SLC37A2، جزيء مرتبط بالفوسفور يزيد في خلايا العضلات الملساء في الأوركا المتكلسة

تكلس الأوعية الدمويةيعد مصدرا رئيسيا لأمراض القلب والأوعية الدمويةفي المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن.فرط فوسفات الدميؤدي إلى زيادة تدفق الفوسفور داخل الخلايا، مما يؤدي إلى زيادة في الخلايا الشبيهة بانيات العظم في خلايا العضلات الملساء الوعائية. PiT-1 يعبر الفوسفات في خلايا العضلات الملساء الوعائية. ومع ذلك، فإن آلية تكلس الأوعية الدموية ليست مفهومة تماما. بحثت هذه الدراسة في الجزيئات المرشحة المرتبطة بالفوسفور بخلاف PiT-1. افترضنا أن الجزيئات المرتبطة بالفوسفور تنتمي إلىالناقل المذاب(SLC) ستشارك العائلة الفائقة في تكلس الأوعية الدموية. نتيجة لتحليل ميكروأري الحمض النووي، ركزنا على SLC37A2 وأظهرنا أن تعبير mRNA لهذه الخلايا زاد على خلايا العضلات الملساء الأبهرية المتكلسة (AoSMC). تم الإبلاغ عن أن SLC37A2 ينقل كلاً من تبادلات الجلوكوز-6-الفوسفات/الفوسفات والفوسفات/الفوسفات. أظهر التحليل المختبري أن تعبير SLC37A2 لم يتأثر بالالتهاب في AoSMC. زاد التعبير عن SLC37A2 mRNA والبروتين في AoSMC المكلس. في الجسم الحي، أظهر التحليل أن تعبير SLC37A2 mRNA في الشريان الأورطيفشل كلوي مزمنارتبطت الفئران بجينات علامة العظم. علاوة على ذلك، تم التعبير عن SLC37A2 في منطقة تكلس الأوعية الدمويةالفئران المصابة بأمراض الكلى المزمنة. ونتيجة لذلك، أظهرنا أن SLC37A2 هو أحد الجزيئات التي تزيد معتكلس الأوعية الدمويةفي المختبر وفي الجسم الحي.

الكلمات الدالة: SLC37A2،تكلس الأوعية الدموية، خلايا العضلات الملساء الأبهري،فشل كلوي مزمن, فرط فوسفات الدم

انقر هنا للحصول على مستخلص سيستانش عضوي طبيعي يحتوي على 25% من الإكيناكوسيد و9% أكتيوسايد لوظيفة الكلى.

الخدمة الداعمة لشركة Wecistanche - أكبر مصدر للسيستانش في الصين:

البريد الإلكتروني:wallence.suen@wecistanche.com

واتساب/هاتف:+86 15292862950

تسوق لمزيد من تفاصيل المواصفات:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

كما بلغ عدد المرضىفشل كلوي مزمن(CKD) يزيد عدد المرضىتتطلب غسيل الكلىسوف تزيد كذلك. معظم الوفيات في المرضى الذين يخضعونغسيل الكلىبسببأمراض القلب والأوعية الدمويةمثلفشل القلب, اضطرابات الأوعية الدموية الدماغية، أو احتشاء عضلة القلب. (،٢) مصدر رئيسيأمراض القلب والأوعية الدمويةهو تكلس خارج الرحم، وهو خلل ناتج عن تكوين وترسب بلورات فوسفات الكالسيوم في الأنسجة الرخوة. (4 6) عوامل مختلفة مثل الالتهابات. الإجهاد التأكسدي، والزيادات في مستويات الكالسيوم (Ca) والفوسفور (P) في البلازما تشارك في تطور تكلس الأوعية الدموية. من بين هذه العوامل، يرتبط فرط فوسفات الدم بقوة بتكلس الأوعية الدموية. (7.8) يحدث فرط فوسفات الدم بسبب الإفراط في تناول الفسفور في ظل انخفاض وظائف الكلى. لذلك، يحتاج المرضى الذين يخضعون لغسيل الكلى إلى الحد من تناول P. (79-12) ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن ذلكتكلس الأوعية الدمويةيتقدم بالفعل عند بدء غسيل الكلى؛ وقد شوهد أيضًا في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن في مرحلة مبكرة عندما لا يكون فرط فوسفات الدم واضحًا. (3) وبالتالي، من المهم منع تكلس الأوعية الدموية لدى المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن في مرحلة مبكرة لتحسين تشخيص الحياة.

مما يؤدي إلى زيادة تدفق P إلى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMC). يتم تنفيذ تدفق P عبر PiT-1، وهو ناقل على سطح غشاء الخلية لـ VSMC. PiT- هو عضو في فصيلة الناقلات المذابة (SLC)، والتي تتضمن ناقل فوسفات الصوديوم المشفر بواسطة SLC20A1.04 PiT- ينقل الفوسفات عبر أغشية الخلايا المعتمدة على Na وبالتالي تمعدن المصفوفة بسبب ارتفاع مستويات p) كما هو داخل الخلايا تزداد مستويات P، ويبدأ VSMC في التعبير عن عوامل النسخ العظمية، مثل عامل النسخ المرتبط بالرونت 2(Runx2)(16). ويتبع هذا التأثير زيادة في التعبير عن الجينات الخاصة بالأوستيوبونتين، مثل الأوستيوبونتين والأوستيوكالسين. بالإضافة إلى ذلك، تقليل التعبير عن البروتينات الخاصة بالعضلات الملساء. مثل بروتين العضلات الملساء 22-0 (SM22-0)، يحدث. ونتيجة لذلك، يتحول VSMC إلى خلايا تشبه الخلايا العظمية. (1718) أظهرت الدراسات السريرية الحديثة أن مستويات الكالسيوم في الدم. تزداد جزيئات البروتين (CPP)، التي تمثل جزيئات فوسفات الكالسيوم الغروية، مع انخفاض وظائف الكلى. (19-21) علاوة على ذلك، تم الإبلاغ عن الارتباطات مع مستويات CPP وP في الدم.2o2i) من الممكن أن يؤدي CpP إلى تحفيز تطور تكلس الأوعية الدموية. 22-24)

ومع ذلك، فقد لوحظ تكلس الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن في مرحلة مبكرة مع مستويات P الطبيعية في البلازما. (13) بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن PiT-1 mRNA في كل مكان في جميع الأنسجة. وبالتالي قد يعمل جزيء آخر بشكل أساسي في منطقة تكلس الأوعية الدموية. هناك تقارير تفيد بأناشتعاليعزز تكلس الأوعية الدموية. العوامل الالتهابية مثل الإنترلوكين (IL)-1B، IL-6، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-a) الناجم عن تمايز VSMC إلى خلايا تشبه الخلايا العظمية (2s26) TNF-a يستحث تكلس الأوعية الدموية من خلال مسار cAMP، الذي يلعب دورًا في تمايز الخلايا العظمية. 2728) ينظم IL-6 مسارات مختلفة تؤدي إلى تكلس الأوعية الدموية لـ VSMC2-31) علاوة على ذلك. IllB، IL-6، وTNF-a هي أيضًا عوامل مرتبطة بزيادة تكلس الأوعية الدموية الناجم عن ارتفاع مستويات p.3233) ومع ذلك. البيانات الحالية لا تشرح بشكل كامل آلية الأوعية الدموية

التكلس الناجم عن هذه العوامل. لقد افترضنا أنه قد تكون هناك جزيئات أخرى مرتبطة بـ P مثل تلك الموجودة في فصيلة SLC الفائقة، المشاركة في تكلس الأوعية الدموية. ركزنا على البروتينات الغشائية في عائلة SLC الفائقة وقمنا بالتحقيق في الجزيئات المحتملة المرتبطة بـ P بخلاف PiT -1 للمشاركة في تكلس الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، قمنا بفحص العلاقة بين الجزيئات المرشحة وتكلس الأوعية الدموية في الفيديو وفي الجسم الحي.

المواد والأساليب

زراعة الخلايا. تم الحصول على خلايا العضلات الملساء البشرية الطبيعية (AoSMC) من Lonza (بازل، سويسرا) وتم زراعة AoSMC وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم الحفاظ على AoSMC في وسط النمو (الوسط القاعدي للخلايا العضلية الملساء المكمل بـ 5٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS)، وعامل نمو البشرة، والأنسولين، وعامل نمو الخلايا الليفية-B، والجنتاميسين / الأمفوتريسين-B). تم تغيير وسائل الإعلام كل يوم. تمت زراعة AoSMC في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة وتم الحفاظ عليها حتى الوصول إلى التقاء ثم استخدامها في التجارب.

AoSMC المكلس تم إحداث تكلس AoSMC كما هو موضح سابقًا. 435) تم زراعة AOSMC في وسط النسر المعدل في Dulbecco المكمل بـ 15٪ FBS والبنسلين - الستربتومايسين وتم تربيته بـ 2.6 ملي مولار P لمدة 3 و6 و9 و12 و14 يومًا. تم ضبط تركيز P بواسطة P bufferNaH وPO/Na وHPO. الرقم الهيدروجيني 7.2). لم يتم استزراع AoSMCs الأخرى بـ 2.6 مم P.

ميكروأري الحمض النووي. تم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) لعينات AoSMC المستنبتة وغير المستنبتة بـ 2.6 مم P. تم تحليل إجمالي RNA 5.0 ميكروغرام باستخدام مصفوفة DNA الدقيقة (Agilent Technologies، Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. تم استخدام 2 ميكروأري لفحص حوالي 26,000 جينًا. تم حساب النسبة عن طريق قسمة مستوى التعبير لـ AoSMC المستنبت بـ 2.6 مم لمدة 12 يومًا على مستوى التعبير لـ AoSMC غير المثقف بـ 2.6 مم P

ميكروأري الحمض النووي

تم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) لعينات AoSMC المستنبتة وغير المستنبتة بـ 2.6 مم P. تم تحليل إجمالي RNA 5.0 ميكروغرام باستخدام مصفوفة DNA الدقيقة (Agilent Technologies، Tokyo. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. تم استخدام 2 ميكروأري لفحص حوالي 26,000 جينًا. تم حساب النسبة عن طريق قسمة مستوى التعبير على AoSMC المستنبت بـ 2.6 مم لمدة 12 يومًا على مستوى التعبير على AoSMC غير المستنبت مع 2.6 مم P.Expression لـ SLC37A2 في التهاب الأوعية الدموية. للحث على الاستجابة الالتهابية في AoSMC، تم زراعة الخلايا باستخدام وسط النمو حتى وصلت إلى نقطة التقاء ثم تمت معالجتها بـ 1 ميكروغرام من عديد السكاريد الدهني (LPS) (LPS من الإشريكية القولونية O111: B4؛ سيجما، سانت لويس، MO) لمدة 24 و 72 بدون 2.6 مم P. لم يتم زراعة AoSMC الأخرى من خلال تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من AoSMC المعالج بـ LPS لمدة 24 و 72 ساعة والخلايا غير المعالجة بـ LPS. تم إجراء SYBR الكمي في الوقت الحقيقي PCR باستخدام cDNA المركب ومجموعة تمهيدية مناسبة لكل جين مستهدف مع نظام PCR في الوقت الحقيقي aStepOnePlus (Applied Biosystems، FosterCity، CA). كانت التسلسلات التمهيدية كما يلي: Human IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' و 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'؛ الإنسان SLC37A2،5TCACTTTAGTGCCCAAGGAGGC -3' و 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG -3'؛ تم حساب مستويات التعبير جليسيرالديهايد -3- هيدروجيناز الفوسفات (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- و5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 وSLC37A2 mRNA بعد التطبيع باستخدام GAPDH. تعبير SLC37A2 في المتكلسة. AoSMC تم استخراج المجموع من AoSMC غير المستنبت بخلايا 2.6 مم P و AoSMC المستزرعة بـ 2.6 مم P لمدة 3 و 6 و 9 و 12 و 14 يومًا. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام cDNA المركب. وكانت تسلسلات التمهيدي كما يلي يلي: Human Runx2 و5-TGAGAGCCGCCTTCCAACCC-3' و5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. تم ​​حساب مستويات التعبير Runx2 وSLC37A2 mRNA بعد التطبيع باستخدام APPH.

تحليل النشاف الغربي.

تم جمع البروتين الكلي من عينات AoSMC المستزرعة تحت نفس الظروف المستخدمة لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. تم تحليل هذه العينات باستخدام محلول ملحي Tris (الرقم الهيدروجيني 75) مكمل بـ 5% NP-40 وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 1%. تم قياس عينات تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA (Thermo FisherScientific.Waltham، MA). وتم ضبط التركيز عن طريق النشاف الغربي، وتم فصل 10 ميكروغرام من البروتين في هلام بولي أكريلاميد 10٪ باستخدام الفصل الكهربائي لجيل دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم. تمت معالجة الغشاء باستخدام الجسم المضاد SLC37A2 (Novus Biologicals، Centennial، CO) أو الجسم المضاد GAPDH (GeneTex، Irvine، CA) كأجسام مضادة أولية، تم تحضينه مع الجسم المضاد المصاحب لـ Rabbit lgG Horseradish peroxidase (R&D Systems، Minneapolis، MN) باعتباره الجسم المضاد الثانوي. وتصور باستخدام Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire، England) ومحلل الصور الانارة (LAS -1000 plus، FUNIFILM، Tokyo، Japan). تم قياس كمية الفرقة باستخدام lmagel.

تجريبي

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة هيوغو، كلية العلوم الإنسانية والبيئة. تم شراء فئران Sprague-Dawley البالغة من العمر اثني عشر أسبوعًا من Japan SLC (شيزوكا ، اليابان). تم الحفاظ على الفئران في دورة مظلمة 12- فاتحة و12- ساعة (09:00-21:00) وسمح لها بالوصول المجاني إلى الطعام والمياه النقية للغاية.

تشتمل الأنظمة الغذائية التجريبية على نظام غذائي تحكم P (1.0% P, 0.6Ca, 20% بروتين)، نظام غذائي الأدينين (0.75% أدنين ، 1.0% P، 0.6%Ca، 2.5% بروتين)، نظام غذائي منخفض P (LP) (0.2% P،0 .6% كالسيوم، 10% بروتين)، واتباع نظام غذائي عالي الفسفور (HP) (1.0% ف، 0.6% كالسيوم، 10% بروتين) يعتمد على نظام AIN93-G الغذائي (الشرقي) الخميرة، طوكيو، اليابان) مع الكازين كمصدر للبروتين. 3637) تم الإبلاغ عن اتباع نظام غذائي منخفض البروتين لتعزيز تكلس الأوعية الدموية في الجرذان المصابة بالفشل الكلوي الناجم عن الأدينين، لذلك تم إجراء تقييد البروتين. 3738) قبل التجميع، جميع الفئران (ن)=23) تم تغذيتهم بنظام غذائي قياسي (الخميرة الشرقية) لمدة أسبوع للتأقلم. عند عمر 13 أسبوعًا، تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين: المجموعة الضابطة (ن=5) ومجموعة مرض الكلى المزمن الناجم عن الأدينين (ن=18). تلقت المجموعة الضابطة النظام الغذائي P لمدة 6 أسابيع. . تلقت مجموعة CKD المستحثة بالأدينين نظام الأدينين الغذائي لمدة 3 أسابيع تقريبًا ثم تم تقسيمها بعد ذلك إلى مجموعتين فرعيتين: مجموعة CKD-LP (n=8) أو مجموعة CKDHP (n=10). تلقت فئران مجموعة CKD-LP ومجموعة CKD-HP نظام LP الغذائي ونظام HP الغذائي لمدة 3 أسابيع، على التوالي خلال الفترة التجريبية، وتم تسجيل تناول الطعام يوميًا. خلال النظام الغذائي الأدينين، تم جمع عينات الدم من الوريد الذيل بين الساعة 10:00 صباحًا و11:00 صباحًا مرة واحدة في الأسبوع حتى الأسبوع الثاني، وبعد ذلك مرة كل يومين لمراقبة مستويات البلازما. أثناء اتباع نظام غذائي LP أو نظام HP الغذائي، تم جمع عينات الدم مرة واحدة في الأسبوع. تم جمع عينات البول وتسجيل حجم البول مرة واحدة كل أسبوع. تم التضحية بالفئران باستخدام مخدر باستخدام الأيزوفلورين (شركة واكو بيور للصناعات الكيماوية. أوساكا اليابان) وفتحات البطن. تم جمع عينات الدم المأخوذة من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي الصدري البطني لتحليلها.

تعبير SLC37A2 على الشريان الأورطي.

تم استخدام ما يقرب من ثلث الشريان الأورطي الصدري البطني الذي تم جمعه لتصور التكلس وإجراء تلطيخ المناعة. تم تضمين الشريان الأورطي في البارافين وتم قطع 4-أجزاء منه. تم تلطيخ المقاطع باستخدام طريقة Von Kossa لمجموعة الكالسيوم (Polysciences. Warrington، PA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء تحليل المناعي مع المقاطع التسلسلية. تم تحضين المقاطع بالجسم المضاد SLC37A2 طوال الليل عند درجة 4 ثم تمت معالجتها باستخدام Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences، طوكيو، اليابان) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تمت معالجة المقاطع باستخدام مجموعة DABsubstrate (Nichirei).

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من بقية الشريان الأورطي الصدري البطني المتجمد. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي باستخدام [كدنا] المركب. كانت تسلسلات التمهيدي كما يلي: الفئران osteo-pontin، 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC -3' و 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC -3' و؛ الفئران SLC37A2، 5- TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG -3' و 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG -3. تم ​​حساب مستويات التعبير mRNA و SLC37A2 mRNA بعد التطبيع باستخدام GAPDH

تحليل احصائي.

يتم تقديم البيانات على أنها متوسط ​​+ SE. وقد تم تحليل الاختلافات بين المجموعات باستخدام اختبار t. في تجارب AoSMC المتكلسة الناجمة عن الفوسفات، تم تحليل الاختلافات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه متبوعًا بطريقة دونيت. في تجارب نموذج CKD، تم تحليل الاختلافات باستخدام اختبار K ruskal-Wallis متبوعًا بطريقة Steel-Dwass. تم تحديد معاملات الارتباط (rs) باستخدام اختبار رتبة معامل الارتباط لسبيرمان. لجميع الاختبارات. قيم p ثنائية الذيل<0.05 were considered statistically significant.