التثبيت المتزامن للهيكل الخلوي للأكتين في خلايا متعددة خاصة بالنفرون يحمي الكلى من الإصابات المتنوعة

أمراض الكلى المزمنةوإصابة الكلى الحادهي ميكانيكياأمراض الكلى المميزة. بينما ترتبط أمراض الكلى المزمنةإصابة بودوسيت, إصابة الكلى الحاديؤثر على الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية. وعلى الرغم من هذه الاختلافات،ميزة أساسيةلكليهماأمراض الكلى الحادة والمزمنةهو الهيكل الخلوي الأكتين غير المنظم. لقد أظهرنا ذلكالتنشيط الدوائي للدينامين GTPaseيخفف من إصابة البودوسيتنماذج الفئران من أمراض الكلى المزمنةبواسطةتعزيز بلمرة الأكتين. نحن هنا نحدد دور الدينامينات في تعديل صلابة وقطبيةالخلايا الظهارية الأنبوبية الكلويةعن طريق ربط خيوط الأكتين في شبكات متفرعة. يؤدي تنشيط قدرة الدينامينات على الارتباط المتشابك بواسطة ناهض جزيء صغير إلى استقرار قشرة الأكتوميوسين في الغشاء القمي ضد الإصابة، والتي بدورهايحافظ على وظيفة الكلىفي نماذج الفئران المختلفة لإصابة الكلى الحادة. والجدير بالذكر أن ناهض الدينامينات يخفف في نفس الوقت الخلايا البودوجية وإصابة أنبوبيفي النموذج الفأري الوراثي لمتلازمة ألبورت. تقدم دراستنا أدلة على الجدوى وتسلط الضوء علىفوائد العلاجات الجديدة الشاملة للوقاية من النيفرون.

انقر هنا للتعرف على تركيبة عشبية من السيستانش جيدة في علاج إصابات الكلى الحادة

الالأسباب الرئيسية لإصابة الكلى الحادة(آكي) هيإقفار, نقص الأكسجة، أوالسمية الكلوية1. على الرغم من أنه يمكن عكس ذلك، إلا أن القصور الكلوي الحاد يمثل مشكلة كبيرة في الرعاية الصحية مع ارتفاع معدل الوفيات وعدم وجود علاج نهائي. بغض النظر عن مسبباته، فإن القصور الكلوي الحاد يصيب في المقام الأول الخلايا الظهارية المستقطبة للأنابيب الكلوية التي تشكل الزغيبات القمية حدود الفرشاة الأنبوبية التي تشارك في تنسيق نقل الإلكتروليت والماء الأساسي. من السمات المورفولوجية المبكرة لـ AKI فقدان حدود الفرشاة وقطبية الخلية بسبب انهيار قشرة الأكتوميوسين في الغشاء القمي .

يتضمن إنشاء وصيانة قطبية الخلية شلالات الإشارة، والاتجار بالأغشية، وديناميكيات الهيكل الخلوي، وكلها منسقة بدرجة عالية. يتم تحديد تنظيم الغشاء القمي إلى حد كبير من خلال بنية شبكات الأكتوميوسين، التي تحدد صلابة القشرة، وبالتالي تسهيل تجميع البروتينات القطبية. في حين تعتبر محركات الميوسين II المولد الرئيسي للتصلب القشري 5,6، فإن بنية قشرة الأكتوميوسين يتم إنشاؤها بواسطة عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) 7.

بالإضافة إلى الـ ABPs المعروفة، فإن حدود الفرشاة للأنابيب الكلوية غنية بدرجة عالية بالدينامين 8، وهو GTPase المعروف بدوره في الالتقام الخلوي 9. يتمتع الدينامين بميل جوهري للتجمع في حالات احتكار قليلة مثل dimers، وtetramers، والخواتم، واللوالب. لقد حددنا لأول مرة التفاعلات المباشرة بين الدينامينات والأكتين 10 وأظهرنا أن قليلية الدينامينات تنظم بلمرة الأكتين في الخلايا الرجلية 11، 12، وهي خلايا متخصصة ضرورية لانتقائية مرشح الكلى. باستخدام نماذج الفئران من CKD، أظهرنا أن تنشيط بلمرة الأكتين المعتمدة على الدينامينات يعكس إصابة الخلايا البيضية عن طريق استعادة بنيتها ووظيفتها الفريدة.

وهنا نبين ذلك فيالخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية، يربط الدينامين الأكتين الخيطي (F-actin) في شبكات متفرعة. يتم تحديد قدرة الربط المتبادل لـ Dynamin من خلال حالة احتكار القلة وطول F-actin. التنشيط الدوائي لأوليجوميريزات الدينامينات يتصدى لـ AKI عن طريق تثبيت شبكات الأكتين وبالتالي سلامة الخلية، مما يحمي الخلايا الظهارية الكلوية جزئيًا من الإصابة الناجمة عن الإجهاد التأكسدي. تحدد دراستنا قشرة الأكتوميوسين للغشاء القمي للخلية الأنبوبية الكلوية كهدف قابل للتخدير في القصور الكلوي الحاد عبر الدينامين كبديل

النتائج تحدد قلة تواجد الدينامينات صلابة وتشكل الغشاء القمي.

لدراسة دور تفاعلات الدينامينات-الأكتين في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية المستقطبة، استخدمنا Bis-T-23، وهو منشط تفارغي لاقتلة الدينامينات المعتمدة على الأكتين في نظام معاد تكوينه، في الخلايا 11،13، وفي الكائن الحي كله12. تم تقييم الأنماط الخلوية في خلايا Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) من خلال متابعة حالة F-actin ونمط تلطيخ بروتين الوصلة الضيقة zonula occludens -1 (ZO -1)، وهو يعتبر علامة حيوية لقطبية الخلية. Cytochalasin D (CytoD) و latrunculin A (LatA) ، مثبطات معروفة لبلمرة الأكتين ، وانخفاض مستويات F-actin ، وتلطيخ ZO -1 المتقطع (الشكل التكميلي 1 أ). في المقابل، تسبب Bis-T-23 في زيادة طفيفة في مستويات F-actin دون أي تأثير على تلطيخ ZO-1. إضافة Bis-T-23 قبل LatA وليس بعده، ومستويات F-actin المحفوظة جزئيًا واستقطاب الخلية. لم تظهر أي من مركبات DMSO ولا دينول 14 المانع للدينامينات أي تأثير (الشكل التكميلي 1 أ).

سمح لنا المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) بتصور التغيرات التي يسببها الدواء في مورفولوجيا الخلية مع التركيز على الغشاء القمي (الشكل 1 أ). كان متوسط ​​ارتفاع خلية MDCK 11 ± 2 ميكرومتر، وكان متوسط ​​طول الزغيبات 0.63 ± 0.2 ميكرومتر (الجدول 1)، وهو ضمن النطاق الذي لوحظ في الكلى. أدى LatA إلى انخفاض ارتفاع الخلية وطول الميكروفيلي وتحويل الميكروفيلي الموزعة بشكل موحد إلى مجموعات، في حين تسبب Bis-T -23 في حدوث تأثيرات معاكسة (الجدول 1، الشكل 1 أ). عند إضافته قبل LatA، يحافظ Bis-T-23 جزئيًا على ارتفاع الخلية وطول الزغيبات الدقيقة. نظرًا لأن الميكروفيلي تظهر تحكمًا رائعًا في الطول يحدده الأكتين القشري في قاعدتها، فإن هذه البيانات توفر دليلًا على أن Bis-T-23 قام بتعديل قشرة الأكتوميوسين في الغشاء القمي.

لتحديد التأثير الدقيق الذي أحدثه Bis-T-23 على الأكتين القشري، قمنا بتصور قشرة الأكتوميوسين داخل الصفيحة باستخدام المجهر الإلكتروني المتماثل البلاتيني (PR-EM). خفض LatA كثافة شبكات الأكتين، وتم إلغاء هذا التأثير جزئيًا بإضافة Bis-T-23 قبل LatA (الشكل 1 ب). نظرًا لأن LatA يعمل على تسريع عملية إزالة بلمرة خيوط الأكتين عن طريق عزل مونومرات الأكتين، فقد قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كان الحفاظ الملحوظ على قشرة الأكتوميوسين بواسطة Bis-T-23 يرجع إلى تأثيره الإيجابي على بلمرة الأكتين. على النقيض من التحفيز القوي لبلمرة الأكتين الذي لوحظ في مستخلصات خلايا البودوسيت ، فإن Bis-T -23 زاد بشكل هامشي فقط بلمرة الأكتين في مستخلص خلايا MDCK (الشكل التكميلي 1 ب). وبالمثل ، فإن الاستنزاف المناعي للدينامينات الداخلية -2 (Dyn2) من المستخلص أو تثبيط نشاط GTPase بواسطة الداينود أدى إلى ضعف هامشي في بلمرة الأكتين (الشكل التكميلي 1 ج). في حين أن LatA وCytoD أضعفا بشكل كبير بلمرة الأكتين، فإن إضافة Bis-T -23 قبل LatA أو CytoD لم تكن قادرة على التغلب على آثارها المثبطة (الشكل التكميلي 1 د، هـ). Jasplakinolide ، وهو دواء يحفز بلمرة الأكتين عن طريق تحفيز نواة خيوط الأكتين ، لم يزيد بشكل كبير المستوى الإجمالي للبلمرة (الشكل التكميلي 1 د) ، مما يشير إلى أن محللة خلية MDCK تظهر مستوى شبه أقصى من الأكتين المبلمر. أشارت هذه البيانات معًا إلى أن تأثيرات Bis-T-23 على مورفولوجيا الغشاء القمي في خلايا MDCK كانت مدفوعة بآلية أخرى غير بلمرة الأكتين.

نظرًا للمعرفة العامة بالتوطين المخصب لـ Dyn2 وF-actin عند حدود الفرشاة للخلايا الظهارية الكلوية، ودور الدينامينات في الالتقام الخلوي، قمنا بعد ذلك بالتحقق مما إذا كان Bis-T-23 يؤثر على الأكتين بشكل غير مباشر عبر التغييرات في الالتقام الخلوي. كما هو متوقع ، تم توطين كل من Dyn2 و F-actin في قشرة الأكتوميوسين أسفل الغشاء القمي ، داخل الميكروفيلي ، وفي الحفر المغلفة بالكلاثرين (CCPs) ، والتي تم تحديدها من خلال شكلها وحجمها المميزين (الشكل التكميلي 1f). قمنا بدراسة ديناميات نقاط التحكم الحرجة باستخدام المجهري مجموع الانعكاس الداخلي (TIRF) . لم يكن لـ Bis-T-23، حتى عند أعلى تركيز له، أي تأثير على توزيع عمر نقاط التحكم الحرجة، في حين قلل الدينول من عدد نقاط التحكم الحرجة المنتجة (الشكل التكميلي 1 ز). يؤكد هذا النقص في الارتباط بين مستوى الالتقام الخلوي والتغيرات في مورفولوجيا الخلية أن Bis-T- 23 يستهدف الأكتين القشري دون التأثير على دور الدينامينات في الالتقام الخلوي.

نظرًا لأنه يتم الحفاظ على قطبية الخلايا الكلوية من خلال البنية والانكماش المستدام لشبكات الأكتوميوسين، والتي تحدد صلابة الخلية في الغشاء القمي، قمنا بعد ذلك بقياس صلابة الخلية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). تم استخدام نظام Nanowizard IV وبرنامج تحليل JPK لتحديد التغييرات في Young's Modulus21 في ظل إعدادات تجريبية مختلفة (الشكل التكميلي 2 أ). أدى العلاج باستخدام LatA إلى انخفاض كبير في صلابة ملامسة الخلايا وتصلب الخلايا القمية في خلايا MDCK (الشكل 1 ج – هـ). في المقابل، أدى Bis-T-23 إلى زيادة صلابة الخلية بشكل ملحوظ مقارنةً بمركبة DMSO (الشكل 1ج-ه)، بما يتوافق مع تأثيراتها الإيجابية على ارتفاع الخلية وعدد الميكروفيلي وكثافة شبكات الأكتين (الجدول 1 و1). الشكل. 1 ب)22. أدت إضافة Bis-T-23 قبل LatA إلى تقليل التأثير السلبي لـ LatA على صلابة الخلية (الشكل 1ج-ه)، وفقًا للتأثير الإيجابي لـ Bis-T-23 على شبكات الأكتين ومورفولوجيا الخلية القمية (الجدول 1، الشكل 1 ب).

الشكل 1. تحدد قلة الداينامين تصلب الخلية من خلال التأثير على بنية الأكتين في الخلايا الظهارية الكلوية. صور تمثيلية SEM لخلايا MDCK المعالجة بـ DMSO (0.1%) أو Bis-T-23 (30 μM، 0.1% DMSO) لمدة 1 0 دقيقة قبل إضافة DMSO (0.1%) أو LatA (0.2 ميكرومتر، 0.1% DMSO) لمدة 2{{23} } دقيقة. تُظهر الصور المكبرة للمدخلات (المناطق ذات الصندوق البرتقالي) ترتيب وتوزيع وكثافة الميكروفيلي في الغشاء القمي. ب صور تمثيلية PR-EM لخلايا MDCK المعالجة كما هو موضح في (أ). تُظهر الصور تغييرات في تنظيم قشرة الأكتوميوسين في خلايا MDCK في ظل الظروف المشار إليها. ج صور تمثيلية لخرائط Young's Modulus لخلايا MDCK التي تمت معالجتها كما هو موضح في (أ). d، e الرسوم البيانية الشريطية التي تمثل معامل يونغ والتي تصور تصلب الخلية المقاسة عند تقاطع الخلية الخلوية (د) أو عند الغشاء القمي (هـ). يمثل كل رمز متوسط ​​صلابة خلية واحدة. تم إنشاء النتائج الموضحة في d و e من خلية واحدة على الأقل 0 من ثلاثة أطباق ثقافة على الأقل. أشرطة الخطأ، تعني ± SD (*P أقل من أو يساوي 0.05، **P أقل من أو يساوي 0.01، ***P أقل من أو يساوي 0.001، ****P أقل من أو يساوي 0.0001، غير مقترن اختبار t ثنائي الذيل). ns، ليست كبيرة.

لقد حددنا أيضًا صلابة الخلية باستخدام نظام BioScope II كنهج تجريبي بديل لـ AFM. في هذه الحالة، تم الحصول على منحنيات المسافة البادئة للقوة وفقًا لنموذج Discher وزملاء العمل المحسوب باستخدام برنامج Matlab. تم تسجيل اتجاهات مماثلة فيما يتعلق بصلابة الخلية للتفاعل بين LatA و Bis-T -23 (الشكل التكميلي 2 ب ، 2 ج). بالإضافة إلى ذلك ، لم يظهر الداينود أي تأثير على تصلب الخلية ، في حين أن CytoD قلل بشكل كبير من تصلب الخلية (الشكل التكميلي 2 د ، هـ) ، وفقًا لأنماط الأكتين الظاهرية (الشكل التكميلي 1 أ). تحدد هذه البيانات معًا العلاقة بين حالة قشرة الأكتوميوسين وتيبس الخلية وتشكل الغشاء القمي واستقطاب الخلية. توضح هذه النتائج أيضًا بشكل مقنع دور قلة الدينامينات في تحديد المعلمات الميكانيكية لقطبية الخلايا الظهارية من خلال تأثيرها على قشرة الأكتوميوسين.

يربط الدينامين خيوط الأكتين في شبكات متفرعة تشكل أساس قطبية الخلية. من أجل توضيح الآلية الجزيئية التي من خلالها تؤثر قلة تواجد الدينامينات على بنية قشرة الأكتوميوسين، قمنا بعد ذلك بدراسة تأثير الدينامينات على خيوط الأكتين في نظام مُعاد تشكيله. واستنادًا إلى الفرضية الحالية، يحدد طول خيوط الأكتين طريقة الارتباط المتبادل. نظرًا لأن متوسط ​​​​طول خيوط الأكتين القشرية داخل الشبكة عند الحافة الأمامية يتراوح بين 100 و 150 نانومتر ، فقد قمنا بفحص تأثيرات الدينامينات على تنظيم الخيوط الأقصر الناتجة عن تغطية F-actin بالجيلسولين (Gsn-actin) (الشكل 1 أ). 2 أ). أدت إضافة Dyn2 إلى تكوين شبكات كبيرة متفرعة (الشكل 2 ب، ج). استنادًا إلى أحجام وأشكال Dyn2 المؤتلف (الشكل 2 د)، تم تشكيل الشبكات في الغالب بواسطة ثنائيات Dyn2 (Dyn2DIMER) ورباعيات (Dyn2TETRA) التي تفاعلت مع العديد من خيوط الأكتين (الشكل 2 هـ): Dyn2DIMER مرتبط بخيطين، يرتبط Dyn2TETRA بما يصل إلى أربعة خيوط، بينما يرتبط Dyn2RING بما يصل إلى ستة خيوط. كشف التكبير المنخفض للصور أن الشبكات المعتمدة على الدينامينات تشكل نمطًا من الأشكال الشبيهة بالحلقات الأصغر والأكبر (الشكل 2 ج).

لربط الملاحظات من النظام المُعاد تشكيله بدور الدينامينات في الخلايا، حددنا بعد ذلك توطين Dyn2 الداخلي على شبكات الأكتين القشرية باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ Dyn2 متبوعًا بجسم مضاد ثانوي مترافق مع الذهب (الشكل التكميلي 3 أ-ج). كما رأينا في النظام المُعاد تشكيله، يرتبط الدينامين بعدد مميز من F-actin داخل الشبكات المتفرعة (الشكل 2f). تحدد هذه البيانات معًا نشاطًا جديدًا للدينامينات، وهو ربط F-actin بالشبكات المتفرعة.

لربط قدرة الدينامينات على الارتباط المتقاطع والتأثير الوقائي لـ Bis-T-23 على قشرة الأكتوميوسين وتشكل الغشاء القمي، قمنا بعد ذلك بفحص تأثيرات Bis-T-23 على بوساطة الدينامينات الشبكات في الأنظمة المعاد تشكيلها (الشكل 3 أ). استنادًا إلى المخططات الكنتورية، التي توفر تمثيلات طبوغرافية لكثافات خيوط متفاوتة، زاد Bis T -23 من كثافة الشبكة الإجمالية (الشكل 3 أ)، وهو ما يمكن تفسيره من خلال الزيادة في عدد F-actin المرتبط بالدينامين بسبب الزيادة في oligomerization لها. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدينامينات هي خيوط أقصر مترابطة بشكل أقوى من F-actin الطويلة (الشكل 3 أ-ج)، مما يشير إلى أن قدرة الدينامينات على تكوين شبكات متفرعة يتم تحديدها من خلال حالة احتكار القلة وطول خيوط الأكتين. تمت مشاركة القدرة على ربط خيوط الأكتين في الشبكات من خلال اثنين من الأشكال الإسوية للدينامينات، والتي تم التعبير عنها في كل مكان عن Dyn2 وdynamin الخاصة بالخلايا العصبية -1 (Dyn1) (الشكل 3 ب، ج).

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

محل:

https٪3a٪2f٪2fwww.xjcistanche.com٪2fcistanche-shop