تكشف النسخ المنفردة للخلية الواحدة عن تفاعلات الخلايا الخلوية المرشحة للكلية بعد إصابة الخلايا بودوسيت المبكرة والانتقائية
Jul 01, 2024
أمراض الكلى المزمنة (CKDs)يؤثر على 700 مليون شخص على مستوى العالم، حتى الآنمحددفايج العلاجاتتفتقر.1 كثيرتنشأ أمراض الكلى أينالكبيبة، الفايوحدة الترشيح في الكلى. تتكون الكبيبة من (1) الخلايا الرجلية، وهي خلايا ما بعد الانقسامية المتخصصة مع عمليات قدم متقنة تتداخل مع تشكيل أغشية شقية وتلتف حول الشعيرات الدموية الكبيبية؛ (2) الخلايا البطانية، التي تقع مقابل الخلايا الرجلية على الغشاء القاعدي الكبيبي المشترك (GBM)؛ (3) خلايا مسراق الكبيبة، التي تشكل مصفوفة توفر الدعم الهيكلي للكبيبة؛ و(رابعا) الخلايا الظهارية الجدارية (PECs)، التي تبطن كبسولة بومان.2 تؤدي إصابة الخلايا بودوسيت، على وجه الخصوص، إلى العديد من أمراض الكلى التقدمية المنتشرة بشكل كبير، بما في ذلك مرض الكلى السكري (DKD)، وتصلب الكبيبات البؤري القطاعي (FSGS)، والمتلازمة الكلوية (سواء مجهول السبب أو الوراثي). يؤدي النمط الأساسي للإصابة إلى فقدان عمليات القدم البودوسيت المتداخلة، والمعروفة باسم محو عملية القدم، الناتج عن إعادة ترتيب الهيكل الخلوي للأكتين. يؤدي هذا المحو إلى تعطيل الحجاب الحاجز، وهو الحاجز المادي الذي يعمل بمثابة حاجزفايلتر، يليه انفصال البودوسيت أو الموت.3,4 من ناحية أخرى، بالإضافة إلى الخلايا الرجلية السليمة، فإن تكوين وصيانةالكبيبيفايحاجز الترشيحيتطلبالتواصل داخل الكبيبات، يتم التحكم فيه بإحكام بواسطة سلسلة من آليات الإشارة الاستبدادية ونظيرة الصماوية. على سبيل المثال، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGFA) هو إشارة بقاء للخلايا البطانية التي تفرزها الخلايا الرجلية، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية B (PDGFB) هو إشارة بقاء للخلايا مسراق الكبيبة التي تفرزها الخلايا البطانية.5 وكثيرا ما لوحظ اضطراب هذه التفاعلات بين الخلايا في مجموعة من الأمراض الكبيبية، بما في ذلك FSGS وDKD.6 ولذلك، فإن تحديد التغييرات التخريبية المبكرة للكبيبة قد يوفر أهدافًا جديدة وفرصة لتحسين النجاح العلاجي للمرض.علاج أمراض الكلى.
بدعم من المعهد الوطني للصحة لمرض السكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى يمنح DK103658، DK099465، وDK095045 (AG).الاتصال داخل الكبيبات، يتم التحكم فيه بإحكام بواسطة سلسلة من آليات الإشارات الاستبدادية ونظير الصماوي. على سبيل المثال، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية A (VEGFA) هو إشارة بقاء للخلايا البطانية التي تفرزها الخلايا الرجلية، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية B (PDGFB) هو إشارة بقاء للخلايا مسراق الكبيبة التي تفرزها الخلايا البطانية. يتم ملاحظة التفاعلات الخلوية في كثير من الأحيان في مجموعة من الأمراض الكبيبية، بما في ذلك FSGS وDKD.6 لذلك، فإن تحديد التغييرات التخريبية المبكرة للكبيبة قد يوفر أهدافًا جديدة وفرصة لتحسين النجاح العلاجي لعلاج أمراض الكلى
أحدث تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) أحادي الخلية (scRNAseq) ثورة في القدرة على دراسة أنواع الخلايا الفردية من الأنسجة المعقدة وحالات الخلايا بعد اضطرابات محددة.7،8 قدمت دراسات scRNAseq الحديثة في الكلى نظرة ثاقبة للملامح النسخية لأنواع خلايا الكلى في الفئران السليمة و العينات البشرية وكذلك في بعض الحالات المرضية، بما في ذلك DKD والتهاب الكلية الذئبي.9e12 ومع ذلك، كانت الدراسات التفصيلية لحالات الخلايا الكبيبية محدودة بسبب العدد الصغير من الخلايا المتاحة للتحليل. علاوة على ذلك، لم تتم مراقبة التغيرات المبكرة الخاصة بنوع الخلية والتي تحدث في جميع الخلايا الكبيبية عند إصابة خلية بودوسيت ولم يتم تحديدها بعد.
يؤدي استئصال البودوسيت عن طريق الحذف المحفز الخاص بالبودوسيت لبروتين داخلي أساسي، CTCF، إلى مرض الكلى البروتيني التدريجي وCKD.13 تاريخيًا، تم إنشاء نماذج الفئران CKD عن طريق إحداث إصابة في الكلى عن طريق السموم الخارجية أو التدخلات الجراحية، والأنظمة دون المستوى الأمثل التي لا ترقى إلى مستوى تلخيص التغييرات الميكانيكية المتسلسلة. يؤدي حذف CTCF، وهو جزيء داخلي أساسي، إلى فقدان سريع لخلايا البودوسيت، وبيلة زلالية تدريجية شديدة، وتغيرات في استقلاب المعادن في العظام، وفشل كلوي، والوفاة المبكرة. 13 يوفر نموذج حذف CTCF الخاص بالبودوسيت (iCTCFpod / ) فرصة فريدة للدراسة التغيرات في تفاعلات الخلايا الخلوية داخل الكبيبات نتيجة لإصابة الخلايا البودوسيت المستحثة. لا يمكن اكتشاف تعبير Podosis CTCF في أقرب نقطة زمنية، في أسبوع واحد من تحريض Cre بوساطة الدوكسيسيكلين في iCTCFpod / الفئران. 13 يبدأ فقدان كريات القدم الكبيرة والتقدمية، كما تم قياسه بالتحليل النسيجي، بعد أسبوعين من تحريض Cre. في الدراسة الحالية، تم إجراء تحليل مفصل في 1-نقطة زمنية أسبوعية لتحديد التغييرات المبكرة في تفاعلات الخلايا داخل الكبيبات الناتجة عن إصابة الخلايا الرجلية التي تؤدي في النهاية إلى مرض الكلى المزمن.
المواد والأساليب
رعاية الحيوان
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى بريجهام والنساء، كلية الطب بجامعة هارفارد. تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها ووافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى بريجهام والنساء بكلية الطب بجامعة هارفارد. تم إنشاء فئران iCrepod-Ctcfwt/fl كما هو موصوف سابقًا وتم تربيتها لإنشاء فئران iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) وiCrepod-Ctcfwt/wt [من النوع البري (WT)]. تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث في هذه الدراسة. تم إعطاء الدوكسيسيكلين (4 جم / لتر) (Sigma D9891) بشكل مستمر في مياه الشرب التي تحتوي على السكروز (50 جم / لتر) (VWR BDH0308) لكل من iCTCFfl / fL (يولد iCTCFpod / الفئران) وفئران التحكم في فضلات WT (6 إلى 8). أسابيع من العمر عند بداية استخدام الدوكسيسيكلين) لدفع تعبير Cre على وجه التحديد في الخلايا الرجلية.
الإثراء الكبيبي من الكلى الكاملة
تمت التضحية بفئران iCTCFpod / وWT بعد أسبوع واحد من علاج الدوكسيسيكلين، وتم تشريح الكلى بسرعة وغسلها بمحلول ملح هانكس المتوازن المثلج (رقم الكتالوج 14170112، Thermo Scientific، Waltham، MA). بعد إزالة كبسولات الكلى، تم إثراء الكبيبات عند درجة حرارة 4 مئوية باستخدام تقنية الغربلة باستخدام مناخل 180- مم، و75- مم، و53- مم. تم شطف الأجزاء المخصبة بالكبيبات التي تم جمعها من غربال 53- ملم بمحلول الملح المتوازن من هانكس المثلج ووضعها على الجليد.
إعداد تعليق خلية واحدة
إعداد المكتبة وتسلسل الخلية الواحدة
تمت معالجة الخلايا المفردة من خلال 10 Chromium 30Single Cell Platform باستخدام Chromium Single Cell 30Library وGel Bead وChip Kits (10 Genomics، Pleas anton، CA)، وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، 10، تمت إضافة 000 خلايا إلى كل قناة من الرقاقة ليتم تقسيمها إلى خرز جل في مستحلب في أداة Chromium، يليها تحلل الخلايا والنسخ العكسي المشفر للحمض النووي الريبي (RNA) في القطرات. وأعقب كسر المستحلب التضخيم والتجزئة وإضافة المحول وفهرس العينة. تم تجميع المكتبات معًا وتسلسلها على Illumina HiSeq.
تفاعل التهجين المتسلسل
تم شراء جميع كواشف تفاعل سلسلة التهجين (HCR) v3 (المجسات ودبابيس الشعر والمخازن المؤقتة) من Molecular Technologies (Pasadena، CA). تم تركيب مقاطع رقيقة من الأنسجة (10 م) في 24- ألواح سفلية زجاجية جيدة (رقم الكتالوج 82050-898، VWR، Radnor، PA) مغلفة بنسبة 1:5{{38} } تخفيف (3- أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان (رقم الكتالوج 440140، سيجما ألدريتش). تمت إضافة المحاليل التالية إلى الأنسجة: 10% فورمالين (رقم الكتالوج 100503- 120، VWR) لمدة 15 دقيقة، غسلتين من 1 PBS (رقم الكتالوج AM9625، Thermo Fisher Scientific)، بارد مثلج 70٪ EtOH عند 20 C لمدة ساعتين (إلى الليل)، ثلاث عمليات غسل من 5 سترات الصوديوم المالحة مع 0.2% توين -20 (SSCT) (رقم الكتالوج 15557044، Thermo Fisher Scientific)، مخزن مؤقت للتهجين (التقنيات الجزيئية) لمدة 10 دقائق، تحقيقات في المخزن المؤقت للتهجين طوال الليل، وأربع عمليات غسل من المخزن المؤقت للغسيل (التقنيات الجزيئية) لمدة 15 دقيقة، وثلاث عمليات غسل من 5 SSCT، ومخزن مؤقت للتضخيم (التقنيات الجزيئية) لمدة 10 دقائق، وثلاث عمليات غسل لمدة 15 دقيقة مع 5 SSCT (1:10، {{31 }} DAPI، رقم الكتالوج TCA2412-5MG, VWR) في الغسيل الثاني. تم تغيير طبيعة دبابيس الشعر بالحرارة في محلول التضخيم طوال الليل. تم تخزين العينات وتصويرها في 5 SSCT. تم إجراء التصوير على قرص دوار متحد البؤر (Yokogawa W1 على Nikon Eclipse Ti) يقوم بتشغيل برنامج NIS-elements AR. تم إجراء تحليل الصور ومعالجتها على إصدار برنامج ImageJ Fiji 2.1.0/1.53c (NIH، Bethesda، MD؛ http://imagej.nih.gov/ij).
معالجة البيانات ومراقبة الجودة
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >تمت إزالة 75% من الخلايا المصنفة على أنها خلايا مزدوجة عالية الثقة من التحليل الإضافي. تمت أيضًا إزالة الخلايا المتبقية المصنفة على أنها مزدوجة عالية الثقة من التحليل الإضافي. تضمن التحليل تقليص عدد الخلايا لمراعاة هذا الاختلاف. على سبيل المثال، إذا كان هناك عدد أقل من خلايا WT في نوع خلية معين، تم استخدام عينة عشوائية من خلايا iCTCF تساوي عدد خلايا WT لتحليل التعبير التفاضلي.
التجميع غير الخاضع للرقابة وتقليل الأبعاد
تم استخدام الإعدادات الافتراضية في Seurat R package16 الإصدار 3.0 للتطبيع (NormalizeData) لأعداد التعبير الجيني، وتحديد الجينات المتغيرة (FindVariableGenes)، وإيجاد نقاط ربط التكامل (FindIntegrationAnchors)، ودمج العينات (IntegrateData) . حدث تباين غير مرغوب فيه بسبب عدد UMIs ونسبة قراءات التعيين لجينات الميتوكوندريا (ScaleData). تم إجراء تقليل الأبعاد باستخدام تحليلات المكونات الرئيسية (RunPCA) على الجينات المتغيرة للغاية. تم استخدام الدالة PCELbowPlot() للتمييز بين المكونات الرئيسية لمزيد من التحليل. لتجميع كل الخلايا، أول 40 من المكونات الرئيسية استحوذت بشكل كافٍ على كل التباين. تم تحديد مجموعات متميزة جزيئيًا باستخدام المعلمات الافتراضية (FindClusters) ودقة 0.4 (FindNeighbors). تمت معالجة البيانات وتحجيمها كما هو موضح أعلاه بعد تعيين الخلايا الكبيبية. تم استخدام ما مجموعه 30 مكونًا رئيسيًا للتجميع النهائي بدقة 0.3 (FindNeighbors).
تصنيف نوع الخلية
تم حساب الجينات المخصبة العنقودية أو الواسمة باستخدام اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون (FindAllMarkers) للتعبير التفاضلي للجينات في الخلايا العنقودية مقابل جميع الخلايا الأخرى واختيار تلك الجينات التي تتجاوز قيمة P المعدلة (معدل الاكتشاف الخاطئ) لقطع {{1 }}.05 كممثل للمجموعة. تم تعيين هوية الكتلة من خلال مقارنة الجينات المعتمدة على البيانات مع قائمة الجينات المنسقة بالأدب لأنواع خلايا الكلى الناضجة.
تحليل التعبير الجيني التفاضلي
تم استخدام تحليل التعبير التفاضلي الزوجي في Seurat (FindMarkers) مع تعيين عتبة تغيير أضعاف السجل على {{0}}.01 والمعلمات الافتراضية لتحليل التعبير التفاضلي بين خلايا iCTCFpod / وWT في مجموعة محددة. ضمن FindMarkers، تم تعيين المعرف 1 على خلايا iCTCFpod / الخلايا المحددة للمجموعة، وتم تعيين المعرف 2 على خلايا WT المقابلة الخاصة بالمجموعة. واعتبرت الجينات ذات P <0.05 المعدلة ذات أهمية.
تحليل التمثيل الزائد
تم استخدام تحليل التمثيل الزائد لتحديد ما إذا كانت أي وظائف أو عمليات بيولوجية معروفة تم تمثيلها بشكل زائد أو إثرائها في قائمة (قوائم) الجينات المعبر عنها تفاضليًا.17 تم استخدام مجموعة R packageclusProfiler،18 على وجه التحديد وظيفة richGO، لتحليل التمثيل الزائد. تم استخدام المعلمات الافتراضية، مع استثناءات ont Z BP، وpvaluecutoff Z 0.25، وqvaluecutoff Z 0.25. تم بعد ذلك استخدام حزمة R richplot (GitHub، https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot، تم الوصول إليها آخر مرة في 30 أغسطس 2021)، وتحديدًا وظيفة emapplot، لتصور نتائج الإثراء من خلال رسم مصطلحات الإثراء العليا.
تحليل مستقبلات يجند
تم استخدام iTALK19 لتعيين المستقبلات للروابط التي تم التعبير عنها بشكل تفاضلي في iCTCFpod / podosis. على وجه التحديد، تم استخدام RawParse لحساب التعبير المتوسط لكل جين، باستخدام بيانات متدرجة من Seurat. تم استخدام FindLR باستخدام متوسط عدد البيانات من نوع Z لتحديد أزواج الروابط والمستقبلات. تم رسم أزواج Ligand والمستقبلات ذات الاهتمام باستخدام المعلمات الافتراضية لـ LRPlot. يشير سمك الخطوط إلى التعبير المتوسط النسبي لليجند، ويشير حجم رأس السهم إلى التعبير المتوسط النسبي للمستقبل.
تحليل نيش نت
تم استخدام حزمة R NicheNet20 للتنبؤ بتفاعلات مستقبلات الارتباط التي قد تؤدي إلى تغييرات التعبير الجيني في نوع الخلية محل الاهتمام. تم الجمع بين جميع مجموعات الخلايا البودوسيتية وجميع المجموعات البطانية لهذا التحليل. تم استخدام جميع المعلمات الافتراضية باستثناء تعيين حد قطع أقل يبلغ 0.11 لتصور إعداد_ligand_target_. تمت معالجة صور معالجة الصور وقياسها الكمي HCR باستخدام برنامج ImageJ2 (NIH، Bethesda، MD؛ http://imagej.nih.gov/ij). بالنسبة لملفات ImageJ، تم استخدام الإصدار 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Contributors (تم الوصول إليه آخر مرة في 2 أغسطس 2020). تم طرح ملفات Raw ND2 من الخلفية باستخدام طريقة Rolling Ball (المكدس المنزلق Z 50) تم بعد ذلك عرض متوسط شدة صور Z-stack، وتم تقسيم قنوات الصور وحفظها بشكل منفصل. تم استخدام الإصدار 3.1.5 من CellProfiler (معهد MIT وHarvard، Cambridge، MA) لتجزئة الخلايا بناءً على شدة التألق. تم تقييم أربعة WT وأربعة iCTCFpod / الفئران لقياس كثافة مضان DAPI للتحليل الإحصائي تم إجراء اختبار twotailed جميع الكبيبات من ثلاث 40 صورة.
الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:
البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com
واتساب/هاتف:+86 15292862950
تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:
https://www.xjcistanche.com٪2FCISTANCHE-shop
انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% أكتيوسايد لوظيفة الكلى.
