التحديد والمقارنة المنهجيان للملفات الشخصية المُعبَّر عنها لجزيئات الإكسوسومال MiRNA في الخنازير المصابة بـ NADC30-مثل سلالة PRRSV

ملخص بسيط:تلعب الإكسوسومات دورًا فريدًا في الإصابة بالفيروسات، وعرض المستضد، وقمع/تعزيز مناعة الجسم. يعد فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) أحد أكثر مسببات الأمراض ضررًا في صناعة الخنازير. هنا، استخدمنا PRRSV NADC30-مثل سلالة CHsx1401 لإصابة 42-الخنازير بعمر يوم واحد بشكل مصطنع، وعزل exosomes المصل، وتحديد 33 miRNA exosomal معبر عنها بشكل تفاضلي (DE) بين مجموعات العدوى والسيطرة، و تم فحص 18 DE miRNAs المرتبطة بعدوى PRRSV والمناعة كجزيئات وظيفية محتملة تشارك في تنظيم عدوى فيروس PRRSV بواسطة exosomes.

خلاصة:الإكسوسومات عبارة عن حويصلات بيولوجية تفرزها وتطلقها الخلايا التي تعمل كوسيط للتواصل بين الخلايا وتلعب دورًا فريدًا في عدوى الفيروس، وعرض المستضد، وقمع/تعزيز مناعة الجسم. يعد فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) أحد أكثر مسببات الأمراض ضررًا في صناعة الخنازير ويمكن أن يسبب اضطرابات إنجابية في الخنازير، وأمراض الجهاز التنفسي في الخنازير، وانخفاض أداء النمو، وغيرها من الأمراض التي تؤدي إلى وفيات الخنازير. في هذه الدراسة، استخدمنا سلالة PRRSV NADC30-مثل CHsx1401 لإصابة 42-الخنازير ذات العمر اليومي بالعدوى بشكل مصطنع وعزل الإكسوسومات المصلية. استنادًا إلى تقنية التسلسل عالي الإنتاجية، تم تحديد 305 miRNAs في exosomes المصل قبل وبعد الإصابة، من بينها 33 miRNAs تم التعبير عنها بشكل تفاضلي بين المجموعات (13 منتظمة نسبيًا و 20 منضبطة نسبيًا). حدد تحليل حفظ التسلسل لجينوم CHsx1401 8 مناطق محفوظة، منها ما مجموعه 16 miRNA معبرًا عنها تفاضليًا (DE) من المتوقع أن ترتبط بالمنطقة المحفوظة الأقرب إلى المناطق الثلاثة.0 UTR لجينوم CHsx1401، بما في ذلك 5 DE miRNAs القادرة على الارتباط بـ CHsx1401 30 UTR (ssc-miR -34 c، ssc-miR -375، ssc-miR -378، ssc-miR -486، ssc-miR -6529). كشف المزيد من التحليل أن الجينات المستهدفة من miRNAs المعبر عنها تفاضليًا كانت متورطة على نطاق واسع في مسارات الإشارات المرتبطة بوظيفة الإكسوسومات والمناعة الفطرية، و18 DE miRNAs (ssc-miR-4331-3p, ssc-miR-744 ، ssc-miR -320، ssc-miR -10 b، ssc-miR -124 a، ssc-miR -128، وما إلى ذلك) المرتبطة بعدوى PRRSV والمناعة. كجزيئات وظيفية محتملة تشارك في تنظيم عدوى فيروس PRRSV بواسطة الإكسوسومات.

نبات السيستانش - يعمل على زيادة جهاز المناعة

الكلمات الدالة:بي آر إس في؛ اكسوسوم المصل؛ ميرنا

1 المقدمة

فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) هو فيروس RNA إيجابي الجديلة ذو هيكل مغلف ينتمي إلى رتبة Nidovirales، عائلة Arteriviridae، جنس Betaarterivirus [1،2]. وهي كروية أو إهليلجية يبلغ قطرها 50-65 نانومتر تحت المجهر الإلكتروني المتجمد [3،4]. يبلغ طول جينوم PRRSV حوالي 15 كيلو بايت مع غطاء 50 وذيل 30 polyA ويحتوي على ما لا يقل عن 10 إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) محاطة بمناطق غير مترجمة (UTRs) عند كلا الطرفين 50 و30 [5،6] و يتم تغليفه ببروتين القفيصة النووية، مع طبقة دهنية مزدوجة لتكوين جزيئات الفيروس. تنتمي الإكسوسومات إلى حويصلات ذات هياكل غشائية أحادية الطبقة ولها نفس البنية الطوبولوجية للخلايا [7]. يكون الشكل "على شكل كوب" أو "على شكل قرص" تحت المجهر الإلكتروني [8،9]. يمكن أن تتواجد الإكسوسومات في الدورة الدموية لفترة طويلة، ويمكن امتصاص المواد الموجودة في الإكسوسومات بواسطة الخلايا المجاورة أو الخلايا المستقبلة البعيدة ومن ثم تنظيم الخلايا المستقبلة للمشاركة في تبادل المواد الوراثية بين الخلايا [10،11]. وهي تتكون أساسًا من مواد سطحية غشائية ومحتويات محمولة، بما في ذلك مستقبلات سطح الخلية، وبروتينات الغشاء، والبروتينات القابلة للذوبان، والدهون، والحمض النووي الريبي (mRNA، وmRNA، وlncRNA، والحمض النووي الريبي الفيروسي، وما إلى ذلك)، والحمض النووي الجينومي، والحمض النووي للميتوكوندريا [12-14]. ]. MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من 18-25 نيوكليوتيدات (nt) محفوظة تطوريًا من RNAs الصغيرة أحادية الجديلة غير المشفرة، والتي تمنع عملية الترجمة عن طريق تحفيز تدهور mRNA المستهدف أو عن طريق الارتباط بـ 30 UTR من mRNA المستهدف، مما يؤدي إلى لإسكات الجينات بعد النسخ، ثم تنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ [15-17]. تشير التقديرات إلى أن miRNAs تنظم أكثر من 60٪ من جينات الثدييات بعد النسخ [18،19]. تلعب MiRNAs دورًا مهمًا في الاتصال بين الخلايا ويمكن استخدامها أيضًا كجزيء وظيفي محتمل لعدوى المرض والفيروسات وانتقالها والدفاع [20]. أظهر عدد متزايد من الدراسات أن miRNAs يمكن أن تكون موجودة في سوائل الجسم، مثل اللعاب والبول وحليب الثدي والدم، وتعمل من خلال الجهاز الدوري للسوائل في الجسم [21،22]. تعتبر miRNAs Exosomal منظمات داخلية للتعبير الجيني والتمثيل الغذائي ويمكن أن تشير إلى حالات مرضية مختلفة [23،24].

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

على مدى العقدين الماضيين، ثبت أن miRNAs لها أدوار حاسمة في تنظيم تطور الخلايا المناعية، والاستجابات المناعية الفطرية، والاستجابات المناعية المكتسبة. تم الإبلاغ عن أن بعض miRNAs الأخرى تعمل على إضعاف عدوى PRRSV من خلال الطرق التالية، أو استهداف جينوم PRRSV أو مستقبل PRRSV مباشرة، أو تلعب دورًا من خلال تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية للمضيف. يمكن لعائلة miR-26 أن تلحق ضررًا كبيرًا بتكاثر الفيروس، ويمكن أن تمنع miR-26a تكرار سلالات النوع 1 والنوع 2 PRRSV في البلاعم السنخية الخنازير (PAMs) عن طريق تنظيم النوع الأول من الإنترفيرون (IFN) المسار، وهو أكثر كفاءة من miR-26b [25,26]. تم تحديد miR-30c وmiR-125b لتعديل الاستجابة المناعية الفطرية للمضيف من خلال استهداف مسار IFN من النوع الأول ومسار NF-κB، على التوالي [27-29]. MiR -23، وmiR -378، وmiR -505 هي عوامل مضيفة مضادة للفيروسات تستهدف PRRSV ولها مواقع مستهدفة محافظة في سلالات PRRSV من النوع 2 [30]. في الوقت نفسه، تم التعرف على المضيف miR-506 لمنع تكرار PRRSV عن طريق استهداف مستقبل PRRSV CD151 مباشرة في خلايا مارك -145 [31]. يمكن أيضًا أن يمنع miR -181 بشكل غير مباشر تكرار PRRSV عن طريق تنظيم مستقبلات PRRSV CD163 في حيدات الدم و PAMs [32]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للـ miRNAs تعزيز تكرار PRRSV عن طريق التدخل في فسيولوجيا الخلية الأساسية. يستهدف MiR -24-3 p و miR -22 بشكل مباشر 30 UTR من H O -1 أثناء عدوى PRRSV للهروب من تثبيط إنزيم الهيم أوكسجيناز -1 (H O -1)، أ بروتين الصدمة الحرارية (المعروف أيضًا باسم HSP32) على PRRSV [33،34]. من المعروف أن الخنازير أكثر عرضة للإصابة بفيروس PRRSV وأقل قدرة على الدفاع عن نفسها ضد دخول هذا العامل الممرض إلى الكائن الحي [35]. وفي الدراسة الحالية تمت دراسة المناعة الفطرية والمناعة المكتسبة للخنازير المصابة بهذا الفيروس على المستوى الجزيئي باستخدام السلالة السائدة في الحقل. تم استخدام مجموعة عزل الإكسوسومات المصلية، والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، واللطخة الغربية (WB) لعزل وتحديد الإكسوسومات المصلية قبل وبعد الإصابة بـ PRRSV، متبوعًا بتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) الصغير، وتحديد هويته، وتشخيصه. وتحليل نتائج التعبير التفاضلي باستخدام طرق المعلوماتية الحيوية للحصول على العديد من miRNAs المرتبطة بـ PRRSV، متبوعة بتحديد نتائج البيانات باستخدام PCR في الوقت الحقيقي الكمي (qRT-PCR).

2. المواد والأساليب

2.1. التجارب على الحيوانات

تم وضع ستة خنازير بيضاء كبيرة الحجم ذات مستضد PRRSV وأجسام مضادة سلبية مزدوجة 42-عمرها يوم واحد في نظام التغذية النظيفة للخنازير من أجل العزل والرعاية الصحية والتكيف البيئي. وكانت جميع الخنازير حرة في الأكل والشرب دون قيود. عندما كانوا على دراية بالظروف في المعزل، تم تلقيح الخنازير عن طريق الأنف بـ 2 مل 105 TCID50/mL PRRSV NADC30- مثل CHsx1401، والذي ذكره أسلافه [36،37]. تم جمع دم الخنازير قبل (المجموعة الضابطة، ن=6) وبعد 7 أيام (مجموعة العلاج، ن=6) التلقيح بالفيروس من الوريد الأجوف الأمامي لعزل المصل. تمت إزالة الحطام الخلوي في المصل عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جم لمدة 15 دقيقة. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات في دراستنا من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بمعهد علوم الحيوان، الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية (CAAS) (بكين، الصين)، IAS 2022-130.

2.2. عزل وتنقية الاكسوسومات في المصل

تم إجراء عزل وتنقية Exosome باستخدام مجموعة exoEasy Maxi (QIAGEN، Hilden، Germany، cat. رقم 76064) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

2.3. المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)

تم رصد معلقات الإكسوسوم المستخرجة على الشبكة النحاسية المطلية بالكربوهيدرات، وتم شطف الإكسوسومات باستخدام برنامج تلفزيوني وتعريضها لتلطيخ خلات اليورانيل القياسي لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التجفيف لعدة دقائق في درجة حرارة الغرفة، تم تصور الشبكة وتصويرها عند 100 كيلو فولت بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (HT -7700، Hitachi-High Tech، طوكيو، اليابان).

2.4. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

تم تخفيف exosomes المستخرجة بـ 1 × PBS عن طريق تغيير الحجم من 10 إلى 30 ميكرولتر. بعد اختبار العينة، تم تحليل تركيز وحجم exosomes المصل بواسطة محلل نانو التدفق N30E باتباع إرشادات الشركة المصنعة (NanoFCM، Xiamen، الصين).

2.5. لطخة غربية

تمت إضافة عينات exosome المستخرجة إلى محلول RIPA الممزوج بمثبط الأنزيم البروتيني (Invitrogen، Waltham، MA، USA) وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) لاستخراج بروتين exosome، الذي تم وضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، وفقًا لتعليمات مجموعة برادفورد، قمنا بقياس تركيز بروتين الإكسوسوم في المصل. خضعت بروتينات Exosome لعملية تمسخ حراري. تم فصل نفس الكمية من البروتين على 12٪ هلام SDS-PAGE ثم نقلها إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (ميليبور، برلينجتون، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). تم نقعه في TBST الذي يحتوي على 5٪ من مسحوق الحليب منزوع الدسم ومختوم لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. لقد نقعنا الغشاء في الجسم المضاد الأولي المخفف (الجسم المضاد لـ CD9، Abcam، Boston، MA، USA، #ab92726؛ الجسم المضاد لـ CD81، Abcam، Boston، MA، USA، #ab109201) طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، واستعادنا طاقتنا. الأجسام المضادة الأولية. لقد نقعنا الغشاء في الجسم المضاد الثانوي المخفف، واحتضنناه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، واستعدنا الجسم المضاد الثانوي. لقد وضعنا الفيلم المغسول لـ PBST على فيلم حفظ طازج، وأضفنا محلولًا متساويًا الحجم مختلطًا من ECL a / b، ووضعناه في جهاز تصوير التألق الكيميائي.

فوائد سيستانش للرجال - تقوية جهاز المناعة

انقر هنا لعرض منتجات Cistanche Enhance Immunity

【اطلب المزيد】 البريد الإلكتروني: cindy.xue@wecistanche.com / تطبيق Whats: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.6. تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) الصغير وتحليل البيانات

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من exosomes باستخدام Trizol وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. اكتشفنا بعد ذلك تركيز الحمض النووي الريبي (RNA) وقيمة الكثافة البصرية (OD) واكتشفنا تدهور ونقاء الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 1٪. وفي الوقت نفسه، تم استخدام Agilent Bioanalyzer 2100 للكشف عن سلامة الحمض النووي الريبي (RNA). استخدمنا إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) للإكسوسومات بعد فحص الجودة. وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، استخدمنا مجموعة إعداد مكتبة RNA الصغيرة المتعددة NEB NEXT لـ Illumina® (Illumina، San Diego، CA، USA). أعدت المجموعة مكتبة صغيرة من RNA cDNA وقامت بتسلسلها لإنتاج 50 قراءات أحادية النهاية بواسطة منصة Illumina Novaseq 6000. تم إنجاز جميع الإجراءات الخاصة بإعداد مكتبة RNA الصغيرة بواسطة Novogene (بكين، الصين). تمت محاذاة البيانات بعد مراقبة الجودة مع الجينوم المرجعي للخنازير (Sus scrofa 11.1) باستخدام ربطة العنق. تم التعرف على miRNAs المعروفة بواسطة قاعدة بيانات miRbase (v22.0) [38] (https://www.mirbase.org، تم الوصول إليها في 14 يناير 2022)، وmiRdeep2 (v0.0.5) [39]، وmiRevo (v1.1). ) [40] واستخدمت للتنبؤ بجزيئات miRNA الجديدة. في الوقت نفسه، تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي للـ miRNAs بواسطة DESeq (الإصدار 1.24.0) [41]، مما يتطلب|تغيير الطية|> 1.6 و ف < 0.05. تم إجراء المحاذاة باستخدام MEGA (V11) [42] متبوعة بتسجيل قاعدة واحدة باستخدام PHAST (الإصدار 1.6.9) [43] وتقييم المناطق الأكثر حفظًا لجينات الفيروس العشرة، بما في ذلك WUH3 (رقم وصول GenBank HM853973)، VR2332 ( رقم وصول GenBank. U87392)، JXA1 (رقم وصول GenBank. EF112445)، CH-1a (رقم وصول GenBank. AY032626)، NADC30 (رقم وصول GenBank. HN654459)، HUN4 (رقم وصول GenBank. EF635006)، HLJZD 22-1812 (رقم وصول GenBank. MN648450)، SC/DJY (رقم وصول GenBank. MT075480)، و Lelystad (رقم وصول GenBank. M96262.2). تم استخدام RNAhybrid (V2.0) [44] للتنبؤ بربط تسلسل miRNA المحدد بـ 3 0 UTR لجينوم الفيروس CHsx1401. تم استخدام ميراندا (v3.3a) وRNAhybrid لاستهداف التنبؤ الجيني. تم استخدام الملف التعريفي العنقودي [45] R لتحليل الإثراء الوظيفي GO (علم الجينات) للجينات المستهدفة وتحليل إثراء مسار KEGG (موسوعة كيوتو للجينات والجينومات).

2.7. التحقق من صحة التعبير ميرنا بواسطة RT-qPCR

تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي من exosomes المصل باستخدام Trizol (Invitrogen، Shanghai، China) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم التحقق من الحمض النووي الريبي المعزول بواسطة RT-qPCR على العينات (ن=6 لكل مجموعة). تم تصنيع cDNA وفقًا لتعليمات مجموعة توليف cDNA 1st strand (بواسطة حلقة جذعية) (Vazyme ، نانجينغ ، الصين) ، وتم إجراء القياس الكمي للتألق باستخدام ABI 75 0 0 وفقًا لـ تعليمات miRNA Universal SYBR qPCR master mix (Vazyme، Nanjing، China). كانت معلمات الدورة الحرارية المستخدمة كما يلي: المرحلة الأولى: 95 ◦C لمدة 30 ثانية؛ المرحلة 2: 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانٍ، و60 درجة مئوية لمدة 34 ثانية، و40 دورة؛ المرحلة 3: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تم استخدام التسلسلات الأولية للmiRNAs، الجين U6، كمرجع [46] وتم إدراجها في الجدول التكميلي S1. تم إجراء جميع عمليات التحقق من qRT-PCR باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية وثلاث مكررات لكل عينة. تم حساب الوفرة النسبية للنصوص باستخدام طريقة 2-Ct، وتم استخدام SPSS (الإصدار 22.0) وGraphPad Prism (الإصدار 8.0) لتحليل البيانات ورسم الخرائط، على التوالي. p <0.05 يعني أن الفرق ذو دلالة إحصائية.

3. النتائج

3.1. القيمة النسبية للمستضد والجسم المضاد بعد التلقيح بالفيروس

يتم عرض نتائج اختبارات مستضد PRRSV والأجسام المضادة قبل (اليوم 0) وبعد تحدي (اليوم 7) في الجدول 1. وكان الكشف المصلي لمستضد PRRSV والجسم المضاد قبل التحدي سلبيًا، وكان المستضد سلبيًا. إيجابية بعد التحدي، مما يشير إلى نجاح إصابة الخنازير بفيروس CHsx1401.

3.2. عزل وتحديد الاكسوسومات في المصل

تم اكتشاف الحويصلات المعزولة من المصل بواسطة TEM. يمكن لمعظم الحويصلات رؤية الإكسوسومات المقعرة على شكل صحن أو قرص في المنتصف. حافة الغشاء من exosomes مرئية، والتشكل كاملة نسبيا (الشكل 1A، B). أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن 95.73% من الإكسوسومات يبلغ قطرها 30-150 نانومتر، بشكل رئيسي حوالي 72.25 نانومتر، بمتوسط ​​قطر 76.22 نانومتر، وهو ما يتوافق مع خصائص حجم الإكسوسومات (الشكل 1C). كان نطاق الحجم هذا مشابهًا للنطاق الذي اكتشفه TEM وأكد أيضًا هوية هذه الحويصلات على أنها إكسوسومات. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن الحويصلات المعزولة من عينات المصل كانت إيجابية بالنسبة لبروتينات CD9 وCD81 (الشكل 1D). تتوافق الخصائص المذكورة أعلاه مع معايير تحديد الإكسوسوم التي صاغتها الجمعية الدولية للحويصلات الإضافية (ISEV) في MISEV2018 [47].

الجدول 1. المستضد والجسم المضاد لـ (اليوم 0) و (اليوم 7) مع فيروس التحدي.

الشكل 1. الخصائص الرئيسية للexosomes المصل. (أ، ب) إظهار الخصائص المورفولوجية للحويصلات بواسطة TEM. أشرطة النطاق هي 500 نانومتر و 100 نانومتر، على التوالي. (ج) يظهر NTA قطر وتركيز معظم الحويصلات. (د) أظهرت اللطخة الغربية وجود علامات الإكسوسوم CD81 وCD9 في الإكسوسومات المصلية. ملحوظة: نتائج المزج في WB هي عينة التعليق المختلط المعزول بواسطة مجموعة exoEasy Maxi

3.3. تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير لإكسوسومات المصل

لكل عينة، وصلت البيانات النظيفة إلى 0.5 جيجا بايت، وكانت النسبة المئوية الأساسية لـ Q30 أعلى من 96.20%. تمت محاذاة القراءات النظيفة لكل عينة مع الجينوم المرجعي للخنزير. من بين 12 عينة، حصلت المجموعة الضابطة على 10,920,887، 10,248,696، 10,109,117، 10,655,494، 9,217,285، و9,782,523 قراءة، على التوالي. حصلت مجموعة العلاج على 11,889,518، 10,593,504، 10,593,504، 12,846,080، 10,105,325، 11,729,451، و9,789,542 قراءة، على التوالي. في المتوسط، يتألف 77.96% من إجمالي القراءات النظيفة من 19 إلى 22 نيوكليوتيدات (nt) في الطول (الشكل 2A). تمثل القراءات بعد مراقبة الجودة أكثر من 92.59٪ من إجمالي القراءات. تمت محاذاة القراءات النظيفة المجهزة إلى الجينوم المرجعي الخنازير، وكان المعدل المعين لـ 12 مكتبة على الجينوم أكثر من 92.30%، وكان المعدل المعين 94.98% (الشكل 2B). وأشارت إلى أن مكتبة المصل exosomal miRNA التي تم إنشاؤها كانت ذات جودة عالية ومناسبة لمزيد من التحليل. التفاصيل مدرجة في الجدول التكميلي S2.

الشكل 2. نظرة عامة على بيانات نسخة الحمض النووي الريبي الصغيرة. (أ) توزيع طول أعداد القراءة لعينات إكسوسوم المصل (nt=النيوكليوتيدات)؛ (ب) معدل 12 عينة تم تعيينها للجينوم المرجعي

3.4. تحليل التعبير التفاضلي للmiRNAs

بعد التحليل الكمي للتعبير ميرنا المحدد، تم فحص ميرنا بواسطة العتبات الموصوفة سابقا في القسم 2.6. تم الحصول على إجمالي 305 miRNAs قبل وبعد تلقيح سلالة CHsx1401 (التحكم، n=6؛ العلاج، n=6). تم تحديد ما مجموعه 33 miRNAs المعبر عنها تفاضليًا (DE) بين المجموعتين ، وتم تنظيم 13 DE miRNAs ، وتم تنظيم 20 DE miRNAs في مجموعة العلاج (الشكل 3 والجدول التكميلي S3).

3.5. تحليل الإثراء الوظيفي للجينات المستهدفة ميرنا

تم التنبؤ بإجمالي 7283 جينًا مستهدفًا بواسطة 33 DE miRNAs، وتركزت وظائف الجينات المستهدفة بشكل أساسي في التنظيم الإيجابي لسلسلة MAPK، وعملية استقلاب الدهون، وتنظيم نقل الإشارة داخل الخلايا، وسلسلة ERK1 وERK2، وما إلى ذلك (الشكل 4A). ). فيما يتعلق بالوظائف الجزيئية، تركز الجينات المستهدفة ميرنا المعبر عنها تفاضليًا بشكل أساسي على النشاط التنظيمي لإنزيم GTP، ونشاط الكيناز، والنشاط التنظيمي للنيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات، والوظائف الأخرى المتعلقة بنقل الإشارة واستقلاب الطاقة (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، من بين مكونات الخلية، تشارك الجينات المستهدفة بشكل رئيسي في الوظائف البيولوجية للبوليمرات فوق الجزيئية، وجولجي، والجسيمات البلعمية الذاتية، وسطح الخلية، والإندوسومات المبكرة، وما إلى ذلك (الشكل 4C). وترتبط وظائف هذه المكونات ارتباطًا وثيقًا بتكوين الإكسوسومات، وهو ما يفسر أيضًا دقة التسلسل. أظهر تحليل تخصيب مسار KEGG أن الجينات المستهدفة تم إثراءها بشكل كبير في الالتقام الخلوي، ومسار إشارات MAPK، ومسار إشارات Rap1، ومسار إشارات السفينجوليبيد، ومسار إشارات PI3K Akt (p <0.05) (الشكل 5A) ). وفي الوقت نفسه، تم تصنيف المسارات المخصبة وتحليلها. وأظهرت النتائج أن مسار KEGG للجين المستهدف تم إثراءه بشكل رئيسي في معالجة المعلومات البيئية، والأمراض البشرية، والنظم البيولوجية (الشكل 5B).

الشكل 3. التعبير التفاضلي للmiRNAs في exosomes. (أ) مؤامرة بركان من miRNAs بين مجموعات المراقبة والعلاج؛ (ب) خريطة الحرارة التجميعية الهرمية لـ DE miRNAs بين مجموعات التحكم والعلاج.

الشكل 4. تحليل إثراء وظيفة GO للجينات المستهدفة DE miRNAs. (أ) العملية البيولوجية للجينات المستهدفة DE miRNAs؛ (ب) الوظائف الجزيئية للجينات المستهدفة DE miRNAs؛ (C) المكونات الخلوية للجينات المستهدفة DE miRNAs

الشكل 5. تحليل إثراء مسار KEGG للجينات المستهدفة. (أ) مسار KEGG المخصب بشكل كبير مع الجينات المستهدفة من DE miRNAs؛ (ب) تصنيف مسارات KEGG المخصبة بشكل كبير.

3.6. استهداف التنبؤ بمصل Exosomal miRNA وجينوم PRRSV CHsx1401

وفقا لدرجة phastCons لقاعدة واحدة بعد المحاذاة بواسطة PHAST، تم الحصول على ما مجموعه ثمانية قطاعات الأكثر حفظًا (العصابات السوداء فوق خريطة الذروة) بين الجينومات الفيروسية (الشكل 6). تم العثور على ما مجموعه 31 DE miRNAs لربط الجزء المحفوظ من خلال التنبؤ بـ miRNAs المرتبطة بالجزء المحفوظ. من بينها، في المنطقة المحفوظة (14,644–15,020 nt) الأقرب إلى 30 UTR (14,870–15,020) من جينوم CHsx1401، من المتوقع أن ترتبط 16 DE miRNAs به، بما في ذلك 5 miRNAs (ssc-miR-34 c وssc-miR-375 وssc-miR-378 وssc-miR-486 وssc-miR-6529) التي يمكنها الارتباط بـ 30 UTR لـ CHsx1401. من بين هذه miRNAs، تم تنظيم ssc-miR -223 فقط بعد الإصابة، وتم تنظيم miRNAs الأخرى بعد الإصابة. انظر الجدول التكميلي S4 للحصول على التفاصيل.

الشكل 6. الأجزاء المحفوظة في جينوم سلالة CHsx1401 التي تنبأ بها PHAST

3.7. فحص DE miRNAs المتعلقة بوظيفة Exosome وPRRSV

تم العثور على مجموعة متنوعة من miRNAs المعبر عنها تفاضليًا والمتعلقة بوظيفة exosomes وPRRSV من خلال تحليل الإثراء الوظيفي للجينات المستهدفة. من بينها، 11 DE miRNAs مثل ssc-miR-4331-3p وssc-miR-744 وssc-miR-320 تشارك في امتصاص الإكسوسوم، وتتركز جيناتها المستهدفة بشكل أساسي في عائلة جينات Ras، وعائلة Annexin، وعائلة جينات الريبوزيل ADP. ثمانية عشر DE miRNAs، بما في ذلك sscmiR-10b، وssc-miR-124a، وssc-miR-128، تشارك في المسارات المرتبطة بالمناعة، وتتركز جيناتها المستهدفة بشكل أساسي في MAPK عائلة الجينات، عائلة الجينات PIK3، وعائلة الجينات البروتين الفوسفاتيز. في حين أن 11 DE miRNAs متورطة في غزو الفيروس، فإن الجينات المستهدفة ذات الصلة تتركز بشكل رئيسي في عائلة الجينات MAPK وعائلة جينات بروتين الفوسفاتيز. علاوة على ذلك، هناك العديد من miRNAs المعبر عنها تفاضليًا، مثل الرواية _102. ستة DE miRNAs، بما في ذلك ssc-miR-320، وssc-miR-423-5p، وssc-miR-4331-3p، وssc-miR-7137-3p، وssc-miR{{ 25}}، يتم التعبير عنها بشكل مشترك في وظيفة exosome، وغزو فيروس PRRSV، والمسارات المرتبطة بالمناعة، كما هو مبين في الشكل 7. وترد التفاصيل في الجدول التكميلي S5.

الشكل 7. DE miRNAs المتعلقة بامتصاص exosome، وغزو PRRSV، والحصانة

3.8. فحص QRT-PCR لـ DE miRNAs بين المجموعتين

تم اختيار خمسة DE miRNAs بشكل عشوائي للتحقق منها. وفقًا لنتائج qRT-PCR، زاد التعبير عن ssc-miR-19a وssc-miR-32 في مجموعة العلاج، بينما زاد التعبير ssc-miR-124a, ssc-miR{ {8}}، وssc-miR-34c أظهرا تعبيرًا أعلى في مجموعة التحكم، بما يتوافق مع بيانات التسلسل (الشكل 8).

الشكل 8. التحقق من صحة خمسة miRNAs DE بواسطة qRT-PCR

4. مناقشة

لا يزال فيروس PRRSV من العوامل المسببة للأمراض العنيدة في صناعة الخنازير العالمية، مما يتسبب في خسائر اقتصادية فادحة في العالم. في الوقت الحاضر، يستخدم التطعيم بشكل رئيسي للوقاية من فيروس PRRSV ومكافحته، ومن بينها لقاح الفيروس الحي المعدل (MLV) هو الأكثر استخدامًا على نطاق واسع [48]. على الرغم من أن هذا اللقاح كان فعالاً في الحد من تفشي حالات PRRS وحدوثها، إلا أنه زاد أيضًا بشكل كبير من التنوع الجيني وتنوع الفيروس وأدى إلى إعادة التركيب الفيروسي بين فيروسات اللقاحات البرية والحية في الميدان [49،50]. في السنوات الأخيرة، تسبب انتشار وانتشار الفيروس المؤتلف NADC30-مثل سلالة PRRSV في حدوث حالات تفشي متعددة لمتلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي في الصين. بقي التشابه بين CHsx1401 وNADC30 المستخدم في هذه الدراسة عند 92.2-99.1%. ومنذ ذلك الحين، أصبح سلالة وبائية في الصين. توجد الإكسوسومات، باعتبارها وسطاء للاتصالات الخلوية، على نطاق واسع في سوائل الجسم المختلفة ولها مزايا فريدة في تشخيص الأمراض وعلاجها [51،52]. وفقًا للتقارير السابقة، تلعب الإكسوسومات دورًا تواصليًا مهمًا في عرض المستضد [53]، والاستجابة المناعية [53،54]، وتكاثر الفيروس [54]، والسرطان [55]، والأمراض التنكسية العصبية [56]، وتولد الأوعية [57]، والخلايا السرطانية. الهجرة [58] والغزو [59]، ولها قيمة بحثية عالية.

في هذه الدراسة، تم استخدام تكنولوجيا التسلسل عالي الإنتاجية لبناء ملف تعريف التعبير ميرنا من exosomes المصل، وتم تحديد 33 DE miRNAs. كما نعلم جميعًا، يمكن أن يرتبط miRNA المشفر بالمضيف بالجينوم الفيروسي ثم ينظم تكاثر الفيروس وتوليفه وإطلاقه للحد من العدوى والتأثير على العملية المرضية [15]. كما تم الإبلاغ بشكل متكرر عن دراسات على miRNAs التي تستهدف الجينوم الفيروسي في الحيوانات. يمكن لـ gga-miR-454 وgga-miR-130b في مرض الجراب المعدي في الدجاج استهداف الجينوم الفيروسي لمنع تكاثر الفيروس، بينما يستهدف gga-miR-21 بشكل مباشر البروتين الفيروسي VP1 لتثبيط ترجمة البروتين الفيروسي [60،61]. في دراسات PRRSV، يرتبط ssc-miR-181 على وجه التحديد بمنطقة محفوظة للغاية أسفل الجينوم الفيروسي ORF4 ويمنع بشدة تكرار PRRSV [62]. في هذه الدراسة، لم يصل اختلاف التعبير عن ssc-miR-181 بين المجموعتين إلى مستوى كبير. في دراستنا، تمت مقارنة جينومات تسعة فيروسات PRRSV مختلفة مع جينومات سلالة CHsx1401، وتم تحديد الأجزاء الثمانية الأكثر حفظًا. كان من المتوقع أن 31 DE miRNAs يمكن أن ترتبط بالأجزاء الثمانية الأكثر حفظًا من CHsx1401، ويمكن أن ترتبط 16 DE miRNAs بالتسلسلات المحفوظة القريبة من 30 UTR لـ CHsx1401. من بينها، 5 DE miRNAs (ssc-miR-34c، ssc-miR-375، ssc-miR-378، ssc-miR-486، وssc-miR{{ 36}}) يمكنه الارتباط في نفس الوقت بـ CHsx1401 30 UTR. بالإضافة إلى ذلك، كان من المتوقع أن يرتبط التعبير المنتظم لـ ssc-miR-223 بالهدف 30 UTR لجينوم PRRSV. أظهرت النتائج أن التسلسلات المحفوظة لجينوم الفيروس قد تلعب دورًا رئيسيًا في إمراضه، وأن الـ miRNAs التي يمكن أن ترتبط بالتسلسلات المحفوظة بين جينومات سلالات PRRSV المختلفة قد يكون لها أهمية مهمة في التحكم في إمراضية الفيروس. لقد ثبت أن بعض miRNAs المعبر عنها تفاضليًا مرتبطة بـ PRRSV من خلال الدراسات السابقة وحتى أنها تشارك بشكل مباشر في تنظيم PRRSV، بما في ذلك ssc-miR-10b [63]، ssc-miR-378 [30] ، ssc-miR-124a [64]، Let-7f-5p [65]، ssc-miR-744 [66]، و ssc-miR{{57 }}أ[67].

يمكن لـ PRRSV التهرب من دفاع المضيف عن طريق التدخل في الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تنظيم هذه العملية من خلال العديد من مسارات الإشارات، بما في ذلك مسار إشارات MAPK، ومسار إشارات PI3K Akt، ومسار إشارات الالتهام الذاتي، ومسار إشارات chemokine، ومسار إشارات TNF. في الوقت الحاضر، يتضمن مسار تشوير MAPK ثلاثة مسارات رئيسية: مسار ERK1/2 وJNK وp38. يمكن أن يؤدي تنشيط سلسلة MAPK إلى تعزيز موت الخلايا المبرمج للخلايا المضيفة، ومساعدة الفيروس في الهروب من استجابة الدفاع المناعي للمضيف، وتعزيز تكرار PRRSV [68]. علاوة على ذلك، فإن تنشيط كينازات c-Jun N-terminal (JNKs) وp38 يمكن أن يعزز أيضًا إطلاق العامل الالتهابي IL-10 [68–70] ويعزز التأثير الالتهابي. بالإضافة إلى تحفيز موت الخلايا المبرمج، يمكن لـ PRRSV أيضًا أن يحفز الالتهام الذاتي، والذي يمكن أن يعزز تكرار PRRSV. يعد تنشيط PI3K / Akt ضروريًا لدخول الفيروس وتعزيز تكرار الفيروس، ويمنع Akt المنشط بـ PRRSV موت الخلايا المبرمج للخلايا المضيفة عن طريق التنظيم السلبي لمسار JNK [71]. TNF يمكن أن يلعب دورًا مهمًا في تحريض وتنظيم الاستجابة الالتهابية مع عوامل التهابية أخرى، لكن تعبير TNF يتأثر بالتنظيم السلبي لتكرار PRRSV [72]. في الدراسة الحالية، miRNAs (ssc-miR-10b, ssc-miR-122-5p, ssc-miR-124a, ssc-miR-128, ssc-miR{ {24}}a-5p، وما إلى ذلك) المخصب في هذه المسارات يشارك في موت الخلايا المبرمج الناجم عن PRRSV، والبلعمة الذاتية، والالتهابات ويرتبط ارتباطًا وثيقًا بالاستجابة المناعية الفيروسية، والتهرب المناعي، والتكاثر.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

الغشاء البلازمي للخلية غني بمجموعة متنوعة من الأطواف الدهنية، والشحميات السفينجولية الغنية بالكوليسترول (السفينجوميلين والشحميات السفينجولية السكرية) هي جزيئات رئيسية من الأطواف الدهنية. قد يكون التعرف على الدهون بواسطة بعض بروتينات الفيروس شرطًا ضروريًا لدخول الفيروس [73]. تقوم الفيروسات المغلفة بإدخال البروتينات السكرية المغلف الفيروسية في الأطواف الدهنية في مرحلة دخول الفيروس، أو تتفاعل مع المستقبلات الموجودة في الأطواف الدهنية، أو تتغير من حالتها الطبيعية إلى الشكل المنشط لبدء أو تعزيز الاستيعاب/الاندماج الفيروسي، مثل فيروس الهربس البسيط، وفيروس السارس التاجي، وفيروس الهربس البسيط. فيروس الإسهال الوبائي الخنازير [73،74]. وجدت الدراسات السابقة أن إزالة الكوليسترول من سطح خلايا مارك -145 تقلل بشكل كبير من عدوى PRRSV، مما يدل على أن تثبيط عدوى PRRSV تم على وجه التحديد عن طريق إزالة الكوليسترول الخلوي. استنفاد الكوليسترول في غشاء الخلية يمنع بشكل كبير دخول الفيروس، وخاصة ارتباط الفيروس وإطلاقه [75]. يمكن أن ينظم استقلاب الشحميات السفينجولية بنية الغشاء والالتصاق، وهو أمر له أهمية كبيرة في غزو فيروس PRRSV. كان الالتقام الخلوي هو الإثراء الأكثر أهمية في هذه الدراسة. يعد الالتقام الخلوي آلية مهمة لامتصاص الخلايا المستهدفة للإكسوسوم. أظهرت الدراسات السابقة أن امتصاص الإكسوسوم هو عملية تتطلب الطاقة وتعتمد على الهيكل الخلوي، مما يسلط الضوء على الدور المحتمل للالتقام الخلوي في هذه العملية [76]. لقد ثبت أن العديد من المسارات يمكن أن تتوسط هذه العملية، بما في ذلك البلعمة، كثرة الخلايا الكبيرة، الكلاثرين، وما إلى ذلك [77،78]، مما أدى إلى تصنيفات وأدوار مختلفة للمواد الملموسة. يشير إثراء miRNAs الإكسوسومي المعبر عنه تفاضليًا في هذا المسار إلى أن الإكسوسومات تلعب دورًا مهمًا في عدوى PRRSV، وقد يؤدي تنظيم نقل المحتوى وامتصاصه في الإكسوسومات إلى تغيرات فيزيولوجية مرضية في الخلايا والأعضاء المستهدفة.

cistanche tubulosa-تحسين الجهاز المناعي

5. الاستنتاجات

من خلال تحديد وتحليل المعلوماتية الحيوية لـ miRNAs exosomal في المصل من الخنازير المصابة بـ PRRSV، تم الحصول على مجموعة متنوعة من المسارات المرتبطة بـ PRRSV وmiRNAs المعبر عنها تفاضليًا في هذه الدراسة، مثل ssc-miR-4331-3p, ssc-miR{{ 5}}، sscmiR-320، ssc-miR-10b، ssc-miR-124a، ssc-miR-128، وما إلى ذلك، والتي تلعب أدوارًا وظيفية محتملة في PRRSV - الاستجابة المناعية المستحثة، والغزو، وامتصاص الإكسوسوم. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن miRNA واحد يمكن أن يستهدف جينات متعددة ويتم تنظيم جين واحد أيضًا بواسطة miRNAs متعددة، فإن العديد من miRNAs تؤدي وظائف متعددة في المسارات المذكورة أعلاه. تم التحقق من أن بعض miRNAs تنظم عدوى PRRSV من خلال العمل على المستقبلات الرئيسية أو استهداف جينوم الفيروس مباشرة، مثل ssc-miR-10b, ssc-miR-378, miR-124a, Let-7f-5p, ssc-miR-744, ssc-miR-19a, إلخ. وفي الوقت نفسه، تنبأت الدراسة الحالية أيضًا بمجموعة متنوعة من miRNAs التي يمكن أن ترتبط بـ الجزء الأكثر حفظًا من 30 UTR لجينوم الفيروس CHX1401، بما في ذلك ssc-miR-34c، ssc-miR-375، ssc-miR-378، ssc-miR{{34} }، وssc-miR-6529، والتي قد تكون مهمة لتنظيم القدرة المرضية الفيروسية.

مراجع

1. شنايدر، إي جيه؛ كيكرت، م. Fang، Y. Arterivirus البيولوجيا الجزيئية والتسبب في المرض. جيه الجنرال فيرول. 2013، 94 ب 10، 2141-2163. [CrossRef] [مجلات]

2. لو، ي.؛ تشانغ، Y.؛ شيانغ، X.؛ شارما، م.؛ ليو، ك. وي، J.؛ شاو، د.؛ لي، ب. تونغ، G.؛ أولسويسكي، MA؛ وآخرون. تساهم إشارات الشق في التعبير عن السيتوكينات الالتهابية الناجمة عن عدوى فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي شديدة الإمراض في الخنازير (HP-PRRSV) في البلاعم السنخية الخنازير. ديف. شركات. إيمونول. 2020، 108، 103690. [CrossRef] [PubMed]

3. ديا، س.؛ سوير، ن.؛ آلان، ر. Athanassius، R. خصائص البنية التحتية والتشكل لفيروس المتلازمة التناسلية والتنفسية للخنازير المنتشر في استنساخ خلايا MARC -145 شديدة التساهل. حال. إكسب. ميد. بيول. 1995، 380، 95-98. [مجلات]

4. Dokland، T. البيولوجيا الهيكلية لـ PRRSV. الدقة الفيروسية. 2010، 154، 86–97. [CrossRef] [مجلات]

5. جونسون، سي آر؛ غريغز، TF. جنانانداراجا، J .؛ Murtaugh، MP البروتين الهيكلي الجديد في فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي للخنازير المشفر بواسطة ORF5 بديل موجود في جميع الفيروسات الشريانية. جيه الجنرال فيرول. 2011، 92 جزء 5، 1107-1116. [CrossRef] [مجلات]

6. لي، SC. لي، س. يو ، غيغاواط. تشوي، الأب. لا، YH. بارك، م. شين، ج.ه. يون، آي جي؛ كانغ، سي. Lee، C. التحليلات المظهرية والوراثية لسلالة فيروس متلازمة التناسل والجهاز التنفسي الموهنة في الخنازير بعد الممرات التسلسلية في الضامة السنخية الخنازير المستنبتة. جي بيطري. الخيال العلمي. 2018، 19، 358-367. [CrossRef] [مجلات]

7. زيبروسكا، أ؛ سكورونيك، أ.؛ ووجاكوسكا، أ؛ ويدلاك، ب. Pietrowska، M. Metabolome of exosomes: التركيز على الحويصلات التي تطلقها الخلايا السرطانية والموجودة في سوائل جسم الإنسان. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2019، 20، 3461. [المرجع المتقاطع]

8. بيبيلمان، النائب. سميت ، إم جي. بيجتيل، مارك ألماني؛ باجليو، SR التولد الحيوي ووظيفة الحويصلات خارج الخلية في السرطان. فارماكول. هناك. 2018, 188, 1-11. [المرجع المتقاطع]

9. زابوروفسكي، النائب؛ بالاج، ل.؛ بريكفيلد، XO؛ لاي، CP الحويصلات خارج الخلية: التركيب، والأهمية البيولوجية، وطرق الدراسة. العلوم البيولوجية 2015، 65، 783-797. [المرجع المتقاطع]

10. المغلّق، فيس بوك؛ كوه، YQ. بيريس، HN؛ فاسواني، ك.؛ هولندا، O .؛ ماير، S .؛ روش، الابن. بيرك، سي آر؛ كروكيندين، MA؛ أراشتشيجي، بج. وآخرون. قد تحدد الإكسوسومات المنتشرة المؤشرات الحيوية للأبقار المعرضة لخطر الخلل الأيضي. الخيال العلمي. النائب 2019، 9، 13879. [المرجع المتقاطع]

11. تشانغ، RC؛ دو، وك. تشانغ، جي واي؛ يو، SX؛ لو، منطقة حرة؛ دينغ، جلالة. تشنغ، واي بي؛ رن، C.؛ Geng، DQ علاج الخلايا الجذعية الوسيطة لإصابة الأعصاب الطرفية: مراجعة سردية. التجديد العصبي. الدقة. 2021، 16، 2170-2176. [مجلات]

12. بريزجونوفا، أو. زاريبوف، م.م. سكفورتسوفا، تي إي؛ ليكشنوف، EA؛ غريغوريفا، الإمارات العربية المتحدة؛ زابوروتشينكو، آيوا؛ موروزكين، إس. ريابشيكوفا، EI؛ يورتشينكو، واي بي؛ فويتسيتسكي، في إي؛ وآخرون. دراسة مقارنة للحويصلات خارج الخلية من بول الأفراد الأصحاء ومرضى سرطان البروستاتا. بلوس وان 2016، 11، e0157566. [CrossRef] [مجلات]

13. كاموسي، ج.؛ ديريجيبوس، MC؛ برونو، س. جرانج، سي. فونساتو، V.؛ تيتا، C. إعادة برمجة الخلايا اللاجينية بوساطة الحويصلات الدقيقة Exosome/microvesicle. أكون. J. السرطان الدقة. 2011، 1، 98-110. [مجلات]

14. تامكوفيتش، SN؛ توتانوف، OS؛ لاكتيونوف، PP Exosomes: الجيل والبنية والنقل والنشاط البيولوجي والتطبيق التشخيصي. الكيمياء الحيوية. موسكو. ملحق. سر. عضوا. خلية بيول. 2016، 10، 163-173. [المرجع المتقاطع]

15. بارتل، موانئ دبي MicroRNAs: علم الجينوم، والتكوين الحيوي، والآلية، والوظيفة. خلية 2004، 116، 281-297. [المرجع المتقاطع]

16. جوردينو، ج.؛ كوستا بيريرا، إس. كوريدييرا، ب. ألفيس، P.؛ كوستا، ل.؛ جوميز، عبد القدير؛ سيلفا سانتوس، ب. Ribot، JC MicroRNA-181a يقيد تمايز الخلايا التائية البشرية عن طريق استهداف Map3k2 وNotch2. EMBO Rep. 2022, 23, e52234. [المرجع المتقاطع]

17. ليو، ب. يان، ل.؛ تشي، Y.؛ صن، واي؛ يانغ، X. RNA طويل غير مشفر AFAP 1- AS1 يسهل تطور سرطان المبيض من خلال تنظيم محور miR -107 / PDK4. J. المبيض الدقة. 2021، 14، 60. [المرجع المتقاطع]

18. كيم، ي.؛ لي، د. بارك، ش. جيون، تي. Jung، CH التفاعل بين microRNAs وعوامل النسخ في تنظيم الالتهام الذاتي في مرض الكبد الدهني غير الكحولي. إكسب. مول. ميد. 2021، 53، 548-559. [المرجع المتقاطع]

19. كازميركزاك، د.؛ جوبيك، ك. ستيرزينسكا، ك؛ نوفيكي، م. روسينسكي، م. Januchowski، R. ملف تعريف تعبير microRNA والدور المحتمل في تنظيم الجينات المقاومة للأدوية في خطوط خلايا سرطان المبيض المقاومة للسيسبلاتين والباكليتاكسيل. كثافة العمليات. جيه مول. الخيال العلمي. 2022، 23، 526. [المرجع المتقاطع]

20. غونغ، ي.؛ وي، X.؛ صن، دبليو؛ رن، العاشر. تشن، J.؛ عوية، جي جي؛ ما، ه.؛ تشان، كغ؛ تشانغ، Y.؛ يساهم Li، S. Exosomal miR -224 في توازن الكائنات الحية الدقيقة في الدملمف أثناء العدوى البكتيرية في القشريات. باثوج بلوس. 2021, 17, هـ1009837. [المرجع المتقاطع]

21. تشنغ، Y.؛ كو، دبليو؛ تشو، د.؛ يو، العاشر. Zhu، Y. الاتجاهات المستقبلية في التشخيص والتشخيص ومراقبة مرض سرطان قشر الكظر: مؤشرات حيوية غير غازية جديدة. أمام. الغدد الصماء. 2022، 12، 811293. [CrossRef] [PubMed]

22. جالو، أ. تاندون، م.؛ أليفيزوس، أنا. Illei، GG تتركز غالبية microRNAs التي يمكن اكتشافها في المصل واللعاب في الإكسوسومات. بلوس وان 2012، 7، e30679. [CrossRef] [مجلات]

23. فان، ب.؛ تشوب، م. تشانغ، زغ. ليو، XS الأدوار الناشئة للmicroRNAs كمؤشرات حيوية وأهداف علاجية للاعتلال العصبي السكري. أمام. نيورول. 2020، 11، 558758. [CrossRef] [PubMed]

24. وي، هـ؛ تشن، س. لين، ل.؛ شا، سي؛ أشعل.؛ ليو، Y.؛ يين، إكس؛ شو، Y.؛ تشن، L.؛ جاو، دبليو؛ وآخرون. تنظيم إنتاج الإكسوسوم وفرز البضائع. كثافة العمليات. جي بيول. الخيال العلمي. 2021، 17، 163-177. [المرجع المتقاطع]

25. جيا، إكس؛ بي، Y.؛ لي، J.؛ شيه، س. يانغ، ه.؛ Liu, W. Cellular microRNA miR-26a يمنع تكاثر فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي في الخنازير عن طريق تنشيط المناعة الفطرية المضادة للفيروسات. الخيال العلمي. النائب 2015، 5، 10651. [المرجع المتقاطع]

26. لي، ل. وي، Z.؛ تشو، Y.؛ جيانغ، Y.؛ يو، ل.؛ تشنغ، ه.؛ تونغ، دبليو؛ يانغ، س.؛ تشنغ، ه.؛ شان، ت.؛ وآخرون. يمنع المضيف miR-26a تكاثر فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي للخنازير عن طريق تنظيم الإنترفيرونات من النوع الأول. الدقة الفيروسية. 2015، 195، 86–94. [المرجع المتقاطع]

27. ليو، ف. وانغ، ه.؛ دو، ل.؛ وي، Z.؛ تشانغ، س. يستهدف Feng, WH MicroRNA-30c سلسلة بيتا لمستقبلات الإنترفيرون-ألفا/بيتا لتعزيز عدوى PRRSV من النوع الثاني. جيه الجنرال فيرول. 2018، 99، 1671-1680. [المرجع المتقاطع]

28. تشانغ، س. هوانغ، C.؛ يانغ، س. جاو، L.؛ ليو، HC. تانغ، J.؛ يقوم Feng, WH MicroRNA-30c بتعديل استجابات IFN من النوع الأول لتسهيل عدوى فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي لدى الخنازير من خلال استهداف JAK1. جي إمونول. 2016، 196، 2272-2282. [المرجع المتقاطع]

29. وانغ، د.؛ تساو، L.؛ شو، Z.؛ فانغ، L.؛ تشونغ، Y.؛ تشن، س. لو، ر. تشن، ه.؛ لي، ك. Xiao، S. MiR-125b يقلل من تكاثر فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي في الخنازير عن طريق التنظيم السلبي لمسار NF-κB. بلوس واحد 2013، 8، e55838. [المرجع المتقاطع]

30. تشانغ، س.؛ قوه ، XK. جاو، L.؛ هوانغ، C.؛ لي، ن.؛ جيا، إكس؛ ليو، دبليو؛ يمنع Feng، WH MicroRNA -23 تكرار PRRSV عن طريق استهداف PRRSV RNA مباشرة وربما عن طريق تنظيم الإنترفيرونات من النوع الأول. علم الفيروسات 2014، 450-451، 182-195. [المرجع المتقاطع]

31. وو، ج.؛ بنغ، X.؛ تشو، أ.؛ تشياو، م.؛ وو، ه.؛ شياو، ه.؛ ليو، G.؛ تشنغ، X.؛ تشانغ، S.؛ يمنع Mei, S. MiR-506 تكرار PRRSV في خلايا MARC -145 عبر CD151. مول. خلية. الكيمياء الحيوية. 2014، 394، 275-281. [المرجع المتقاطع]

32. جاو، ل.؛ قوه ، XK. وانغ، ل.؛ تشانغ، س. لي، ن.؛ تشن، العشرين؛ وانغ، Y.؛ Feng، WH MicroRNA 181 يمنع عدوى فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) للخنازير عن طريق استهداف مستقبل PRRSV CD163. جي فيرول. 2013، 87، 8808-8812. [المرجع المتقاطع]

33. شياو، س.؛ دو، T.؛ وانغ، العاشر. ني، ه؛ يان، Y.؛ لي، ن.؛ تشانغ، C.؛ تشانغ، أ.؛ جاو، J.؛ ليو، ه.؛ وآخرون. يعمل MiR-22 على تعزيز تكاثر فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي في الخنازير من خلال استهداف العامل المضيف H O -1. دكتور بيطري. ميكروبيول. 2016، 192، 226-230. [المرجع المتقاطع]

34. شياو، س.؛ وانغ، العاشر. ني، ه؛ لي، ن.؛ تشانغ، أ.؛ ليو، ه.؛ بو، F.؛ شو، L.؛ جاو، J.؛ تشاو، س؛ وآخرون. يعمل MicroRNA miR-24-3p على تعزيز تكاثر فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي من خلال قمع تعبير الهيم أوكسجيناز -1. جي فيرول. 2015، 89، 4494-4503. [المرجع المتقاطع]

35. بتلر، جي. سينكورا، م. وانغ، ج.؛ ستيبانوفا، ك.؛ لي، Y.؛ Cai، X. اضطراب تطور الخلايا الصعترية يكمن وراء جائحة PRRS: فرضية قابلة للاختبار. أمام. إيمونول. 2019، 10، 1077. [المرجع المتقاطع]

36. تشو، ل.؛ وانغ، Z .؛ دينغ، Y.؛ ستيبانوفا، ك.؛ لي، Y.؛ Cai, X. NADC30-مثل سلالة فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي في الخنازير، الصين. الظهور. تصيب. ديس. 2015، 21، 2256-2257. [المرجع المتقاطع]

37. تشو، ل.؛ يانغ، ب. شو، L.؛ جين، ه.؛ قه، العاشر؛ قوه، X.؛ هان، J.؛ يانغ، هـ. تقييم فعالية ثلاثة لقاحات فيروسات حية معدلة ضد سلالة من فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي الخنازير NADC30-like. دكتور بيطري. ميكروبيول. 2017، 207، 108-116. [المرجع المتقاطع]

38. وونغ، ن.؛ Wang، X. miRDB: مورد عبر الإنترنت للتنبؤ بأهداف microRNA والشروح الوظيفية. الدقة الأحماض النووية. 2015، 43، D146 – D152. [المرجع المتقاطع]

39. فريدلاندر، م.ر. ماكوياك، SD؛ لي، ن.؛ تشن، دبليو؛ يحدد Rajewsky، N. miRDeep2 بدقة المئات من جينات microRNA الجديدة المعروفة في سبعة فروع حيوانية. الدقة الأحماض النووية. 2012، 40، 37-52. [المرجع المتقاطع]

40. ون، م. شين، Y.؛ شي، س. Tang، T. miREvo: منصة تحليل تطورية متكاملة لـ microRNA لتجارب تسلسل الجيل التالي. معلومات بي إم سي الحيوية. 2012، 13، 140. [المرجع المتقاطع]

41. أندرس، س.؛ Huber، W. تحليل التعبير التفاضلي لبيانات عدد التسلسل. الجينوم بيول. 2010, 11, R106. [CrossRef] [مجلات]

42. تامورا، ك.؛ ستيتشر، G.؛ كومار، S. MEGA11: تحليل الوراثة التطورية الجزيئية، الإصدار 11. مول. بيول. تطور. 2021، 38، 3022-3027. [CrossRef] [مجلات]

43. هوبيسز، إم جي. بولارد، كانساس؛ Siepel، A. PHAST، وRPHAST: تحليل التطور الوراثي باستخدام نماذج المكان/الزمان. مختصر. المعلومات الحيوية. 2011، 12، 41-51. [CrossRef] [مجلات]

44. كروجر، ج.؛ Rehmsmeier، M. RNAhybrid: التنبؤ بهدف microRNA سهل وسريع ومرن. الدقة الأحماض النووية. 2006، 34، W451 – W454. [المرجع المتقاطع]

45. يو، ج. وانغ، إل جي؛ هان، Y.؛ He، QYclusterProfiler: حزمة R لمقارنة المواضيع البيولوجية بين مجموعات الجينات. أوميس 2012، 16، 284-287. [المرجع المتقاطع]

46. ​​كيو، ر. دينغ، ج. تشن، J.؛ Cao، L. تحليل microRNAs exosomal في المصل والسمات المرضية السريرية للمرضى الذين يعانون من سرطان غدي البنكرياس. العالم جي سورج. أونكول. 2013، 11، 219. [المرجع المتقاطع]

47. تيري، سي؛ ويتوير، كيلوواط. أيكاوا، إي؛ الكاراز ، إم جي . أندرسون، دينار؛ أندريانتسيتوهاينا، ر.؛ أنطونيو، أ.؛ عرب، ت.؛ آرتشر، ف؛ أتكين سميث، حارس مرمى. وآخرون. الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV2018): بيان موقف الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية وتحديث لإرشادات MISEV2014. جي اكستراسل. الحويصلات 2018، 7، 1535750. [CrossRef]

48. ليو، ك.-س.؛ تشوي، جي واي؛ هان، TW. بارك، كيه تي؛ كيم، هونج كونج تأثير التطعيم بلقاح فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي المعدل للخنازير الحية على أداء النمو في خنازير التسمين في الظروف الميدانية. جي بيطري. ميد. الخيال العلمي. 2016، 78، 1533-1536. [المرجع المتقاطع]

49. بيان، ت.؛ صن، واي؛ هاو، م. تشو، L.؛ قه، العاشر؛ قوه، X.؛ هان، J.؛ Yang، H. فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي المؤتلف من النوع 2 بين NADC30-like وMLV-like: التوصيف الوراثي والقدرة المرضية للخنازير. تصيب. جينيت. تطور. 2017، 54، 279-286. [المرجع المتقاطع]

50. لي، ي.؛ جي، ج. وانغ، J.؛ تان، ف. تشوانغ، J.؛ لي، العاشر. Tian, ​​K. تسلسل الجينوم الكامل لـ NADC30-مثل فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي للخنازير الذي يتميز بإعادة التركيب مع سلالات أخرى. إعلان الجينوم. 2016, 4, ه00330-16. [المرجع المتقاطع]

51. كالوري، ر. Lebleu، VS البيولوجيا والوظيفة والتطبيقات الطبية الحيوية للإكسوسومات. العلوم 2020، 367، eaau6977. [CrossRef] [مجلات]

52. مياو، XY التطورات الأخيرة في فهم دور miRNAs في exosomes وإمكاناتها العلاجية. جي متكامل. الزراعية. 2017، 16، 753-761. [المرجع المتقاطع]

53. شنودة، ب.ب. Ajit، SK تعديل الاستجابات المناعية بواسطة exosomes المستمدة من الخلايا التي تقدم المستضد. كلين. ميد. رؤى باثول. 2016، 9 (ملحق S1)، CPath-S39925. [CrossRef] [مجلات]

54. لي، س.؛ لي، س. وو، س. يقوم Chen، L. Exosomes بتعديل التكاثر الفيروسي والاستجابات المناعية المضيفة في عدوى فيروس التهاب الكبد B. بيوميد الدقة. كثافة العمليات. 2019، 2019، 2103943. [المرجع المتقاطع]

55. التخضير، DW؛ جوبال، كورونا؛ شو، ر.؛ سيمبسون، آر جيه؛ Chen، W. Exosomes وأدوارها في تنظيم المناعة والسرطان. في ندوات في علم الأحياء الخلوي والتنموي؛ الصحافة الأكاديمية: كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية، 2015؛ المجلد 40، ص 72-81.

56. هويت، ج.؛ هيل، AF Exosomes في أمراض الأمراض التنكسية العصبية. جي بيول. الكيمياء. 2016, 291, 26589–26597. [المرجع المتقاطع]

57. ريبيرو، م.ف. تشو، ه.؛ ميلارد، آر دبليو؛ Fan، G. تعمل Exosomes في المؤيدة والمضادة لتكوين الأوعية الدموية. العملة. الأوعية الدموية 2013، 2، 54-59. [المرجع المتقاطع]

58. لان، ج.؛ صن، ل. شو، ف؛ ليو، L.؛ هو، ف. سونغ، د. هو، Z .؛ وو، دبليو؛ لو، اكس؛ وانغ، J.؛ وآخرون. تعمل الإكسوسومات المشتقة من البلاعم M2 على تعزيز هجرة الخلايا وغزوها في سرطان القولون. الدقة السرطان. 2019, 79, 146-158. [المرجع المتقاطع]

59. آغا، م. بينتز، جي إل؛ رافا، س.؛ توريسي، السيد؛ كوندو، س.؛ واكيساكا، ن.؛ يوشيزاكي، T .؛ باجانو، شبيبة. Shackelford، J. Exosomal HIF1 يدعم الإمكانات الغازية للإكسوسومات الإيجابية المرتبطة بسرطان البلعوم الأنفي 1-. أونكوجين 2014، 33، 4613-4622. [المرجع المتقاطع]

60. فو، م.؛ وانغ، ب. تشن، العاشر. هو، ز. وانغ، Y.؛ لي، العاشر. تساو، ه.؛ يقوم Zheng، SJ gga-miR -454 بقمع تكرار فيروس مرض الجرابي المعدي (IBDV) من خلال الاستهداف المباشر للجزء الجينومي IBDV B والمثبطات الخلوية لإشارة السيتوكين 6 (SOCS6). الدقة الفيروسية. 2018، 252، 29-40. [المرجع المتقاطع]

61. فو، م.؛ وانغ، ب. تشن، العاشر. هو، ز. وانغ، Y.؛ لي، العاشر. تساو، ه.؛ Zheng، SJ MicroRNA gga-miR-130b يمنع تكاثر فيروس مرض الجرابي المعدي من خلال استهداف الجينوم الفيروسي والمثبطات الخلوية لإشارة السيتوكين 5. J. Virol. 2018، 92، ه01646-17. [المرجع المتقاطع]

62. قوه، XK. تشانغ، س. جاو، L.؛ لي، ن.؛ تشن، العشرين؛ Feng، WH زيادة التعبير عن microRNA 181 تمنع تكاثر فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي ولها آثار على السيطرة على عدوى الفيروس. جي فيرول. 2013، 87، 1159-1171. [CrossRef] [مجلات]

63. كونغ، ب.؛ شياو، س. تشن، Y.؛ وانغ، ل.؛ جاو، J.؛ لي، م. هو، ز. قوه، Y.؛ تشاو، G.؛ تشانغ، العاشر. وآخرون. تحدد نسخ miRNA وmRNA المتكاملة من البلاعم السنخية الخنازير (خلايا PAM) التوقيعات الجزيئية الخاصة بسلالة miRNA المرتبطة بعدوى H-PRRSV وN-PRRSV. مول. بيول. 2014، 41، 5863-5875. [CrossRef] [مجلات]

64. لي، ن.؛ هوانغ، ك. تشن، Y.؛ هوانغ، Z.؛ تشانغ، Y.؛ لينغ، C.؛ ليو، Y.؛ شي، J.؛ شياو، س. يُظهر Yao، L. MicroRNA ssc-miR-124a نشاطًا مضادًا للفيروسات ضد فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي عن طريق قمع الجينات المضيفة CD163. دكتور بيطري. ميكروبيول. 2021، 261، 109216. [CrossRef] [PubMed]

65. لي، ن.؛ دو، T.؛ يان، Y.؛ تشانغ، أ.؛ جاو، J.؛ هو، ج. شياو، س. Zhou، EM MicroRNA Let-7f-5p يمنع فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي عن طريق استهداف MYH9. الخيال العلمي. النائب 2016، 6، 34332. [المرجع المتقاطع]

66. تشن، ي.؛ وانغ، ف. ليانغ، دبليو؛ ليو، J.؛ جاو، ج.؛ وانغ، Y.؛ شو، X.؛ سو، س. تشانغ، س. Liu، B. تحديد الحمض النووي الريبي (RNA) غير المشفر المعبر عنه تفاضليًا في البلاعم السنخية الخنازير من تونغتشنغ والخنازير البيضاء الكبيرة استجابت لـ PRRSV. الخيال العلمي. النائب 2018، 8، 15621. [المرجع المتقاطع]

67. تشو، العاشر. ميشال، جي جي؛ جيانغ، Z .؛ Liu، B. MicroRNA تحديد ملامح التعبير في الضامة السنخية لخنازير Tongcheng الصينية الأصلية المصابة بـ PRRSV في الجسم الحي. تطبيق J. جينيت. 2017، 58، 539-544. [المرجع المتقاطع]

68. لي، YJ. Lee، C. يتم قمع تكرار فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي عن طريق تثبيط مسار إشارات الكيناز (ERK) الذي ينظم الإشارات خارج الخلية. الدقة الفيروسية. 2010، 152، 50-58. [المرجع المتقاطع]

69. سونغ، س. بي، J.؛ وانغ، د.؛ فانغ، L.؛ تشانغ، L.؛ لي، ف. تشن، ه.؛ Xiao، S. تعمل عدوى فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي في الخنازير على تنشيط إنتاج IL -10 من خلال مسارات NF-κB و p38 MAPK في البلاعم السنخية الخنازير. ديف. شركات. إيمونول. 2013، 39، 265-272. [المرجع المتقاطع]

70. يين، س.؛ هوو، Y.؛ دونغ ذ.؛ فان، ل.؛ يانغ، ه.؛ وانغ، ل.؛ نينغ، Y.؛ Hu، H. تنشيط c-Jun NH (2) - كيناز المحطة مطلوب من أجل موت الخلايا المبرمج الناجم عن فيروس المتلازمة التناسلية والجهاز التنفسي ولكن ليس لتكاثر الفيروس. الدقة الفيروسية. 2012، 166، 103-108. [المرجع المتقاطع]

71. Fan، L. مسارات الإشارة المشاركة في تنظيم تحريض موت الخلايا المبرمج في الخلايا المضيفة عند الإصابة بـ PRRSV. جينات الفيروسات 2019، 55، 433-439. [المرجع المتقاطع]

72. لوبيز فويرتس، ل.؛ كامبوس، إي. دومينيك، ن.؛ إزكيرا، أ. كاسترو، JM. دومينغيز، J.؛ Alonso، F. فيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRS) ينظم إنتاج TNF في البلاعم المصابة. الدقة الفيروسية. 2000, 69, 41-46. [المرجع المتقاطع]

73. تيسييه، إ.؛ Pécheur، EI Lipids كمعدِّلات لاندماج الغشاء بوساطة بروتينات الاندماج الفيروسي. يورو. بيوفيس. ج. 2007، 36، 887-899. [المرجع المتقاطع]

74. جيون، ج.ه. Lee، C. الكولسترول الخلوي مطلوب لعدوى فيروس nidovirus. قوس. فيرول. 2017، 162، 3753-3767. [المرجع المتقاطع]

75. صن، ي.؛ شياو، س. وانغ، د.؛ لو، ر. لي، ب. تشن، ه.؛ Fang، L. كوليسترول الغشاء الخلوي مطلوب لدخول فيروس المتلازمة التناسلية والتنفسية للخنازير وإطلاقه في خلايا مارك -145. الخيال العلمي. الصين الحياة العلمية. 2011، 54، 1011-1018. [المرجع المتقاطع]

76. تيان، ت.؛ تشو، YL؛ تشو، YY؛ ليانغ، غف؛ وانغ، يي؛ هو جين تاو، FH. Xiao، ZD Exosome من خلال الالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين وخلايا الخلايا الكبيرة والتوسط في تسليم miR -21. جي بيول. الكيمياء. 2014، 289، 22258-22267. [المرجع المتقاطع]

77. مولكاهي، لوس أنجلوس؛ الوردي، RC. كارتر، طرق DRF وآليات امتصاص الحويصلة خارج الخلية. جي اكستراسل. الحويصلات 2014، 3، 24641. [CrossRef]

78. تشانغ، م. زانغ، إكس؛ وانغ، م. لي، Z .؛ تشياو، م.؛ هاه.؛ Chen، D. الناقلات النانوية المستندة إلى Exosome كمركبات مستوحاة من الحياة ومتعددة الاستخدامات لتوصيل الأدوية: التطورات والتحديات الحديثة. جي ماتر. الكيمياء. ب 2019، 7، 2421-2433. [المرجع المتقاطع]