Sidt2 هو بروتين رئيسي في مسار تحلل الالتهام الذاتي والجسيم الليزوزومي وهو ضروري للحفاظ على بنية الكلى ووظيفة الترشيح Ⅱ

مناقشة

أظهر عدد كبير من الدراسات أن LMPs متورطة في وظائف الكلى أو التوازن الهيكلي [21-25]. وجدت دراستنا السابقة أن LMP Sidt2 يؤثر على مسار الإشارة الالتهابية ويسبب تلفًا لخلايا مسراق الكبيبة في الفأر [28]. في هذه الدراسة، ولأول مرة، قمنا بدراسة التأثيرات على بنية ووظيفة كلى الفأر الناجمة عن LMP Sidt2. وقد وجد أن حذف Sidt2 أدى إلى اندماج عمليات قدم الكلى في الفأر، وسماكة الغشاء القاعدي، وذمة الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية، وتلف الميكروفيلي، وزيادة بروتينية عند 24 ساعة، مما يشير إلى أن فقدان Sidt2 يؤدي إلى ضعف وظيفة الترشيح. وبنية كلية الفأر، لكن آليتها التفصيلية غير واضحة.

لأن LMPs هي وحدات وظيفية مهمة في الليزوزوم [17] وخلل الليزوزوميهو أحد العوامل المسببة للأمراض الشائعة للعديد من أمراض الكلى المزمنة (CDKs) (المراجع [4، 29])، لقد أجرينا تحقيقات ذات صلة على الليزوزومات بعد حذف Sidt2 ووجدنا أن عدد الليزوزومات الحمضية انخفض ودرجة الحموضة في زيادة الليزوزومات في المختبر. ومع ذلك، لم تكن هناك تغييرات واضحة في أعداد الليزوزومات الأولية المرتبطة بالبلعمة الذاتية وإجمالي الليزوزومات عن طريق التحليل المجهري الإلكتروني. تمثل الكاثيبسينات أكبر مجموعة من الإنزيمات المحللة للبروتين في الليزوزومات [30]، ومن بينها CTSB الذي يعد واحدًا من أكثر البروتيازات الليزوزومية وفرة [31].

نظرًا لأن الكاثيبين يحتاج إلى التحمض من أجل النضج (التنشيط)، فإن التغير في الرقم الهيدروجيني سيؤدي في النهاية إلى انخفاض كبير في تدهور البروتين [32]. أظهرت المستويات في الجسم الحي وفي المختبر انخفاضًا في نشاط ومحتوى هيدرولاز حمض الليزوزوم، مما يؤكد أيضًا أن Sidt2 يثبط وظيفة الليزوزومية من خلال التأثير على نضوج البروتياز في الليزوزومات.

انقر هنا للحصول على التركيبة العشبية للسيستانش للكلى

وفي الوقت نفسه، يعمل الليزوزوم كمركز إعادة تدوير لتحلل المستقلبات الخلوية ومنتجات النفايات في نهاية الالتهام الذاتي [1]. تعد وظيفة التحلل الليزوزومي الطبيعية ضرورية للالتهام الذاتي، والحفاظ على توازن الخلايا، وتمكين الخلايا من البقاء في الحالات الفسيولوجية [33-36]. لقد ثبت أن حدوث وتطور العديد من أمراض الكلى مرتبط بالالتهام الذاتي غير الطبيعي [37-39]. لقد وجدت الدراسات الحديثة أن Sidt2 هو ناقل DNA/RNA الليزوزومي. تعتبر الأنواع غير التقليدية من الالتهام الذاتي من خلال الالتهام الذاتي RNautophagy والبلعمة DNautophagy (RDA) مهمة لتدهور الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي (RNA) الانتقائي [40]. لقد وجدنا سابقًا أن حذف Sidt2 يدمر اندماج الجسيمات البلعمية والليزوزومات، مما يتسبب في عدم قدرة الميتوكوندريا التالفة على التحلل، مما يؤدي إلى تلف بنية ووظيفة العضلات الهيكلية [41]. ولذلك، في هذه الدراسة، قمنا باستكشاف الالتهام الذاتي عندما يكون تلف الكلى ناتجًا عن حذف Sidt2. لاحظنا أن جسيمات البلعمة الذاتية قد تراكمت في كليتي الفئران Sidt2 من خلال المجهر الإلكتروني. الالتهام الذاتي هو عملية ديناميكية، بما في ذلك تكوين جسيمات البلعمة الذاتية وتكوين وتحلل جسيمات البلعمة الذاتية. يتم التحكم في تكوين جسيمات البلعمة الذاتية المبكرة بواسطة جين Atg، ويعد تكوين LC3-II علامة على تكوين جسيمات البلعمة الذاتية [42]. لقد وجدنا أن تعبيرات البروتينات المرتبطة بالالتهام الذاتي Atg وLC3-II زادت بعد حذف Sidt2، مما يشير إلى إمكانية تعزيز نشاط الالتهام الذاتي. ومع ذلك، قد يكون سبب تراكم LC3-II أيضًا هو انسداد مسار جسيمات البلعمة الذاتية في نهاية البلعمة الذاتية

لمزيد من استكشاف تأثير Sidt2 على حالة الالتهام الذاتي الكلوي، تم قياس التعبير وتكوين بروتين الشحن P62، وكذلك تم التحقيق في آثار الأدوية التي تستهدف الالتهام الذاتي (CQ و RAPA). يجب دمج P62 مع LC3B ثم يتحلل في الليزوزوم. غالبًا ما تمثل الزيادة في مستوى بروتين P62 انسدادًا في تدفق الالتهام الذاتي [43]. للقضاء على سبب الزيادة في إنتاج P62، قمنا بقياس مستوى mRNA لـ P62 ووجدنا أن إنتاج P62 قد انخفض، وبالتالي فإن تراكم LC 3- II ربما كان بسبب إعاقة التدهور. لمزيد من استكشاف عملية الالتهام الذاتي، أجرينا تجربة تقليب الكلوروكين. يمكن للكلوروكين تحييد البيئة الحمضية للليسوسوم، وبالتالي تدمير وظيفة الليزوزوم وتثبيط الالتهام الذاتي [44]. تعكس الزيادة في بروتين LC3-II قبل وبعد علاج CQ عدد جسيمات البلعمة الذاتية المتحللة بواسطة الليزوزومات، والتي يمكن أن تعكس نشاط الالتهام الذاتي. يمكن أيضًا استخدام نفس اختبار الوجه CQ لتحديد مقدار تدهور P62 من خلال مسار البلعمة الذاتية. تمشيًا مع النتائج التي توصلنا إليها، أدى حذف Sidt2 إلى انخفاض تدفق الالتهام الذاتي بسبب نهاية الالتهام الذاتي المسدودة. في الوقت نفسه، في تجربة RAPA، زادت مستويات البروتين LC3-II وP62 بشكل ملحوظ في مجموعة Sidt2−/−، مما قد يدعم أيضًا أن نقص Sidt2 يضعف المرحلة النهائية من الالتهام الذاتي.

تتضمن المرحلة النهائية من الالتهام الذاتي تكوين وتدهور الجسيمات الحالة الذاتية. استخدمنا تجارب التوطين المشترك للتألق المناعي LAMP1 وLC3B للكشف عن اندماج جسيمات البلعمة الذاتية والليزوزومات [45، 46]، وأظهرت النتائج أنه تم حظر اندماج جسيمات البلعمة الذاتية والليزوزومات بعد حذف Sidt2. تكتشف تجربة وضع العلامات المزدوجة Ad-mCherry-GFP-LC3B تكوين وتدهور الجسيمات الحالة الذاتية [27]. وأكدت كذلك أن انسداد تكوين وتدهور الجسيمات الحالبة الذاتية هو السبب الرئيسي للضرر الذي يلحق ببنية الكلى ووظيفتها بعد حذف Sidt2.

من النتائج المذكورة أعلاه، يمكننا أن نستنتج أن غياب Sidt2 يسبب انخفاض في عدد الليزوزومات الحمضية وأن خلل التحمض في الليزوزومات يؤثر على نضوج الإنزيمات المتحللة. قد يكون هذا هو السبب الأكثر أهمية للضرر الذي يلحق بمسار تحلل البلعمة الذاتية والليزوسوم بالإضافة إلى اضطرابات الاندماج الذاتي والجسيم الليزوزومي. وفي الوقت نفسه، قد تكون عملية الالتهام الذاتي الضعيفة مرتبطة ارتباطًا وثيقًا ببنية الكلى التالفة ووظيفة التصفية بعد حذف Sidt2 (الشكل 8). تتناول دراستنا فقط جزءًا من تأثيرات Sidt2 على بنية الكلى ووظيفتها، ولكن المثير للاهتمام هو أن تراكم بروتينات الالتهام الذاتي الرئيسية وضعف بنية الكلى ووظيفتها الناجم عن حذف Sidt2 تشبه التغيرات في بروتينات الالتهام الذاتي الرئيسية و زيادة كبيرة في بروتينية في اعتلال الكلية السكري [37، 47]. قد يكون إصلاح وظيفة الليزوزوم بمثابة استراتيجية جديدة محتملة لعلاج اعتلال الكلية السكري [37]. نتوقع أن يوفر Sidt2 طريقة لاستكشاف التسبب في أمراض الكلى وعلاجها في المستقبل.

اختبار بروتين البول في الفئران تم اختيار 12-فئران WT وفئران Sidt2−/− الذكور التي تم اختيارها عشوائيًا وتم وضعها في أقفاص استقلابية وصامت ولكن تم إعطاؤها الماء. تم جمع عينات بول لمدة 24 ساعة، ثم تم اختبارها بحثًا عن بروتين البول (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute، CHN، C035-2-1) (يرجى الرجوع إلى المواد التكميلية للحصول على طرق مفصلة). تم شراء الخلايا الكبيبية الكبيبية للخلايا MPC5 من مجموعة BeNa Culture Collection، وتم تربيتها باستخدام 10٪ FBS (Excell Bio، South America، FSP500) وDMEM منخفض الجلوكوز (Sigma-Aldrich، 6046). تم شراء خلايا مسراق الكبيبة SV40 MES 13 من بنك الخلايا النموذجي للجنة الحفاظ على الثقافة التابع للأكاديمية الصينية للعلوم، وتم تربيتها باستخدام 10٪ FBS (Excell Bio، South America، FSP500) وDMEM عالي الجلوكوز (Sigma-Aldrich، 6429). . تم الحفاظ على تركيز ثاني أكسيد الكربون في صندوق زراعة الخلايا عند 5% وتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة. تم شراء الكلوروكين (CQ) والراباميسين (RAPA) من Sigma-Aldrich (C6628، V900930). تم إذابة 10 ملي مولار CQ و 25 ملغم / مل من الراباميسين في الماء النقي للغاية. تمت إضافة CQ إلى طبق بتري بحيث كان التركيز النهائي 50 ميكرومتر، وتم حضنه لمدة 16 ساعة كمثبط للالتهام الذاتي. تمت إضافة Rapamycin إلى طبق بتري بتركيز نهائي قدره 15 ميكرومتر واحتضانه لمدة ساعتين كمنشط للالتهام الذاتي. تم استخدام نظام ناقلات الفيروسة البطيئة لتحرير الجينات CRISPR/Cas9 لإزالة جين Sidt2 Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535، Feng Zhang) وتم شراء البلازميدات، وتم استخدام أداة التصميم عبر الإنترنت sgRNA (//crispr.mit.edu/) ل تصميم sgRNA يستهدف Sidt2.

كانت التسلسلات التمهيدية كما يلي: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC -3 ′، R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT -3 ′، تم تصنيعها بواسطة شركة التكنولوجيا الحيوية (Sangon Biotech، Shanghai، CHN). باستخدام نظام الفيروس البطيء CRISPR/Cas9، تم خطية بلازميد Lenticrispr-v2 وربطه بـ sgRNA الملدن المزدوج لبناء Lenticrispr-v{{1{{180}}}} البلازميد المؤتلف Sidt2. تم استخدام كاشف ترنسفكأيشن Vigofect (Vigorous Biotechnology، Beijing، CHN) لنقل البلازميد Lenticrispr-v2 و Lenticrispr-v 2- Sidt2 البلازميد المؤتلف من أجل بناء الفيروس البطيء. تم نقل الفيروس البطيء الذي تم الحصول عليه إلى خلايا MPC5 وخلايا SV40 MES 13. بعد 48 ساعة، تم تحضين الخلايا بالبورينوميسين لمدة 72 ساعة للاختيار. وكانت الخلايا الباقية هي مجموعة Sidt2+/+ ومجموعة Sidt2−/− التي تم نقلها بنجاح. تم استخدام عزل الحمض النووي الريبي (RNA) وفحص PCR في الوقت الحقيقي Trizol (Invitrogen) لاستخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من خلايا الكلى الفأرية، وكانت طريقة RT-PCR المحددة كما هو موضح سابقًا [21]. كانت تسلسلات الاشعال لـ RT-PCR كما يلي: Actin (بمعنى: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG -3 ′، R: 5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT -3 ′)، P62 (بمعنى: F: 5) ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(بمعنى: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′, R:5'-GGATGCAGTCTGTG TAGAGCACA{ {48}}'). النشاف الغربي الطريقة المحددة كما ذكرنا من قبل [28]. في هذه الدراسة، شملت الأجسام المضادة الأولية الأرانب المضادة لـ LC3B (1:1000؛ Sigma-Aldrich L7543)، والأرانب المضادة P62 (1:1000؛ Abcam ab205719)، والمضادة للفأر - -أكتين (1:1000؛ سيجما الدريخ) A5316)، مضاد للأرنب Sidt2 (1:1000؛ Invitrogen PA5-69064)، مضاد للأرنب Atg5 (1:1000؛ تقنية تشوير الخلايا 9980S)، مضاد للأرنب Atg7 (1:1000؛ تقنية تشوير الخلية 8558S) ، أرنب مضاد Atg12 (1: 1000؛ تقنية تشوير الخلية 2011S)، مضاد الماوس LAMP1 (1: 1000؛ سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية H4A3)، أرنب مضاد الكاثيبين B (1: 1000؛ تقنية تشوير الخلية 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B تم تلقيح الخلايا على أطباق بيتري ذات القاع الزجاجي من Nunc. بعد النمو إلى كثافة مناسبة، تمت إضافة Ad-mCherry-GFP-LC3B (توقيت Beyo، Shanghai، CHN، C3011-10 مل)، مما أدى إلى تركيز نهائي قدره 10 −11 vp/mL. بعد التحفيز لمدة 48 ساعة، تمت ملاحظة أعداد نقاط الفلورسنت mCherry وGFP مباشرة تحت مجهر الليزر متحد البؤر (Leica SP8، ألمانيا). التألق المناعي تم تلقيح الخلايا على أطباق بتري ذات قاع زجاجي وتم تثبيتها باستخدام بارافورمالدهيد. بعد الحجب، تم تحضين الخلايا طوال الليل باستخدام الجسم المضاد الأولي، ثم تم تحضينها بالجسم المضاد الثانوي لمدة 90 دقيقة في الظلام. تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (لايكا SP8، ألمانيا) بعد صبغ النوى باستخدام DAPI (1 ميكروغرام/مل). وشملت الأجسام المضادة الأولية P62 (1:200؛ Abcam ab205719)، LAMP1 (1:200؛ سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية H4A3)، LC3B (1:200؛ Sigma-Aldrich L7543)؛ تشتمل الأجسام المضادة الثانوية على الأجسام المضادة الثانوية للفئران المضادة لـ Cy3-الماعز المترافق Affinipure المضاد للفئران IgG (H + L) (1:200؛ Proteintech SA00009-1)، CoraLite488-الماعز المقترن Affinipure IgG المضاد للفأر (H + L) (1:200؛ Proteintech SA00013-1)، CoraLite594- IgG المقترن Affinipure الماعز المضاد للأرنب (H + L) (1:200؛ Proteintech SA{{144) }}). بالنسبة إلى LysoTracker (Beyotime، Shanghai، CHN، C1046)، قمنا أيضًا بتلقيح الخلايا على أطباق بيتري ذات القاع الزجاجي. بعد النمو إلى كثافة مناسبة، تمت إضافة سائل زراعة الخلايا الذي يحتوي على تركيز LysoTracker النهائي البالغ 75 نانومتر إلى الخلايا، والتي تم تصويرها بعد 45 مترًا من التحفيز. استخدم ImageJ لحساب عدد نقاط الفلورسنت ومعامل ارتباط بيرسون. ملاحظات المجهر الإلكتروني النافذ من كل مجموعة، تم اختيار الفئران الذكور Sidt2−/− وWT البالغة من العمر 3 أسابيع بشكل عشوائي لإعداد عينات المجهر الإلكتروني من أنسجة الكلى، والطريقة المحددة هي كما هو موضح سابقًا [48] ، التقط صورًا عشوائيًا للأقسام باستخدام المجهر الإلكتروني، هناك أكثر من 10 صور مأخوذة من أقسام الكلى لكل فأر، اختر عشوائيًا 3-5 صور بتكبير 8000 × من صور المجهر الإلكتروني لكل فأر، واحسب عدد الجسيمات الحالبة الذاتية في الصورة، وقارن مجموعة Sidt2 -/− مع مجموعة WT. فيما يتعلق بإعداد عينات المجهر الإلكتروني للخلية، كشط ما لا يقل عن 105 خلايا بمكشطة الخلية وجمعها في أنبوب EP، ثم الطرد المركزي عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 م، وتجاهل المادة طافية وملئها بمثبت المجهر الإلكتروني. بعد تخزينه في ثلاجة 4 درجات لأكثر من ساعة واحدة، يمكن تقديمه للفحص. تم التقاط الصورة بالمجهر الإلكتروني بواسطة شركة KingMed Diagnostics (قوانغتشو، الصين). LysoSensor تم تلقيح الخلايا على طبق بئر 96-. بعد النمو إلى كثافة مناسبة، تمت إضافة وسط مسخن مسبقًا (37 درجة) يحتوي على 1 ميكرومتر LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). تم تحضين الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة، ثم تمت إزالة الوسط واستبداله بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم استخدام وضع WellScan لقراءة اللوحة في BioTek Citation 5 (BioTek، Winooski، VT، USA). تم قياس الإسفار باستخدام الأطوال الموجية للإثارة/الانبعاث Ex360nm/Em450nm وEx380nm/Em540nm، وتم تحديد درجة الحموضة الليزوزومية من نسبة Em540 إلى Em450. التحليل الإحصائي تم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SEM. تم إجراء المقارنة الإحصائية بين مجموعتين باستخدام اختبارات t غير المقيدة. عند استخدام برنامج Graphics 8.0 للتحليل الإحصائي، اعتبرت P <0.05 ذات دلالة إحصائية. تم تكرار كل مجموعة من التجارب في هذه الدراسة ثلاث مرات على الأقل بشكل مستقل. توفر البيانات مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها و/أو تحليلها خلال الدراسة الحالية متاحة من المؤلف المقابل بناء على طلب معقول.

مراجع

1. Settembre C، Fraldi A، Medina DL، Ballabio A. إشارات من الليزوزوم: مركز تحكم للتخليص الخلوي واستقلاب الطاقة. نات ريف مول خلية بيول. 2013;14:283–96.

2. Lamming DW، Bar-Peled L. Lysosome: مركز الإشارات الأيضية. مرور. 2019;20:27–38.

3. بالابيو أ. الليزوزوم الرائع. إمبو مول ميد. 2016;8:73–76.

4. ياماموتو تي، تاكاباتاكي واي، تاكاهاشي أ، كيمورا تي، نامبا تي، ماتسودا جي، وآخرون. يساهم الخلل الليزوزومي الناجم عن النظام الغذائي عالي الدهون وضعف تدفق البلعمة الذاتية في تسمم الدهون في الكلى. J صباحا سوك نيفرول. 2017;28:1534–51.

5. نونكليرك د، رونا إس، توبو جي، زانين جي، هيوسون-ستينون جيه إيه، شوديس آر بي، وآخرون. الإصابة الأنبوبية والتجدد في كلية الفئران بعد التعرض الحاد للجنتاميسين: دراسة زمنية. رن فشل. 1992;14:507–21.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

احصل على مستخلص السيستانش العضوي الطبيعي الذي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% من الأكتيوسايد للكلى.