من النوع الثاني من الإنترفيرون (IFN). بالمقارنة مع الخلايا المتكاثرة، تقوم الخلايا الهرمة بتنظيم مستقبل الإنترفيرون، وتصبح شديدة الحساسية تجاه البيئة الدقيقة للإنترفيرون، وتحفز بقوة أكبر تأثيرات آلية تقديم المستضد التي يتم تلخيصها أيضًا في الخلايا السرطانية البشرية التي تخضع للشيخوخة المستحثة بالعلاج. يؤدي تعطيل استشعار الإنترفيرون في الخلايا الهرمة إلى إضعاف خلوصها المناعي دون تعطيل حالة الشيخوخة أو برنامجها الإفرازي المميز. تظهر نتائجنا أن الخلايا الهرمة تتمتع بقدرة معززة على إرسال واستقبال الإشارات البيئية وتعني أن كل عملية مطلوبة لمراقبتها المناعية الفعالة.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

دلالة:

يكشف عملنا عن تفاعل بين برامج إعادة تشكيل الأنسجة واستشعار الأنسجة التي يمكن أن تشارك فيها الشيخوخة في السرطانات المتقدمة لجعل الخلايا السرطانية أكثر وضوحًا لجهاز المناعة التكيفي. يؤسس هذا الوجه الجديد للشيخوخة تفاعلات إشارات غير متجانسة متبادلة يمكن تحفيزها علاجيًا لتعزيز المناعة المضادة للأورام.

مقدمة

الشيخوخة الخلوية عبارة عن برنامج استجابة للضغط النفسي يتميز بتوقف دورة الخلية المستقرة وبرنامج إفرازي قادر على إعادة تشكيل بيئة الأنسجة (1). في الأنسجة الطبيعية، تساهم الشيخوخة في توازن الأنسجة أثناء التئام الجروح؛ ومع ذلك، في الأنسجة القديمة أو التالفة، يمكن أن يسبب التراكم الشاذ للخلايا الهرمة التهابًا مزمنًا وانخفاض قدرة الأنسجة على التجدد (2-4). في السرطان، ثبت أن الشيخوخة تتوسط التأثيرات المفيدة والضارة على بيولوجيا الأنسجة. من ناحية، توفر الشيخوخة حاجزًا أمام تكون الأورام التي تبدأها الجينات المسرطنة وتساهم في النشاط المضاد للأورام في بعض علاجات السرطان (5، 6). من ناحية أخرى، فإن استمرار الخلايا السرطانية الهرمة بعد العلاج يمكن أن ينتج بيئة نسيجية تعزز الانتكاس والانتشار (7، 8). لا تزال الأسس الجزيئية لهذه النواتج البيولوجية المتعارضة غير مفهومة بشكل جيد. أحد جوانب برنامج الشيخوخة الذي من المحتمل أن يساهم في مثل هذه البيولوجيا المتنوعة هو النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP؛ المرجع 9). يتم تنشيط SASP من خلال عملية إعادة تشكيل الكروماتين العالمية التي تتطور ويتم التحكم فيها بواسطة منظمات جينية رئيسية مثل BRD4 وعوامل النسخ المسببة للالتهابات مثل NF-κB وC/EBP- (10-12). وهذا بدوره يؤدي إلى تحفيز الجينات التي تشفر بروتينات إعادة تشكيل الأنسجة مثل البروتينات المعدنية المصفوفية، وعوامل النمو، وعوامل تحلل الفيبرين المعروفة بأنها تلعب أدوارًا حاسمة في عملية التئام الجروح (3، 13، 14). تشتمل مكونات SASP الأخرى على الكيموكينات والسيتوكينات التي يمكن أن تغير تكوين وحالة الخلايا المناعية داخل الأنسجة، مما يؤدي إلى الاستهداف المناعي وإزالة الخلايا الهرمة نفسها (15، 16). ومع ذلك، فإن التراكم الشاذ للخلايا الهرمة في العديد من السياقات المرضية يعني أن الإزالة المناعية ليست نتيجة عالمية للشيخوخة أو SASP وتثير احتمال وجود آليات إضافية تملي التأثيرات المفيدة والضارة بشكل متناقض للشيخوخة في بيولوجيا الأنسجة والمراقبة المناعية. (17-19).

من المؤكد أن المراقبة المناعية المرتبطة بالشيخوخة يمكن أن يكون لها تأثيرات قوية مضادة للسرطان، على الرغم من أن آليات المستجيب الدقيقة تختلف باختلاف نوع الأنسجة والخلايا (10، 15، 16، 20). في نماذج الفئران من سرطان الخلايا الكبدية (HCC)، يتم التخلص من خلايا ورم الكبد التي يتم تحفيزها للشيخوخة بواسطة آليات تعتمد على المناعة والتي يشارك فيها النوع البري (WT) p53 (15). بالاتفاق، يتم تحور TP53 بشكل متكرر في سرطان الكبد البشري، خاصة في أورام "فئة الانتشار" التي تظهر أسوأ تشخيص (21، 22). على الرغم من أن العلاج المناعي وأدوية استهداف TP53- تظهر كاستراتيجيات واعدة لتحسين نتائج المرض، إلا أن الأساس الجزيئي للاستجابة والمقاومة يظل غير معروف (23-25). لذلك، فإن فهم الآليات التي تصبح بها خلايا ورم الكبد الهرمة مرئية للجهاز المناعي قد يسهل استراتيجيات تحفيز المناعة المضادة للأورام في سرطان الكبد الكبدي المتحول 53- والذي قد يمتد إلى أنواع الأورام الأخرى.

هنا، شرعنا في وضع مبادئ تعدل التعرف المناعي على الخلايا الهرمة وإزالتها لتحديد آليات الشيخوخة القابلة للتنفيذ والتي يمكن استغلالها لتحسين السيطرة المناعية على السرطان. ولتحقيق هذه الغاية، قمنا بتطوير نموذج جديد "محفز للشيخوخة" حيث يمكن تحويل خلايا سرطان الكبد بشكل انتقائي إلى حالة الشيخوخة من خلال التعديل الجيني لـ p53 الداخلي. لقد فكرنا في أن هذا من شأنه أن يحاكي تأثيرات العلاجات التي تؤدي إلى الشيخوخة (26، 27) مع تجنب التأثيرات المربكة للعلاجات المسببة للشيخوخة على الخلايا المناعية أو المكونات الأخرى لبيئة الأنسجة. باستخدام هذا النموذج ومن ثم توسيعه ليشمل أنظمة أخرى، نكشف أنه، بالإضافة إلى SASP، فإن الشيخوخة تؤدي إلى إعادة تشكيل رئيسية لبروتينات سطح الخلية وبرامج الإشارات بطريقة من المتوقع أن تغير بشكل أساسي الطريقة التي تشعر بها الخلايا وتستجيب للعوامل البيئية. الإشارات، المتمثلة هنا من خلال فرط الحساسية تجاه البيئة الدقيقة من النوع II IFN (IFN). تتيح هذه العملية تنظيمًا أكثر قوة لآلات معالجة المستضد وتقديمه في الخلايا السرطانية الهرمة، مما يجعلها عرضة للمراقبة المناعية في الجسم الحي. وهكذا، تكشف نتائجنا عن برنامج استشعار الأنسجة المعاد توصيله في الخلايا الهرمة، والذي يعمل بالتنسيق مع SASP لتعزيز إمكاناتها المناعية، وبالتالي تسهيل رفض الورم بوساطة المناعة.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

نتائج

نموذج 53-للأورام ذات الكفاءة المناعية القابلة للاستعادة لدراسة مراقبة الشيخوخة

لدراسة كيفية إعادة برمجة الشيخوخة للحالات الخلوية والأنسجة، استغلنا تقنية حقن الوريد الذيل الهيدروديناميكي (HTVI) (28) لإنشاء نموذج لسرطان الكبد محفز للشيخوخة يتم التحكم فيه بواسطة دبوس الشعر القصير p53 الخاص بالورم (shRNA). على وجه التحديد، تم نقل خلايا الكبد البالغة من فئران Bl/6 ذات الكفاءة المناعية في الجسم الحي باستخدام ناقل ناقلة SB13 للجمال النائم واثنين من بنيات الترانسبوزون (ترميز NrasG12D-IRES-rtTA وTRE-tRFP-shp53، أو "NSP") التي تندمج في الجينوم. . في نظام Tet-On هذا، يتم قمع p53 الداخلي في وجود الدوكسيسيكلين (Dox) من خلال تنشيط shRNA المحفز المرتبط بـ RFP (الشكل 1A)، مما يتيح التحكم الوراثي للشيخوخة في الأورام القائمة. تمشيا مع حدوث الطفرات التي تعمل على تعطيل TP53 وتنشيط مسارات إشارات تكاثر الخلايا (على سبيل المثال، PI3K / AKT و RAS / MAPK) في أورام الكبد البشرية، أدى التعاون بين RAS المسرطنة وقمع p53 إلى تحول خلايا الكبد، مع معظم تطورت الفئران بأورام ذات سمات متباينة بشكل سيئ بعد 5 إلى 8 أسابيع من الإصابة بفيروس HTVI. كشف التنميط النسخي أن أورام الفئران هذه تشبه فئة "انتشار" سرطان الكبد البشري (الشكل التكميلي S1A – S1F) ، وهي الفئة النموذجية لسرطان الكبد البشري الذي يؤوي طفرات TP53 (21 ، 22 ، 29).

استنادًا إلى العمل السابق (15)، توقعنا أن إعادة تنشيط p53 في النظام المذكور أعلاه من شأنه أن يؤدي إلى الشيخوخة وإشراك المناعة المضادة للأورام. وبناء على ذلك، أدى انسحاب دوكس إلى تراجع كبير في الورم على مدى عدة أسابيع، مما أدى إلى بقاء الحيوان لفترة طويلة (الشكل 1 ب و ج). كشف تحليل الأورام بعد 14 يومًا من انسحاب Dox عن التنظيم الناقص المتوقع لـ p53 shRNA (كما تصوره مراسل RFP المرتبط) وتراكم -galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA - - gal) دون أي تأثيرات ملحوظة على RAS-المؤثر p-ERK (الشكل 1D). وبالمثل، لوحظت زيادة في نشاط SA- - gal وملامح النسخ المرتبطة بـ SASP، إلى جانب توقف تكاثري مصاحب، في الخلايا السرطانية المستكشفة بعد 6 إلى 8 أيام من استعادة p53 (الشكل التكميلي S2A – S2H). تجدر الإشارة إلى أن إدخال هذه الثقافات (المحفوظة على Dox للحفاظ على إسكات p53) في الفئران ذات الكفاءة المناعية التي تتغذى على Dox أنتجت أورامًا ثانوية متزامنة وبؤرية تراجعت مع حركيات مماثلة مثل الأورام الأولية عند انسحاب Dox (الشكل 1B ؛ الشكل التكميلي S3A-) S3E). استبعدت تجارب التحكم باستخدام نظام Tet-Off أو دمج p53 shRNA التأسيسي احتمال أن يكون لـ Dox نفسه أي تأثير على سلوك الورم في نموذجنا (الشكل التكميلي S3F و S3G). ولذلك، يسمح هذا النظام بتحفيز الشيخوخة بشكل فعال في الخلايا السرطانية دون اللجوء إلى العلاجات التي يمكن أن تغير أيضًا الجهاز المناعي المضيف. ونظرًا لمرونته الإضافية، استخدمنا نموذج زرع العظام (المشار إليه فيما يلي باسم "NSP") للعديد من الدراسات الآلية الموضحة أدناه. كما كان متوقعا، كانت انحدارات الورم الملحوظة المذكورة أعلاه بوساطة مناعية. ومن ثم ، خضعت أورام NSP التي نشأت بعد عملية الزرع في الفئران Nude و Rag2 - / - Il2rg - / - (R2G2) التي تعاني من نقص المناعة إلى استجابة تثبيط الخلايا بارزة ولكنها فشلت في التراجع ، حيث أظهرت حيوانات R2G2 العيوب الأكثر عمقًا (الشكل 1E – G ؛ التكميلي) الشكل S3H وS3I). نظرًا لأن الفئران العارية معيبة في المناعة التكيفية وأن R2G2 معرض للخطر أيضًا في جوانب المناعة الفطرية، فإن هذه النتائج تشير ضمنًا إلى أن الجهاز المناعي التكيفي ضروري لتراجع الورم بكفاءة في النموذج وإنشاء سياق تجريبي يتم التحكم فيه جيدًا لاستكشاف الأساس الآلي لـ هذه الآثار.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

الشيخوخة تؤدي إلى التحول من التهرب المناعي للورم إلى التعرف على المناعة

لتوصيف تأثيرات الشيخوخة المثبطة للورم، قمنا بعد ذلك بتمييز البيئات المناعية الدقيقة للأورام التي تؤوي p53- المكبوت (يشار إليه باسم "المتكاثر") والمستعاد p53- (يشار إليه باسم "الشيخوخة" ) الخلايا السرطانية بعد أسبوع واحد من انسحاب دوكس، وهو الوقت الذي يتم فيه ظهور الشيخوخة، لكن الأورام لم تتراجع بعد (الأشكال التكميلية S2 وS3 وS4A). أظهرت الآفات التي تحتوي على خلايا ورم شيخوخة زيادة بمقدار ∼ 1.8- أضعاف في إجمالي الخلايا المناعية CD 45+ مقارنة مع عناصر التحكم المتكاثرة (الشكل 2A؛ المرجعان 15 و16). كشفت التحليلات المناعية والنسيجية (في اليوم التاسع بعد انسحاب دوكس) أن هذا ينطوي على زيادة ملحوظة في النسبة المئوية للخلايا الليمفاوية (الخلايا البائية، وخلايا CD4 T، وخلايا CD8 T) وانخفاض في النسبة المئوية لـ Gr 1+ الخلايا / العدلات الكابتة المشتقة من النخاع الشوكي (CD11b + Gr 1+ Ly6Clo؛ الشكل 2B؛ الأشكال التكميلية S4B). على الرغم من أن نسبة البلاعم كنسبة مئوية من إجمالي عدد سكان CD45 ظلت دون تغيير، فقد زادت الأعداد المطلقة بشكل ملحوظ (الشكل 2A وB؛ الشكل التكميلي S4C – S4E). ضمن مجموعة الخلايا التائية، أظهرت خلايا CD8 T المتراكمة علامات تجربة المستضد (CD44+، CD69+) وتضم عددًا متزايدًا من الخلايا المستجيبة (CD44+CD62L−؛ الشكل 2ج، المرجع 30). أدت إعادة التشكيل الشاملة للبيئة المناعية إلى زيادة كبيرة في CD3: نسبة العدلات للأورام التي تؤوي خلايا هرمة (الشكل التكميلي S4F)، وهي تأثيرات تتفق مع الزيادات المماثلة في CD3: نسبة العدلات التي ارتبطت بالتفاعل المناعي في الإنسان. أورام الكبد (31). يمكن تصور إعادة التصميم باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد بعد إزالة الأنسجة (الشكل 2D؛ الشكل التكميلي S4G وS4H؛ الفيديو التكميلي S1؛ المرجع 32).

الشكل 1. نموذج الورم 53-القابل للترميم لدراسة المراقبة المناعية للشيخوخة. أ، إنشاء نموذج سرطان كبد الفأر 53- القابل للاستعادة والمعتمد على NRAS باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم الذي يتم تسليمه من خلال HTVI. (تم الإنشاء باستخدام BioRender.com.) B، مخطط بالموجات فوق الصوتية التمثيلي لنماذج سرطان الكبد بالحقن المثلي وHTVI في الوقت المحدد بعد استعادة p53. ج، تحليل البقاء على قيد الحياة للفئران في نموذج HTVI. D ، الهيماتوكسيلين التمثيلي ويوزين (H&E) ، التألق المناعي (IF) ، و-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA - - gal) تلطيخ p 53- المكبوت (إيقاف p53) و - المستعاد (p53 قيد التشغيل لـ 14 يومًا) أقسام الورم المتولدة من نموذج HTVI. أشرطة النطاق ، 5 {{3 0}} ميكرومتر. E – G، الحقن المثلي للخلايا السرطانية NSP المنقولة بواسطة ناقلات GFP-luciferase في كبد سلالات الفئران ذات الكفاءة المناعية والعوز المناعي. E، تغير حجم الورم المقاس بالموجات فوق الصوتية عند استعادة p53. R2G2، Rag2-Il2rg ماوس مزدوج الضربة القاضية. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. n أكبر من أو يساوي 9 لكل سلالة. F، صور مجهرية تمثيلية في 21 يومًا من p53 على أو نقطة النهاية p53 خارج الورم. G، تلطيخ ممثل IHC للخلايا السرطانية التي تحمل علامة GFP في اليوم 21 عند استعادة p53. أشرطة النطاق، 100 ميكرومتر. **، ف < 0.01؛ ***، ف < 0.001.

لتحديد أنواع الخلايا المناعية المحددة المسؤولة عن المراقبة المناعية للخلايا السرطانية الهرمة، أنشأنا مجموعات متوازية من الفئران التي تؤوي أورام NSP المثلية وفحصنا تأثير استنفاد مجموعات الخلايا المناعية المختلفة على تراجعات الورم بعد انسحاب دوكس. في حين أن حجب الأجسام المضادة التي تستهدف العدلات/الخلايا الوحيدة (Gr1)، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK1.1)، وخلايا CD4 T (GK1.5) لم يكن له أي تأثير، فإن استنفاد خلايا CD8 T (2.43) والبلاعم (باستخدام كلودرونيت الشحمي) ، والتي تستهدف بشكل انتقائي الخلايا البلعمية (CD11b + F4 / 80+) ولكن ليس الخلايا الجذعية الكلاسيكية (CD11b − CD11c + MHC − II + CD 103+؛ المرجعان 33 و 34) ضعف انحدار الورم بشكل ملحوظ (الشكل 1 أ). 2E؛ الشكل التكميلي S4I).لتوصيف كيف يؤدي شيخوخة الورم المدفوعة بـ p53- إلى مناعة مضادة للأورام منتجة، أجرينا تحليل RNA-seq (scRNA-seq) أحادي الخلية لخلايا CD45 المعزولة حديثًا من NSP المتكاثر والشيخوخة. الأورام في وقت مبكر بعد انسحاب Dox (8 أيام؛ الشكل التكميلي S5A وS5B) واستخدمت خوارزمية اختبار الوفرة التفاضلية Milo (35) لالتقاط تحولات حالة الخلية داخل أنواع الخلايا المناعية التي تتوسط هذه العملية (الشكل التكميلي S5C – S5F). تماشيًا مع مساهمتها في انحدار الورم، أظهرت المجموعات السكانية الفرعية للخلايا التائية CD8 والبلاعم تغيرات ملحوظة في الكمية والحالة. فيما يتعلق بالخلايا التائية، تم إثراء الأورام المتكاثرة (المكبوتة) بشكل كبير في حالات CD8 T التي تظهر تعبيرًا عاليًا عن كل من علامات الخلل الوظيفي (Tox، وTigit، وLag3، وCtla4، وPdcd1/PD1، وCd160) وعلامات التنشيط (Prf1). ؛ الشكل 2F و G؛ الشكل التكميلي S5G؛ الجدول التكميلي S1). أظهرت خلايا CD8 T أيضًا مستويات عالية من Tnfrsf9، وهي علامة معروفة بأنها تحدد مجموعات فرعية من الخلايا التائية التي لديها القدرة على إعادة تنشيطها في سرطان الكبد البشري وأنواع السرطان الأخرى (36، 37). في تناقض صارخ، في الآفات الهرمة (المعاد تنشيطها)، ظهرت مجموعات CD8 T نشطة للغاية، مما يدل على مستويات منخفضة من علامات الخلل الوظيفي والتعبير العالي عن السيتوكينات المستجيبة (على سبيل المثال، Ifng، Tnf؛ الجدول التكميلي S1). وفقًا لذلك، أظهر التوصيف النسخي لأنسجة الورم السائبة توقيعات مناعية نشطة وسمية للخلايا في الأورام الهرمة التي تخضع للانحدار (الشكل التكميلي S5H؛ المرجع 38).

الشكل 2. الشيخوخة تؤدي إلى تبديل الورم المناعي للتهرب من المناعة. A، صور تمثيلية لتلطيخ CD45 وGFP بمناسبة الخلايا المناعية والخلايا السرطانية، على التوالي، في الأورام المكبوتة p53- والمستعادة p53- (7 أيام بعد استعادة p53). صحيح، تم حساب القياس الكمي لمنطقة تلطيخ CD45+ من 3 حقول عشوائية لكل ماوس. كل نقطة تمثل الماوس. ب، تحليل التدفق الخلوي للمشهد المناعي العالمي في نموذج ورم الكبد NSP مثلي. يتم إجراء التنميط المناعي للأورام الهرمة بعد 9 أيام من انسحاب دوكس، وهي نقطة زمنية يتم فيها إنشاء حالة الشيخوخة بالكامل، ولكنها تسبق تراجع الورم الهائل. G-MDSC، الخلايا الكابتة المشتقة من النخاع الشوكي المحببة؛ M-MDSC، الخلايا الكابتة المشتقة من النخاع الشوكي. يتم تجميع البيانات من تجربتين مستقلتين، مع n=7 في المجموعة المتكاثرة وn=9 في المجموعة المسنة. لاحظ أنه مع زيادة العدد المطلق لخلايا CD45+ في آفات ورم NSP الهرمة (A)، كذلك يزداد العدد الإجمالي لأنواع الخلايا المشار إليها. ج، تحليل التدفق الخلوي لخلايا CD8 T. يتم تجميع البيانات من تجربتين مستقلتين، مع n=11 في المجموعات المتكاثرة وn=10 في المجموعات الهرمة. تم إجراء التجارب بعد 9 أيام من انسحاب Dox. D، صور مسح الأنسجة التمثيلية لأورام الكبد NSP المثلية. تتم تسمية الخلايا التائية، والعدلات، والأوعية الدموية بواسطة تلطيخ CD3، وMPO، وCD31، على التوالي. تم جمع العينات بعد 9 أيام من انسحاب دوكس. E، يتم قياس تغير حجم الورم بالموجات فوق الصوتية عند استعادة p53 في الفئران بعد استنفاد أنواع محددة من الخلايا المناعية باستخدام الأجسام المضادة أو الأدوية. F ، يسار ، مؤامرة تقريب وإسقاط متشعب موحد (UMAP) لخلايا CD8 T المعزولة من أورام p 53- المتكاثرة المكبوتة (PRO) و p {{3 0}} أورام الشيخوخة (SEN) المعاد تنشيطها. على اليمين، تحليل تخصيب مجموعة الجينات لجينات علامة استنفاد الخلايا التائية في الخلايا التائية المضغوطة 8+ من الأورام المتكاثرة (المكبوتة 53-) مقابل الأورام الهرمة (المعاد تنشيطها). متنوعه، درجة التخصيب الطبيعية؛ بفال، قيمة P. مؤامرة G و UMAP للتعبير عن الجينات المحددة (Cd8a، Cd44، Tnfrsf9، Cd69، Tox، و Fasl) بين خلايا CD8 T المعزولة من الشيخوخة (p{{40}} إعادة تنشيطها) والمتكاثرة (p{ {41}}مكبوتة) الأورام. H، صور التألق المناعي التمثيلي لخلايا CD8 T وتلطيخ البلاعم الإيجابي F4/80- في ورم الكبد NSP المثلي. تم جمع عينات الورم بعد 9 أيام من انسحاب دوكس. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. جميع أشرطة النطاق، 100 ميكرومتر. تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل. *، ف < 0.05؛ **، ف < 0.01.

قدمت التغييرات في حجرة البلاعم دليلًا إضافيًا على أن شيخوخة الخلايا السرطانية أدت إلى تحول من التهرب المناعي إلى المراقبة. ومن ثم، أشار scRNA-seq والنمط المناعي والأنسجة إلى أن الأنماط الظاهرية للبلاعم المرتبطة بالورم انتقلت من F4/80lo؛ ينص CD11chi (المجموعة 8)، بما في ذلك مجموعات PD-L 1+ المثبطة للمناعة (سمة من أورام سرطان الكبد البشرية ذات التشخيص السيئ؛ المرجعان 39، 40) إلى F4/80hi؛ حالات CD11c− (المجموعة 0) ، محددة بالتعبير العالي عن التوقيع الجيني لعرض المستضد (الأشكال التكميلية S5E – S5J و S6A و S6B ؛ الجدول التكميلي S1). تجدر الإشارة إلى أن هذه F4/80hi المرتبطة بالشيخوخة؛ كانت البلاعم CD11c− حساسة بشكل خاص لعلاج الكلودرونيت الشحمي (الشكل التكميلي S6C – S6E) ، مما أدى أيضًا إلى انخفاض كبير في جزء خلايا CD8 النشطة ولكن ليس خلايا CD4 T (الشكل التكميلي S6F و S6G) ، مما يشير إلى وجود CD8 الاستجابة المناعية المعتمدة على T والتي تنطوي على التعاون مع البلاعم. وفقًا لذلك ، أكدت التحليلات النسيجية أن خلايا CD8 T المتراكمة والبلاعم F4 / 80+ تم إثراءها بشكل متكرر بعد تحريض الشيخوخة في الأورام (الشكل 2H ؛ الشكل التكميلي S4D). بشكل جماعي، تدعم هذه التحليلات البيولوجية والجزيئية نموذجًا يؤدي فيه شيخوخة الخلايا السرطانية إلى تحول مفاجئ من التهرب المناعي إلى المراقبة المناعية بوساطة التغيرات في البلاعم وحالات الخلايا التائية CD8، مما يؤدي إلى مناعة منتجة ضد الأورام، وفي النهاية، رفض الورم.

الشيخوخة تعيد تشكيل برامج استشعار الأنسجة والمناظر الطبيعية لسطح الخلية

شرعنا بعد ذلك في استغلال النموذج المذكور أعلاه لفهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن جعل الخلايا السرطانية الهرمة مرئية لجهاز المناعة. يتضمن تحريض السينس برنامج إعادة تشكيل الكروماتين الذي يعمل على إسكات الجينات التكاثرية وتنشيط العديد من الجينات التي تشفر عوامل SASP، مع اعتماد البرنامج الأخير إلى حد كبير على القارئ المحسن BRD4 (10). لذلك أجرينا تجارب التنميط النسخي على خلايا NSP في ظل ظروف متكاثرة (مكبوتة p53-) مقابل ظروف الشيخوخة (مستعادة p53-) في غياب ووجود JQ1، وهو دواء يمنع وظيفة BRD4 (الجدول التكميلي S2). ). تمشيا مع التوقعات، قللت استعادة p53 بشكل كبير من التعبير عن الجينات التكاثرية وحفزت التعبير عن عوامل SASP المعروفة (الشكل 3A؛ الشكل التكميلي S7A؛ المرجع 7)، بما في ذلك العديد من السيتوكينات المعروفة بتحفيز الخلايا التائية (Cxcl16، Il18). ) أو تنشيط البلاعم وتوظيفها (Csf2، بروتين تشفير GM-CSF) أو مرتبط سابقًا بالشيخوخة (Igfbp7، Igfbp3، Pdgfa). كما هو متوقع من العمل السابق (10) ، كانت العديد من نصوص تشفير SASP المنتظمة (∼ 65٪) تعتمد على BRD 4- (الشكل التكميلي S7B). وبالمثل، تم إفراز مجموعة من عوامل النمو والمعدلات المناعية من الخلايا الهرمة، كما تم تقييمها بواسطة فحوصات السيتوكينات المتعددة، بما في ذلك الخلايا التائية وجاذبات البلاعم CCL5 وCXCL9 وGMCSF، بالإضافة إلى عامل إعادة تشكيل الأوعية الدموية VEGF (الشكل التكميلي 1). .S7C). لذلك، يرتبط الشيخوخة في الخلايا السرطانية NSP المستعادة بـ SASP قوي، بما يتوافق مع إعادة التشكيل الملحوظ للنظام البيئي المناعي الموصوف أعلاه.

ومن المثير للدهشة أن فحص التوطين تحت الخلوي للجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEG) كشف أن الخلايا السرطانية الهرمة لم تزيد فقط من تعبيرها عن عوامل SASP المفرزة ("خارج الخلية،" EC)، ولكنها أظهرت أيضًا تغييرات كبيرة في مستويات التعبير عن النصوص التي تشفر البروتينات السطحية ("غشاء البلازما،" PM؛ الشكل 3B). في الواقع، قام 25% من إجمالي DEGs المنظم بتشفير بروتينات PM، وهو إثراء كبير انحرف عن التوزيع العشوائي (15%؛ الشكل 3ب). تم ربط PM-DEGs الديناميكية بنقل إشارات البروتين التيروزين كيناز (Nrp1، Egfr)، ونشاط مستقبلات السيتوكين (Ifngr1)، ومستقبلات المصفوفة خارج الخلية (Itgb3، Cd44)، وناقلات الأيونات (Slc12a1، Slc24a3) والتقاط الجزيئات المعروفة المرتبطة بالشيخوخة ( Cd44، وVcam1، وItgb3)، مما يشير إلى أن الخلايا الهرمة قد تتمتع بقدرة معززة على التفاعل مع بيئتها والاستشعار بها (الشكل 3C؛ الشكل التكميلي S7D؛ المراجع 41-43). ومن المثير للاهتمام أن الزيادة المرتبطة بالشيخوخة في التعبير عن العديد من بروتينات PM تم إضعافها بواسطة JQ1، مما يشير إلى أن تحريضها قد يكون جزءًا من برنامج إعادة تشكيل الكروماتين الأوسع المقترن بـ SASP (الشكل ثلاثي الأبعاد؛ المرجع 10). تجدر الإشارة إلى أن التغييرات العميقة في نسخ الجينات التي تشفر بروتينات PM حدثت أيضًا في الخلايا السرطانية التي تعاني من نقص NSP 53- والتي تم علاجها باستخدام تركيبة الأدوية المسببة للشيخوخة trametinib و palbociclib (الشكل التكميلي S7E ، اللوحة العلوية ؛ الجدول التكميلي S2 ؛ المرجع 20) وفي سلسلة مكونة من 13 خطًا متنوعًا وراثيًا TP53 WT وTP 53- من خطوط السرطان البشرية المتحولة المستمدة من سرطانات الكبد والثدي والرئة والقولون المستحثة للشيخوخة بواسطة محفزات مختلفة (الشكل 3E؛ الشكل التكميلي 1). S7F، المرجع 44). كان هذا قويًا بشكل خاص بالنسبة لـ PM-DEGs المنتظمة (ولكن غير المنتظمة) ، مما يذكرنا بالتأثيرات التي لوحظت لعوامل EC SASP (الشكل 3E ؛ الشكل التكميلي S7E ، اللوحة السفلية). ولذلك، فإن التعبير المتغير بشكل ملحوظ لبروتينات سطح الخلية التي لاحظناها في نموذجنا يمتد إلى ما هو أبعد من الشيخوخة المستحثة وقد يكون سمة مميزة لحالة الشيخوخة.

الشكل 3. الشيخوخة يعيد تشكيل برامج استشعار الأنسجة والمناظر الطبيعية لسطح الخلية. A، تحليل تخصيب مجموعة الجينات (Reactome) لبيانات RNA-seq من الانتشار (PRO، p53 off) مقابل الخلايا السرطانية في الكبد المسنة (SEN، p53 لمدة 8 أيام) في المختبر. NES، درجة التخصيب الطبيعية. B، التوطين دون الخلوي لـ DEGs (P < 0.05؛ تغيير الطية > 2) في جميع الجينات المكتشفة [النصوص لكل مليون كيلو قاعدة (TPM) > 1] من RNA-seq. C ، تحليل علم الجينات (GO) لـ DEGs الذي يشفر بروتينات PM المنتظمة في الخلايا الهرمة. TM، الغشاء. D، التحليل النسخي لجميع DEGs (المتكاثرة مقابل الشيخوخة) في وجود أو عدم وجود علاج JQ1. تحتوي المجموعة C1 (باللون الأحمر) على الجينات الخاصة بالشيخوخة الحساسة لـ JQ1، وتحتوي المجموعة C4 (باللون الأزرق) على الجينات الخاصة بالانتشار الحساسة لـ JQ1. E ، التحليل التلوي لمجموعة بيانات RNA-seq من SENESCopedia عن طريق إجراء توطين تحت الخلوي لـ DEGs (مثل الشكل 2D) واختبار Fisher الدقيق لفحص الإثراء النسبي لـ EC / PM-DEGs المنتظمة والمنتظمة المنحرفة عن التوزيع العشوائي. انظر أيضًا الشكل التكميلي S7E وS7F. F، تحليل قياس الطيف الكتلي (MS) للبروتين المخصب PM في الخلايا المتكاثرة والشيخوخة. يتم تطبيع مستوى البروتين إلى التعبير المتوسط ​​للبروتين في جميع العينات. الضوابط هي العينات التي لا تحتوي على علامات البيوتين والتي تعمل كخلفية. تمثل الصناديق الحمراء والزرقاء البروتينات المخصبة في الخلايا الهرمة والمتكاثرة، على التوالي. n=6 لكل من المجموعتين التجريبيتين الهرمتين والمتكاثرتين، وn=3 و4 على التوالي للتحكم فيهما. G ، توزيع GeneCards المنتظمة والمُنضبطة المُوضحة ببروتينات PM الموصوفة بواسطة MS. نك، لا يوجد تغيير. H ، مؤامرة بركانية لبروتينات PM المشروحة بـ GeneCards والتي تم وصفها بواسطة MS.

للتحقق من صحة إعادة التشكيل العالمي لعوامل PM في الشيخوخة على مستوى البروتين، أجرينا البروتينات السطحية على الخلايا السرطانية المتكاثرة والشيخوخة NSP، باستخدام طريقة إثراء وضع العلامات على البيوتين، حيث تم تمييز بروتينات سطح الخلية بالبيوتين غير المنفذ للغشاء، تمت تنقيته وإخضاعه لقياس الطيف الكتلي (الشكل 3F؛ الشكل التكميلي S7G؛ المرجع 45). ولوحظ وجود علاقة قوية بين التكرارات البيولوجية في كل حالة (الشكل التكميلي S7H)، مع إثراء البروتينات المكتشفة لبروتينات PM المشروحة بنسبة 60٪ بعد تحريض الشيخوخة المستحثة p53-. ومن بين 887 بروتينًا تم اكتشافها بشكل متكرر، تم التعبير عن أكثر من 50% منها بشكل تفاضلي. ترتبط معظم البروتينات المعبر عنها تفاضليًا جيدًا بالاتجاه الذي لوحظ في بيانات التوصيف النسخي لدينا، على الرغم من أنه تم التعبير عن بعضها تفاضليًا دون تغيير مماثل في مستويات النسخ (الشكل التكميلي S7I).

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

تضمنت بروتينات سطح الخلية المشروحة التي تم الكشف عنها بواسطة قياس الطيف الكتلي عند تحريض الشيخوخة العديد من العوامل المرتبطة سابقًا بالشيخوخة (على سبيل المثال، CD44 وVCAM1)، وعوامل النمو المختلفة ومستقبلات السيتوكينات (على سبيل المثال، EGFR، ICAM1، وIFNGR1)، وعوامل أخرى أقل تميزًا (الشكل 1). 3F – H الشكل التكميلي S7J و S7K). تجدر الإشارة إلى أن مجموعة البروتينات المخصبة لسطح الخلية المحددة في نموذجنا أظهرت تداخلًا محدودًا مع تلك المحددة في الخلايا الليفية البشرية التي تمر بالشيخوخة المستحثة بالجينات الورمية (46)، مما يشير إلى عدم التجانس بين أنواع الخلايا أو محفزات الشيخوخة. بغض النظر، تظهر هذه النتائج أنه بالإضافة إلى تجديد الأسلاك في برنامجها الإفرازي، تخضع الخلايا الهرمة لتغيرات عميقة في محتوى ووفرة بروتينات سطح الخلية، وتعني ضمنًا أن الخلايا الهرمة تكتسب سمات مميزة لاستشعار البيئة الدقيقة التي قد تؤثر على حالتها ومصيرها في الجسم الحي. .

يتم إعداد الخلايا الهرمة لاستشعار IFNg وتضخيم إشارات IFNg

لتحديد المسارات التي قد تؤثر وظيفيًا على كيفية إحساس الخلايا الهرمة ببيئتها، قمنا باستخراج مجموعات البيانات النسخية والبروتينية للتغيرات المرتبطة بالشيخوخة والمرتبطة بالمناعة المضادة للأورام. ومن المثير للاهتمام أن تحليل علم الجينات (GO) كشف أن استجابة إنترفيرون جاما من النوع الثاني (IFN ) (47) كانت من بين أفضل 5 مسارات مشروحة تم إثراؤها أثناء الشيخوخة وتعتمد على برامج المحسن الخاصة بحالة الخلية (على سبيل المثال، JQ1- الحساسة ؛ أي "C1" من الشكل ثلاثي الأبعاد؛ الشكل التكميلي S8A). من بين النصوص المعدلة، لاحظنا العديد من المنظمات الإيجابية لإشارة IFN، بما في ذلك الوحدة الفرعية لمستقبل IFN IFNGR1 (واحدة من البروتينات الأكثر تنظيمًا بشكل كبير من بياناتنا البروتينية) ومؤثرات الإنترفيرون المتعددة (Irf1، وIrf7، وIrf9؛ المراجع 47، 48). الشكل 4A – C الشكل التكميلي S8B و S8C). إلى جانب هذه الجينات الحساسة والمنتظمة لـ Brd، انخفضت بشكل ملحوظ النصوص التي تشفر المنظمين السلبيين لإشارات IFN (Ptpn2 وSocs1 وSocs3) (الشكل 4C؛ المرجعان 49 و50). وقد لوحظت تغييرات مماثلة في الخلايا السرطانية NSP التي عولجت بمحفزات الشيخوخة المختلفة (الشكل 4C؛ الشكل التكميلي S8D – S8G)، وعلى نطاق أوسع، في لوحة مكونة من 13 شخصًا من سرطان الثدي والرئة والكبد والقولون. تم تحفيز خطوط الخلايا للشيخوخة (الشكل 4D؛ المرجع 44). ولذلك، فإن التغييرات في التعبير عن مكونات إشارات IFN من النوع الثاني هي سمة عامة للخلايا الهرمة، بغض النظر عن نوع الخلية، والنمط الجيني للخلية، والأنواع، وطبيعة محفز الشيخوخة. أدت الزيادة المتزامنة في مؤثرات إشارات IFN وانخفاض المنظمات السلبية إلى افتراض أن الخلايا الهرمة تصبح مهيأة لاستشعار IFN داخل بيئتها. لاختبار هذه الفرضية بشكل مباشر، قمنا بمعالجة خلايا NSP المتكاثرة والشيخوخة باستخدام IFN المؤتلف وأجرينا تحليلات مناعية لتنشيط إشارات JAK-STAT. على الرغم من أن IFN زاد بشكل كبير مستويات خط الأساس لـ STAT1 في كلتا الولايتين، إلا أن الخلايا الهرمة تراكمت لديها المزيد من الفسفرة STAT1، بغض النظر عن محفز الشيخوخة (الشكل 4E؛ الشكل التكميلي S8H). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أيضًا مستوى متزايدًا من JAK1 المفسفر في الخلايا الهرمة المستعادة p53-، مما يدعم أيضًا اكتشافنا حول مسار إشارات JAK-STAT أكثر نشاطًا في الخلايا الهرمة التي تستشعر IFN (الشكل التكميلي S8I). كما كان متوقعًا من التحليلات النسخية، أدى الشيخوخة أيضًا إلى انخفاض في بروتين PTPN2 (51)، بغض النظر عن وجود IFN خارجي (الشكل 4E). وبالتالي، تقوم الخلايا الهرمة بتنشيط إشارات الإنترفيرون بشكل أكثر كفاءة استجابةً للحد من تركيز الإنترفيرون في البيئة.

الشيخوخة وEC IFNg يتعاونان في تنظيم آلات معالجة وعرض المستضد

لفهم المساهمة الوظيفية لاستشعار IFN في برنامج الشيخوخة بشكل أفضل، قمنا بعد ذلك بمقارنة الحالات المظهرية والنسخية للخلايا السرطانية المتكاثرة والمستعادة 53-المُعالجة بـ IFN المؤتلف عند مستوى منخفض (50 بيكوغرام/مل) أو جرعة أعلى (1 نانوجرام/مل). على الرغم من أن إضافة IFN خارجي إلى الخلايا السرطانية المتكاثرة أو الهرمة كان له تأثير ضئيل على الحيوية أو الانتشار أو التعبير الجيني لـ SASP لأي نوع من الخلايا عند الجرعات التي تم اختبارها (الشكل 5A؛ الشكل التكميلي S9A – S9D)، فقد كانت هناك تغييرات ملحوظة في وقد لوحظ التعبير الجيني لمسار IFN المرتبط بحالة الشيخوخة. على وجه التحديد، كشف التجميع الخاضع للإشراف لـ "توقيع استجابة IFN" المميز عبر الخلايا المتكاثرة والشيخوخة عن ثلاث وحدات DEG: (1) الجينات التي يتم تنظيمها أثناء الشيخوخة بغض النظر عن IFN (بما في ذلك المنظمات السلبية المذكورة أعلاه)؛ (2) الجينات التي يتم تنظيمها أثناء الشيخوخة بغض النظر عن الإنترفيرون؛ ومن المثير للاهتمام، (3) مجموعة كبيرة من DEGs التي يتم تحفيزها بشكل تعاوني من خلال مزيج من الشيخوخة والإنترفيرون (الشكل 5 ب). ولذلك، يؤدي الشيخوخة إلى تغييرات كمية ونوعية في الاستجابة النسخية للإنترفيرون . أحد المخرجات الراسخة لإشارات IFN التي تنظم قابلية الخلايا للمراقبة المناعية التكيفية هو زيادة القدرة على عرض المستضد بوساطة جزيئات MHC من الدرجة الأولى (MHC-I؛ المرجعان 47، 52). في الواقع، فإن العديد من الجينات التي يتم تنظيمها في الخلايا الهرمة (جينات الفئة الثانية) أو التي يتم تحفيزها بشكل زائد في وجود IFN خارجي (جينات الفئة الثالثة) تشمل مكونات آلية عرض المستضد. من بين الجينات المستحثة أثناء الشيخوخة (جينات الفئة الثانية) كان Tap1، الناقلات المرتبطة بمعالجة المستضد، وPsme1، وهو عامل بروتيزومي مرتبط بمعالجة المستضد (53). أولئك الذين لديهم فرط الحساسية تجاه IFN الخارجية (جينات الفئة الثالثة) يشملون Nlrc5، وهو منشط نسخي لجينات MHC-I (54)؛ عامل التجميع MHC-I Tapbp؛ والوحدة الفرعية MHC-I B2m. كان هناك جينان آخران من الفئة الثالثة عبارة عن مكونات من البروتين المناعي (Psmb8 وPsmb9) والتي يمكن أن تغير أفعالها ذخيرة الببتيدات المقدمة عند الإفراط في التعبير عنها وترتبط باستجابة الورم المحسنة لحصار نقطة التفتيش المناعية (55). تم تأكيد هذا الناتج المضخم لـ IFN في الخلايا الهرمة بواسطة RT-qPCR وتم الاحتفاظ به عند مستويات أعلى من IFN خارجي (الشكل 5C؛ الجدول التكميلي S3). تمشيا مع العملية متعددة العوامل الموصوفة أعلاه ، لم يلاحظ هذا التأثير في الخلايا السرطانية المتكاثرة ، حتى تلك التي تزيد من التعبير عن IFNGR1 cDNA و / أو تعامل مع IFN (الشكل التكميلي S10A – S10D).

الشكل 4. تستعد الخلايا الهرمة لاستشعار وتضخيم إشارات IFN. مستوى A و B، IFNGR1 على الخلايا المتكاثرة والشيخوخة التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي (A) والتحقق من صحتها بواسطة قياس التدفق الخلوي (B). الاتحاد الأفريقي هو وحدة تعسفية. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. n=6 لكل من المجموعتين المتكاثرة والشيخوخة. C، التحليل النسخي للجينات المحددة التي تنظم إشارات IFN من بيانات RNA-seq لثلاثة خطوط خلايا مستقلة قابلة للاستعادة (NSP وNSM2 وNSP5) تستعيد p53 مع خلايا NSP المعالجة بمحفزين آخرين للشيخوخة. SEN/PRO، شيخوخة/متكاثرة؛ T + P، تراميتينيب بالإضافة إلى بالبوسيكليب. تعبير D، mRNA للجينات المحددة المشاركة في إشارات IFN في خطوط الخلايا البشرية التي تم تحفيزها للشيخوخة. العلاج: علي، أليسرتيب؛ إيتو، إيتوبوسيد. يشير الرقم إلى مدة العلاج (أيام). يتم الحصول على البيانات من مجموعة البيانات العامة SENESCopedia (44). E، الأعلى، التحليل المناعي لخلايا NSP تحت محفزات شيخوخة مختلفة في وجود أو عدم وجود IFN (1 نانوغرام / مل). أسفل، القياس الكمي لشدة الإشارة من طخة مناعية. ف-STAT1، الفوسفو-STAT1 (Tyr701).

بما يتوافق أيضًا مع تغييرات التعبير الجيني الموصوفة أعلاه، تقوم الخلايا السرطانية الهرمة بتنظيم MHC-I بشكل أكثر قوة استجابةً لمستويات منخفضة من IFN خارجي مقارنة بنظيراتها المتكاثرة. ومن ثم، في حين أن مستويات سطح الخلية من MHC-I لكل من الخلايا المتكاثرة والشيخوخة كانت منخفضة عند خط الأساس وتسببها IFN خارجي، أظهرت الخلايا الهرمة زيادة كبيرة في تعبير بروتين MHC-I (الشكل 5D). وقد لوحظت أوجه تآزر مماثلة في تعبير HLA على سطح الخلية (المماثل لـ MHC-I في الفئران) في الخلايا السرطانية البشرية من الكبد وأنواع السرطان الأخرى التي تسبب الشيخوخة باستخدام بوتلين، الذي يشارك في برنامج الشيخوخة المعتمد على 53- (56) ، أو trametinib / palbociclib ، الذي يستهدف بشكل تفضيلي الخلايا السرطانية باستخدام مسار MAPK المنشط (الشكل التكميلي S11A – S11D ؛ المرجع 20). تجدر الإشارة إلى أن التأثيرات التوافقية للعلاج الدوائي والإنترفيرون على تعبير HLA تتطلب تحريض الشيخوخة ولم تحدث في خلايا ورم الكبد التي فشلت في الشيخوخة بسبب طفرة p53 التلقائية أو المهندسة (غير مستجيبة للمخطط التفصيلي) أو مسار MAPK غير مفرط النشاط (غير مستجيب) إلى تراميتينيب/بالبوسيكليب). علاوة على ذلك، على الرغم من أن مسارات استجابة IFN من النوع الأول والثاني تتضمن مكونات متداخلة، فإن علاج IFN خارجي لا يمكن أن يحل محل IFN في إنتاج تحريض قوي لـ MHC-I في الخلايا الهرمة ولا تحريض تفاضلي قوي بين الخلايا المتكاثرة والخلايا الهرمة في نموذج استعادة p53 الخاص بنا ( الشكل التكميلي S11E وS11F). تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا البشرية والفأرية التي تم تحفيزها للشيخوخة تكتسب قدرة متزايدة على معالجة المستضد وعرضه في وجود كميات محدودة من الإنترفيرون.

تعمل الخلايا السرطانية الهرمة على تنشيط مسار إشارات IFNg في الجسم الحي

لتحديد العواقب في الجسم الحي لإعادة توصيل إشارات IFN المحددة في الخلايا الهرمة، قمنا بعد ذلك بتكييف نظام مراسل استشعار IFN (IGS) لتصور تنشيط إشارات IFN داخل الخلايا مباشرة في الوقت الفعلي (57). يتكون هذا المراسل من سلسلة من تسلسلات تنشيط IFN المتفق عليها، والتي لها خصوصية للنوع II IFN على الإشارات الأخرى (57)، متبوعة بتسلسل [كدنا] الذي يشفر بروتين الفلورسنت ZsGreen1 ويرتبط بجينات RFP معبر عنها بشكل أساسي لتصور الخلايا المنقولة ( الشكل 6 أ). كانت الخلايا السرطانية NSP التي تعبر عن هذا البناء إيجابية RFP وأظهرت زيادة تعتمد على الجرعة في إشارة ZsGreen1 عند العلاج باستخدام IFN في المختبر والتي زادت بعد تحريض p53 أو بعد العلاج بالأدوية المسببة للشيخوخة (الشكل 6B؛ الشكل التكميلي S12A وS12B) .

استخدمنا بعد ذلك هذا النظام لمراقبة نشاط الإشارات بعد تحريض الشيخوخة في الأورام. تم حقن الخلايا السرطانية المنقولة بواسطة المراسل (على Dox) والتي تعبر عن RFP التأسيسي في كبد المستلمين المسانجين الذين يتغذىون على Dox، وعند ظهور الورم، تمت إزالة Dox للحث على تعبير p53 وتحفيز الشيخوخة على النحو الوارد أعلاه (انظر الشكلين 1 و 2). تم عزل الأورام المتراجعة بعد 9 أيام من انسحاب Dox للتصوير ثلاثي الأبعاد لنشاط المراسل والتقييم الموازي لإشارة IFN بالمقارنة مع عناصر التحكم المنتشرة (من الفئران التي تم الحفاظ عليها على Dox). كما هو موضح في الشكل 6C، أظهرت الخلايا السرطانية المتكاثرة القليل من تعبير المراسل، إن وجد، في حين أظهرت الخلايا السرطانية التي تم تحفيزها للشيخوخة في الجسم الحي إشارة ZsGreen1 أكثر بروزًا (الشكل 6C وD؛ فيديو تكميلي S2). تزامن هذا التأثير مع زيادة محددة في مستويات بروتين IFN (ولكن ليس النوع الأول IFN) في مستخلصات أنسجة الورم (الشكل 6E؛ الشكل التكميلي S12C).

لاختبار ما إذا كان التركيب المتغير للخلايا المناعية في الأورام الهرمة (الشكل 2؛ الأشكال التكميلية S5 – S6) ساهم في تعزيز الإشارة لمراسل IGS، أجرينا فحوصات زراعة النباتات في المختبر مما يسمح بتعرض الخلايا السرطانية الهرمة أو المتكاثرة إلى عدد متساو من خلايا CD8 T المنشطة، والتي حددناها عبر بيانات scRNA-seq باعتبارها المصدر الخلوي السائد لـ IFN في الجسم الحي (الشكل 6F – H). لا تزال الخلايا الهرمة تظهر زيادة كبيرة في إشارة ZsGreen1 مقارنة بعناصر التحكم المنتشرة (الشكل 6I). تمشيًا مع تنشيط الإشارات غير المستقلة للخلية، لم يتم اكتشاف IFN في الوسائط المكيفة من الخلايا السرطانية NSP في ظل ظروف تكاثرية أو شيخوخة (الشكل التكميلي S12D)، ومع ذلك تم اكتشاف IFN بسهولة عند الزراعة مع خلايا CD8 T، وهو التأثير الذي كان تم تعزيزه بشكل أكبر من خلال إضافة البلاعم والمرتبطة بزيادة فئة MHC الأولى على الخلايا الهرمة بالإضافة إلى زيادة تنشيط خلايا CD8 T (الشكل التكميلي S12E – S12J). بشكل جماعي، تدعم هذه البيانات نموذجًا حيث تعمل التفاعلات غير المتجانسة بين الخلايا السرطانية الهرمة والخلايا المناعية على توعية الورم بالإنترفيرون الخارجي، مما يؤدي إلى تعزيز عرض المستضد ومراقبة مناعية فعالة.

الشكل 5. الشيخوخة وEC IFN تتعاون من أجل تنظيم آلات معالجة وعرض المستضد. تعبير A و B، mRNA عن الجينات في خلايا NSP المتكاثرة والشيخوخة في المختبر في وجود أو عدم وجود علاج IFN (50 بيكوغرام / مل). يتم تطبيع مستوى مرنا إلى التعبير المتوسط ​​للجين في جميع العينات. A ، عوامل SASP لترميز DEG في نموذجنا. ب، جينات استجابة IFN من قاعدة بيانات توقيع هولمارك. C، RT-qPCR لجينات مسار عرض المستضد المحددة في الخلايا المتكاثرة والشيخوخة المعالجة بتركيز منخفض (50 بيكوغرام / مل) أو عالي (1 نانوغرام / مل) من IFN. العينات من 2 مكررات بيولوجية. مستوى D وMHC-I للخلايا المتكاثرة والشيخوخة المعالجة بالإنترفيرون لمدة 24 ساعة مقاسًا بواسطة قياس التدفق الخلوي. مؤسسات التمويل الأصغر، كثافة مضان متوسط. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM.

الشكل 6. الشيخوخة تعزز الإشارات غير المتجانسة بوساطة IFN من الخلايا المناعية المنشطة إلى الخلايا السرطانية. رسم توضيحي لمراسل IGS. (تم الإنشاء باستخدام BioRender.com.) B، يسار، مؤامرات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي تقيس إشارات ZsGreen1 في خلايا NSP المتكاثرة والشيخوخة المعالجة بـ 1 نانوغرام / مل IFN. حسنًا، التحديد الكمي للنسبة المئوية لخلايا ZsGreen1- الإيجابية عند علاج IFN. مؤسسات التمويل الأصغر، كثافة مضان متوسط. C و D، التصوير التمثيلي ثلاثي الأبعاد للأورام التي تم تطهيرها من الأنسجة من خط خلايا NSP الكبدي المحقون بشكل مثلي معبرًا عن مراسل IGS (C). القياس الكمي لثلاثة حقول تم اختيارها عشوائيًا من ورم الكبد لكل فأر (D). n=5 و n=3 للمجموعات المتكاثرة والشيخوخة (9 أيام بعد استعادة p53)، على التوالي. أشرطة النطاق، 100 ميكرومتر. E، أعلى، مقايسة مجموعة الخرز الخلوي لمستوى IFN من عينات أنسجة الورم في الجسم الحي (7 أيام بعد استعادة p53). في الأسفل، نصوص الجينات المشار إليها من RNA-seq للعينات السائبة من الأورام الناتجة عن HTVI (PRO، p53 off؛ SEN، p53 الترميم لمدة 12 يومًا). TPM، النصوص لكل كيلو بايت مليون. تحتوي مجموعة Ifna/b على 14 نوعًا فرعيًا من Ifna وجين Ifnb واحد. F و G، تعبير Ifng في الخلايا المناعية المتسللة للورم والتي تم تحديدها بواسطة scRNA-seq في نموذج NSP القابل للزرع (كما في الشكل 2، عينة تم جمعها في اليوم الثامن بعد استعادة p53). H ، تقريب موحد ومؤامرة إسقاط للتعبير عن Havcr2 (ترميز TIM3) و Ifng في خلايا CD8 T التي تم حصادها من آفة الورم المتكاثرة (P) والشيخوخة (S). يتم نسخ اللوحة العلوية من الشكل 2F (يسار) للإشارة إلى الخلايا المقابلة لكل حالة. I، القياس الكمي لكثافة ZsGreen1 للخلايا السرطانية NSP في تجربة زراعة الخلايا السرطانية OT-I T وSIINFEKL التي تعبر عن الخلايا السرطانية (نسبة المستجيب إلى الهدف، 5:1) بعد ساعتين 0 من الزراعة العضوية. إشارة تقاس بالتدفق الخلوي. T + P، تراميتينيب بالإضافة إلى بالبوسيكليب. انظر التفاصيل التجريبية في الشكل التكميلي S12E. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل. *، ف < 0.05؛ **، ف < 0.01؛ ***، ف < 0.001.

تعد إشارات IFNg في الخلايا السرطانية الهرمة ضرورية للمراقبة المناعية

تشير نتائجنا إلى أن التطهير المناعي للخلايا السرطانية الهرمة NSP يتضمن التأثيرات المشتركة لـ SASP، المعروف بتحفيز تجنيد الخلايا المناعية (10، 20، 58)، إلى جانب قدرة الخلايا الهرمة التي لم يتم تقديرها سابقًا لتعزيز الاستشعار والاستجابة للخلايا السرطانية. إشارات EC، كما هو موضح هنا مع IFN. لاختبار مساهمة برنامج استشعار IFN المرتبط بالشيخوخة في المراقبة المناعية للخلايا السرطانية الهرمة، قمنا بفحص كيف يؤثر تعطيل IFNGR في الخلايا السرطانية، أو استنفاد IFN في المضيف، على إزالة الخلايا السرطانية NSP عند تحريض الشيخوخة . في الواقع ، كان انحدار الورم (ولكن ليس الشيخوخة في حد ذاته ؛ الشكل التكميلي S13A – S13D) ضعيفًا عند الضربة القاضية (KO) لـ IFNGR1 (الشكل 7A و B ؛ الشكل التكميلي S14A – S14C) ، وهو التأثير الذي كان أكثر وضوحًا بالنسبة لـ أورام IFNGR السليمة المصقولة في الفئران Ifng -/− (الشكل 7C و D) والمرتبطة بالخسارة المتوقعة لسطح MHC-I في الخلايا السرطانية (الشكل التكميلي S14D وS14E).

بما يتوافق مع المساهمة المعروفة لإشارة IFN وخلية الورم MHC-I في مشاركة CD8+ (59)، فإن الأورام التي تفتقر إلى IFNGR1 أو تلك التي تطورت في متلقي Ifng−/− تحتوي على خلايا CD8 T أقل من نظيراتها WT في كليهما. الحالات المتكاثرة والشيخوخة (الشكل التكميلي S14F) بينما لا تزال تسبب تسللًا مناعيًا قويًا بما في ذلك البلاعم الوفيرة (الشكل 7E و F ؛ الشكل التكميلي S14G). بغض النظر، لم يكن النمط الظاهري لمراقبة الشيخوخة مجرد نتيجة لهذا الانخفاض في خلايا CD8 T. لا تزال فحوصات الاستزراع النباتي التي توفر تعرضًا موحدًا للخلايا السرطانية IFNGR1 KO وWT لخلايا CD8 T والبلاعم تظهر القتل المعتمد على IFNGR 1- للخلايا السرطانية الهرمة (الشكل التكميلي S15A – S15E) - وهو الاعتماد الذي يتطلب وجود كل من T الخلايا والبلاعم، ولم يتم ملاحظة ذلك في الخلايا السرطانية المتكاثرة تحت نفس الظروف. تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن القدرة المعززة للخلايا الهرمة على استشعار الإنترفيرون المصغر للبيئة تعمل بالتنسيق مع تجنيد الخلايا المناعية المحفزة بواسطة SASP لتمكين التفاعلات غير المتجانسة المعززة بشكل متبادل بين الخلايا السرطانية والبلاعم والخلايا التائية المنشَّطة التي تعمل على تحسين عرض المستضد والمراقبة المناعية. ، مما يؤدي إلى تراجعات الورم قوية.

مناقشة

بفضل نموذج ورم الفئران الذي يخضع فيه التهرب المناعي للسرطان مقابل مراقبة الشيخوخة لرقابة وراثية مشددة، نكشف كيف تغير الخلايا الهرمة بشكل كبير قدرتها على إرسال واستقبال الإشارات البيئية (الشكل التكميلي S16). تماشيًا مع برامج الشيخوخة المعروفة، أدى تحريض الشيخوخة الذي يحركه p53- إلى إسكات الجينات التكاثرية وتحفيز SASP. ومع ذلك، لاحظنا أيضًا تأثيرًا عميقًا على التعبير الجيني لبروتينات PM، بما في ذلك مجموعة من مستقبلات عامل النمو ومستقبلات السيتوكينات التي من المتوقع أن تغير بشكل جذري كيفية استجابة الخلايا الهرمة للإشارات البيئية. الأهم من ذلك، على الرغم من أننا استخدمنا نموذج سرطان الكبد كنظامنا التجريبي الأساسي، فقد لوحظ وجود تجديد مماثل في التعبير عن أجهزة استشعار سطح الخلية وبرامج الجينات التي تتحسس للإشارات البيئية في مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية الفأرية والبشرية التي عولجت بخلايا محفزة للشيخوخة. وكلاء، مما يعني أن برنامج الاستشعار المتغير هو السمة المميزة العامة لحالة الشيخوخة.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

يتضمن أحد مسارات الاستشعار البارزة التي تم تغييرها في الخلايا الهرمة إشارات IFN من النوع الثاني. في نموذج سرطان الكبد الخاص بنا وفي جميع حالات الشيخوخة التي قمنا بفحصها، يكون الشيخوخة مصحوبًا بتغييرات في التعبير النسخي والبروتيني داخل الخلية من المتوقع أن تعزز الإشارة من IFN خارجي. في الواقع، تقوم الخلايا الهرمة بتنشيط مؤثرات IFN بشكل أكثر قوة استجابةً لـ IFN في المختبر وفي الجسم الحي، كما أن كلاً من مسار مستجيب IFN سليم وIFN في البيئة مطلوبان من أجل إزالة خلايا CD8 T الفعالة للخلايا السرطانية الهرمة. على الرغم من أن تحليل مسار نسخ الخلايا الهرمة يحدد دائمًا إشارات IFN من النوع الثاني كميزة غنية، إلا أن التداخلات بين مكونات إشارات النوع الأول والثاني وحقيقة عدم اكتشاف IFN عادةً كعامل SASP قد تركت أسئلة ميكانيكية فيما يتعلق بإشارة IFN من النوع الثاني في الشيخوخة. غير مستكشفة إلى حد كبير. توضح دراساتنا أن هذا التخصيب في توقيعات إشارات IFN للخلايا الهرمة يعكس قدرة معززة لاستشعار IFN الذي يكون إنتاجه هو الأبرز في الجسم الحي.

الشكل 7. إشارات الإنترفيرون في الخلايا السرطانية الهرمة ضرورية للمراقبة المناعية. A، Ifngr1 KO لكل من خلايا NSP المتكاثرة والشيخوخة التي تم التحقق من صحتها بواسطة قياس التدفق الخلوي. B ، النمط الظاهري لانحدار الورم لـ Ifngr1 KO أو التحكم في الخلايا السرطانية المنقولة بواسطة sgRNA التي يتم حقنها بشكل تقويمي في الفئران Bl / 6N عند استعادة p53. يعمل sgRNA للتحكم الذي يستهدف صحراء الجينات الموجودة على Chr8 (Ctrl KO) بمثابة عنصر تحكم. C ، النمط الظاهري لانحدار الورم للخلايا السرطانية الوالدية NSP التي يتم حقنها بشكل تقويمي في الفئران WT أو Ifng KO عند استعادة p53. D، صور مجهرية تمثيلية للورم تم جمعها في اليوم 21 بعد استعادة p53 من C. E، تحليل التدفق الخلوي لوفرة CD45 في الورم من المجموعات المشار إليها. F ، التألق المناعي التمثيلي في الورم المكبوت (المتكاثر) {{1{18}}}} والورم 53- المستعاد (الشيخوخة، بعد 7 أيام من استعادة p53) من المضيف المشار إليه. تم نقل الخلايا السرطانية NSP باستخدام ناقل معبر عن GFP للتصور. أشرطة النطاق، 50 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± SEM. تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل. **، ف < 0.01؛ ***، ف < 0.001.

ربما يكون الناتج الأكثر رسوخًا لإشارة IFN من النوع الثاني يتضمن قدرته على تحفيز آلية عرض المستضد. في الواقع، تسبب IFN في التعبير عن سطح الخلية لـ MHC-I (أو HLA في الخلايا البشرية) في نموذجنا في ظل ظروف التكاثر والشيخوخة. ومع ذلك، كان تنظيم MHC-I الناجم عن IFN أكثر وضوحًا في الخلايا الهرمة، وهو تأثير يرتبط بزيادة التعبير عن الناقل المرتبط بمعالجة المستضد، وعوامل معالجة المستضد الأخرى، والمكونات الهيكلية لـ MHC-I. ولوحظ وجود فرط حساسية مماثل للإنترفيرون في تحفيز MHC-I/HLA في خطوط خلايا سرطان الكبد والرئة البشرية التي تم تحفيزها للشيخوخة. تشير هذه النتائج إلى أن برنامج الشيخوخة يمكنه تعزيز عرض المستضد في الخلايا غير المناعية، وبالتالي تسهيل المراقبة المناعية للورم. تدعم نتائجنا نموذجًا يتم بموجبه تحديد التأثير النهائي للخلايا الهرمة على بيولوجيا الأنسجة من خلال التأثيرات المجمعة لكيفية إرسال واستقبال الإشارات البيئية. لا تحفز الخلايا الهرمة فقط SASP، الذي يؤدي إلى إعادة تشكيل الأنسجة ويغير حالة الخلية وتكوين الخلايا المناعية في البيئة، ولكنها أيضًا تغير سطحها بشكل كبير، مما يؤدي إلى قدرة تفاضلية على استشعار العوامل البيئية، والتي تتمثل هنا في IFN . الأهم من ذلك، أن تعطيل إشارات IFN لم يكن له أي تأثير على تحريض الشيخوخة أو SASP في نظامنا، ولكنه أضعف انحدارات الورم اللاحقة، مما يشير إلى أن الاستشعار البيئي المتغير يعمل بالتنسيق مع SASP لتحديد الناتج النهائي لبرنامج الشيخوخة - في هذه الحالة، المراقبة المناعية. يبدو أن هذه التأثيرات جزء من برنامج جيني منسق، حيث يظهر كل من برنامج SASP وبرامج الاستشعار اعتماداً بارزاً على عامل إعادة تشكيل الكروماتين BRD4.

على الرغم من أن آلية المراقبة المناعية في نموذجنا تعتمد على التأثيرات التعاونية لمجموعات الخلايا التائية CD8 والبلاعم التي تعكس الانتقال من "البرد المناعي" إلى البيئة الدقيقة للورم "الساخنة المناعية"، فإن أنواع الخلايا المناعية الفطرية أو التكيفية الأخرى قد تتعرف وخلايا شيخوخة واضحة في سياقات مختلفة، أو، بدلا من ذلك، قد لا تحدث المراقبة المناعية على الإطلاق (18، 19). مما لا شك فيه أن بعض هذه الفروق تعكس عدم التجانس في إفراز عامل SASP (13، 14)، على الرغم من أن نتائجنا تثير احتمال أن مدى وطبيعة الاستشعار البيئي المتغير قد يؤثر أيضًا على كيفية تأثير الخلايا الهرمة على بيولوجيا الأنسجة. على الرغم من أن توقف استشعار IFN (عبر Ifngr1 KO) وحذف MHC-I (B2M KO) في الخلايا السرطانية الهرمة قد أضعف المراقبة المناعية في الجسم الحي، إلا أنه لم يلغي انحدار الورم تمامًا بعد تحريض الشيخوخة، مما يشير إلى أن استشعار IFN في الخلايا الهرمة هو أمر جيد. ليس المسار الوحيد الذي يساهم في تراجع الورم. بغض النظر، فإن حقيقة أن الخلايا الهرمة يمكن أن تستجيب بشكل مختلف للإشارات البيئية تعني أن حالتها الجزيئية النهائية في الأنسجة ستكون مختلفة عنها في زراعة الخلايا، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى توصيف أفضل للعملية في الجسم الحي.

قد تساعد نتائجنا في تفسير التأثيرات المتناقضة لبيولوجيا الشيخوخة في علم وظائف الأعضاء والمرض، ولها آثار على الاستخدام الفعال للعلاجات المعدلة للشيخوخة. على سبيل المثال، في نموذجنا، تم تحديد الفرق بين إزالة الخلايا السرطانية الهرمة واستمراريتها، على الأقل جزئيًا، من خلال وجود IFN البيئي وسلامة إشارات IFN من النوع الثاني في الخلايا الهرمة. يشير هذا إلى أن الاختلاف في قدرة الخلايا الهرمة على تجنيد واستشعار الخلايا المناعية المفرزة للإنترفيرون أو أنواع الخلايا المناعية الأخرى يمكن أن يؤثر بشكل عميق على إزالة الخلايا الهرمة، مثل انخفاض الإنترفيرون البيئي أو تناقص إشارات IFN من النوع الثاني يمكن أن يمكّن من ثبات الخلايا الهرمة داخل الأنسجة. في سياق السرطان، يمكن للعلاجات التي تحفز شيخوخة الخلايا السرطانية - وهو برنامج تثبيط الخلايا - أن تؤدي إلى تراجع الورم بوساطة مناعية أو إعادة حساسية الأورام لحصار نقطة التفتيش المناعية، ومع ذلك فإن هذه ليست النتائج الشاملة. على هذا النحو، فإن عدم التجانس في SASP (الذي يمكن أن يختلف بين أنواع الخلايا السرطانية ومحفزات الشيخوخة) أو استشعار وإخراج الإنترفيرون [ربما يتأثر بحذف أو طفرة مسار الإنترفيرون أو مكونات HLA (60) أو آليات النسخ العكسية المكتشفة هنا] قد يؤثر على فعالية مثل هذه العلاجات في المرضى. تماشيًا مع هذه الفكرة، فإن التحريض الموجه بالعلاج لملفات تعريف SASP محددة يتنبأ بنتائج المرضى في مجموعة فرعية من المرضى المصابين بسرطان المبيض (61). على النقيض من ذلك، فإن استراتيجيات تعزيز المراقبة المناعية للخلايا الهرمة عن طريق زيادة حساسيتها للإنترفيرون (على سبيل المثال، مع مثبطات PTPN2) قد تساعد في تحيز مخرجات البرنامج نحو رفض الخلايا السرطانية. نحن نتصور أن التحقيق في هذا البرنامج وغيره من برامج إعادة تشكيل الأنسجة واستشعارها في خزعات الورم قبل وبعد العلاج (على سبيل المثال، من خلال الملامح النصية أو البروتينية) قد يكشف عن مؤشرات حيوية جديدة للاستجابة و/أو استراتيجيات مجمعة لتحسين الإدارة السريرية للسرطان.

مراجع

1. Di Micco R، Krizhanovsky V، Baker D، d'Adda di Fagagna F. الشيخوخة الخلوية في الشيخوخة: من الآليات إلى الفرص العلاجية. نات ريف مول سيل بيول 2021;22:75–95.

2. مونوز-اسبين د، سيرانو م. الشيخوخة الخلوية: من علم وظائف الأعضاء إلى علم الأمراض. نات ريف مول سيل بيول 201؛15:482–96.

3. ديماريا إم، أوهتاني إن، يوسف إس إيه، رودير إف، توسان دبليو، ميتشل جي آر، وآخرون. دور أساسي للخلايا الهرمة في التئام الجروح الأمثل من خلال إفراز PDGF-AA. ديف سيل 201؛31:722–33.

4. شو إم، بيرتسخالافا تي، فار جي إن، ويجاند بي إم، بالمر إيه كيه، ويفودا إم إم، وآخرون. تعمل أدوية السينوليتيك على تحسين الوظيفة البدنية وزيادة العمر في سن الشيخوخة. نات ميد 201؛24:1246–56.

5. سيرانو إم، لين إيه دبليو، ماكوراش إم إي، بيتش دي، لوي إس دبليو. يثير Oncogenic Ras شيخوخة الخلايا المبكرة المرتبطة بتراكم p53 و p16INK4a. خلية 199؛88:593–602.

6. إيوالد جيه إيه، ديسوتيل جيه إيه، وايلدنج جي، جارارد دي إف. الشيخوخة الناجمة عن العلاج في السرطان. J Natl Cancer Inst 201;102:1536–46.

7. Coppe JP، Desprez PY، Krtolica A، Campisi J. النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة: الجانب المظلم لقمع الورم. أنو ريف باثول 201؛5: 99–118.

8. ديماريا إم، أوليري إم إن، تشانغ جيه، شاو إل، ليو إس، أليميرة إف، وآخرون. الشيخوخة الخلوية تعزز الآثار الضارة للعلاج الكيميائي وانتكاسة السرطان. السرطان ديسكوف 201؛7: 165–76.

9. كوبي جي بي، باتيل سي كيه، رودير إف، صن واي، مونوز دي بي، غولدستين جي، وآخرون. تكشف الأنماط الظاهرية الإفرازية المرتبطة بالشيخوخة عن وظائف الخلايا غير المستقلة لـ RAS المسرطنة ومثبط الورم p53. بلوس بيول 200؛6:2853–68.

10. تاسدمير ن، بانيتو أ، رو جي إس، ألونسو كوربيلو د، كاميولو إم، تشاهارجانيه دي إف، وآخرون. يربط BRD4 إعادة عرض المُحسِّن والمراقبة المناعية للشيخوخة. السرطان ديسكوف 201؛6:612–29.

11. شين واي، سكوبو سي، وانغ إكس، فانغ إكس، بالغلي بي، بولدن جي إي، وآخرون. التحكم في النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة بواسطة NF-kappaB يعزز الشيخوخة ويعزز الحساسية الكيميائية. جينات ديف 201;25:2125–36.

12. كويلمان تي، ميشالوغلو سي، فريديفيلد إل سي، دوما إس، فان دورن آر، ديسميت سي جيه، وآخرون. الشيخوخة الناجمة عن الجين الورمي والتي تنتقل عن طريق شبكة التهابية تعتمد على الإنترلوكين. خلية 200؛133:1019–31.

13. باسيستي إن، كالي إيه، جيون أوه، كوينمان سي، باين تي، راو سي، وآخرون. أطلس بروتيني للإفرازات المرتبطة بالشيخوخة لتطوير المؤشرات الحيوية للشيخوخة. بلوس بيول 202؛18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A، de Jong TV، Melov S، Guryev V، Campisi J، Demaria M. كشف عدم التجانس النسخي في الخلايا الهرمة. كور بيول 201;27:2652–60.

15. شيويه دبليو، زيندر إل، ميثينج سي، ديكينز آر إيه، هيرناندو إي، كريزانوفسكي في، وآخرون. يتم تحفيز الشيخوخة وإزالة الورم عن طريق استعادة p53 في سرطانات الكبد الفئران. طبيعة 200؛ 445: 656–60.

16. كانغ تي دبليو، يفسا تي، وولر إن، هوينيكي إل، ويستيفيلد تي، داوتش دي، وآخرون. مراقبة الشيخوخة لخلايا الكبد ما قبل الخبيثة تحد من تطور سرطان الكبد طبيعة 201؛ 479: 547-51.

17. أوفاديا واي، لاندسبيرجر تي، لينس إتش، فاداي إي، جال إتش، بيران أ، وآخرون. يؤدي ضعف المراقبة المناعية إلى تسريع تراكم الخلايا الهرمة والشيخوخة. نات كومون 201؛9:5435.

18. Lujambio A. لتطهير أو عدم تطهير (الخلايا الهرمة)؟ هذا هو السؤال. المقايسات الحيوية 2016;38 ملحق 1:S56–64. 19. دي ميتري د، توسو أ، تشن جيه جيه، سارتي إم، بينتون إس، جوست تي آر، وآخرون. الورم المتسلل إلى الخلايا النخاعية Gr -1+ يعادي الشيخوخة في السرطان. طبيعة 201؛515:134–7.

20. روسيتي إم، ليبولد جيه، بوت إم جيه، فينيل إم، كوليك إيه، سالجادو إن آر، وآخرون. تساهم السمية الخلوية بوساطة الخلايا NK في السيطرة على الورم عن طريق مزيج من الأدوية المثبطة للخلايا. العلوم 2018;362:1416–22.

21. لوفيت جي إم، كيلي آر كيه، فيلانويفا إيه، سينجال إيه جي، بيكارسكي إي، رواياي إس، وآخرون. سرطانة الخلايا الكبدية. نات ريف ديس برايمر 2021؛7:6.

22. شيانج دي واي، فيلانويفا أ، هوشيدا واي، بيكس جيه، نيويل بي، مينجويز بي، وآخرون. المكاسب البؤرية لـ VEGFA والتصنيف الجزيئي لسرطان الكبد. ريس السرطان 200؛ 68: 6779–88.

23. لوفيت جي إم، كاستيت إف، هيكينوالدر إم، مايني إم كيه، مازافيرو في، بيناتو دي جي، وآخرون. العلاج المناعي لسرطان الكبد. نات ريف كلين أونكول 202؛19:151–72.

24. Sangro B، Sarobe P، Hervas-Stubbs S، Melero I. التقدم في العلاج المناعي لسرطان الكبد. نات ريف غاسترونتيرول هيباتول 2021;18:525–43.

25. ليفين ج. استهداف البروتين P53 لعلاجات السرطان: التأثير الانتقالي لأبحاث P53. دقة السرطان 2022;82:362–4.

26. شياو واي، تشن جي، تشو إتش، تسنغ إكس، روان زي، بو زي، وآخرون. الجمع بين العلاج الأحادي p53 mRNA مع حصار نقطة التفتيش المناعية يعيد برمجة البيئة المكروية المناعية لعلاج فعال للسرطان. نات كومون 2022؛13:758.

27. ديمير أو، باروس إي بي، أوفوت تي إل، روزنفيلد إم، أمارو آر إي. عرض متكامل لديناميات p53، والوظيفة، وإعادة التنشيط. كور أوبين ستراكت بيول 2021;67:187–94.

28. سودا تي، ليو د. توصيل الجينات الهيدروديناميكية: مبادئه وتطبيقاته. مول ثير 200؛15:2063–9.

29. هوشيدا واي، نيجمان إس إم، كوباياشي إم، تشان جيه إيه، برونيت جي بي، تشيانغ دي واي، وآخرون. يكشف تحليل النسخ التكاملي عن فئات فرعية جزيئية شائعة لسرطان الكبد البشري. ريس السرطان 200؛ 69: 7385-92.

30. Kaech SM، Hemby S، Kersh E، Ahmad R. التنميط الجزيئي والوظيفي للذاكرة CD8 T تمايز الخلايا. خلية 200؛111:837–51.

31. Bruix J، Cheng AL، Meinhardt G، Nakajima K، De Sanctis Y، Llovet J. العوامل النذير والتنبؤات لفائدة السرافينيب في المرضى الذين يعانون من سرطان الخلايا الكبدية: تحليل دراستين من المرحلة الثالثة. جي هيباتول 201;67:999–1008.

32. أدروفير جي إم، أروكا-كريفيلين إيه، كرينسيوك جي، أوستوس إف، روخاس-فيجا واي، روبيو-بونس إيه، وآخرون. يؤدي "نزع سلاح" بروتين العدلات المبرمج إلى تقليل حجم الالتهاب. نات إيمونول 202؛21: 135–44.

33. زيسبيرجر إس إم، أوديرمات بي، مارتي سي، زيندر-فجالمان إيه إتش، بالمر-هوفر كيه، شويندينر آر إيه. استنفاد البلاعم المرتبطة بالورم بوساطة كلودرونيت-الجسيم الشحمي: نهج علاجي جديد وفعال للغاية مضاد لتولد الأوعية. بر جي كانسر 200؛ 95: 272–81.

34. دي سيمون جي، أندرياتا إف، بليريوت سي، فوماجالي في، لورا سي، جارسيا مانتيجا جيه إم، وآخرون. تحديد مجموعة فرعية من خلايا كوبفر قادرة على عكس الخلل الوظيفي في الخلايا التائية الناجم عن تحضير الخلايا الكبدية. المناعة 2021;54:2089–100.

35. دان إي، هندرسون إن سي، تيشمان إس إيه، مورغان إم دي، ماريوني جي سي. اختبار الوفرة التفاضلية على بيانات الخلية المفردة باستخدام الرسوم البيانية المجاورة الأقرب. نات بيوتكنول 202؛40:245–53.

36. كيم إتش دي، بارك إس، جيونج إس، لي واي جي، لي إتش، كيم سي جي، وآخرون. يحدد الشكل 4-1BB حالة التنشيط المتميزة لخلايا CD8 (+) T المنهكة والمتسللة للورم في سرطان الخلايا الكبدية. أمراض الكبد 2020;71:955–71.

37. لي واي، وانغ زي، جيانغ دبليو، تسنغ إتش، ليو زي، لين زي، وآخرون. تحدد الخلايا التائية TNFRSF9(+) CD8(+) المتسللة للورم مجموعات فرعية مختلفة من سرطان الخلايا الكلوية الصافية مع التشخيص والاستجابة العلاجية المناعية. علم المناعة الأورام 2020؛9:1838141.

38. بينديا جي، مليكنيك بي، توسوليني إم، كيريلوفسكي إيه، فالدنر إم، أوبينوف إيه سي، وآخرون. تكشف الديناميكيات الزمانية المكانية للخلايا المناعية داخل الورم عن المشهد المناعي في سرطان الإنسان. المناعة 201؛39:782–95.

39. كوانغ دي إم، تشاو كيو، بينج سي، شو جي، تشانغ جي بي، وو سي، وآخرون. تعمل الخلايا الوحيدة المنشطة في السدى الصفاقي لسرطان الخلايا الكبدية على تعزيز الامتياز المناعي وتطور المرض من خلال PD-L1. جي إكسب ميد 200؛206:1327–37.

40. لو إل جي، تشو زل، وانغ إكس واي، ليو بي، لو جي واي، ليو إس، وآخرون. يحرر الحصار PD-L1 الخواص المضادة للأورام الجوهرية للبلاعم المحللة للسكر في سرطان الخلايا الكبدية. جوت 2022;71:2551–60.

41. ميلانوفيتش إم، فان دي إن واي، بيلينكي دي، دابريتز جي إتش إم، تشاو زي، يو واي، وآخرون. إعادة البرمجة المرتبطة بالشيخوخة تعزز استئصال السرطان. طبيعة 201؛553:96–100.

42. يوسف إتش، تشوبالا سي جيه، لي دي، تشن إم بي، بورك آن، زيرا كا، وآخرون. الدم المسن يضعف نشاط السلائف العصبية الحصين وينشط الخلايا الدبقية الصغيرة عبر الخلية البطانية في الدماغ VCAM1. نات ميد 201؛25:988–1000.

43. رابيساردا في، بورغيسان إم، ميغيلا في، إنشيفا في، سنيجدرز أب، لوجامبيو أ، وآخرون. ينظم Integrin beta 3 الشيخوخة الخلوية عن طريق تنشيط مسار TGF-beta. سيل ريب 201؛18:2480–93.

44. يوكيمز إف، ثيجسين بي، دي كونتي جي، يانسن آر، بوجاكار زي، جروت كيه، وآخرون. السرطان SENESCopedia: رسم لشيخوخة الخلايا السرطانية. مندوب الخلية 2021;36:109441.

45. بيرنا إف، بيرمان إس إتش، سوني آر كيه، مانسيلا-سوتو جيه، إيكم جيه، هامية إم، وآخرون. دمج البروتينات والنسخ للعلاج المنهجي لمستقبلات المستضد الخيميري التوافقي لمرض AML. خلية السرطان 2017;32:506–19.

46. ​​هواري إم، إيتو واي، كانغ تي دبليو، ويكيز إم بي، ماثيسون إن جيه، باتن دا، وآخرون. يتوسط NOTCH1 التبديل بين إفرازين متميزين أثناء الشيخوخة. نات سيل بيول 201;18:979–92.

47. كاسترو إف، كاردوسو أب، جونكالفيس آر إم، سيري كيه، أوليفيرا إم جي. إنترفيرون جاما على مفترق طرق المراقبة المناعية للورم أو التهرب. فرونت إيمونول 201؛9:847.

48. بلاتانياس إل سي. آليات الإشارات بوساطة الإنترفيرون من النوع الأول والنوع الثاني. نات ريف إيمونول 200;5:375–86.

49. مانجوسو آر تي، بوب إتش دبليو، زيمر إم دي، براون إف دي، ييتس كيه بي، ميلر بي سي، وآخرون. يحدد فحص كريسبر في الجسم الحي Ptpn2 كهدف للعلاج المناعي للسرطان. طبيعة 201؛547:413–8.

50. Song MM، Shuai K. إن مثبط إشارات السيتوكين (SOCS) 1 وSOCS3 ولكن ليس بروتينات SOCS2 يمنع الأنشطة المضادة للفيروسات والتكاثر بوساطة الإنترفيرون. جي بيول تشيم 199؛ 273: 35056–62.

51. كليبي إم، سولييه جيه، أسنافي في، مينتينز إن، هورناكوفا تي، نووبس إل، وآخرون. PTPN2 ينظم سلبا JAK1 المسرطنة في سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية. دم 2011;117:7090–8.

52. Zhou F. الآليات الجزيئية لـ IFN-gamma لتنظيم معالجة وعرض المستضد من الدرجة الأولى MHC. إنت ريف إيمونول 200؛28:239–60.

53. مكارثي إم كيه، واينبرغ جي بي. العدوى المناعية والفيروسية: منظم معقد للالتهاب. فرونت ميكروبيول 2015؛ 6:21.

54. يوشيهاما إس، فيجايان إس، صديق تي، كوباياشي كانساس. NLRC5/CITA: لاعب رئيسي في المراقبة المناعية للسرطان اتجاهات السرطان 2017؛3: 28–38.

55. كالاورا إس، لي جي إس، بارنيا إي، ليفي آر، جرينبرج بي، ألون إم، وآخرون. يرتبط التعبير المناعي للبروتينات المناعية بتشخيص أفضل والاستجابة لعلاجات نقاط التفتيش في سرطان الجلد. نات كومون 2020؛ 11:896.

56. Efeyan A، Ortega-Molina A، Velasco-Miguel S، Herranz D، Vasilev LT، Serrano M. تحريض الشيخوخة المعتمدة على p 53- بواسطة nutlin المضاد MDM2 -3 a في خلايا الفأر من الخلايا الليفية أصل. ريس السرطان 200؛67:7350–7.

57. هوكسترا إم إي، بورنز إل، ديكغراف إف إي، فيليبس دي، بارديك إن، توبيس إم، وآخرون. التعديل لمسافات طويلة للخلايا السرطانية المارة بواسطة خلايا CD8 (+) T التي تفرزها IFNgamma. نات كانسر 2020؛1: 291–301.

58. روسيتي إم، موريس جي بي تي، ميزادرا آر، راسل جيه، ليبولد جيه، روميسر بي بي، وآخرون. إعادة تشكيل الأوعية الدموية الناجم عن الشيخوخة يخلق نقاط ضعف علاجية في سرطان البنكرياس خلية 2020؛181:424–41.

59. ديغي AS، ريتشاردز إي، أولد إل جيه، طريق شرايبر. تعزيز نمو الجسم الحي ومقاومة رفض الخلايا السرطانية معبرًا عن مستقبلات غاما IFN السلبية السائدة. المناعة 199؛1: 447–56.

60. جاو جي، شي إل زد، تشاو إتش، تشن جي، شيونغ إل، هي كيو، وآخرون. فقدان جينات مسار IFN جاما في الخلايا السرطانية كآلية لمقاومة العلاج المضاد لـ CTLA-4. خلية 201؛167:397–404.

61. بافنهولز إس في، سالفاجنو سي، هو واي جي، ليمجوكو إم، باسلان تي، تيان إس، وآخرون. تحريض الشيخوخة يملي الاستجابة للعلاج الكيميائي والمناعي في النماذج قبل السريرية لسرطان المبيض. بروك ناتل أكاد ساي يو إس إيه 202؛119:e2117754119.

62. شاو دي دي، شيويه دبليو، كرال إي بي، بوتكار إيه، بيتشيوني إف، وانغ إكس، وآخرون. يتلاقى KRAS و YAP1 لتنظيم EMT وبقاء الورم. خلية 201؛158:171–84.

63. تشو سي، كيم كيه، وانغ إكس، بارتولومي أ، سالوماو إم، دونجيوفاني بي، وآخرون. يؤدي تنشيط خلايا الكبد إلى تليف الكبد في التهاب الكبد الدهني غير الكحولي. ساي ترانس ميد 201؛10:eaat0344.

64. سوساكي إي إيه، تايناكا كيه، بيرين دي، يوكيناجا إتش، كونو إيه، أويدا إتش آر. بروتوكولات CUBIC المتقدمة لتنظيف وتصوير كامل الدماغ والجسم. نات بروتوك 201;10:1709–27.

65. Bolger AM، Lohse M، Usadel B. Trimmomatic: أداة تشذيب مرنة لبيانات تسلسل Illumina. المعلوماتية الحيوية 201؛30:2114–20. 66. دوبين أ، ديفيس كاليفورنيا، شليزنجر إف، درينكوف جيه، زاليسكي سي، جها إس، وآخرون. STAR: مصفف RNA-seq العالمي فائق السرعة. المعلوماتية الحيوية 201؛29:15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq- إطار عمل بايثون للعمل مع بيانات التسلسل عالية الإنتاجية. المعلوماتية الحيوية 201؛31:166–9.

68. Love MI، Huber W، Anders S. تقدير معتدل لتغير الطية والتشتت لبيانات RNA-seq باستخدام DESeq2. الجينوم بيول 201؛15:550.

69. تشين إي، تان سي إم، كو واي، دوان كيو، وانغ زي، ميريليس جي في، وآخرون. Enrichr: أداة تحليل إثراء قائمة جينات HTML5 التفاعلية والتعاونية. بي إم سي بيوينف 201؛14:128.

70. فوروتان إم، بوفا دي دي، ليو آر، حوران كيه، كورسونز جيه، ديفيس إم جي. تسجيل عينة واحدة من الأنماط الجزيئية. بي إم سي بيوينف 201؛19:404.

71. بيندر جي إكس، بليتشر فرانكيلد إس، تسافو كيه، ستولت سي، أودونوغو إس آي، شنايدر آر، وآخرون. المقصورات: توحيد وتصور أدلة توطين البروتين تحت الخلوي. قاعدة بيانات (أكسفورد) 2014;2014:bau012.

72. شبكة أبحاث أطلس جينوم السرطان. التوصيف الجينومي الشامل والمتكامل لسرطان خلايا الكبد. الخلية 2017؛ 169:1327-41.

73. كولابريكو أ، سيلفا تي سي، أولسن سي، جاروفانو إل، كافا سي، جاروليني دي، وآخرون. TCGAbiolinks: حزمة R/Bioconductor للتحليل التكاملي لبيانات TCGA. ريس الأحماض النووية 201؛44:e71.

74. Hanzelmann S، Castelo R، Guinney J. GSVA: تحليل تباين مجموعة الجينات لبيانات ميكروأري وRNA-seq. بي إم سي بيوينف 201؛14:7.

75. بانكهيد بي، لوغري إم بي، فرنانديز جيه إيه، دومبروفسكي واي، ماك آرت دي جي، دان بي دي، وآخرون. QuPath: برنامج مفتوح المصدر لتحليل الصور الرقمية للأمراض. ممثل العلوم 201؛7:16878.

76. بيرنشتاين نيوجيرسي، فونغ إن إل، لام آي، روي إم إيه، هندريكسون دي جي، كيلي دي آر. منفردًا: تحديد مزدوج في RNA-Seq للخلية الواحدة عبر التعلم العميق شبه الخاضع للإشراف. سيل سيست 2020;11:95–101.

77. Satija R، Farrell JA، Gennert D، Schier AF، Regev A. إعادة البناء المكاني لبيانات التعبير الجيني للخلية الواحدة. نات بيوتكنول 201؛33:495–502.

78. McInnes L، Healy J، Melville J. UMAP: تقريب وإسقاط متشعب موحد لتقليل الأبعاد. أرخايف: 1802.03426 [طبعة أولية]. 2018. متاح على: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. تراج في إيه، والتمان إل، فان إيك نيوجيرسي. من لوفان إلى ليدن: ضمان مجتمعات جيدة التواصل. ممثل العلوم 2019؛9:5233.

80. كورسونسكي آي، ميلارد إن، فان جيه، سلويكوسكي كيه، تشانغ إف، وي كيه، وآخرون. تكامل سريع وحساس ودقيق لبيانات الخلية الواحدة مع Harmony. طرق نات 201؛16:1289–96.