موقع الضعف في SARS-CoV-2 Spike يحفز الأجسام المضادة الواقية على نطاق واسع ضد المتغيرات الفرعية Omicron المتميزة من الناحية الجينية

التطور السريع لفيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب لمتلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة أكد متغيرات أوميكرون على الحاجة إلى تحديد الأجسام المضادة ذات قدرات تحييد واسعة النطاق لتوجيه العلاجات أحادية النسيلة واستراتيجيات التطعيم المستقبلية. هنا، حددنا S728-1157، وهو جسم مضاد معادل على نطاق واسع (bnAb) يستهدف موقع ربط المستقبل (RBS) المشتق من شخص مصاب سابقًا بفيروس WT SARS-CoV-2 قبل انتشار فيروس كورونا. المتغيرات المثيرة للقلق (VOCs). أظهر S728-1157 تحييدًا متقاطعًا واسع النطاق لجميع المتغيرات السائدة، بما في ذلك D614G وBeta وDelta وKappa وMu وOmicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). علاوة على ذلك، قام S728-1157 بحماية الهامستر من التحديات داخل الجسم الحي باستخدام فيروسات WT وDelta وBA.1. أظهر التحليل الهيكلي أن هذا الجسم المضاد يستهدف حلقة من الفئة 1/RBS-A في مجال ربط المستقبل عبر تفاعلات قطبية وكارهة للماء مع منطقة تحديد تكامل السلسلة الثقيلة 3 (CDR-H3)، بالإضافة إلى العناصر الشائعة في CDR-H1/ CDR-H2 من الأجسام المضادة من الفئة 1/RBS-A. الأهم من ذلك، أنه كان من السهل الوصول إلى هذه الحاتمة في الحالة المفتوحة وحالة ما قبل الانصهار، أو في بنيات السنبلة المستقرة بالهيكسابرولين (6P)، مقارنةً ببنيات الديبرولين (2P). بشكل عام، يُظهر S728-1157 إمكانات علاجية واسعة وقد يفيد تصميمات اللقاحات الموجهة نحو الأهداف ضد متغيرات SARS-CoV-2 المستقبلية.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

مقدمة

منذ بداية الجائحة في ديسمبر 2019، أدى فيروس المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) إلى أكثر من 660 مليون حالة إصابة بمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) وأكثر من 6.5 مليون حالة وفاة على مستوى العالم. على الرغم من أن التطوير والتوزيع السريع للقاحات والعلاجات قد أدى إلى الحد من تأثير فيروس كورونا -19 إلى حد كبير، إلا أن ظهور المتغيرات المنتشرة المثيرة للقلق (VOCs) لا يزال يمثل تهديدًا كبيرًا بسبب احتمال حدوث المزيد من التهرب المناعي وتعزيز القدرة المرضية. كان متغير D614G هو البديل الأقدم الذي ظهر وأصبح منتشرًا عالميًا بعد ذلك. بالمقارنة مع WT، أظهر متغير D614G زيادة في قابلية الانتقال بدلاً من زيادة الإمراضية، وبالتالي من غير المرجح أن يقلل من فعالية اللقاحات في التجارب السريرية (1). بين ظهور D614G حتى أكتوبر 2021، تطورت 4 مركبات عضوية متطايرة إضافية مهمة في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك Alpha وBeta وGamma وDelta. ومن بين هذه المتغيرات، أصبحت دلتا تهديدًا عالميًا خطيرًا بسبب قابليتها للانتقال، وزيادة شدة المرض، والتهرب المناعي الجزئي، كما يتضح من انخفاض قدرة المصل متعدد النسيلة وmAbs على تحييد هذه السلالة (2-6). بعد ذلك بوقت قصير، في نوفمبر من عام 2021، تم تحديد متغير Omicron والإعلان عنه باعتباره مركبات عضوية متطايرة جديدة. يمتلك هذا البديل أكبر عدد من الطفرات حتى الآن ويبدو أنه ينتشر بسرعة أكبر من السلالات السابقة (7، 8). حاليًا، هناك مجموعة واسعة من سلالات Omicron الفرعية التي تؤدي إلى حالات فيروس كورونا-19 جديدة، حيث أصبحت BQ.1 وBQ.1.1 وXBB.1.5 مهيمنة على BA.5 وتمثل معظم الحالات الجديدة في جميع أنحاء العالم في ذلك الوقت. الكتابة. يمكن أن تفلت متغيرات Omicron من التعرف عليها من خلال المناعة المرتبطة بلقاح فيروس كورونا المستجد (COVID-19 بدرجات متفاوتة، مما يقلل بشكل كبير من فعالية تحييد الأجسام المضادة في الدم لدى الأفراد والأفراد المتعافين والمطعمين بالكامل بـ mRNA والمعززين بـ WT/BA.5 ثنائي التكافؤ الجديد. لقاح مرنا (9، 10). وبالمثل، تمكنت متغيرات Omicron من الهروب من ربط العديد من mAbs العلاجية لترخيص الاستخدام في حالات الطوارئ (EUA)، على الرغم من أنها أثبتت سابقًا فعاليتها ضد المركبات العضوية المتطايرة السابقة (10-12). نظرًا لانخفاض التحييد ضد Omicron والتهديد المستمر للمركبات العضوية المتطايرة المستقبلية، هناك حاجة ملحة لتحديد أجسام مضادة واسعة وقوية يمكن أن تحمي من سلالات SARS-CoV{38}} المتنوعة والمتطورة. في هذه الدراسة، حددنا مجال ربط مستقبلات قوي - تفاعلي (RBD-reactive) mAb من الدم المحيطي لفرد SARS-CoV-2 - في مرحلة النقاهة والذي قام بتحييد ألفا وبيتا وكابا ودلتا ومو بشكل فعال. ومتغيرات Omicron (BA.1 وBA.2 وBA.2.75 وBA.4 وBA.5 وBL.1 وXBB). هذا mAb، S728-1157، قلل بشكل كبير من الأحمال الفيروسية BA.1 Omicron وDelta وWT في الرئتين والغشاء المخاطي للأنف بعد التحدي في الجسم الحي في الهامستر. يربط S728-1157 موقع ربط المستقبل (RBS) الذي يتم كشفه بالكامل عندما يكون RBD الموجود على السنبلة في التشكل الأعلى. يستخدم mAb العناصر الزخرفية الموجودة في CDR-H1 وCDR-H2 الشائعة في الأجسام المضادة IGHV3-53/3-66 من الفئة 1/RBS-A (13، 14)، ولكن أيضًا من خلال اتصالات فريدة واسعة النطاق مع CDR -H3 للتحايل على الطفرات في طفرات المركبات العضوية المتطايرة. يشير هذا إلى أن التصميم العقلاني لتعزيزات اللقاح المستقبلية التي تغطي متغيرات Omicron يجب تعديله لتقديم ارتفاع ثابت في التكوين الأعلى في الغالب للحث الأمثل على الفئة 1 / RBS-A mAbs التي لها ميزات CDR-H3 مماثلة.

فوائد سيستانش-تقوية جهاز المناعة

نتائج

عزل mAbs المتفاعل مع RBD والذي يظهر أنماطًا متنوعة من التحييد والفعالية. قبل انتشار سلالات Omicron، قمنا سابقًا بوصف 43 مللي أمبير تستهدف الحواتم المميزة على بروتين السنبلة، بما في ذلك مجال N-terminal (NTD)، وRBD، والوحدة الفرعية 2 (S2). لم يكن أي من هذه الأجسام المضادة قادرًا على تحييد متغيرات SARS-CoV-2 المنتشرة في ذلك الوقت (15). في هذه الدراسة، تم التعبير عن لوحة إضافية من mAbs المتفاعلة مع RBD من 3 أفراد ذوي استجابة عالية والذين قاموا بإعداد استجابات IgG قوية مضادة للارتفاع، كما هو محدد سابقًا (16) (الجداول التكميلية 1 و3؛ المواد التكميلية متاحة عبر الإنترنت مع هذه المقالة؛ https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). على الرغم من أن نسبة الخلايا B المرتبطة بـ RBD كانت متشابهة في المستجيبين المرتفعين مقارنةً بالمستجيبين المتوسطين والمنخفضين (الشكل 1 ، A – C) ، كانت معدلات فرط الحركة الجسدية ذات السلسلة الثقيلة أكبر بكثير في المجموعة عالية الاستجابة (الشكل 1). و D و E)، مما يشير إلى أن هؤلاء الأفراد قد يكون لديهم أعلى إمكانية لتوليد mAbs قوي التفاعل (16). تمت دراسة هذه الأجسام المضادة بشكل أكبر ضد طفرات RBD لتحديد تصنيفات الحاتمة الخاصة بها (17). من بين 14 mAbs المتفاعلة مع RBD، حددنا 4 mAbs من الفئة 2، و2 mAbs من الفئة 3، و8 mAbs غير مصنفة والتي أظهرت انخفاضًا طفيفًا أو معدومًا في الارتباط ضد أي طفرات RBD رئيسية تم اختبارها (الشكل 1F). تجدر الإشارة إلى أن الأجسام المضادة من الفئة 2 والفئة 3 والفئة 4 تتوافق تقريبًا مع حلقات RBS BD وS309 وCR3022 المحددة في الدراسات السابقة (13، 18). لم تتعرف الفئة 2 و3 RBD mAbs على طفرة RBD متعددة المتغيرات التي تحتوي على بدائل K417N/E484K/L452R/ N501Y، وهي RBD مصممة بشكل مصطنع لتشمل طفرات رئيسية للهروب من الفيروس (17، 18)، كما أنها لم تثبت أي تفاعل متبادل مع RBD لـ SARS-CoV-1 ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS)-CoV (الشكل 1F). من الناحية الوظيفية، قامت الفئة 2 و3 RBD mAbs بتحييد متغيرات D614G وDelta بشكل فعال، لكن نشاط التحييد كان أكثر محدودية ضد Beta وKappa وMu (الشكل 1G). لم يتم تقييم أي من الأجسام المضادة من الفئة 2 أو 3 لأي متغير Omicron تم اختباره.

في المقابل، فإن غالبية mAbs غير المصنفة مرتبطة بمتغير RBD وتتفاعل بشكل تصالبي مع SARS-CoV-1 RBD (الشكل 1F). من بين هذه، حددنا 3 mAbs وS451-1140 وS626-161 وS728-1157، والتي أظهرت فعالية تحييد عالية ضد D614G وBeta وDelta وKappa وMu و Omicron BA.1 بتركيز مثبط بنسبة 99% (IC99) في حدود 20-2500 نانوغرام/مل (الشكل 1G). نظرًا لفعالية التحييد الواسعة لـ 3 mAbs، بالإضافة إلى منصة فحص البلاك، قمنا أيضًا بإجراء نشاط التحييد ضد BA.2.75 وBL.1 (BA.2.75+R346T) الأصلي وBA.4 وBA. فيروسات BA.5، وXBB باستخدام اختبار تحييد تقليل التركيز (FRNT) (الشكل 1G). من بينها، عرض S728-1157 أنشطة تحييد عالية مقابل لوحة متغيرات Omicron بما في ذلك BA.1 وBA.2 وBA.4 وBA.5، مع IC99 يصل إلى 100 نانوغرام/مل كما تم قياسه بـ فحص البلاك. وقد لوحظ سيناريو مماثل باستخدام FRNT، حيث حافظ S728-1157 على نشاط التحييد العالي ضد BA.2.75 وBL.1 وBA.4 وBA.5 وXBB مع IC50 في نطاق 8–300 نانوغرام. / مل (الشكل 1ز). قام S451-1140 بتحييد BA.1 وBA.2 وBA.2.75 وBL.1 بشكل فعال، ولكن ليس BA.4 وBA.5، كما لوحظ في كلا منصتي مقايسة التحييد. من ناحية أخرى، لم يُظهر S626-161 نشاطًا معادلاً ضد متغيرات Omicron خارج متغير BA.1 (الشكل 1G). على الرغم من أن S626-161 كان لديه قوة تحييد أقل ضد المركبات العضوية المتطايرة التي تم اختبارها مقارنة بالجسمين المضادين الآخرين، إلا أنه كان mAb الوحيد الذي أظهر تفاعلًا تبادليًا ليس فقط مع SARS CoV-1 RBD ولكنه كان قادرًا أيضًا على تحييد الخفافيش. فيروسات كورونا WIV-1 وRsSHC014 (الشكل 1، F وG). تشير هذه البيانات إلى أن S626-161 يتعرف على الحاتمة المحفوظة المشتركة بين سلالات الفيروسة المفصلية هذه ولكنها غائبة في BA.2 والسلالات الأحدث. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع S728-1157 وS451-1140، يحتوي S626-161 على CDR-H3 أطول يمكن أن يوفر قدرة محسنة للتعرف على رقعة محفوظة للغاية من المخلفات المشتركة عبر الفيروسات المفصلية، كما هو موضح في دراسة سابقة (19) (الشكل التكميلي 1). عند مقارنة الجينات المتغيرة للجلوبيولين المناعي الثقيل (IGHV) والسلسلة الخفيفة (IGLV أو IGKV) لهذه الـ 3 mAbs مع قاعدة بيانات mAbs المعادلة لـ SARS-CoV -2 المتاحة (13، 15، 20–27)، وجدنا أن السلسلة الثقيلة الجينات المتغيرة المستخدمة بواسطة S 728-1157 (IGHV 3-66)، S 451-1140 (IGHV 3-23)، و S 626-161 (IGHV 4-39) لها تم الإبلاغ سابقًا عن تشفير العديد من الأجسام المضادة لـ SARS-CoV -2 التي تستهدف RBD (21، 22، 28، 29). ومع ذلك، فقط S728-1157 كان لديه أزواج جينية متغيرة فريدة من نوعها ثقيلة وخفيفة السلسلة والتي لم يتم الإبلاغ عنها في قاعدة البيانات (الجدول الإضافي 3)، مما يشير إلى أنه ليس نمطًا مستنسخًا عامًا.

الشكل 1. توصيف mAbs المتفاعل مع RBD المعزول من فيروس كورونا -19 - الأفراد المتعافين

تم تمييز 3 mAbs (S451-1140 وS626-161 وS728-1157) بشكل أكبر لتحديد اتساع الارتباط ضد SARSCoV-2 المركبات العضوية المتطايرة (الشكل 2 وA وB) . لقد ثبت أن الارتفاع المثبت قبل الانصهار والذي يحتوي على 2-بدائل البرولين في الوحدة الفرعية S2 (2P؛ ديبرولين) هو مناعة متفوقة مقارنة بارتفاع WT وهو أساس العديد من فيروسات SARS-CoV الحالية-2 اللقاحات، بما في ذلك اللقاحات المعتمدة على الحمض النووي الريبوزي المرسال (30، 31). في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن أن بروتين سبايك المستقر بـ 6 برولين (6P؛ هيكسابرولين) يعزز التعبير ويكون أكثر استقرارًا من تركيبة الديبرولين الأصلية؛ ونتيجة لذلك، فقد تم اقتراح استخدامه في الجيل التالي من لقاحات فيروس كورونا-19 (32، 33). لتحديد ما إذا كانت هناك اختلافات في مولد الضد بين بنيات ارتفاع الديبرولين والهيكسابرولين، تم تضمين كلا المستضدات في لوحة الاختبار الخاصة بنا. كما تم قياسه بواسطة ELISA، وجدنا أن 3 مللي أمبير مرتبطة بمستضد ارتفاع 6P-WT إلى حد أكبر مقارنة مع ارتفاع WT-2P (الشكل 2، A وB). أظهرت جميع mAbs الثلاثة ارتباطًا مشابهًا لفيروسات ألفا وبيتا وغاما ودلتا، مقارنةً بـ WT-2P (الشكل 2، A وB). ومع ذلك، تم تقليل التفاعلات الملزمة لهذه الـ 3 mAbs بشكل كبير مقابل لوحة من مستضدات عائلة Omicron (الشكل 2، B، وC). كان ربط S451-1140 حساسًا للطفرات الموجودة في BA.1 وBA.2، مما أدى إلى انخفاض كبير في الارتباط وانخفاض بمقدار 31- أضعاف في التحييد مقابل هذه المتغيرات مقارنةً بـ WT-2 مستضد P وفيروس D614G، على التوالي (الشكل 2B). أظهر أيضًا mAb المعادل لفيروس الساربيك، S626-161، 1.2- إلى 3.5-ارتباط مخفض لمستضد سبايك BA.1، والذي قد يمثل {{45} }أضعاف الانخفاض في نشاط التحييد ضد BA.1 (الشكل 1G والشكل 2، B وC). بالنسبة للجسم المضاد الأكثر فعالية على نطاق واسع (bnAb)، S728-1157، تم تقليل الارتباط بمستضدات Omicron إلى حد أقل (يتراوح من 1.1- إلى 4.4-fold) مقارنة مع ارتفاع WT -2 P ولم يتأثر في تحييد النشاط (الشكل 1G والشكل 2، B وC). قد يكون الانخفاض الكبير في ارتباط mAb المعادل لـ Omicron بارتفاع BA.1 بسبب التغييرات في حركته والمتعلق بالتعبئة الضيقة لهياكل Omicron 3- RBD-down وتفضيل 1- يصل RBD الذي يساعد في تجنب الأجسام المضادة، كما ذكرت دراسة سابقة (34). تتمتع طفرات التثبيت 2P و6P أيضًا بتأثيرات تفاضلية في متغيرات Omicron حيث أظهرت جميع mAbs الثلاثة أكثر من 2.8- أضعاف الارتباط المتزايد لـ Spike BA.1-6P مقارنةً بـ BA.1-2P الإصدار، ولكن تم زيادة الارتباط بشكل طفيف فقط لإصدارات Spike BA.2 وBA.4/5 6P مقارنة بإصداراتها 2P بمقدار 1.2 × إلى 1.4 ×، مما يشير إلى إمكانية وصول أفضل قليلاً لـ mAbs المُعادل لـ Omicron إلى الإصدارات السداسية القطب، خاصة بالنسبة لبناء سبايك BA.1. بالإضافة إلى ELISA، تم استخدام قياس تداخل الطبقة البيولوجية (BLI) لتحديد معدل الارتباط وثوابت التوازن (kon وkoff وKD) لهذه الـ 3 mAbs إلى لوحة من مستضدات الارتفاع (الشكل التكميلي 2). كانت معدلات التعرف على ارتباط مستضد الجزء (Fab) بمسامير السداسيبرولين 1.5- إلى 3.3-أضعاف أسرع عند مقارنتها بطفرات الديبرولين (الشكل التكميلي 2، B وC)، مما يوضح ذلك يتم بناء الأجسام المضادة المرتبطة بـ 6P بسرعة أكبر من بناء 2P. ربما كان هذا متوقعًا إذا كان الوصول إلى الحواتم أكثر سهولة على RBD في الحالة المفتوحة على ارتفاع السداسيبرولين. باستثناء S626- 161، ينفصل Fabs عن ارتفاع السداسيبرولين بشكل أبطأ (كان لديه انخفاض koff) من ارتفاع الديبرولين، بحيث أظهر KD الإجمالي أن S728-1157 وS451-1140 مرتبطان بـ S626- 161 ارتفاع الهيكسابرولين مع تقارب أكبر (الشكل التكميلي 2، B وC). كانت الزيادة في الارتباط بارتفاع الهيكسابرولين أكثر وضوحًا بالنسبة لـ IgG السليم من خلال نموذج التفاعل 1: 2 كما هو موضح بواسطة S 728-1157 وS 451- 1140 mAbs، بما يتوافق مع تعرض الحواتم المتعددة مع تثبيت 6P مما يسمح تحسين الطمع (الشكل التكميلي 2، A وC). مجتمعة، تشير هذه النتائج إلى أن الحلقات المستهدفة قد تكون أكثر سهولة نسبيًا في الوصول إلى الارتفاع المستقر 6P عندما يكون RBD في الحالة المفتوحة. تم إجراء التحليلات الهيكلية بعد ذلك للتحقق من هذا التخمين.

الشكل 2. ربط اتساع mAbs لتحييد أوميكرون

التحليل الهيكلي لتحييد mAbs على نطاق واسع. كتقريب أولي للحواتم المقيدة، تم استخدام اختبار المنافسة ELISA لتحديد ما إذا كانت هذه الأجسام الثلاثة المحايدة على نطاق واسع تشترك في أي تداخل مع اللوحة الحالية من mAbs، وهي مجموعة من mAbs ذات خصائص الحاتم المعروفة من الدراسات السابقة (15، 25، 35) و 2 mAbs آخرين قيد الاستخدام السريري حاليًا، LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) وREGN10933 (Regeneron) (37). تتداخل مواقع الارتباط لـ S451-1140 وS728-1157 جزئيًا مع CC12.3 (23, 25)، والجسم المضاد المعادل من الفئة 1، ومعظم الأجسام المضادة من الفئة 2، بما في ذلك LY-CoV555 وREGN10933، ولكن ليس مع الأجسام المضادة من الفئة 3 والفئة 4 (الشكل 3A). شارك S626-161 تداخلًا ملحوظًا في منطقة الارتباط مع الفئة 1 CC12.3، والعديد من الأجسام المضادة من الفئة 4، بما في ذلك CR3022، والأجسام المضادة الأخرى غير المصنفة، مع وجود بعض التداخل الجزئي مع عدة أجسام مضادة من الفئة 2 وأجسام مضادة واحدة من الفئة 3 (الشكل 3 أ). على نحو مماثل، كشف اختبار BLI للمنافسة أن S451-1140 وS728-1157 يتنافسان بقوة مع بعضهما البعض للارتباط بارتفاع WT-6P، في حين أن S626-161 لم يفعل ذلك (الشكل التكميلي 3). بشكل عام، تشير هذه البيانات إلى أن S451-1140 وS728-1157 يتعرفان على الحواتم المماثلة التي تختلف عن S626-161.

الشكل 3. آلية التحييد الواسعة لـ S728-1157

تم تشفير الجسم المضاد S728-1157 بواسطة IGHV3-66 ويمتلك منطقة تحديد تكاملية قصيرة 3 (CDR-H3). على وجه الخصوص، mAbs التي تربط RBS في وضع الربط 1 (أي موقع RBS-A أو موقع الفئة 1)، والتي يتم تمثيلها بواسطة CC12.1، CC12.3، B38، وC105 (13، 18، 23، 29، 38، 39)، تميل إلى استخدام IGHV 3-53 أو 3-66 وتكون حساسة لطفرات المركبات العضوية المتطايرة (40). ومع ذلك، فإن منطقة CDR-H3 الخاصة بـ S728-1157 تتميز بشكل كبير عن الأجسام المضادة الأخرى من هذه الفئة، مما قد يمثل نشاطها الأوسع. لفهم الأساس الهيكلي للتحييد الواسع بواسطة S 728-1157 في هذه الحلقة، قمنا بحل بنية المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) (الشكل 3B) لـ IgG S 728-1157 في المجمع مع ارتفاع WT { {31}}P-Mut7، نسخة من Spike WT-6P تمتلك رابطة ثاني كبريتيد interprotomer عند C705 وC883، بدقة إجمالية تبلغ 3.3 Å تقريبًا (الشكل التكميلي 4E). باستخدام توسيع التناظر، والتصنيف المركز، وأساليب الصقل، حققنا الدقة المحلية في واجهة RBD-Fv إلى حوالي 4 Å (الشكل التكميلي 4E والجدول التكميلي 8). تم تحديد التركيب البلوري لـ S728-1157 Fab بدقة 3.1 Å واستخدم لبناء النموذج الذري في واجهة RBD-Fv. تؤكد بنياتنا أن S 728-1157 مرتبط بحلقة RBS-A (أو الفئة 1) في تشكيل RBD-up (الشكل 3B والشكل التكميلي 4E)، على غرار IGHV 3-53 / {{55} الأخرى } الأجسام المضادة (الشكل 3C). يفسر الانسداد المجسم لموقع ربط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2) بواسطة S728-1157 فعاليته العالية في المعادلة ضد السارس-CoV-2. يتفاعل الشكل 32NY33 والشكل 53SGGS56 (23) في S 728-1157 CDR-H1 و-H2 مع RBD بنفس الطريقة تقريبًا مثل CC12.3 (الشكل التكميلي 4 وB وC). ومع ذلك، بالمقارنة مع VH 98DF99 في CC12.3، يشكل VH 98DY99 في S728-1157 CDR-H3 تفاعلات أكثر شمولاً، بما في ذلك التفاعلات الكارهة للماء والقطبية، مع RBD، والذي قد يفسر التحييد الواسع ضد المركبات العضوية المتطايرة (الشكل الجداول ثلاثية الأبعاد والتكميلية 6 و7). قد يسهل أيضًا diglycine VH 100GG101 في S728- 1157 CDR-H3 ربطًا أكثر شمولاً مقارنةً بـ VH Y100 في CC12.3، ويرجع ذلك على الأرجح إلى المرونة في بقايا الجليكاين التي تؤدي إلى تشكيل مختلف لطرف CDR -حلقة H3 والتحول النسبي للمخلفات عند 98DY99.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

على الرغم من أن المركبات العضوية المتطايرة من Omicron لها طفرات واسعة النطاق في RBD، فإن معظم هذه المخلفات لا تتفاعل مع S728-1157، حيث لا يزال الارتباط ملحوظًا (الشكل التكميلي 4A). من نموذجنا المرتفع WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157، من المتوقع أن تقوم Y505 إلى VL Q31، وE484 إلى VH Y99 بتكوين روابط هيدروجينية (الشكل التكميلي 4D والجدول التكميلي 6) ) ، والتي من المحتمل أن تتعطل بسبب طفرات Omicron Y505H و E484A. ومع ذلك، فإن طفرة Y505H ستظل تسمح بوجود رابطة هيدروجينية مع VL Q31، وستضيف طفرة E484A سلسلة جانبية أخرى كارهة للماء بالقرب من المخلفات الكارهة للماء VL Y99، F456، وY489. قد تشرح جهات الاتصال هذه، جزئيًا، الآلية التي تمكن S728-1157 من الاحتفاظ بنشاط التعادل، وإن كان منخفضًا، ضد مستضد الارتفاع BA.1 (الشكل 1G والشكل 2B). من المحتمل أن يكون مستضد BA.1، بدوره، مرتبطًا بطفرات Omicron التي تغير المشهد المطابق لبروتين السنبلة (34). ومع ذلك، فإن العديد من المخلفات المتحورة جسديًا، على سبيل المثال، VH L27 وL28 وR31 وF58 وVL V28 وQ31، في S728-1157 متورطة في التفاعل مع SARS-CoV-2 RBD (الشكل التكميلي 1 و الجدول التكميلي 7)، والذي قد يساهم أيضًا في تفاعله الواسع مقارنةً بـ CC12.3. بشكل عام، كشفت دراساتنا الهيكلية عن أساس التحييد الواسع لـ S728-1157 الذي يمكنه استيعاب معظم الطفرات في المركبات العضوية المتطايرة في SARS-CoV-2.

الشكل 4. الفعالية الوقائية لـ bnAbs ضد عدوى SARS-CoV-2 في الهامستر.

يقلل S728-1157 من تكاثر SARS-CoV-2 BA.1 Omicron وDelta وWT SARS-CoV-2 في الهامستر السوري. لتقييم الفعالية الوقائية لـ mAbs المُحيِّد على نطاق واسع، استخدمنا نموذجًا ذهبيًا لعدوى الهامستر السوري والذي تم استخدامه على نطاق واسع لـ SARS-CoV-2. تلقى الهامستر 5 ملغم/كغم من اختبار mAbs أو مجموعة تحكم نظيرية تستهدف مستضدًا غير ذي صلة (بروتين سكري فيروس إيبولا) عن طريق الحقن داخل الصفاق بعد يوم واحد من الإصابة بفيروسات SARS CoV-2. تم جمع أنسجة الرئة والأنف بعد 4 أيام من الإصابة (الشكل 4A). أدى الاستخدام العلاجي لـ S728-1157 إلى انخفاض عيار متغيرات WT وBA.1 Omicron وDelta في كل من القرينات الأنفية ورئتي الهامستر المصاب (الشكل 4، B – D). ومن المثير للاهتمام، أن تأثير S728-1157 في الرئتين كان مثيرًا، حيث قلل من الأحمال الفيروسية WT وBA.1 Omicron بحوالي 104PFU، مع إلغاء التتر الفيروسي لمتغير BA.1 Omicron تمامًا (الشكل 4C). على النقيض من التحييد في المختبر (الشكل 1G)، لم يقلل S451-1140 من التكاثر الفيروسي BA.1 Omicron في القرينات الرئوية والأنفية، مما يشير إلى الانفصال بين التحييد في المختبر وحماية الجسم الحي لهذا الاستنساخ (الشكل 4E) . بالمقارنة، أدت إدارة S626-161 إلى انخفاضات ملحوظة بشكل هامشي في عيار فيروسات الرئة بعد تحدي WT وBA.1 (الشكل 4 وF وG). تؤكد هذه البيانات أنه لتحديد mAbs الواقي على نطاق واسع بدقة، يلزم تقييم فعالية الحماية بالتوازي مع نشاط التحييد. للمضي قدمًا، سيكون من المثير للاهتمام دراسة مدى اعتماد القدرة الوقائية لـ S728-1157 على Fc. بشكل عام، يمثل S728-1157 mAb واعدًا يتمتع بفعالية تحييد واسعة النطاق ضد متغيرات SARS CoV -2 القادرة على تقليل تكرار WT وDelta وBA.1 بشكل كبير في الجسم الحي.

نادرًا ما تؤدي عدوى SARS-CoV-2 إلى ظهور mAbs قوي مثل S728-1157 – مثل التحييد المتقاطع. نظرًا للتحييد المتبادل والإمكانات الوقائية لـ S728-1157، سعينا إلى تقييم ما إذا كانت الأجسام المضادة المشابهة لـ S728-1157 يتم تحفيزها بشكل شائع بين الاستجابات متعددة النسائل في مرضى SARS-CoV-2. لتقييم ذلك، أجرينا منافسة ELISAs باستخدام مصل النقاهة للكشف عن عيارات الأجسام المضادة لـ RBD التي يمكن أن تتنافس على الارتباط مع S728-1157 (الشكل 5A). تم تقسيم المواضيع إلى 3 مجموعات على أساس حجم استجابات الأجسام المضادة، كما هو محدد سابقا (15، 16). على الرغم من أن المستجيبين المرتفعين والمعتدلين لديهم عيارات أعلى من الأجسام المضادة المصلية التنافسية S728-1157 مقارنة بالمستجيبين المنخفضين (الشكل 5ب)، إلا أن التتر كان منخفضًا جدًا في جميع المجموعات، مما يشير إلى أنه من غير المألوف الحصول على مستويات عالية من S{{ 18}} – مثل الأجسام المضادة في المصل متعدد النسيلة بعد الإصابة بفيروس WT SARS-CoV-2. بالإضافة إلى S728-1157، قمنا باختبار منافسة مصل النقاهة مع mAbs الأخرى، بما في ذلك S451- 1140، وS626-161، وLY-CoV555، وREGN10933، وCR3022، وCC12.3. على غرار S728-1157، لاحظنا انخفاضًا نسبيًا في عيارات الأجسام المضادة التي تتنافس مع S451-1140 وS626-161 وLY-CoV555 وREGN10933 وCC12.3 في مصل متعدد النسيلة من معظم المتعافين. الأفراد (الشكل 5، C – F وH). ومع ذلك، يميل المستجيبون المرتفعون إلى الحصول على عيارات أعلى بشكل ملحوظ مقابل تلك التي تحيد mAbs مقارنةً بالمستجيبين المنخفضين (الشكل 5، B–F وH). في المقابل، كانت الأجسام المضادة التي تستهدف موقع الحاتمة CR3022 أكثر وضوحًا لدى الأفراد المتعافين، مما يشير إلى إثراء الأجسام المضادة RBD من الفئة 4 في المصل متعدد النسيلة (الشكل 5G). والجدير بالذكر أنه لم يكن هناك اختلاف كبير في عيار CR3022 عبر مجموعات المستجيبين الثلاثة، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة لموقع CR3022- تم تحفيزها باستمرار أثناء عدوى WT SARS-CoV-2 في معظم الأفراد. ومن المثير للاهتمام، أنه بالمقارنة مع CC12.3، تم اكتشاف S728-1157 عند مستويات أقل بمقدار 4- أضعاف في مصل المستجيبين العاليين. وبالتالي، على الرغم من أن الأجسام المضادة من الفئة 1 يتم تحفيزها بشكل متكرر عن طريق العدوى الطبيعية والتطعيم (14، 20، 28، 29، 41-43)، تشير بياناتنا إلى أن الأجسام المضادة المشابهة لـ S728-1157 والتي تمثل مجموعة فرعية من هذه الفئة نادرة نسبيًا.

بالإضافة إلى ذلك، قمنا بفحص الفرق في التفاعل مع الارتفاع المستقر لـ 2P مقابل 6P في أمصال أترابية النقاهة لدينا (الشكل 5، I – K). لقد وجدنا أن جميع مجموعات المستجيبين الثلاثة قامت بتركيب أجسام مضادة تفاعلية مضادة للارتفاع المستقر ضد ارتفاع 6P WT إلى حد أكبر من الارتفاع المستقر 2P WT، بعامل من 6 إلى 11 ضعفًا (الشكل 5J)، مما يشير إلى أن تم عرض الحواتم المستضدية الرئيسية أو تثبيتها بشكل أفضل على المستضد المستقر 6P. باستخدام نفس العينات، كان لدى المستجيبين المرتفعين والمعتدلين أيضًا عيارات أقل من الأجسام المضادة المضادة للارتفاع ضد BA.1-2P مقارنة بـ BA.1-6P، بمقدار 4 إلى 5 أضعاف (الشكل 5K). تجدر الإشارة إلى أن المستجيبين المنخفضين كان لديهم تغير طفيف في تفاعل الارتباط ضد الارتفاع BA.1 Omicron-2P و6P (2-تقليل الطية) مقارنةً بـ WT-2P و6P ارتفاع (2-) {28}}تقليل الطيات) (الشكل 5، J وK)، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة في المصل ضد الحواتم المتفاعلة BA.1 Omicron قد تكون محدودة أكثر في الأشخاص ذوي الاستجابة المنخفضة. بشكل عام، تشير هذه البيانات إلى أن هناك ارتباطًا محسنًا متعدد النسيلة ناجمًا عن العدوى الطبيعية للارتفاع المستقر بـ 6P، لكل من فيروسات WT وOmicron.

يتم تحفيز الأجسام المضادة المشابهة لـ S728-1157 على النحو الأمثل في سياق المناعة الهجينة. أصبحت العدوى الأولية لـ SARS-CoV-2 بدون تطعيم نادرة في الوضع العالمي الحالي، وأفادت العديد من الدراسات أن مناعة SARS-CoV-2 تختلف بين الأفراد الذين لديهم تاريخ محدد للتطعيم/العدوى. ونتيجة لذلك، سعينا بعد ذلك إلى التحقق من حالات التعرض الشائعة، بصرف النظر عن عدوى WT بفيروس السارس-CoV-2 السلفي وحده، التي من شأنها أن تحفز بشكل فعال الأجسام المضادة الشبيهة بـ S728–1157 في البلازما من اللقاحات أحادية التكافؤ المعتمدة على mRNA مع أو بدون لقاحات سابقة. عدوى. لقد حصلنا على العينة الحيوية اللازمة من مجموعة دراسة الحماية المرتبطة بالمناعة السريعة لـ SARS-CoV-2 (باريس)، والتي تابعت العاملين في مجال الرعاية الصحية طوليًا منذ بداية الوباء (44). قمنا باختيار عينات من البلازما من المشاركين في الدراسة المحصنين بالكامل (2 × تم تطعيمهم) مع وبدون عدوى وكذلك من المشاركين المعززين (3 × تم تطعيمهم) مع وبدون عدوى. بالإضافة إلى ذلك، قمنا أيضًا بتضمين عينات من المشاركين في الدراسة الذين تلقوا لقاح mRNA ثنائي التكافؤ (الأسلاف WA1/2020 بالإضافة إلى Omicron BA.5) (الشكل 6A والجدول التكميلي 2). حدثت حالات العدوى المتقدمة لدى المشاركين الذين تلقوا لقاحات معززة في الوقت الذي حلت فيه سلالات أوميكرون محل جميع سلالات SARS-CoV-2 الأخرى في منطقة العاصمة نيويورك. لقد وجدنا أن الأفراد الذين تم تطعيمهم بشكل مزدوج لديهم أقل عيار من الأجسام المضادة المصلية التنافسية S728-1157 بين المجموعات الخمس من العينات التي تم اختبارها (الشكل 6B). والجدير بالذكر أن هذه المستويات كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في مجموعة النقاهة غير المحصنة (جميع المستجيبين؛ الشكل 5 ب). بالمقارنة، فإن الأفراد الذين لديهم تاريخ من العدوى الطبيعية، بما في ذلك الأفراد في مرحلة النقاهة الذين حصلوا على 2 من 3 جرعات لقاح، والأفراد الذين عانوا من عدوى اختراقية وتلقوا جرعة معززة ثنائية التكافؤ، أظهروا مستويات أعلى بكثير من استنباط S728-1157 مقارنة مع غير مصابين. ولكن الأفراد الذين تم تطعيمهم (الشكل 6B). على الرغم من أن مجموعة الجرعة 3- غير المصابة عرضت فقط زيادة غير مهمة مقارنة بمجموعة الجرعة 2-، إلا أن التقسيم المزدوج حسب نوع اللقاح أشار إلى أن الجرعات الثالثة المتماثلة من BNT162b2 وmRNA-1273 زادت بشكل ملحوظ S{{ 38}}مثل تحييد عيارات الأجسام المضادة بمقدار 2.72 × و2.85 ×، على التوالي (الشكل 6، C وD). تجدر الإشارة إلى أنه من بين المشاركين الذين لديهم 3 اتصالات إجمالية مع ارتفاع بأي وسيلة، كانت عيارات الأجسام المضادة الشبيهة بـ S728-1157- أعلى بمقدار 3 مرات في اللقاحات المزدوجة للنقاهة مقارنةً باللقاحات الثلاثية الساذجة للعدوى، مما يشير إلى أن SARS-CoV{{ 51}} العدوى تحفز هذا النمط المستنسخ على النحو الأمثل. من بين مجموعات المناعة الهجينة، لاحظنا أن غالبية الأفراد المعززين الذين حصلوا على اختراق والذين تلقوا جرعة اللقاح المعزز ثنائي التكافؤ كان لديهم عيار أعلى بشكل هامشي من الأجسام المضادة S728-1157 مقارنةً بمجموعات النقاهة التي تم تطعيمها قبل أوميكرون، مما يشير إلى أن S{{53 }} كان العيار يقترب على الأرجح من الاستقرار بعد 3 تعريضات. قمنا أيضًا بالتحقق من عيارات الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تنافست مع CC12.3 وCR3022 بالإضافة إلى S728-1157. أظهر جميع الأفراد عيارات عالية نسبيًا من CC12.3- وCR3022-مثل الأجسام المضادة، بغض النظر عن عدد ونوع التعرض (الشكل التكميلي 5)، على عكس ما لاحظناه بالنسبة لـ S728-1157- مثل الأجسام المضادة. بشكل عام، تشير هذه البيانات إلى أن عدوى SARS-CoV-2 وتطعيم mRNA يساهمان في تحفيز الأجسام المضادة الشبيهة بـ S728-1157-، حيث تلعب العدوى دورًا مهيمنًا أكثر في الأفراد الذين تم تطعيمهم.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

أخيرًا، عند مقارنة الاستجابات ضد الارتفاع المستقر 2P مقابل 6P في مجموعة تطعيم mRNA، وجدنا أن معظم المجموعات أثارت مستويات مماثلة من الأجسام المضادة ضد كلا التركيبين. كان الاستثناء من ذلك هو المجموعة غير المصابة بالتطعيم الثلاثي، والتي أظهرت تفاعلًا أعلى إحصائيًا، على الرغم من زيادة طفيفة فقط، تجاه 2P مقارنة بالارتفاع المستقر 6P (الشكل 6E). تشير هذه البيانات إلى أنه على النقيض من العدوى الطبيعية (الشكل 5 وJ وK)، فإن التطعيم وحده ينتج استجابة متعددة النسيلة تقتصر أكثر على الحواتم في بنية Spike-2P، بما يتماشى مع Spike{{12 }} صياغة اللقاحات الحالية. في النهاية، تدعم هذه النتائج فكرة أن تثبيت 6P للقاحات SARS-CoV-2 المستقبلية يمكن أن يكون ذا فائدة كبيرة في تحفيز أنماط مستنسخة من الأجسام المضادة الوقائية على نطاق واسع مثل S728-1157.

الشكل 5. منافسة الأجسام المضادة في مصل النقاهة مع mAbs المتفاعلة مع RBD على نطاق واسع ومقارنة استجابة الأجسام المضادة في المصل ضد الارتفاعات المستقرة 6P مقابل 2P

الشكل 6. منافسة الأجسام المضادة في المصل الملقحة بـ mRNA مع S728-1157 التي تعمل على تحييد mAbs المتفاعل مع RBD ومقارنة استجابة الأجسام المضادة في المصل ضد الارتفاعات المستقرة 6P مقابل 2P.

مناقشة

في هذه الدراسة، حددنا bnAb قويًا معزولًا من خلية ذاكرة B لشخص تعافى من عدوى SARS-CoV-2 أثناء الموجة الأولية لوباء COVID-19. حافظ هذا bnAb، S728- 1157، على تفاعل ربط كبير وكان له نشاط تحييد ثابت ضد جميع المركبات العضوية المتطايرة من SARS-CoV-2 التي تم اختبارها، بما في ذلك Omicron BA.1 وBA.2 وBA.2.75 وBL.1 ( BA.2.75+R346T)، وBA.4، وBA.5، وXBB، وكان قادرًا على تقليل التتر الفيروسي المعدي بشكل كبير بعد الإصابة بـ Delta وBA.1 في الهامستر.

لقد وجدنا أن مصل النقاهة من مجموعتنا يحتوي على تركيزات منخفضة من الأجسام المضادة التي تتنافس مع S728-1157 (جسم مضاد من الفئة 1/ RBS-A) والفئة 2 من الحاتمة mAbs. يشير هذا إلى أن S728-1157 فريد إلى حد ما من الأجسام المضادة الأخرى التي تستهدف الحواتم من الفئة 1 ويتم تحفيزها بشكل غير متكرر في تجمع خلايا الذاكرة B الخاصة بـ RBD. بدلاً من ذلك، يبدو أن مجموعة العدوى الطبيعية لدينا تحفز الأجسام المضادة التي تستهدف الحاتمة CR3022 (الفئة 4)؛ غالبًا ما تكون الأجسام المضادة من هذه النوعية متفاعلة بشكل متقاطع ولكنها أقل فعالية في التحييد من الأجسام المضادة التي تستهدف RBS (14، 17). هذه البيانات مكملة لنتائجنا السابقة التي توضح أن وفرة الأجسام المضادة من الفئة 3/S309 في أمصال النقاهة قد تساهم في تحييد النشاط ضد متغيرات ألفا وغاما، في حين أن نقص الأجسام المضادة من الفئة 2 قد يفسر انخفاض قدرة التحييد ضد دلتا (15). . على الرغم من ذلك، تم الإبلاغ عن أن نطاق نشاط معظم هذه الأجسام المضادة التي تستهدف RBS (RBS-A/class 1 وRBS-B وC/class 2 وRBS-D وS309/class 3) ضد متغيرات Omicron محدود للغاية. (11، 40، 45).

يتمثل التحدي الرئيسي للمضي قدمًا في تحديد كيفية تحسين استنباط الأجسام المضادة المتفاعلة على نطاق واسع لحلقات RBS المحفوظة. وفي هذا الصدد، لاحظنا هنا أن الأفراد الذين لديهم مناعة هجينة لديهم عيارات أعلى بكثير من الأجسام المضادة الشبيهة بـ S728-1157- مقارنة بالأفراد الذين تم تطعيمهم دون إصابة سابقة. والأهم من ذلك، أنه تمت ملاحظة هذه الظاهرة حتى عندما تم التحكم في عدد حالات التعرض (على سبيل المثال، في النقاهة من اللقاحين المزدوجين مقابل اللقاحات الثلاثية غير المصابة)، مما يشير إلى وجود بعض عناصر المناعة المرتبطة بالعدوى (أو تركيبة لقاح يمكن أن تحاكي هذا النوع من المناعة) مهم لاستنباط هذا النمط المستنسخ. يتوافق هذا مع الأدلة التجريبية التي توثق أن الأفراد ذوي المناعة الهجينة لديهم ملفات تعريف أوسع لتفاعل الأجسام المضادة مقارنة بأولئك الذين لديهم فقط استجابات مناعية ناجمة عن التطعيم أو استجابات مناعية ناجمة عن العدوى الأولية (9).

أوضحت الهياكل هنا أن S728-1157 ربطت حلقة RBS-A/class 1 في التشكل الأعلى RBD. يبدو أن هذه الحاتمة يمكن الوصول إليها بسهولة أكبر على المسامير المستقرة 6P، والتي تم الإبلاغ عن أنها تقدم 2 RBDs في شمال الولاية، مقارنة مع المسامير 2P، التي تقدم 1 فقط (30، 33، 46، 47)، والتي لها الأجسام المضادة لدينا محددة لارتفاع التشكل تظهر تحسين الربط. تم عزل S728-1157 بعد الإصابة الطبيعية؛ في مثل هذه السياقات، من المرجح أن تكون احتمالات تحفيز الحيوانات المستنسخة الشبيهة بـ S728-1157 أعلى نظرًا لأن RBD يجب أن يكون قادرًا على تبني شكل أعلى، حتى بشكل عابر، للربط بـ ACE2، وبالتالي كشف هذه الحاتمة. على عكس غالبية الأجسام المضادة IGHV3-53/3-66 RBS-A/الفئة 1، يمكن لـ S728-1157 استيعاب الطفرات الرئيسية في طفرات المركبات العضوية المتطايرة باستخدام تفاعلات مكثفة بين CDR-H3 وRBD (29، 48-50). يستخدم S728-1157 أيضًا سلسلة خفيفة مختلفة (IGLV3-9) مقارنة بالأجسام المضادة الأخرى الأقل اتساعًا مثل CC12.3 (IGKV3-20)، والتي قد تؤثر على تفاعلات الربط الشاملة؛ ومع ذلك، يشير تحليلنا إلى وجود رابطة هيدروجينية أقل بين السلسلة الخفيفة S 728-1157 وRBD مقارنةً بـ CC12.3 (الجدول الإضافي 7). على الرغم من أن معظم مخلفات التلامس CDR-H3 المهمة للتفاعل المتبادل للمركبات العضوية المتطايرة في هذا التفاعل مشفرة بسلالة جرثومية ولم يتم تقديمها عن طريق طفرات جسدية، فإن العديد من المخلفات المتحولة جسديًا في مناطق الإطار أو CDR-H1 وCDR-H2 وCDR-L1 موجودة. المشاركة في التفاعل مع SARS-CoV-2 RBD. من ناحية، يشير هذا إلى أن خلايا الذاكرة B التي تشفر الأجسام المضادة من فئة IGHV3-53/66 يمكن أن تكتسب درجة مماثلة من التفاعل المتبادل من خلال المزيد من نضج التقارب. من ناحية أخرى، يشير هذا أيضًا إلى إمكانية تصميم مناعة تستهدف السلالة الجرثومية وتستهدف الخلايا البائية الساذجة مثل S728-1157-. في حين أنه قد يكون من الصعب تصميم لقاحات يمكنها على وجه التحديد إنتاج أجسام مضادة تشبه S728-1157 مع CDR-H3s محددة قادرة على التغلب على طفرات المركبات العضوية المتطايرة، فمن المشجع ملاحظة تقييد جينات IGHV في فيروسات السارس القوية الأخرى { {58}} تحييد دراسات mAbs (13، 15، 20-27). وبدلاً من ذلك، قد يكون هذا ممكنًا أيضًا من خلال التحصين التكراري باستخدام مناعة RBD المحسنة، كما تم الإبلاغ سابقًا عن مسببات الأمراض الأخرى (51-55).

على الرغم من ملاحظة العديد من الطفرات في الموقع المستضدي RBS-A/ الفئة 1 (18)، فيما يتعلق بالحاتمة S728-1157، فإن 13 من 15 إجمالي بقايا اتصال RBD و2 من 3 CDR-H{{9} }يتم حفظ بقايا الاتصال RBD المرتبطة داخل Omicron وجميع المركبات العضوية المتطايرة الأخرى. يشير هذا إلى أن منطقة RBD حيث توجد الحلقة S728-1157 قد تتضمن بقايا مهمة لوظيفتها الديناميكية وملاءمتها الفيروسية، وبالتالي ستكون أقل تحملاً للطفرات وانجراف المستضدات من بقايا موقع RBS-A/ الفئة 1 المحيطة. إذا كان الأمر كذلك، فيجب تقليل الميل إلى فقدان هذه الحاتمة المعينة مع تطور المتغيرات الفيروسية، مما يجعل توصيف S728-1157 والأجسام المضادة والحواتم المشابهة مهمًا للقاحات المقاومة للمتغيرات أو التطوير العلاجي لـ mAb. باختصار، تحدد دراستنا bnAbs التي قد تفيد في تصميم المستضدات للجيل التالي من لقاحات فيروس كورونا المقاومة للمتغيرات أو تكون بمثابة علاجات mAb المقاومة لتطور SARS CoV-2. على وجه الخصوص، من حيث الفعالية والاتساع المشتركين، يبدو أن S728-1157 هو أفضل جسم مضاد معزول في فئته حتى الآن. نظرًا لأن هذا الجسم المضاد يرتبط بسهولة أكبر مع تثبيت 6P، فمن المتوقع أن يتم تحفيزه بشكل تفضيلي بواسطة بروتينات سبايك المؤتلفة المؤتلفة 6P أو الفيروس بأكمله، مما يشير إلى أن تعديل الهيكسابرولين يمكن أن يفيد تركيبات اللقاح المستقبلية من أجل الحماية المثلى ضد السارس-CoV في المستقبل. متغيرات -2 والفيروسات المفصلية الأخرى.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

طُرق

عزل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. تم عزل PBMCs من مرشحات تخفيض الكريات البيض وتم تجميدها كما هو موضح سابقًا (24). تم إثراء الخلايا B من PBMCs عبر FACS. كانت الخلايا ملطخة بـ CD19، CD3، وتحقيقات المستضد المرتبطة بـ oligo-fluorophore؛ تم تحديد الخلايا محل الاهتمام على أنها CD3 – CD 19+ Antigen+. تم إنشاء جميع mAbs من الخلايا المصنفة بطعم المستضد والتي تحمل علامات قليلة والتي تم تحديدها من خلال خلية واحدة RNA-Seq، كما هو موضح سابقًا (15، 24). تم إيداع بيانات الخلية B المفردة التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في Gene Expression Omnibus: GSE171703 وGSM5231088–GSM5231123.

تم اختيار الخلايا B الخاصة بمستضد معين لتوليد mAbs بناءً على كثافة مسبار المستضد التي تم تحليلها بواسطة JMP Pro 15. وتم تصنيع جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة للأجسام المضادة بواسطة تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT) وتم استنساخها في IgG1 البشري وسلسلة خفيفة بشرية κ أو lect. ناقلات التعبير بواسطة تجميع جيبسون، كما هو موضح سابقًا (56). تم نقل السلاسل الثقيلة والخفيفة من mAb المقابلة بشكل عابر إلى خلايا HEK293T (ATCC). بعد ترنسفكأيشن لمدة 18 ساعة، تمت إضافة الخلايا المنقولة بطاف متوسط ​​الورم الهجين الخالي من البروتين (PFHM-II، Gibco). تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على mAb المفرز في اليوم الرابع وتم تنقيتها باستخدام حبات agarose البروتينية (Thermo Fisher Scientific) كما هو مفصل سابقًا (56). تم استخلاص تسلسلات السلاسل الثقيلة والخفيفة من الأجسام المضادة المميزة جيدًا من بنك بيانات البروتين (PDB)، وLY-CoV555 (معرف PDB: 7KMG)، وCR3022 (معرف PDB: 6W7Y)، وREGN1{{ 125}}933 (معرف PDB: 6XDG) وتم تصنيعها كما هو موضح أعلاه. تم توفير CC12.3 mAb (معرف PDB: 6XC4) بواسطة Meng Yuan في معهد سكريبس للأبحاث (سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). التعبير البروتيني المؤتلف. ارتفاع D614G SARS-CoV-2 كامل الطول (FL)، BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P، XBB-6P، WT RBD، طفرات RBD فردية (R346S، K417N، K417T، G446V، L452R، S477N، F486A، F486Y، N487Q، Y489F، Q493A، Q493N، N501Y، تم إنشاء Y505A، وY505F)، ومجموعة RBD المتحولة (K417N/E484K/L452R/NN501Y)، وSARS-CoV-1 RBD، وMERS-CoV RBD داخليًا. باختصار، تم التعبير عن المستضدات المؤتلفة باستخدام خلايا Expi293F (Thermo Fisher Scientific). تم استنساخ الجين محل الاهتمام في ناقل تعبير للثدييات (AbVec معدّل داخليًا) وتم نقله باستخدام مجموعة ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم حصاد الطاف في اليوم الرابع بعد ترنسفكأيشن واحتضانه بحمض النيتريلوتري أسيتيك (Ni-NTA) agarose (Qiagen). تم إجراء التنقية باستخدام عمود تدفق الجاذبية وتم شطفها باستخدام محلول عازل يحتوي على إيميدازول كما هو موضح سابقًا (57، 58). تم تخزين الشطافة مؤقتًا وتبادلها مع PBS باستخدام وحدة الطرد المركزي Amicon (Millipore). استقرت طفرات FL المؤتلفة بواسطة طفرات 2P للمتغيرات B.1.1.7 Alpha و B.1.351 Beta و P.1 Gamma و B.1.617.2 Delta و BA.1 و BA.2 و BA.4 Omicron. تم إنتاجه في مختبر ساثر في معهد سياتل لأبحاث الأطفال. تم إنتاج K417V وN439K وE484K RBDs وFL Spike المؤتلف WT-2P و6P في مختبر كرامر في كلية إيكان للطب في جبل سيناء. تم تصميم وإنتاج SARS-CoV-2-6P-Mut7 وSpike BA.1-6P كما هو موضح في دراسة سابقة (59). يتم سرد تسلسل البروتين والموارد لكل مستضد في الجدول التكميلي 4. ELISA. تم طلاء بروتينات SARS-CoV-2 ذات الارتفاع المؤتلف/بروتينات RBD على صفائح ميكروتيتر عالية الارتباط بالبروتين (Costar) عند 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني عند 50 ميكرولتر / بئر وتم الاحتفاظ بها طوال الليل عند 4 درجات. تم غسل الأطباق باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.05٪ Tween 20 (PBS-T) وتم حظره بـ 150 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على 20٪ FBS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. تم تخفيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بشكل تسلسلي 3-أضعاف بدءًا من 10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني واحتضانها في الآبار لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة. تم بعد ذلك غسل الأطباق واحتضانها باستخدام الجسم المضاد IgG المضاد للإنسان والماعز المصاحب لـ HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098)، 1:1، 000) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. بعد الغسيل، تمت إضافة 100 ميكرولتر من ركيزة Super AquaBlue ELISA (eBioscience) لكل بئر. تم قياس الامتصاصية عند 405 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق (Bio-Rad). تم توحيد المقايسات باستخدام الجسم المضاد للتحكم S144-509 (15)، مع خصائص ربط معروفة في كل لوحة، وتم تطوير اللوحات حتى وصل امتصاص عنصر التحكم إلى OD قدره 3.0. تم اختبار جميع mAbs في نسختين، وتم إجراء كل تجربة مرتين.

مصل إليسا. تم طلاء صفائح العيار المجهري عالية الارتباط بالبروتين بمستضدات ارتفاع SARS-CoV -2 المؤتلفة عند 2 ميكروغرام / مل في PBS طوال الليل عند 4 درجات. تم غسل الأطباق باستخدام PBS 0.05% توين وتم حظرها بـ 200 ميكرولتر PBS 0.1% توين + 3% مسحوق الحليب الخالي من الدسم لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT). تم تعطيل عينات البلازما بالحرارة لمدة ساعة عند 56 درجة قبل إجراء التجربة المصلية. تم تخفيف البلازما بشكل تسلسلي 2-fold في PBS 0.1% Tween + 1% مسحوق حليب خالي الدسم. تم تحضين الأطباق بتخفيفات المصل لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة. تم تخفيف الجسم المضاد الثانوي Ig المضاد للإنسان والماعز المصاحب لـ HRP بنسبة 1:3، 000 مع PBS 0.1% Tween + 1% من مسحوق الحليب الخالي من الدسم للكشف عن ارتباط الأجسام المضادة. بعد ساعة واحدة من الحضانة، تم تطوير الأطباق باستخدام 100 ميكرولتر من محلول SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تم استخدام 50 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 3M لإيقاف تفاعل التطوير. تم قياس الامتصاصية عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق (Bio-Rad). تم استقراء التتر نقطة النهاية من المنحنى القياسي 4PL السيني (حيث x هو تركيز السجل) لكل عينة. يتم تعريف حد الاكتشاف (LOD) على أنه متوسط ​​+ 3 SD لإشارة OD المسجلة باستخدام البلازما من أفراد ما قبل السارس-CoV-2. تم إجراء جميع الحسابات في برنامج GraphPad Prism (الإصدار 9.0).

مسابقة إليسا. لتحديد تصنيف الحاتمة المستهدفة لـ mAbs المتفاعلة مع RBD، تم إجراء ELISAs المنافسة باستخدام mAbs أخرى ذات خصائص ربط الحاتمة المعروفة مثل mAbs المنافسة. تم أحيائيًا mAbs المنافس باستخدام EZ-Link sulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) لمدة ساعتين عند RT. تمت إزالة البيوتين الزائد من mAbs المعالج بالبيوتينيل باستخدام أعمدة تحلية Zeba ذات الوزن الجزيئي 7 كيلو (MWCO) (Thermo Fisher Scientific). كانت الألواح مغلفة بمستضد RBD 2 ميكروغرام / مل طوال الليل عند 4 درجات. تم حجب الصفائح باستخدام PBS–20% FBS لمدة ساعتين عند RT، وتمت إضافة التخفيف 2- أضعاف mAbs لفئة أو مصل غير محدد، بدءًا من 20 ميكروجرام/مل من mAbs وتخفيف المصل بنسبة 1:10. بعد حضانة الجسم المضاد لمدة ساعتين عند درجة حرارة الغرفة، تمت إضافة المنافس المعالج بالبيوتينيل mAb بتركيز ضعف ثابت التفكك (KD) واحتضانه لمدة ساعتين أخريين عند درجة حرارة الغرفة مع mAb أو المصل الذي تمت إضافته مسبقًا. تم غسل الأطباق واحتضانها باستخدام 100 ميكرولتر من الستربتافيدين المترافق مع HRP (التكنولوجيا الحيوية الجنوبية) عند تخفيف بنسبة 1:1 000 لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة. تم تطوير اللوحات باستخدام الركيزة Super AquaBlue ELISA (eBioscience). لتطبيع المقايسات، تمت إضافة mAb المنافس بيوتينيلاتيد إلى بئر دون أي mAbs أو مصل منافس كعنصر تحكم. تم تسجيل البيانات عندما وصل امتصاص عنصر التحكم جيدًا إلى OD قدره 1.0-1.5. تم بعد ذلك حساب النسبة المئوية للتنافس بين mAbs عن طريق قسمة ODs المرصودة للعينة على OD الذي تم الوصول إليه عن طريق التحكم الإيجابي، وطرح هذه القيمة من 1، وضربها في 100. بالنسبة للمصل، تم تحويل ODs log10 وتحليلها بواسطة الانحدار غير الخطي لتحديد 50 قيم تركيز التثبيط % (IC50) باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 9.0). تم تحويل البيانات إلى Log1P ورسمها في رسم بياني يمثل تخفيف المصل المتبادل لـ IC50 من تخفيف المصل الذي يمكنه تحقيق منافسة بنسبة 50% مع المنافس mAb محل الاهتمام. تم اختبار جميع mAbs في نسختين، وتم إجراء كل تجربة مرتين بشكل مستقل، وتم حساب متوسط ​​القيم من تجربتين مستقلتين.

فحوصات البلاك. تم إجراء فحوصات البلاك باستخدام فيروسات SARS-CoV-2 المختلفة على خلايا Vero E6/TMPRSS2 (المجموعة اليابانية للمصادر الحيوية البحثية (JCRB)) (الجدول التكميلي 5). تمت زراعة الخلايا لتحقيق تقارب بنسبة 90% قبل أن يتم تجريبها وزرعها بكثافة 3 × 104 خلايا / بئر في 96- صفائح جيدة. في اليوم التالي، تم تحضين 102 وحدة PFU من متغير SARS-CoV-2 مع mAbs 2- أضعاف مخففة لمدة ساعة واحدة. تم تحضين خليط فيروس الجسم المضاد مع خلايا Vero E6/TMPRSS2 لمدة 3 أيام عند 37 درجة. تم تثبيت الألواح باستخدام 20٪ ميثانول ثم صبغها بمحلول البنفسجي البلوري. تم حساب التركيزات المثبطة الكاملة (IC99) باستخدام السجل (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية (المنحدر المتغير)، والتي تم إجراؤها في GraphPad Prism (الإصدار 9.0). تم اختبار جميع mAbs في نسختين، وتم إجراء كل تجربة مرتين. اختبار تحييد تقليل التركيز. تم استخدام اختبارات تحييد تقليل التركيز (FRNTs) لتحديد أنشطة التحييد كمنصة إضافية بخلاف اختبار البلاك. تم خلط التخفيفات التسلسلية للمصل بدءًا من التركيز النهائي 1:20 مع 103 وحدات تشكيل تركيز من الفيروس لكل بئر واحتضانها لمدة ساعة عند 37 درجة. كانت عينة المصل المجمعة قبل الوباء بمثابة عنصر تحكم. تم تلقيح خليط فيروس الجسم المضاد على خلايا Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) في أطباق جيدة وحضنت لمدة ساعة عند 37 درجة. تمت إضافة كمية متساوية من محلول ميثيل السليلوز إلى كل بئر. تم تحضين الخلايا لمدة 16 ساعة عند 37 درجة ثم تثبيتها بالفورمالين. بعد إزالة الفورمالين، تم تحصين الخلايا باستخدام فأر mAb ضد SARS-CoV-1/2 البروتين النووي [استنساخ 1C7C7 (Sigma-Aldrich)]، متبوعًا بجلوبيولين مناعي مضاد للفأر يحمل علامة HRP (Sigma-). ألدريش ؛ A8924). تم تلوين الخلايا المصابة باستخدام TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) ثم غسلها بالماء المقطر. بعد التجفيف، تم قياس أرقام التركيز باستخدام محلل ImmunoSpot S6 وبرنامج ImmunoCapture وبرنامج BioSpot (التقنية الخلوية). تم حساب IC50 من القيمة المحرفة من السجل (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية، باستخدام الانحدار غير الخطي المتغير (4 معلمات) الذي تم إجراؤه في GraphPad Prism (الإصدار 9.0).

مراجع

1. هوى جى، وآخرون. يُظهر متغير SARS-CoV-2 D614G تكاثرًا فعالاً خارج الجسم الحي وانتقاله في الجسم الحي. علوم. 2020;370(6523):1464–1468.

2. جارسيا بلتران دبليو إف، وآخرون. تفلت متغيرات فيروس السارس المتعددة -2 من عملية التحييد عن طريق المناعة الخلطية الناجمة عن اللقاح. خلية. 2021;184(9):2523.

3. وول إيك، وآخرون. تحييد نشاط الأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 المركبات العضوية المتطايرة B.1.617.2 وB.1.351 عن طريق التطعيم BNT162b2. لانسيت. 2021;397(10292):2331-2333.

4. إدارا ف، وآخرون. استجابات العدوى والأجسام المضادة المعادلة الناجمة عن اللقاح لمتغيرات SARS-CoV-2 B.1.617. ن إنجل ي ميد. 2021;385(7):664-666.

5. تشو د، وآخرون. دليل على هروب فيروس SARS-CoV-2 المتغير B.1.351 من الأمصال الطبيعية والمستحثة باللقاحات. خلية. 2021;184(9):2348–2361.

6. وايسبلوم واي، وآخرون. الهروب من تحييد الأجسام المضادة بواسطة متغيرات البروتين الشوكي لـ SARS-CoV-2. إليفي. 2020;9:e61312.

7. غراهام إف. الإحاطة اليومية: متغير فيروس كورونا أوميكرون يضع العلماء في حالة تأهب. طبيعة. 2021؛.

8. كريم سسا، كريم قا. متغير Omicron SARS-CoV-2: فصل جديد في جائحة فيروس كورونا-19. لانسيت. 2021;398(10317):2126–2128.

9. كارينيو جي إم، وآخرون. نشاط مصل النقاهة واللقاح ضد السارس CoV-2 أوميكرون. طبيعة. 2021;602(7898):682–688.

10. وانغ كيو، وآخرون. خصائص التهرب من الأجسام المضادة المثيرة للقلق في المتغيرات الفرعية لـ SARS-CoV-2 BQ وXBB. خلية. 2022;186(2):279-286.

11. فانبلارجان لوس أنجلوس، وآخرون. فيروس SARS-CoV-2 المعدي B.1.1.529 يفلت فيروس Omicron من عملية التحييد بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية. نات ميد. 2022;28(3):490-495.

12. تاكاشيتا إي، وآخرون. فعالية الأجسام المضادة والأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس Covid-19 Omicron Variant. ن إنجل ي ميد. 2022;386(10):995-998.

13. يوان م، وآخرون. التعرف على مجال ربط مستقبل SARS-CoV-2 عن طريق تحييد الأجسام المضادة. الكيمياء الحيوية Biophys الدقة المشتركة. 2021;538:192–203.

14. شركة بارنز، وآخرون. السارس-CoV-2 تحييد هياكل الأجسام المضادة يُعلم الاستراتيجيات العلاجية. طبيعة. 2020;588(7839):682–687.

15. تشانغروب S، وآخرون. التحييد المتقاطع لمتغيرات SARS-CoV-2 الناشئة المثيرة للقلق بواسطة الأجسام المضادة التي تستهدف الحواتم المميزة على الارتفاع. مبيو. 2021;12(6):e0297521.

16. جوثميلر جي جي، وآخرون. ترتبط شدة الإصابة بـ SARS-CoV-2 بالمناعة الخلطية الفائقة ضد الطفرة. مبيو. 2021;12(1):e02940–20.

17. غريني AJ، وآخرون. تعيين الطفرات إلى SARS-CoV-2 RBD التي تفلت من الارتباط بفئات مختلفة من الأجسام المضادة. نات كومون. 2021;12(1):4196.

18. ليو إتش، ويلسون آي. الحواتم المحايدة الوقائية في SARS-CoV-2. إيمونول القس. 202؛310(1):76-92.

19. جيت كاليفورنيا، وآخرون. تفاعل تبادلي واسع النطاق عبر الفيروسات المفصلية التي تظهرها مجموعة فرعية من الأجسام المضادة المحايدة المشتقة من الجهات المانحة لـCOVID-19. مندوب الخلية. 2021;36(13):109760.

20. بروير PJM، وآخرون. تحدد الأجسام المضادة المعادلة القوية من مرضى فيروس كورونا-19 أهدافًا متعددة للضعف. علوم. 2020;369(6504):643-650.

21. بينتو د، وآخرون. تحييد متقاطع لـ SARS CoV -2 بواسطة جسم مضاد بشري أحادي النسيلة لـ SARS-CoV. طبيعة. 2020;583(7815):290–295.

22. روبياني دف، وآخرون. استجابات الأجسام المضادة المتقاربة لـ SARS-CoV-2 لدى الأفراد المتعافين. طبيعة. 2020;584(7821):437-442.

23. يوان م، وآخرون. الأساس الهيكلي لاستجابة الأجسام المضادة المشتركة لـ SARS-CoV-2. علوم. 2020;369(6507):1119-1123.

24. دوغان إتش إل، وآخرون. يكشف تحديد خصائص المناعة المناعية للخلايا البائية بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-2 عن تطور الأجسام المضادة إلى أهداف فيروسية غير معادلة. حصانة. 2021;54(6):1290–1303.

25. روجرز TF، وآخرون. عزل الأجسام المضادة القوية لـ SARS CoV-2 التي تعمل على تحييد الأجسام المضادة والحماية من المرض في نموذج حيواني صغير. علوم. 2020;369(6506):956-963.

26. شميتز AJ، وآخرون. يحمي الجسم المضاد العام الناتج عن اللقاح من السارس-CoV-2 والمتغيرات الناشئة. حصانة. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. شي آر، وآخرون. يستهدف الجسم المضاد المعادل البشري موقع ربط مستقبلات SARS-CoV-2. طبيعة. 2020;584(7819):120-124.

28. تساو واي، وآخرون. أجسام مضادة قوية تحييد ضد السارس-CoV-2 تم تحديدها من خلال تسلسل خلية واحدة عالي الإنتاجية للخلايا البائية للمرضى المتعافين. خلية. 2020;182(1):73–84.

29. شركة بارنز، وآخرون. تكشف هياكل الأجسام المضادة البشرية المرتبطة بارتفاع SARS-CoV-2 عن الحواتم الشائعة والسمات المتكررة للأجسام المضادة. خلية. 2020;182(4):828-842.

30. كوربيت كانساس، وآخرون. تم تمكين تصميم لقاح SARS-CoV-2 mRNA من خلال جاهزية النموذج الأولي لمسببات الأمراض. طبيعة. 2020;586(7830):567–571.

31. أمانات ف، وآخرون. أدى إدخال اثنين من البرولين وإزالة موقع الانقسام متعدد القاعدة إلى زيادة فعالية لقاح SARS-CoV-2 المؤتلف القائم على السنبلة في نموذج الفأر. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. صن دبليو، وآخرون. يؤدي فيروس مرض نيوكاسل الذي يعبر عن بروتين سبايك مستقر لـ SARS-CoV-2 إلى استجابات مناعية وقائية. نات كومون. 2021;12(1):6197.

33. هسيه سي إل، وآخرون. التصميم القائم على البنية لأشواك SARS-CoV-2 المثبتة مسبقًا. علوم. 2020;369(6510):1501-1505.

34. جوبيل إس إم، وآخرون. التنوع الهيكلي لارتفاع SARS-CoV-2 Omicron. خلية مول. 2022;82(11):2050–2068.

35. يوان م، وآخرون. حلقة مشفرة محفوظة للغاية في مجالات ربط مستقبلات SARS-CoV-2 وSARS-CoV. علوم. 2020;368(6491):630-633.

36. ستار TN، وآخرون. خريطة كاملة لطفرات SARS-CoV-2 RBD التي تفلت من الجسم المضاد وحيد النسيلة LY-CoV555 وكوكتيله مع LY-CoV016. مندوب الخلية ميد. 2021;2(4):100255.

37. باوم أ، وآخرون. تمنع الأجسام المضادة REGN-COV2 عدوى SARS-CoV-2 وتعالجها في قرود المكاك الريسوسي والهامستر. علوم. 2020;370(6520):1110-1115.

38. وو نورث كارولاينا، وآخرون. وضع ربط بديل للأجسام المضادة IGHV3-53 لمجال ربط مستقبل SARS-CoV-2. مندوب الخلية. 2020;33(3):108274.

39. وو واي، وآخرون. يقوم زوج غير متنافس من الأجسام المضادة البشرية المحايدة بحظر ارتباط فيروس COVID-19 بمستقبله ACE2. علوم. 2020;368(6496):1274-1278.

40. يوان م، وآخرون. التداعيات الهيكلية والوظيفية للانجراف المستضدي في المتغيرات الحديثة لـ SARS-CoV-2. علوم. 2021;373(6556):818–823.

41. يان كيو، وآخرون. Germline IGHV3-53-توجد الأجسام المضادة المعادلة المشفرة لاستهداف RBD بشكل شائع في مخزون الأجسام المضادة لمرضى فيروس كورونا-19. الميكروبات الناشئة تصيب. 2021;10(1):1097-1111.

42. تشانغ س، وآخرون. الأجسام المضادة العامة القوية والوقائية IGHV3- 53/3-66 وطفرة الهروب المشتركة الخاصة بها على ارتفاع فيروس SARS-CoV-2. نات كومون. 2021;12(1):4210.

43. وانغ زي، وآخرون. الأجسام المضادة التي يسببها لقاح mRNA لـ SARS-CoV-2 والمتغيرات المنتشرة. طبيعة. 2021;592(7855):616–622.

44. سيمون الخامس، وآخرون. باريس وسبارتا: العثور على كعب أخيل لفيروس السارس-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. ستار TN، وآخرون. الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 RBD التي تعمل على زيادة الاتساع والمقاومة للهروب. طبيعة. 2021;597(7874):97-102.

46. ​​الجدران AC، وآخرون. هيكل ووظيفة ومستضد البروتين السكري الشوكي لـ SARS-CoV-2. خلية. 2020;181(2):281-292.

47. هندرسون ر، وآخرون. التحكم في تشكيل بروتين سكري SARS-CoV-2. نات ستركت مول بيول. 2020;27(10):925–933.

48. شريستا إل بي، وآخرون. تحييد الأجسام المضادة على نطاق واسع ضد متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة. الجبهة المناعية. 2021;12:752003.

49. غريني AJ، وآخرون. ترتبط الأجسام المضادة الناتجة عن تطعيم mRNA-1273 على نطاق أوسع بمجال ربط المستقبل مقارنة بتلك الناتجة عن عدوى SARS-CoV-2. ترجمة العلوم ميد. 2021;13(600):eabi9915.

50. رينكي SM، وآخرون. تؤدي العدوى بمتغير بيتا لـ SARS-CoV-2 إلى ظهور أجسام مضادة قوية خاصة بالنسب ومتفاعلة. علوم. 2022;375(6582):782-787.

51. راميرت J، وآخرون. تهيمن الأجسام المضادة المتفاعلة على نطاق واسع على استجابة الخلايا البائية البشرية ضد عدوى فيروس الأنفلونزا H1N1 الوبائي لعام 2009. J إكسب ميد. 201؛208(1):181-193.

52. جوثميلر جي جي، وآخرون. التعرض الأول للأجسام المضادة المحايدة على نطاق واسع الناجمة عن فيروس H1N1 والتي تستهدف حلقات رأس الهيماجلوتينين. ترجمة العلوم ميد. 2021;13(596):eabg4535.

53. باجيك جي، وآخرون. تركز هندسة مستضد الأنفلونزا على الاستجابات المناعية للحاتمة الفيروسية ذات الطبقة الفرعية ولكن الواقية على نطاق واسع. الميكروب المضيف للخلية. 2019;25(6):827–835.

54. ناخباجور ر، وآخرون. يؤدي نهج لقاح فيروس الأنفلونزا الشامل القائم على الهيماجلوتينين إلى إحداث مناعة واسعة وطويلة الأمد في تجربة المرحلة الأولى العشوائية التي يتم التحكم فيها بالعلاج الوهمي. نات ميد. 2021;27(1):106-114.

55. أنجيليتي د، وآخرون. تطويق المناعة المناعية لاستهداف الحواتم المحايدة على نطاق واسع. Proc Natl Acad Sci US A. 201;116(27):13474–13479.

56. جوثميلر جي جي، وآخرون. طريقة فعالة لتوليد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من الخلايا البائية البشرية. طرق مول بيول. 2019;1904:109–145.

57. أمانات ف، وآخرون. اختبار مصلي للكشف عن التحويل المصلي لـ SARS-CoV-2 في البشر. نات ميد. 2020;26(7):1033-1036.

58. ستادلباور د، وآخرون. التحويل المصلي لـ SARS-CoV-2 في البشر: بروتوكول مفصل للمقايسة المصلية، وإنتاج المستضد، وإعداد الاختبار. العملة بروتوك ميكروبيول. 2020;57(1):e100.

59. توريس جي إل، وآخرون. رؤى هيكلية لجسم مضاد بشري أحادي النسيلة قوي للغاية لتحييد السارس-CoV-2. Proc Natl Acad Sci الولايات المتحدة الأمريكية. 2022;119(20):e2120976119.

60. سولواي سي، وآخرون. المجهر الجزيئي الآلي: نظام ليجينون الجديد. J ستركت بيول. 2005;151(1):41–60.

61. لاندر جي سي، وآخرون. Appion: خط أنابيب متكامل يعتمد على قاعدة البيانات لتسهيل معالجة صور EM. J ستركت بيول. 200؛166(1):95-102.

62. فوس إن آر، وآخرون. DoG Picker وTiltPicker: أدوات برمجية لتسهيل اختيار الجسيمات في المجهر الإلكتروني أحادي الجسيم. J ستركت بيول. 2009;166(2):205-213.

63. بيترسن إي إف، وآخرون. UCSF Chimera--نظام تصوري للبحث والتحليل الاستكشافي. ي حساب الكيمياء. 2004;25(13):1605–1612.

64. البنجاني أ، وآخرون. التحسين غير الموحد: يعمل التنظيم التكيفي على تحسين إعادة بناء جسيم البرد الواحد. طرق نات. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: تحديد وتصحيح CTF في الوقت الحقيقي. J ستركت بيول. 2016;193(1):1–12.

66. زيفانوف ج، وآخرون. أدوات جديدة لتحديد بنية EM بالتبريد عالي الدقة تلقائيًا في RELION -3. إليفي. 2018;7:e42166.

67. كاسانال أ، وآخرون. التطورات الحالية في coot لبناء النموذج الجزيئي للفحص المجهري الإلكتروني والبيانات البلورية. علوم البروتين. 2020;29(4):1069–1078.

68. فرينز ب، وآخرون. إصلاح الأخطاء في هياكل البروتين السكري تلقائيًا باستخدام رشيد. بناء. 2019;27(1):134–139.

69. كلاهولز بي بي. استخلاص وصقل النماذج الذرية في علم البلورات والتجميد EM: أحدث أدوات Phenix لتسهيل تحليل البنية. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(نقطة 10):878–881.

70. بيترسن إي إف، وآخرون. UCSF ChimeraX: تصور الهيكل للباحثين والمعلمين والمطورين. علوم البروتين. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z، Minor W. معالجة بيانات حيود الأشعة السينية التي تم جمعها في وضع التذبذب. طرق الانزيمول. 1997;276:307–326.

72. مكوي AJ، وآخرون. برنامج فيزر البلوري. تطبيق J Crystallogr. 2007;40(نقطة 4):658-674.

73. تشيانغ م، وآخرون. تم اختيار الأجسام المضادة المحايدة لفيروس السارس CoV-2 من مكتبة الأجسام المضادة البشرية التي تم إنشاؤها منذ عقود. Adv Sci (وينه). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P، Cowtan K. Coot: أدوات بناء النماذج للرسومات الجزيئية. اكتا كريستالوجر دي بيول كريستالوجر. 2004;60(نقطة 12 نقطة 1):2126-2132.

75. آدامز بي دي، وآخرون. PHENIX: نظام شامل قائم على لغة بايثون لحل البنية الجزيئية. اكتا كريستالوجر دي بيول كريستالوجر. 2010;66(نقطة 2):213-221.

76. مونتيل جارسيا د، وآخرون. Epitope-Analyzer: أداة ويب قائمة على البنية لتحليل الحواتم المحايدة على نطاق واسع. J ستركت بيول. 2022;214(1):107839.