دراسة آثار الكالسيتريول المضادة للشيخوخة على الخلايا القاتلة الطبيعية للإنسان في المختبر

خلاصة

يعتبر على نطاق واسع أن فيتامين (د) له تأثير تنظيمي على جهاز المناعة. أظهرت بعض التحقيقات السريرية أن الطلب علىيزيد فيتامين د مع تقدم العمر. الكالسيتريول هو الشكل النشط بيولوجيافيتامين د. ومع ذلك ، فإن تأثيره على الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية (NK) لا يزال غير واضح. لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في تأثيرات الكالسيتريول المضادة للشيخوخة والتأثير المناعي على الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام سلسلة من الأساليب المناعية لاستكشاف دورها المهم في المناعة الفطرية. وجدنا أن الكالسيتريول عكس التعبير عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا القاتلة الطبيعية وأعاق توسعها عن طريق الحفاظ على هذه الخلايا في المرحلة G1 ، دون أي موت الخلايا المبرمج أو الإرهاق. منع الكالسيتريول إطلاق السيتوكينات المرتبطة بالالتهاب ، مثل إنترلوكين -5 (IL -5) ، إنترلوكين -13 (IL -13) ، إنترفيرون جاما (IFN-) ، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-). تم تقليل تحلل الخلايا القاتلة الطبيعية بواسطة الكالسيتريول عندما تمت زراعة هذه الخلايا بشكل مشترك مع الخلايا السرطانية K562. وجدنا أيضًا أن الكالسيتريول ينظم مسار سيرتوين المرتبط بالشيخوخة 1- بروتين / كيناز R-like endoplasmic reticulum kinase (SIRT1 / pERK) ومسار SIRT 1- deltaExon8 (SIRT 1- ∆Exon8) عن طريق تنشيط مستقبلات فيتامين د (VDR). علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الكالسيتريول منظمًا سلبيًا محتملًا لخلية NKموت الخلايا المبرمجوتعطيل الميتوكوندرياالذي يسببهالاكسدة. وهكذا ، يعرض الكالسيتريولآثار مكافحة الشيخوخةعلى الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية في المختبر عن طريق تنشيط محور SIRT 1- ومقاومة الشيخوخة التأكسدية.

انقر هنا للحصول على مكملات مكافحة الشيخوخة من سيستانش

1 المقدمة

لقد وجدت العديد من الدراسات أن الشيخوخة لها تأثير مباشر على العديد من الأمراض ، مثل الأمراض المعدية ، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، والأمراض العصبية التنكسية ، واضطرابات المناعة الذاتية ، والسرطان. شيخوخة الكائن الحي تصاحبها مناعة. تشمل السمات المشتركة للشيخوخة بشكل رئيسي الشيخوخة الملتهبة مع التهاب منخفض مزمن [1] ، وعدم استقرار الجينوم ، واختلال في التعبير البروتيني ، وتعطيل الميتوكوندريا ، والشيخوخة الخلوية ، والتغيرات في التواصل بين الخلايا [2]. بصفتها المكون الرئيسي للمناعة الفطرية ، تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية دورًا مهمًا في مكافحة العدوى والتأثيرات المضادة للأورام بالإضافة إلى تنظيم جهاز المناعة [3]. يمكن للخلايا القاتلة الطبيعية القضاء على الخلايا المستهدفة مباشرة أو عن طريق السمية الخلوية المعتمدة على الجسم المضاد (ADCC) ، بدلاً من إظهار أي استجابات خاصة بالمستضد أو الجسم المضاد [4]. ترتبط الخلايا القاتلة الطبيعية أيضًا بتفاعلات فرط الحساسية وأمراض المناعة الذاتية [5]. عندما يتقدم الجهاز المناعي في العمر ، فإن التعبير عن مستقبلات التنشيط السطحي مثل المجموعة القاتلة الطبيعية 2 العضو D (NKG2D) [6] ، مستقبلات تشبه الغلوبولين المناعي القاتل (KIR) ، مجموعة العلامات السطحية للتمايز 57 (CD57) [7] ، زادت مجموعة التمايز 16 (CD16) [8]. يمكن لهذا الجزيء أن ينشط وظيفة قتل الخلايا القاتلة الطبيعية ، مما قد يؤدي إلى اختلال التوازن الخلوي والالتهاب في كبار السن. وفي الوقت نفسه ، انخفضت الجزيئات المثبطة للخلايا القاتلة الطبيعية مثل المجموعة القاتلة الطبيعية 2 العضو A (NKG2A) ، والمجموعة القاتلة الطبيعية 2 العضو C (NKG2C) ، ومستقبلات السمية الخلوية الطبيعية (NCRs) [6]. العلامات الأخرى المرتبطة بالشيخوخة للخلايا القاتلة الطبيعية هي الغلوبولين المناعي للخلايا التائية والبروتين 3 الذي يحتوي على نطاق الميوسين (TIM3) وزيادة موت الخلايا المبرمج -1 (PD -1). قد يؤدي تنظيم PD -1 و TIM3 أثناء التورم المناعي إلى تثبيط وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية ويؤدي إلى استنفاد الخلايا القاتلة الطبيعية [9].

هناك عامل آخر يؤدي إلى الإصابة بالضعف المناعي وهو الالتهاب المناعي [10]. تم الإبلاغ عن مستويات عالية من السيتوكينات الالتهابية التي تطلقها الخلايا القاتلة الطبيعية لتسبب تلف الحمض النووي ، والإجهاد التأكسدي ، وشيخوخة الخلايا. علاوة على ذلك ، قد يؤدي عدم التوازن الخلوي للخلايا القاتلة الطبيعية وحالة الالتهاب إلى الإصابة بأمراض المناعة الذاتية [11]. مستويات إنترلوكين -1 (IL -1) ، إنترلوكين -4 (IL -4) ، إنترلوكين -6 (IL -6) ، إنترلوكين -10 (IL -10) ، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-) أعلى لدى كبار السن [12]. على الرغم من انخفاض عدد الخلايا المناعية الكلية مع تقدم العمر ، إلا أن عدد الخلايا القاتلة الطبيعية زاد بشكل ملحوظ ، والذي قد يكون ناتجًا عن تسلل الخلايا الالتهابية [13].

يوجد فيتامين د في شكلين نشطين في جسم الإنسان مثل فيتامين د 2 (إرغوكالسيفيرول) وفيتامين د 3 (كالسيتريول). تتمثل الوظيفة الأساسية لفيتامين د في تعزيز امتصاص الكالسيوم والفوسفور. ينظم فيتامين د أيضًا وظائف المناعة [14]. على الرغم من أن العديد من التقارير قد ركزت على وظائفه المضادة للعدوى والمضادة للأورام [15] ، إلا أن الكالسيتريول يُظهر تأثيرات مضادة للالتهابات أيضًا [16]. يتم التعبير عن مستقبلات فيتامين د (VDR) في خلايا مناعية مختلفة [17]. يساهم انخفاض إنتاج السيتوكينات الالتهابية في تقليل التفاعلات الالتهابية. من المعروف أن الكالسيتريول يثبط إنتاج TNF- و interleukin -1 (IL -1) و interleukin -2 (IL -2) و interferon-gamma (IFN-) و السيتوكينات الالتهابية الأخرى في الخلايا البائية والتائية. ويمكنه أيضًا إطلاق السيتوكينات المضادة للالتهابات مثل IL -4 و IL -10 [18] وتنظيم الالتهام الذاتي ضد تسلل الخلايا الالتهابية [19].

تم الإبلاغ عن الخصائص المضادة للأكسدة في الكالسيتريول في الاكتئاب ، وأمراض الكبد الدهنية [20] ، وأمراض القلب والأوعية الدموية ، وغيرها من الأمراض المرتبطة بالالتهاب. تتراكم الجذور الحرة وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أيضًا في الخلايا والأنسجة أثناء الشيخوخة. أظهرت البيانات المنشورة أن الإجهاد التأكسدي يؤثر على مجموعة متنوعة من مسارات الإشارات في الخلايا [21] ، بما في ذلك مسارات SIRT1 والبروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) ومسارات العامل النووي B (NF-B). يعتبر الجين SIRT1 بمثابة جين طول العمر ويؤدي قمع هذا الجين إلى اضطرابات متعلقة بتعبير البروتين ودورة الخلية والتمثيل الغذائي [22]. SIRT 1- ΔExon8 هو شكل إسوي جديد لـ SIRT1 ، والذي كان موجودًا في الثدييات عن طريق التضفير بدلاً من ذلك. تم اعتبار SIRT 1- ΔExon8 أيضًا كعامل تنظيمي مشترك لـ SIRT1 كامل الطول [23].

حتى الآن ، تركز دراسات قليلة جدًا على آثار الشيخوخة والشيخوخة التأكسدية على الخلايا القاتلة الطبيعية. لم يتم الإبلاغ عن تأثيرات الكالسيتريول على SIRT 1- ΔExon8 أيضًا. لذلك هدفت هذه الدراسة إلى معرفة تأثير مادة الكالسيتريول على الشيخوخة والشيخوخة التأكسدية للخلايا القاتلة الطبيعية ، حيث تحتل هذه الخلايا موقعًا مركزيًا في الجهاز المناعي الفطري للإنسان.

2. المواد والأساليب

2.1 ثقافة الخلية والكواشف

تم الحصول على ثلاث عينات من الدم المحيطي البشري من المتبرعين الذين لم يكن لديهم أي مرض مناعي ذاتي نشط ، أو مرض التهابي حاد أو مزمن ، أو سرطان ، أو أمراض أخرى مرتبطة بالمناعة. تراوحت أعمار المتبرعين من 48 إلى 65 سنة. تم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) باستخدام Lymphoprep Ficoll. تم توسيع خلايا NK وصيانتها باستخدام NK Cell Culture Kit (MoreCell ، Shenzhen ، الصين) عند 37 درجة / 5 بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

2.2 تحليل التدفق الخلوي

بعد العلاج بالكالسيتريول لمدة 72 ساعة ، تم تلوين الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام FITC-CD3 المضاد للإنسان ، و PerCp-CD56 ، و APC-CD16 ، و PE-NKG2A ، و PE-TIM3 ، و PE-PD1 ، و PE-KIR (BioLegend ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء جميع فحوصات FACS باستخدام مقياس التدفق الخلوي DxFLEX (بيكمان ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.3 قياس تمدد الخلية ، وإطلاق السيتوكين ومقايسة دورة الخلية

تم تحديد تمدد الخلية باستخدام مجموعة عد الخلايا -8 [24] (CCK8 ؛ Beyotime ، شنغهاي ، الصين). عولجت الخلايا القاتلة الطبيعية بالكالسيتريول لمدة 48 ساعة وتم جمع المادة الطافية لمقايسة إطلاق السيتوكين. تم فحص مستويات السيتوكين باستخدام لوحة LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). أولاً ، تم تحضين حبات التقاط السيتوكين بالمعايير أو العينات ثم تم تحضينها بأجسام مضادة للكشف عن البكتيريا. تمت إضافة محلول ربط الجسم المضاد للكشف الحيوي ، الستربتافيدين (SA) -PE ، لاحقًا لتوفير إشارة الفلورسنت [25]. ثم تم تحليل هذه الإشارات باستخدام اختبار FACS.

تم قياس دورة الخلية باستخدام مجموعة الكشف عن دورة الخلية (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين). عولجت الخلايا القاتلة الطبيعية بالكالسيتريول لمدة 72 ساعة. تم تثبيت هذه الخلايا في 70 في المائة من الإيثانول المثلج ثم صبغها باستخدام ريبونوكلياز A (RNase A) ويوديد البروبيديوم (PI) (Beyotime ، شنغهاي ، الصين) [26].

2.4 مقايسة قتل الخلايا القاتلة الطبيعية

تم تحضين خلايا الكريات الحمر البشرية ، خلايا K562 (ATCC ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، بـ 10 ميكرومتر 3 ، 3 - ثنائي أوكتاديسيل-أوكساكاربوسيانين (DIOBeyotime ، شنغهاي ، الصين) لمدة 15 دقيقة ثم إضافتها إلى خلايا NK المعالجة بالكالسيتريول بنسب مختلفة (E / T '= 1: 1 ، 5: 1 و 10: 1) لمدة 4 ساعات ، على التوالي (27].

2.5 تحريض الشيخوخة التأكسدية وتحليل تلطيخ X-gal

نموذج شيخوخة الخلايا في المختبر NK باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H2O2). من أجل تحديد التأثير المضاد للأكسدة للكالسيتريول ، عولجت الخلايا القاتلة الطبيعية أولاً بالكالسيتريول ثم تعرضت لـ 100 ميكرومتر من H O لمدة 24 ساعة. تم قياس نشاط -galactosidase باستخدام تلطيخ 5- برومو -4- كلورو -3- indolyl - - D-galactopyranoside (X-gal). تم إصلاح الخلايا المعالجة في بارافورمالدهيد بنسبة 4 في المائة وملطخة بمحلول تلطيخ الجالاكتوزيداز (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين) طوال الليل عند 37 درجة [28]. تم بعد ذلك تعليق الخلايا الملطخة في برنامج تلفزيوني وتم الحصول على صور لهذه الخلايا باستخدام نظام مجهر لايكا الانعكاسي. تم جمع ثلاث صور مجهرية بشكل عشوائي من مواقع مختلفة بمعدل تكبير 40 × لكل مجموعة. تم حساب النسبة المئوية للخلايا الملطخة بـ X-gal واستخدامها لتقييم شيخوخة الخلايا باستخدام برنامج ImageJ V.1.45S.

2.6 تلطيخ وتحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا

تم استخدام Chloromethyl-X-Rosamine (CMXRos) و Hoechst (Beyotime ، شنغهاي ، الصين) لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا. تم تحديد نواة الخلية (الزرقاء) بواسطة تلطيخ Hoechst ، بينما تم تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا من خلال خصوصية الميتوكوندريا التي تشير إلى صبغة الفلورسنت ، CMXRos. أظهرت خلايا Hoechst plus CMXRos (المميزة بأسهم بيضاء) نشاطًا منخفضًا. تم حساب مستوى التألق النسبي بقسمة عدد خلايا هويشت الإيجابية على الخلايا الإيجابية لـ CMXRos [29]. تم تحضين الخلايا باستخدام 200 نانومتر CMXRos و Hoechst (30 دقيقة ، 37 درجة) واكتشافها باستخدام مجهر لايكا المقلوب بأطوال موجية مثيرة تبلغ 579 نانومتر و 350 نانومتر. تم حساب النسبة المئوية لخلايا Hoechst plus CMXRos plus كما هو موضح في القسم 2.5.

2.7 النشاف الغربي

تم تحلل الخلايا باستخدام مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) محلول تحلل (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين) مع مثبط الفوسفاتيز PhosSTOP (روش ، بازل ، سويسرا) و 1 ميكرومتر من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) (بيوتايم ، شنغهاي ، الصين). تم قياس كمية البروتين الكلي باستخدام Bradford Protein Assay Kit (TAKARA ، طوكيو ، اليابان). تم فصل عينات البروتين بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الدوديسيل كبريتات-بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ونقلها إلى 0. 22 ميكرومتر من أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (غشاء Immobilon-P ؛ ميليبور ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد الانسداد ، تم فحص الأغشية بالأجسام المضادة الأولية واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية [30]. تم الكشف عن الأغشية باستخدام نظام Odyssey (LI-COR ، نبراسكا ، الولايات المتحدة الأمريكية).

2.8 التحليل الإحصائي

تم تحليل البيانات عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام GraphPad Prism وتم تقديمها على أنها متوسط ​​± الانحراف المعياري (SD). 6846 W. LI ET AL: تم اعتبار الاختلافات ذات دلالة إحصائية في P <0. 05. تم تحليل النتائج أيضًا باستخدام برنامج GraphPad.

يطلب المزيد:

البريد الإلكتروني: wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950